專利名稱：癌抗原特異性t細胞受體基因、由該基因編碼的肽及其使用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌抗原特異性T細胞的受體基因中所含的多核苷酸和 由該多核苷酸編碼的肽，以及使用它們的例如診斷、預(yù)后或治療監(jiān)測 等癌癥檢查和癌癥治療等。
背景技術(shù)：
癌癥治療包括用手術(shù)摘除癌癥、放射治療、用抗癌藥治療和免疫 療法。在這些治療中，免疫療法在近年來特別引人注意，因為其對癌 癥的選擇性、特異性高、且?guī)缀鯖]有副作用。其中，大力進行了通過 將大量存在于多種種類的癌細胞和白血病細胞中的WT1蛋白作為靶標 來治療癌癥和白血病的探索。為了研究將WT1作為靶標的抗癌治療的 機理并進一步提高治療效果，有必要鑒定WT1特異性細胞毒性T細胞 (CTL)的T細胞受體(TCR)基因的核苷酸序列和由該核苷酸序列編碼的 受體肽的氨基酸序列。然而，截至目前為止，雖然進行了一些研究(參 見例如非專利文獻l-5)，但對那些受體基因和受體肽的序列知之甚少， 更不用說沒有對其加以有效使用的描述了。
非專利文獻1: Valmori D.等，J. Immunol. 168: 4231-4240， 2002 非專利文獻2: Dietrich PY.等，Cancer Res. 61: 2047-2054， 2001 非專利文獻3: CouliePG.等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 102卯-10295， 2001
非專利文獻4: Godelaine D.等，J. Immunol. 171: 4893-4897， 2003 非專利文獻5:MandruzzatoS.等，J. Immunol. 169: 4017-4024，
200
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是揭示對WTl蛋白的WTl特異性細胞毒性T細胞 (CTL)的T細胞受體(TCR)的氨基酸序列以及編碼它們的基因的核普酸 序列，特別是其CDR3區(qū)的氨基酸序列和核苷酸序列，以及在癌癥檢查(診斷、預(yù)后、治療監(jiān)測等)和癌癥治療中使用這些。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人進行了廣泛的研究，首次判定了健康
者和HLA - A * 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的 T細胞受體(TCR)的VP鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列，并因 而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供了以下內(nèi)容
(1) 多核普酸，該多核苷酸具有編碼WT1特異性細胞毒性T細胞 (CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的CDR3的核苷酸序列，該多核苷 酸具有DNA、與該DNA互補的RNA、或它們的互補序列，所述DNA 具有序列號1-1695中示出的4壬意的CDR3核苷酸序列。
(2) .上述(l)記載的多核普酸，其中，所述多核苷酸由DNA、其互 補的RNA、或它們的互補序列組成，所述DNA包含序列號1-1695 中示出的任意的CDR3核苷酸序列。
(3) .肽，該肽具有WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受 體(TCR)的Vp鏈的CDR3的氨基酸序列，該肽具有序列號1696-3389 中示出的任意的CDR3氨基酸序列。
(4) .上述(3)記載的肽，該肽由序列號1696-3389中示出的任意的 CDR3的氨基酸序列組成。
(5) .上述(1)或(2)記載的多核苷酸或者上述(3)或(4)記載的肽作為 癌標記的用途。
(6) .診斷HLA-A^2402陽性患者中的癌癥的方法，該方法包括評 估在治療前從所述患者處取得的樣本中的WT1特異性CTL克隆能力， 所述WT1特異性CTL具有上述(1)或(2)記載的任意的多核苷酸或者上 述(3)或(4)記載的任意的肽，其中，當具有多重克隆能力(multiplicityof clonality)的WT1特異性CTL存在時，判定該患者有患癌癥的可能性。
(7) .上述(6)記載的方法，其中，在治療前的患者中當具有任意的 CDR3多核苷酸或任意的CDR3肽且具有3以上的克隆能力的WT1特 異性CTL的克隆能力越大、或者當具有3以上的克隆能力的WT1特 異性CTL的種類越多時，判定該患者患癌癥的可能性越高。
(8) .檢測HLA-A火2402陽性患者對WT1肽免疫療法的敏感性的方 法，該方法包括評估在治療前從所述患者處取得的樣本中的WT1特異 性CTL的克隆能力和種類數(shù)，所述WT1特異性CTL具有上述(1)或(2)記載的任意的多核苷酸或者上述(3)或(4)記載的任意的肽，其中，當所 述患者中具有多重克隆能力的WT1特異性CTL的種類比對WT1肽免 疫療法無反應(yīng)的主體中更多時，判定該患者對WT1肽免疫療法具有敏 感性。(9) .上述(8)記載的方法，其中，在治療前的患者中當具有多重克 隆能力的WT1特異性CTL克隆的種類越多或者克隆能力越大時，判 定該患者對WT1肽免疫療法的敏感性越高。(10) . HLA-A* 2402陽性患者中的WT1肽免疫療法的監(jiān)測方法，該 方法包括評估在治療前和治療后從所述患者處取得的樣本中的WT1特 異性CTL克隆的克隆能力，所述WT1特異性CTL克隆具有上述(l) 或(2)記載的任意的多核苷酸或者上述(3)或(4)記載的任意的肽，其中， 當任意WT1特異性CTL克隆的克隆能力在治療后比治療前增加時， 判定該患者對WT1肽免疫療法有反應(yīng)。(11) .上述(10)記栽的方法，其中，在WT1肽免疫療法之后，當克 隆能力的增加率越大、或者具有增加的克隆能力的克隆的種類越多時， 判定患者對WT1肽免疫療法的反應(yīng)性越高。(12) .抗體，該抗體抗上述(3)或(4)記載的肽。(13) .芯片，該芯片含有上述(1)或(2)記載的多核苷酸、上述(3)或(4) 記載的肽、或者上述(12)記載的抗體。(14) .CDR3多肽擴增用引物，該引物具有選自序列號3389-3416 中所示序列中的序列。(15) .用于診斷癌癥的試劑盒、用于檢測患者對WT1肽免疫療法 的敏感性的試劑盒、或用于監(jiān)測WT1肽免疫療法的試劑盒，所述試劑 盒包括用于檢測具有上述(1)或(2)記載的多核苷酸或者上述(3)或(4)記 載的肽的WT1特異性CTL的手段。(16) .用于診斷癌癥的裝置、用于檢測患者對WT1肽免疫療法的 敏感性的裝置、或用于監(jiān)測WT1肽免疫療法的裝置，所述裝置包括用 于檢測具有上述(1)或(2)記載的多核苷酸或者上述(3)或(4)記載的肽的 WT1特異性CTL的手段。(17) .上述(15)記載的試劑盒，該試劑盒包括上述(13)記載的芯片或 上述(14)記載的引物。(18) .上述(16)記載的裝置，其中在裝置中使用上述(13)記載的芯片6或上述(14)記載的引物。(19). HLA-A* 2402陽性癌癥患者的淋巴細胞，所述、淋巴細胞中引 入了含有上述(1)或(2)記載的多核苷酸序列的T細胞受體基因。本發(fā)明還提供使用來自HLA-A*2402陽性患者的淋巴細胞的癌癥 治療，其中將包含CDR3多核普酸的T細胞受體基因引入到所述淋巴 細胞中。此外，本發(fā)明還提供抗CDR3多肽的抗體及其使用。 根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)揭示了 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T 細胞受體(TCR)的VP鏈基因中所含的核苷酸序列以及由其編碼的肽的 氨基酸序列，特別地揭示了 CDR3的核苷酸和氨基酸序列，使用這些 多核苦酸和肽，可以進行廣泛的癌癥檢查(診斷、預(yù)后、治療監(jiān)測等)、 癌癥治療等。


