一種鑒別結(jié)縷草品種的引物及結(jié)縷草品種的鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種鑒別結(jié)縷草品種的引物及結(jié)縷草品種的 鑒別方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中國是世界上結(jié)縷草資源最為豐富的國家，同時(shí)，結(jié)縷草也是我國唯一一個(gè)出口 種子的草坪草種。農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《草品種審定技術(shù)規(guī)程》指出，育成品種應(yīng)同時(shí)具備特異性 (distinctness)、一致性（uniformity)和穩(wěn)定性（stability)(簡稱三性或"DUS")。因此， 草品種審定前，除了需要完成統(tǒng)一安排的區(qū)域試驗(yàn)外，新草品種還應(yīng)通過"三性"測(cè)試。目 前，對(duì)新草品種的"三性"測(cè)試和鑒定的方法通常采用外觀形態(tài)特征描述法。測(cè)試結(jié)果容易 受環(huán)境因素的影響，且周期較長。且隨著育種材料遺傳基礎(chǔ)的日益狹窄及選育品種數(shù)目的 日益增多，品種間的差異越來越小，單純依靠傳統(tǒng)的植物學(xué)性狀已經(jīng)難以將它們準(zhǔn)確鑒別。
[0003] SSR即簡單序列重復(fù)，亦稱微衛(wèi)星，是近年來發(fā)展起來建立在PCR基礎(chǔ)上的第二代 分析標(biāo)記。微衛(wèi)星在原核生物和真核生物基因組中隨機(jī)分布，而且該標(biāo)記呈共顯性，符合孟 德爾遺傳模式。SSR標(biāo)記自開發(fā)以來，已在多種植物的遺傳多樣性、指紋圖譜、純度鑒定、資 源親緣關(guān)系分析、連鎖圖譜構(gòu)建、基因定位等研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。相比于AFLP、RAH)等 分子標(biāo)記技術(shù)，SSR具有易于操作，高度重復(fù)性和可靠性，顯示出較強(qiáng)的多態(tài)性等優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 因此有必要通過SSR分子標(biāo)記手段，構(gòu)建結(jié)縷草現(xiàn)有品種的DNA標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，為 結(jié)縷草新品種的鑒定提供一種可靠、快捷的分子遺傳學(xué)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)鑒別技術(shù)中存在的上述缺陷，提供一種可靠、快捷的 結(jié)縷草品種鑒定方法。
[0006] 為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明提供了一種鑒別結(jié)縷草品種的引物，其特征在于，包括 正向引物：5 ' -ITGAITCAGITGGTGAAACA-3 ' ；和反向引物：5 ' -GACTTAITITCGACGAACTACC-3 '。
[0007] 其中，所述結(jié)縷草品種包括膠東青結(jié)縷草、蘭引III號(hào)、青島結(jié)縷草、華南結(jié)縷草、蘇 植1號(hào)和上海結(jié)縷草中的至少一種。
[0008] 在本發(fā)明中，所述結(jié)縷草品種還可以包括本領(lǐng)域已知和未知的其它結(jié)縷草品種。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種結(jié)縷草品種的鑒別方法，包括以待測(cè)樣品基因組DNA為模板 DNA，利用本發(fā)明所提供的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0010] 本發(fā)明所提供的鑒別方法包括，首先利用所述引物對(duì)已知品種的結(jié)縷草標(biāo)準(zhǔn)品的 基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物，根據(jù)所述PCR產(chǎn)物建立不同品種的結(jié)縷草標(biāo)準(zhǔn)品 的SSR標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
[0011] 當(dāng)進(jìn)行結(jié)縷草品種鑒別時(shí)，利用所述引物對(duì)待鑒別的結(jié)縷草基因組DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增結(jié)果，將所述擴(kuò)增結(jié)果與各結(jié)縷草標(biāo)準(zhǔn)品的SSR標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，從 而進(jìn)行品種鑒別。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中給出了膠東青結(jié)縷草、蘭引III號(hào)、青島結(jié)縷草、華南結(jié) 縷草、蘇植1號(hào)和上海結(jié)縷草的SSR標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（如圖2所示）。
[0013] 在本發(fā)明所提供的鑒別方法中，所述PCR擴(kuò)增體系為：43. 0 y 1 PCR Supermix(Invitrogen)，1 y 1上游引物，1 y 1下游引物以及1. 0 y 1的模板DNA，共46 y 1體 系。
