一種基于cox-2基因檢測胃癌易感性的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)療研究領(lǐng)域，涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，具體涉及 一種基于C0X-2基因檢測胃癌易感性的試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，其中飲食習(xí)慣，生活環(huán)境以及幽門螺桿菌的感染等 均是導(dǎo)致胃癌發(fā)生的高危因素。遺傳因素也是一項重要的方面?；虻亩鄳B(tài)性是導(dǎo)致疾病 發(fā)生遺傳以及疾病發(fā)生遺傳易感性的重要方面。其中以單核苷酸多態(tài)性最為常見。
[0003] 單核苷酸多態(tài)性由于是人類基因組中最為常見的多態(tài)形式，因此其可以作為人類 疾病的一種特有基因。某一個或者幾個的單核苷酸多態(tài)性可以代表某個單體區(qū)域的單核苷 酸多態(tài)性稱之為標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性。
[0004] 環(huán)氧化酶（C0X)是花生四烯酸向前列腺素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，又被稱為前列腺素過氧 化物合酶，是一種膜結(jié)合蛋白，其有兩種同工酶。其中cox-1為結(jié)構(gòu)性酶廣泛分布于多種組 織之中，可自行表達，其催化作用所產(chǎn)生的物質(zhì)對于穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)有著重要的意義；C0X-2 為誘導(dǎo)型酶，在正常情況下僅在腎臟和腦組織中存在少量表達，而在其他細胞中則缺失，當(dāng) 受到誘導(dǎo)刺激時表達可以發(fā)生改變。
[0005]本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，C0X-2-1195G/A(rs689466)及 C0X-2-8473T/C(rs5275)基因 型單核苷酸多態(tài)性與胃癌的發(fā)生有著相關(guān)性。但在臨床檢測中，樣品有限，采用有限的樣品 量，同時檢測更多C0X的SNP位點對基于C0X-2基因檢測胃癌易感性來說非常重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種基于C0X-2基因檢測胃癌易感性的試劑盒及 其用途。
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供了一種基于C0X-2基因檢測胃癌易感性的試劑盒，包括： SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:9 及 SEQ ID N0:10 所示核苷酸序列組成的多重 PCR 引物組。
[0008] 本發(fā)明提供的基于C0X-2基因檢測胃癌易感性的試劑盒利用多重PCR引物對待測 樣品進行多重PCR反應(yīng)，可同時檢測出C0X-2基因上rs689466號SNP位點和rs5275號SNP 位點，節(jié)約了臨床樣品資源，提高了樣品利用率。
[0009] 優(yōu)選地，所述基于C0X-2基因檢測胃癌易感性的試劑盒中的多重PCR引物組用于 多重PCR反應(yīng)，以擴增待測樣品；其中，每個多重PCR反應(yīng)體系中采用的多重PCR引物組總 濃度為10uM。
[0010] 進一步優(yōu)選地，所述多重PCR反應(yīng)程序為：
[0011]
[0012] 優(yōu)選地，所述胃癌易感性的檢測為針對云南?。▋?yōu)選為文山州）地區(qū)人群進行的 胃癌易感性檢測。
[0013] 第二方面，本發(fā)明提供了一種評估人群胃癌易感性的方法，包括如下步驟：
[0014] 1)提取待測樣品的DNA，采用多重PCR反應(yīng)擴增提取的DNA樣品，其中，所述多 重 PCR 反應(yīng)采用的多重 PCR 引物組為 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:9 及 SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列組成的多重PCR引物組；
[0015] 2)凝膠電泳分離純化PCR產(chǎn)物片段；單堿基延伸后質(zhì)譜檢測SNP位點；
[0016] 3)對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計，獲得人群胃癌易感性的評估結(jié)果。
[0017] 優(yōu)選地，每個多重PCR反應(yīng)體系中采用的多重PCR引物組總濃度為10uM。
[0018] 優(yōu)選地，所述多重PCR反應(yīng)程序為：
[0019]
[0020] 優(yōu)選地，所述胃癌易感性的檢測為針對云南省（優(yōu)選為文山州）地區(qū)人群進行的 胃癌易感性檢測。