圖1-1表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的V卩鏈的 CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左 邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱(Vname)、 J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...]\1...0-區(qū)...^)賈2...!1-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。圖1-2表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的 CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左 邊的數(shù)字表示vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名 稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...]\1...0-區(qū)...^^2...^區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。圖1-3表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的V|3鏈的 CDR3的核普酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左 邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名 稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)..^1...0-區(qū)...(？) 2...>1-區(qū)"表示核苦酸序列的各部分的來源。2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的 CDR3的核香酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左 邊的數(shù)字表示vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名 稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...]\1...0-區(qū)...^^2...^區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。圖1-5表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的 CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左 邊的數(shù)字表示vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名 稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)... 1...0-區(qū)...(1 ^2...>1-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。圖1-6表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的 CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左 邊的數(shù)字表示vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名 稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苦酸序列上的"V-區(qū)..^1...0-區(qū)...^^2...^區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。圖1-7表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的V|5鏈的 CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左 邊的數(shù)字表示vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名 稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苦酸序列上的"V-區(qū)...]^1...0-區(qū)...^^2... 1-區(qū)"表示核普酸序列的各部分的來源。圖1-8表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的 CDR3的核苦酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左 邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名 稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...]^1...0-區(qū)...^)\2... 1-區(qū)，，表示核苷酸序列的各部分的來源。圖1-9表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A^ 2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的V卩鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...]\1...0-區(qū)...^) 2...1-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-10表示本發(fā)明中鑒定的健康者和31^-入* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的V卩鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...]\1...0-區(qū)...^) 2... 1-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-11表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)..,]\1.."-區(qū)...^^2... 1-區(qū)"表示核*酸序列的各部分的來源。
圖1-12表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示V(5鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)... 1...0-區(qū)...^^2..丄區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-13表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#，，表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...]\1...0-區(qū)...^戸2...>1-區(qū)"表示核苦酸序列的各部分的來源。
圖1-14表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名
9稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...]^1...0-區(qū)...(卩)~2...<1-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-15表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)…Nl…D-區(qū)…(P)N2…J-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-16表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A頭2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的CDR3的核普酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苦酸序列上的"V-區(qū)…Nl…D-區(qū)…(P)N2…J-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-17表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的V(3鏈的CDR3的核普酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...1\1...0-區(qū)...^戸2...(1-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖l-18表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-AA 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的V卩鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)…Nl…D-區(qū)…(P)N2…J-區(qū)"表示核普酸序列的各部分的來源。
圖l-19表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)…Nl…D-區(qū)…(P)N2…J-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
10圖l-20表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-AA 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的V卩鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...]^1...0-區(qū)...^^2... 1-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-21表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示V(3鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...]^1...0-區(qū)...(？)~2...(1-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-22表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的V|3鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...1^1...0-區(qū)...^^2... 1-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-23表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...]\1...0-區(qū)...^^2...<1-區(qū)"表示核*酸序列的各部分的來源。
圖1-24表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)..^1...0-區(qū)...^)漢2... 1-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-25表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的V卩鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)…Nl…D-區(qū)…(P)N2…J-區(qū)"表示核普酸序列的各部分的來源。
圖1-26表示本發(fā)明中鑒定的健康者和￡^入-入* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的V卩鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...1^1...0-區(qū)...^^2...1-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-27表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的CDR3的核苦酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...]\1...0-區(qū)...^^2...(1-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-28表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的V卩鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...1^1...0-區(qū)...(？)賈2... 1-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-29表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示V(5鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核香酸序列上的"V-區(qū)...]\1...0-區(qū)...(？) 2...11-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-30表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的V卩鏈的CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#，，表示克隆號，點左邊的數(shù)字表示vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)…Nl…D-區(qū)…(P)N2…J-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-31表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的 CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左 邊的數(shù)字表示vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名 稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核普酸序列上的"V-區(qū)...1\1...0-區(qū)...^^2...