[0014] 其中，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5min ;94°C變性20s，58°C退火lmin，72°C延伸 30s，共 14 個(gè)循環(huán)；94°C變性 20s，55°C退火 lmin，72°C延伸 30s，共 28 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin 后獲得PCR產(chǎn)物。
[0015] 其中，所述結(jié)縷草基因組DNA優(yōu)選為提取自結(jié)縷草葉片。
[0016] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，發(fā)明人對(duì)提取基因組DNA的CTAB法進(jìn)行了改 進(jìn)，獲得了一種適合于結(jié)縷草的基因組DNA提取方法，具體的，可以包括以下步驟：
[0017] 稱取新鮮葉片組織，置于液氮預(yù)冷的研缽內(nèi)，加入液氮，快速研磨至粉末狀，研磨 后的植物粉末放入離心管中，置于液氮中；每個(gè)樣品加入DNA混合提取液（每lOmlDNA提 取液加入0. 〇57g亞硫酸氫鈉）核裂解液和十二烷基肌氨酸鈉，用渦旋振蕩器將管內(nèi)溶液 及植物粉末混合均勻；將樣品置于65°C水浴鍋中45min，水浴過程中每隔10-20min混勻一 次，操作盡可能溫和；取出離心管，置于冰上冷卻，待離心管中混合液至15_25°C后，每管加 入24:1的氯仿：異戊醇混合液，用輕柔的動(dòng)作上下混勻，當(dāng)樣品充分混合后，12000rpm離心 lOmin ;離心結(jié)束后，吸取上清液于已滅菌的1. 5ml離心管中，加入預(yù)冷的異丙醇，在離心管 壁和蓋子上做好標(biāo)記。輕輕地上下顛倒混勻，當(dāng)樣品充分混合后放在-20°C中靜置lOmin后 放入離心機(jī)，13000rpm離心6min ;離心后棄上清液，所得沉淀用70%乙醇沖洗兩次，放入通 風(fēng)櫥中風(fēng)干。待管中0嫩完全干燥，加入50-100 ^1(1(11120、1^1尺似86，在37°(：水浴鍋中 水浴，充分溶解獲得結(jié)縷草的基因組DNA。
[0018] 其中，DNA提取液配方優(yōu)選為：稱取D-山梨醇6. 375g、Tris-basel. 21g、 EDTA-Na20. 168g，用無菌水定容至100ml，pH范圍調(diào)至7. 5-8. 25之間，4°C保存。
[0019] 核裂解液配方優(yōu)選為：稱取 Tris-base 2. 42g、EDTA-Na2l. 86g、氯化鈉 11. 69g、 CTAB 2g，用無菌水定容至100ml，pH范圍調(diào)節(jié)至7. 5-8. 0之間，高溫高壓滅菌。
[0020] 5 %十二烷基肌氨酸鈉配方優(yōu)選為：稱取5g十二烷基肌氨酸鈉，無菌水定容至 100ml，用濾紙過濾，室溫保存。
[0021] 本發(fā)明還提供了含有所述引物的試劑盒。所述試劑盒中還包括PCR反應(yīng)試劑。
[0022] 本發(fā)明還提供了所述引物或所述試劑盒在鑒別結(jié)縷草品種中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明所提供的引物和方法將SSR分子標(biāo)記技術(shù)引入DUS測(cè)試，利用DNA指紋技 術(shù)構(gòu)建結(jié)縷草品種真?zhèn)蔚认嚓P(guān)鑒定的檢測(cè)體系，可以用于建立已知結(jié)縷草品種的DNA指紋 圖譜數(shù)據(jù)庫，從而對(duì)待鑒定品種與標(biāo)準(zhǔn)品種DNA指紋圖譜和數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)比較和判別，進(jìn) 行新結(jié)縷草品種的遺傳學(xué)鑒定，成為新結(jié)縷草品種身份確認(rèn)和品種鑒定的發(fā)展方向，相對(duì) 于結(jié)縷草品種現(xiàn)行的"三性"測(cè)試和鑒定的方法（外觀形態(tài)特征描述法），測(cè)試結(jié)果不受環(huán) 境因素的影響，操作方便快捷，測(cè)定周期明顯縮短，且測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。一方面為品 種鑒定提供了最為可靠快捷的方法；另一方面有效地解決同種異名、同名不同質(zhì)和疑似、近 似品種的管理問題。該技術(shù)對(duì)于加強(qiáng)我國草品種管理，提升草品種審定工作質(zhì)量具有極其 重要的意義。而且可為牧草良種繁育認(rèn)定體系建立和強(qiáng)化種市場監(jiān)管提供科學(xué)、高效的技 術(shù)支撐。
【附圖說明】
[0024] 圖1為六個(gè)結(jié)縷草品種PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，其中，M marker ;1:上海結(jié)縷草；2 :蘇植 1號(hào)結(jié)縷草3 :華南結(jié)縷草；4 :青島結(jié)縷草；5 :蘭引III號(hào)結(jié)縷草；6 :膠東青結(jié)縷草。
[0025] 圖2為六個(gè)結(jié)縷草品種的SSR標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，其中，1:上海結(jié)縷草；2 :蘇植1號(hào)結(jié) 縷草3 :華南結(jié)縷草；4 :青島結(jié)縷草；5 :蘭引III號(hào)結(jié)縷草；6 :膠東青結(jié)縷草。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面將通過【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 1)結(jié)縷草基因組DNA的提?。?br>[0029] 樣品數(shù)目：每個(gè)品種樣品以25株群體為一個(gè)混合樣。
[0030] 2)試劑配制方法：
[0031] DNA 提取液配方：稱取