[0021] 第三方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的基于C0X-2基因檢測胃癌易感性 的試劑盒在檢測C0X-2基因上的rs689466號和rs5275號SNP位點的基因型中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)：采用本發(fā)明提供的試劑盒，同時對C0X-2基因上的rs689466號和 rs5275號SNP位點進行PCR擴增，檢測發(fā)現(xiàn)：C0X-2-1195G/A及C0X-2-8473T/C基因型單核 苷酸多態(tài)性與胃癌的發(fā)生有著相關(guān)性，含有突變基因A和C者更容易發(fā)生胃癌。
【附圖說明】 圖 1 是本發(fā)明實施例提供的 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2和 SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10 的多重PCR結(jié)果； 圖 2 是本發(fā)明實施例提供的 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和 SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10 的多重PCR結(jié)果。
【具體實施方式】
[0023] 以下實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方 法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0024] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0025] 儀器與試劑。所有的DNA引物均喲上海的英駿生物公司提供，采用酚氯仿法抽提 基因組。DNA Marker:東勝生物，Low ladder/marker，M1031。具體步驟如下：
[0026] 實施例1 SNP篩選
[0027] 采用Haploview的軟件進行C0X-2基因的tagSNP篩選。然后再采用FastSNP對 候選的tag SNPs進行功能和風(fēng)險預(yù)測，從而能夠挑選一種具有潛在功能效應(yīng)的SNPs。其中 對tag SNPs的風(fēng)險評估依據(jù)主要是采用遺傳風(fēng)險評估方案進行評分。通過篩選，本文捕獲 兩個潛在的 tag SNPs (rs689466 以及 rs5275)。
[0028] 實施例2 DNA樣品提取
[0029] 將采集的凝血塊500 y 1大小并且將其置于離心管中，加入800 y 1的TE，混勻后進 行DNA的提取。混勻后進行離心操作，10000rpm/min，離心5分鐘。然后依次加入400 y 1 的LTE，25 y 1的10%的SDS和5 y 1濃度為20mg/ml的PK液，過夜消化。消化結(jié)束后將其 上清液吸取并且同時加入等體積的酚，渦旋15分鐘后再次離心。吸取上清液后加入1 :1的 氯仿和酚，再次渦旋離心。再吸取上清液，加入2倍的無水乙醇和3M的乙酸鈉，在-20°C的 條件下進行沉淀反應(yīng)。沉淀接受后棄去上清液，然后加入75%的乙醇再次離心。取出上清 液后將離心后的沉淀物質(zhì)干燥，待用。
[0030] 實施例3引物設(shè)計
[0031] 采用Mass Assay Design 3. 1(美國sequenom公司）進行引物設(shè)計，設(shè)計PCR擴 增引物及延伸引物。
[0032] PCR擴增引物：
[0033] 針對rs689466號SNP位點的特異性引物設(shè)計3對：
[0034]第1對：
[0035] (SEQID N0:1)
[0036] 正義引物：5' -TCCGTGTCTCATGAAGAATCA-3'（Tm 值為 59°C )，
[0037] (SEQ ID NO:2)
[0038] 反義引物：5' -CTCCCTGATGCGTGGATTAT-3'（Tm 值為 60°C );
[0039]第2對：
[0040] (SEQ ID NO:3)
[0041]正義引物：5' -ATGCTCCTCCCTGAGCACTA-3'（Tm 值為 60°C )，
[0042] (SEQ ID NO:4)
[0043]反義引物：5'-GITTCCTGCCTTCTGATGGA-3'（Tm 值為 60°C );
[0044]第 3 對：
[0045] (SEQID NO:5)
[0046] 正義引物：5' -ATCTCACCCTCACATGCTCCT-3'（Tm 值為 61°C )，
[0047] (SEQIDNO:6)
[0048]反義引物：5'-AITTGCAGGGACGCTAAATGT-3'（Tm值為 61°C );
[0049] 針對rs5275號SNP位點的特異性引物設(shè)計2對：
[0050]第1對：
[0051] (SEQID NO:7)
[0052]正義引物：5 '-CCAGAGAGAAATGAGITITGACG-3'（Tm值為 60 °C )，
[0053] (SEQ ID NO:8)
[0054]反義引物：5'-ITGGTGAAAAAGGAACATCACTT-3'（Tm值為 60°C );
[0055]第2對：
[0056] (SEQID NO:9)
[0057]正義引物：5'-TCGATGITTCCAATGCATCT-3'（Tm值為 59. 5°C )，
[0058] (SEQ ID NO: 10)
[0059]反義引物：5'-T