^區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-32表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的 CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#，，表示克隆號，點左 邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名 稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...]>(1...0-區(qū)...^戸2...!1-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-33表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的 CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左 邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名 稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)... 1...0-區(qū)...^^2...<1-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-34表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的 CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#，，表示克隆號，點左 邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名 稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細—節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)...1\1...0-區(qū)...^^2... 1-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖1-35表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的 CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左 邊的數(shù)字表示vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名 稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)…Nl…D-區(qū)…(P)N2…J-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
13圖1-36表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A* 2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的 CDR3的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，"克隆#"表示克隆號，點左 邊的數(shù)字表示vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號。V名稱、J名 稱和D名稱分別表示V區(qū)、J區(qū)和D區(qū)的細節(jié)。核苷酸序列上的"V-區(qū)…Nl…D-區(qū)…(P)N2…J-區(qū)"表示核苷酸序列的各部分的來源。
圖2-1表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號，Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase 1表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-2表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號; HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-3表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#，，表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育
14不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-4表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-AA2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-5表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-6表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示VP鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號；HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-7表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-8表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-AA2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-9表示本發(fā)明中鑒定的健康者和￡ ^^4*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#，，表
16示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-10表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-AA2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示VP鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-11表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#，，表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示V(3鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-12表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-13表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-AA2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆弁，，表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-14表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。圖2-15表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-AA2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#，，表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示VP鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-16表示本發(fā)明中鑒定的健康者和^1^^*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-17表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周
19血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-18表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-AA2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#，，表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示VJ3鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-19表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-AA2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-20表示本發(fā)明中鑒定的健康者和￡[1^1-人*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示V(3鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12
20周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-21表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示VJ5鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-22表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#，，表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-23表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#，，表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示VP鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-24表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#，，表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vj3鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-25表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示VP鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-26表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#，，表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示VP鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-27表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-AA2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-28表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-29表示本發(fā)明中鑒定的健康者和丑1^-人*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不
23良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase 1表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-30表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-31表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-32表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV
24是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-33表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-34表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A*2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-35表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A力2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#，，表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示Vp鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
圖2-36表示本發(fā)明中鑒定的健康者和HLA-A^2402陽性患者的 WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的各個克隆的克隆能力。"克隆#"表 示克隆號，點左邊的數(shù)字表示VP鏈的族號，點右邊的數(shù)字表示編號； HV是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育 不良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。HV 是健康志愿者，AML是急性髓細胞白血病患者，MDS是脊髓發(fā)育不 良綜合征患者。這些縮寫附帶的數(shù)字是健康志愿者號和患者號。Res 表示對治療反應(yīng)的患者；nonRes表示對治療無反應(yīng)的患者。此外，pre 表示治療前，4w、 8w、 12w和42w分別表示治療后4周、8周、12 周和42周。Phase l表示第一期臨床試驗。PB(pre)表示治療前的外周 血；BM(pre)表示治療前的骨髓。
具體實施例方式
本發(fā)明人用包含WT1肽/HLA - A * 2402復(fù)合體的WT1四聚體對
癌癥患者的外周血淋巴細胞進行染色，使用FACS--分離WT1四聚
體陽性細胞；從分離的各細胞產(chǎn)生cDNA，通過應(yīng)用PCR法來判定編 碼CDR3的核苷酸序列(圖1-1至1-36)，所述CDR3包含在WT1特異 性細胞毒性T細胞(CTL,以下有時稱為"WT1特異性CTL，，)的T細胞 受體(以下有時稱為"TCR，，)的Vp鏈中。從這些結(jié)果，還判定了 CDR3 的氨基酸序列(圖1-1至1-36;序列號1696-3389)。這些序列是由本發(fā) 明首次鑒定的。
因此，在第一方面，本發(fā)明提供多核苷酸，該多核苷酸具有編碼 從健康者和5^入-入*2402陽性患者中獲得的WT1特異性細胞毒性T細 胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vp鏈的CDR3的核苷酸序列，其中該 多核苷酸是具有序列號1-1695中示出的任意CDR3核苷酸序列的DNA、與該DNA互補的RNA、或具有它們的互補序列的多核苷酸。 本說明書中，將這些DNA和RNA分子及它們的互補的多核苷酸統(tǒng)稱 為"CDR3多核苷酸"。例如，除了含有序列號1-1695中示出的核苦酸 序列的DNA之外，CDR3多核苷酸還包括含有這些序列的DNA。另外 例如，除了與含有序列號1-1695中示出的核苷酸序列的DNA互補的 RNA之外，CDR3多核苦酸還包括含有這些序列的RNA。此外，例如， CDR3多核香酸包括具有上述DNA或RNA的序列的多核苷酸、以 及與RNA互補的多核苷酸。"CDR多核苷酸"包括具有編碼"CDR3肽" 的筒并序列的那些。
在另 一個方面，本發(fā)明提供具有WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL) 的T細胞受體(TCR)的V(3鏈的CDR3的氨基酸序列的肽，其中CDR3 的氨基酸序列在任意的序列號1696-3389中示出。在本說明書中，將 這些肽統(tǒng)稱為"CDR3肽"。例如，除了含有在序列號1696-3389中示 出的任意CDR3氨基酸序列的肽之外，CDR3肽還包括含有這些CDR3 氨基酸序列的肽(例如Vp鏈肽或其一部分等)。另外，由在序列號 1696-3389中示出的氨基酸序列中、其中一個至多個(優(yōu)選一個至三個、 一個或兩個、或一個)氨基酸被取代、添加或缺失的氨基酸序列組成的 肽；或者含有在序列號1696-3389中示出的氨基酸序列中、其中一個 至多個(優(yōu)選一個至三個、 一個或兩個、或一個)氨基酸,皮取代、添加或 缺失的氨基酸序列的肽也包含在"CDR3肽"中。但是，要求這些肽與原 來的肽具有同等的功能。這些CDR3肽是由上述的CDR3多核苷酸編 碼的肽。
CDR3區(qū)域是最多樣化的部分，也是與抗原識別的特異性最密切相 關(guān)的部分。因此，本發(fā)明的CDR3多核普酸序列和CDR3肽序列被認 為是特別針對HLA-A*2402陽性患者中的WT1特異性CTL的序列。 因此，只要編碼某T細胞的TCR的V卩鏈基因的CDR3區(qū)的多核苷酸 或?qū)?yīng)于CDR3區(qū)的肽具有本發(fā)明的多核苷酸或肽的序列，則該T細 胞就被認為是WT1特異性。因此，本發(fā)明的CDR3多核苷酸和CDR3 肽，可用作廣泛多樣性的癌癥的標記，用于諸如癌癥診斷、患者對WT1 肽免疫療法的敏感性的診斷、測試患者對WT1肽免疫療法的反應(yīng)等。
只要是從含有WT1的細胞產(chǎn)生的癌癥，則本發(fā)明的CDR3多核苷 酸和CDR3肽可存在于任何種類的癌癥患者的淋巴細胞中。已知WT1
27是多種癌癥和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的癌抗原。因此，本發(fā)明的CDR3 多核普酸和CDR3肽以及本發(fā)明的如下所述的方法，可以適用于幾乎 所有種類的癌癥，例如包括但不限于諸如急性髓細胞白血病、急性 、淋巴細胞白血病、惡性、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、慢性髓細胞白血病、 骨髓發(fā)育不良綜合征、移植同種的造血干細胞后的復(fù)發(fā)等血液惡性疾 ?。恢T如舌癌、牙齦癌、口底癌、咽癌、喉癌、唾液腺癌、甲狀腺癌 等實體癌癥；諸如乳腺癌、肺癌、胸腺癌等胸部癌癥；諸如結(jié)腸癌、 小腸癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、膽管癌、胃腸道內(nèi)分泌腫瘤、胃腸道 類癌等胃腸道癌癥；諸如腎癌、尿路上皮癌、生殖細胞瘤、維爾姆斯 瘤、前列腺癌、子宮體癌、宮頸癌、子宮肉瘤、卵巢惡性腫瘤等泌尿 及生殖器癌；諸如骨原發(fā)性惡性腫瘤(例如骨肉瘤和尤因肉瘤)、軟組織 肉瘤等肌骨骼惡性腫瘤；諸如皮膚癌、神經(jīng)母細胞瘤、惡性神經(jīng)膠質(zhì) 瘤(膠質(zhì)母細胞瘤)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的原發(fā)性惡性淋巴瘤、髓母細胞瘤和 原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤(PNET)等其他癌癥。
可以使用傳統(tǒng)的基因工程技術(shù)和/或化學(xué)合成工序來制造CDR3多 核苷酸或CDR3肽。例如，CDR3多核苷酸可從細胞分離或化學(xué)合成。 CDR3多核苷酸也可以4吏用諸如PCR等已知的方法來擴增。另外，例 如，可以將CDR3多核苷酸(任選使用已知的方法擴增到合適的程度) 整合至合適的載體中并引入到合適的細胞中，或者可以采用生物射彈 轟擊或電穿孔而引入到合適的細胞中。然后，對引入了CDR3多核苷 酸的細胞進行培養(yǎng)以表達，從而獲得CDR3多核苷酸或CDR3肽?？?用的栽體和細胞、基因轉(zhuǎn)移的條件、培養(yǎng)條件以及分離基因和肽的方 法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，可適當選擇使用?；瘜W(xué)合成法可用于 制造CDR3多核苷酸或CDR3肽。這類化學(xué)合成法是已知的，基因的 化學(xué)合成法包括使用amidite的固相DNA合成以及l(fā)-4磷酸酯法；肽 的化學(xué)合成法包括Fmoc法。
因此，在另一個方面，本發(fā)明提供診斷HLA-A^ 2402陽性患者的 癌癥的方法，該方法包括評估在治療前從所述患者處取得的樣本中的、 具有任意CDR3多核普酸或任意CDR3肽的WT1特異性CTL的克隆 能力，其中當多重克隆能力存在時，判定該患者有可能患有癌癥。在 本說明書中，術(shù)語"克隆能力"是指，檢測到具有同一的核苷酸序列或 者氨基酸序列的細胞的頻率。為了考察克隆能力， 一般使用可以識別單個細胞的細胞分選儀。"患者，，包括被懷疑有癌癥和患有癌癥的人。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過考察患者中具有任意CDR3多核苷酸或CDR3 肽的WT1特異性CTL的克隆能力，可以判定該患者是否患有癌癥。 從圖2-1至2-36可知，在健康人(HV1至HV4)中，具有任意CDR3多 核苦酸或CDR3肽的WT1特異性CTL的克隆能力對幾乎所有的克隆 為l，對極少的克隆為2或3;然而，與此相對，在治療前所有的癌癥 患者(AML(急勝髓細胞白血病)l-4和MDS(骨髓發(fā)育不良綜合征)l-5)都 無一例外地具有多重克隆能力，所述克隆能力為具有任意CDR3多核 苷酸或任意CDR3肽的WT1特異性CTL的克隆能力。與健康人相比， 其克隆能力的數(shù)目更大，這樣的細胞種類也更多。治療前患者中的克 隆能力的增加以及具有多重克隆能力的細胞種類的增加，表明了患者 體內(nèi)對癌細胞的防護與攻擊已經(jīng)開始的可能性。
鑒于這些結(jié)果,如果在檢查來自被實驗者的樣本時，在具有任意 CDR3多核苷酸或CDR3肽的WT1特異性CTL中發(fā)現(xiàn)多重克隆能力， 就可以判定該被實驗者有患癌癥的可能性。此外，當治療前的被實驗 者中的具有任意CDR3多核苷酸或CDR3肽的WT1特異性CTL的克 隆能力越大、或者當具有多重克隆能力的WT1特異性CTL的種類越 多，那么可以判定被實驗者患癌的可能性越高。另外，在上述判定方 法中，當治療前的患者中的具有任意CDR3多核苷酸或CDR3肽且具 有3以上的克隆能力的WT1特異性CTL的克隆能力越大、或者當具 有3以上的克隆能力的WT1特異性CTL的種類越多，那么可以判定 患者患癌的可能性越高。
在另 一方面，本發(fā)明提供用于檢測HLA-A* 2402陽性患者對WT1 肽免疫療法的敏感性的方法，該方法包括評估在治療前從所述患者處 取得的樣本中的、具有權(quán)利要求1記載的任意多核苷酸或權(quán)利要求2 記栽的任意肽的WT1特異性CTL的克隆的種類數(shù)目和克隆能力，其 中當該患者中具有多重克隆能力的WT1特異性CTL克隆的種類比對 該治療無反應(yīng)的主體中更多時，則該患者被判定為對WT1肽免疫療法 具有敏感性。
具有任意CDR3多核苷酸或CDR3肽的WT1特異性CTL抵抗患 者體內(nèi)的癌細胞來起作用。在這個過程中，治療前已經(jīng)有多重克隆能 力的克隆傾向于通過WT1肽免疫療法來進一步增加克隆能力或者保持其克隆能力。還認為，當有盡可能多種類的克隆，使得在總體上有效
的WT1特異性CTL克隆的數(shù)目和種類增加時，WT1免疫療法更可能 成功。更嚴格地說，當患者中的具有多重克隆能力的WT1特異性CTL 克隆的種類比無反應(yīng)主體中更多時，可以判定患者對WT1肽免疫療法 的敏感性高。
從圖2-1至2-36可知，對WT1肽免疫療法反應(yīng)的AML患者與健 康者和無反應(yīng)患者相比，治療前的具有多重克隆能力的克隆的種類數(shù) 更多。AML1(反應(yīng)者)IO種(總克隆能力為58); AML2(反應(yīng)者)12 種(總克隆能力為93); AML3(無反應(yīng)者)9種(總克隆能力為27); AML4(無反應(yīng)者)3種(總克隆能力為10)。健康者HV1-5中具有多重 克隆能力的克隆的種類為0至2種的范圍。
在另一個方面，本發(fā)明提供監(jiān)測HLA-A* 2402陽性患者中的WT1 肽免疫療法的方法，該方法包括評估在所述治療前和治療后從患者處 取得的樣本中的、具有權(quán)利要求1記載的任意多核苷酸或權(quán)利要求2 記載的任意肽的WT1特異性CTL克隆的克隆能力，其中當任意WT1 特異性CTL克隆的克隆能力在治療后比治療前增加時，判定該患者對 WT1狀免疫療法有反應(yīng)。
從圖2-1到2-36可以看出，觀測到了 AML患者中在WT1肽免疫 療法期間克隆能力增加(包括克隆能力從O上升到1以上的情況)的 WT1特異性CTL。表現(xiàn)出這種行為的示例性克隆包括來自AML(Pt 1) 的克隆# 02.28、 #05.034、 #05.135、 #05.219、 #09.65、 #12.04、 # 13.13、 # 27.016和# 28.83;以及來自AML(Pt2)的克隆弁02.27、 # 05.035、 #05.141、 #05.219、 #06.009、 #12.04、 #12.20、 #15.44、 #20.068 和# 27.032。由于WT1肽免疫療法而存在克隆能力增加的克隆，這表 明了對WT1肽免疫療法的反應(yīng)。即認為，克隆能力的增加顯示出WT1 肽免疫療法在一定期間奏效。這些克隆能力的增加可以是暫時性的或 持續(xù)性的。如果某些克隆的克隆能力暫時增加而之后下降，那么其他 WT1特異性CTL的克隆能力將增加以補充該效果。考慮到對癌細胞的 效果，更希望克隆能力有較大的增加。因此，在WT1肽免疫療法之后， 克隆能力的增加比例越大、或具有增加的克隆能力的克隆的種類越多， 可以判定患者對WT1肽免疫療法的反應(yīng)性越高。根據(jù)癌癥的種類和部 位，可使用適當?shù)姆椒▉頇z查癌細胞的數(shù)目及性質(zhì)。在上述監(jiān)測治療的方法中，雖然比較WT1肽免疫療法前后的克隆 能力，但治療前后的時間間隔可以是任意的。例如，可以是幾天、一 周、兩周、三周、四周、兩個月、三個月或更長。
在上文所述的本發(fā)明的方法中，考察克隆能力用的手段(means)和 方法、考察克隆的種類(即確定CDR3肽的氨基酸序列或?qū)ζ渚幋a的核 苷酸序列)用的手段和方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所共知，本領(lǐng)域的技術(shù)人 員可以方便地進4亍這些操作。例如，如本說明書中的實施例所示，可 使用FACSAria裝置等已知的分選裝置、以及諸如PCR法等公知的基 因擴增方法(例如使用選自表l中所列序列的引物組)。為了以更嚴格或 更明確的方式分才斤本發(fā)明的CDR3多核苷酸或CDR肽，人們只需確i人 在Vp鏈基因的CDR3的核苷酸序列、IMGT、 J區(qū)和D區(qū)是否列于圖 1-1至1-36即可。這種確認是本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常能進行的。
WT1肽免疫療法也是眾所周知的。例如，可通過對HLA-A*2402 陽性患者，例如透皮給予HLA-A*2402限制性WT1肽天然型(氨基酸 序列CMTWNQMNL)或者修飾型(modified form)(氨基酸序列 CYTWNQMNL)來進行。 一般來說，1次的給藥量是以jig/kg體重至 mg/kg體重的次序(order)，可以以一周 數(shù)周間隔給藥。
在另一個方面，本發(fā)明提供含有CDR3多核苷酸或與其互補的多 核苷酸的芯片、或者含有CDR3肽的芯片、含有抗CDR3肽的抗體的 芯片。這些芯片可以是微芯片、微列陣等形式。這些芯片的生產(chǎn)可以 按常規(guī)方法進行，例如，可以在玻璃基底上固定抗CDR3多核苷酸或 CDR3肽的抗體。被固定在芯片上的CDR3多核苷酸、與其互補的多 核苷酸、CDR3肽、抗CDR3肽的抗體的種類為1種~全部種類；優(yōu)選 將全部種類固定來進行詳盡的分析。例如，可以將包含與序列號1-1695 中示出的核苷酸序列互補的核苷酸序列的所有種類的多核苷酸固定在 芯片上；例如，還可以將特異性地識別并結(jié)合包含序列號1696-3389 中示出的氨基酸的所有種類的肽的抗體固定在芯片上。芯片上的CDR3 多核苷酸、與其互補的多核苷酸、CDR3肽、抗CDR3肽的抗體的配 置是任意的。
這些芯片可用于例如上述的癌癥的診斷。樣本可以是患部組織、 例如血液和淋巴液的體液、或腸黏膜。優(yōu)選樣本是外周血。例如，當 分析對象是CDR3多核苷酸時，按常規(guī)方法從細胞中提取核酸，使用
31固定了包含與序列號1-1695中示出的核苷酸序列互補的核苷酸序列 的所有的多核苷酸的芯片，可以考察樣本中存在的雜交DNA的種類和 量。另外，例如，當分析對象是CDR3肽時，使用固定了抗體的芯片， 可以考察樣本中存在的特異性結(jié)合的肽的種類和量，所述抗體是特異 性地識別并結(jié)合包含序列號1696-3389中示出的氨基酸序列的所有種 類肽的抗體。
在這方面，本發(fā)明提供特異性地識別CDR3肽并與其結(jié)合的抗體。 優(yōu)選這類抗體是特異性地識別并結(jié)合序列號1696-3389中示出的任意 氨基酸序列的抗體。準備這樣的抗體的方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說 是眾所周知的。
典型地，樣本中的DNA或芯片上的DNA序列被標記以指示雜交 的有無和雜交量。例如，可以通過使抗序列號1696-3389的CDR3肽 的各抗體在芯片上排列，考察其與樣本中的CDR3肽的特異性結(jié)合， 來鑒定樣本中的CDR3肽的存在與否以及種類。典型地，樣本中的肽 或芯片上的抗體被標記，以使可以判定特異性結(jié)合的存在與否。能夠 表示雜交或特異性結(jié)合的存在與否以及量的標記是已知的，包括例如 熒光標記、放射性標記、酶標記和發(fā)色團標記。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可 以方便地選擇合適的標記。同時，通過使用上述芯片，可以通式分析 多種樣品。
本發(fā)明的CDR3多核苷酸和CDR肽可以使用諸如DNA印跡法、 RNA印跡法、菌落雜交和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)等已知的方法以 及利用上述芯片來進行分析和鑒定。
如上所述，本發(fā)明的CDR3 DNA序列已使用實施例中所示的引物、 特別是表l所示的引物組來判定。因此，本發(fā)明提供用于擴增CDR多 核苷酸的引物，該引物具有選自序列號3389-3416中示出的序列的序 列。例如，含有序列號3391-3415中所示的引物的引物組可用于CDR3 核苷酸的擴增。
本發(fā)明還提供含有用于檢測具有CDR3多核苷酸或CDR3肽的 WT1特異性CTL的手段的、用于診斷癌癥的試劑盒、用于測試患者對 WT1肽免疫療法的敏感性的試劑盒、或用于監(jiān)測WT1肽免疫療法的 試劑盒。本發(fā)明還提供含有用于檢測具有CDR3多核苷酸或CDR3肽 的WT1特異性CTL的手段的、用于診斷癌癥的裝置、用于測試患者對WT1肽免疫療法的敏感性的裝置、或監(jiān)測WT1肽免疫療法的裝置。 諸如上述的引物組的用于擴增基因的部件、上述的芯片、或用于分才斤 從芯片獲得的信息的手段可作為構(gòu)成成份用于該試劑盒中、或用于該 裝置中。
在另一方面，本發(fā)明涉及來自HLA-A*2402陽性癌癥患者的淋巴 細胞，該淋巴細胞引入了含有CDR3多核苷酸序列的T細胞受體基因。 優(yōu)選該淋巴細胞是外周血淋巴細胞，該外周血淋巴細胞引入了含有本 發(fā)明的CDR3多核苷酸的WT1特異性CTL的TCR的Vp鏈基因、以 及WT1特異性CTL的TCR的Va鏈基因。在制備這樣的外周血淋巴 細胞時，使用這些WT1特異性CTL的TCR的VP鏈的單種基因而可 以獲得多種的外周血淋巴細胞，而它們又依次被引入到患者身上。然 而，從改善治療效果的觀點考慮，優(yōu)選使用WT1特異性CTL的TCR 的Vp鏈的多種基因來獲取多種的外周血淋巴細胞，并將它們引入到患 者身上。或者，優(yōu)選根據(jù)個人的情況選擇引入的合適基因的核苷酸序 列，因為治療有效的基因中的核苷酸序列可能根據(jù)患者和癌癥種類而 有所不同。
制備要引入的基因的方法和將基因引入外周血淋巴細胞的方法在 本領(lǐng)域是已知的。例如，可以將要引入的基因整合到合適的載體然后 再引入到合適的細胞，或者可以通過生物射彈轟擊和電穿孔等而引入 到合適的細胞。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以適當選擇基因轉(zhuǎn)移和細胞培養(yǎng) 的其他條件。
如上所述將引入了基因的淋巴細胞在患者體外進行培養(yǎng)，可以獲 得大量的WT1特異性CTL。然后，通過將獲得的CTL引入到癌癥患 者中，可以殺滅表達WT1的肺瘤細胞，從而進行癌癥治療。優(yōu)選引入 所得的CTL的患者與獲得外周血淋巴細胞的患者是同一人。
上述的癌癥治療可并用包括抗癌藥物及放射治療的其他的癌癥治 療。上述的癌癥治療適用于廣泛的癌癥。在上面它們是例舉性的而不 是限制性的。
在另一個方面，本發(fā)明提供抗CDR3肽的抗體及其使用方法。制 備這樣的抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。這種抗體可以用于檢測 或鑒定主體樣本中的淋巴細胞，該淋巴細胞在Vp鏈中具有本發(fā)明的 CDR3肽的氨基酸序列或包含上述序列的氨基酸序列。例如，抗含有序列號1696-3389的任意氨基酸序列的肽的抗體可用于檢測或鑒定癌癥 特異性淋巴細胞。這些抗體也可用于執(zhí)行本發(fā)明的方法，例如，用于 診斷癌癥的方法。
這種抗體還可以與具有本發(fā)明的CDR3氨基酸序列的淋巴細胞接 觸以激活它們。這樣，激活的淋巴細胞可用于治療癌癥。優(yōu)選激活從 癌癥患者處取得的淋巴細胞，根據(jù)需要使增生，通過將淋巴細胞返給 患者來進行癌癥治療。這種抗體還可以用來富集目標WT1特異性T細 胞。例如，這種抗體可以用來富集癌癥患者中的WT1特異性T細胞， 從而輔助癌癥治療。
在另一方面，本發(fā)明提供用于確定實體癌癥的位置和大小的方法， 該方法包括在上述本發(fā)明的外周血、淋巴細胞^皮標i己可檢測標記后對 患者給藥，然后檢查標記的位置和量。該標記可以是已知的標記，如 锝-99等放射性標記以及熒光標記。用于標記細胞的方法也是已知的。 標記的檢測和信號的定量也是本領(lǐng)域已知的，它們可以通過4吏用輻射 計數(shù)器、熒光測定、或者采用活組織檢查取得組織標本來進行。
下面參考實施例對本發(fā)明進行更詳細的說明，但應(yīng)該認識到，本 發(fā)明不限于此。
實施例1
A:實驗方法及使用材料 (l)細胞
從5位健康志愿者(HV1至HV5)和4位HLA-A*2402陽性AML患 者(AML1至AML4)處取得外周血樣本。從5位HLA-A*2402陽性MDS 患者(MDS1至MDS5)處取得骨髓樣本和外周血樣本。更具體地說，對 AML1,外周血是在治療前和治療開始后的第4、 8、 12、 42周獲得的。 對AML2，外周血是在治療前和治療開始后的第4、 8、 12、 42周獲得 的。對AML3，外周血是在治療前和治療開始后的第4、 8周獲得的。 對AML4，外周血是在治療前和治療開始后的第4周獲得的。對MDS1， 在治療前獲得骨髓和外周血；在治療開始后的第4、 8、 12周獲得外周 血。對MDS2至MDS5，收集治療前的外周血和骨髓。將所得的外周 血樣本供于使用Ficoll-Hypaque(法瑪西亞，烏普薩拉，瑞典)的密度梯 度離心分離，來分離外周血單核細胞(PBMC)，并在4吏用前冷凍儲存在
34-170。C。用WT1肽免疫療法對上述患者進行治療。在治療中使用的WT1肽的氨基酸序列是Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu (序列號3390)。該肽以兩周間隔通過皮內(nèi)注射而給藥。
(2) 流式細胞術(shù)分4斤和分選
首先，將每一樣本2x106個的PBMC在FACS緩沖液(含2。/。胎牛血清的PBS)中用PE接合HLA-A*2402-WT1 235-243四聚體(筒稱MBL，東京，日本)在37。C下染色30分鐘。隨后，用下面所述的5種顏色的熒光染料標記的單克隆抗體，在黑暗中且在冰上染色25分鐘FITC-標記抗-CD4、 CD14、 CD16、 CD19和CD56、抗-CD3國PerCP、 抗曙CD8-APC-Cy7(BD生物科學(xué)公司，圣何塞，加利福尼亞)、抗-CD45RA-APC和抗-CCR7-PE-Cy7(BD Pharmingen公司，圣地亞哥，加利福尼亞州)。將染色的細胞用FACS緩沖液洗滌兩次。使用FACSAria裝置(BD生物科學(xué))進行分選，使用FACSDiva軟件(BD生物科學(xué))進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果，從CD4-CD14-CD16-CD19-CD56-細胞部分(fraction)中獲得了單一的HLA-A*2402-WT1 235-243四聚體+003+€08+細胞，它們凈皮定義為WT1 -Tet+細胞。
(3) 從分選的單一細胞合成TCR-P鏈的cDNA為了消除DNA污染，進行充分的單一細胞的RT-PCR,進行了
cDNA合成，PCR的所有的步驟都在不同的潔凈臺中進行。在加入了15 jil的cDNA反應(yīng)混合物的PCR管中直接分選單一 WTl-Tet+細胞。該cDNA反應(yīng)混合物在溶解緩沖液(包含0.5 % Triton X-IOO的IX cDNA緩沖液)中包括以下成分反轉(zhuǎn)錄酶(SuperScriptIII，Invitrogen，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)、0.5mM dNTPs(Invitrogen公司)、20個單位(U)的RNA酶抑制劑(Invitrogen公司)、100 ng/ml的明膠(Roche，印第安納波利斯，印第安納州)、100 ng/ml的tRNA(Roche)以及200nM的TCR-p鏈恒定區(qū)特異性引物(5，-CACCAGTGTGGCCTTTTG-3'(序列號3391))。分選后，將樣本在50。C下孵育卯分鐘用于cDNA合成，然后在95。C下孵育5分鐘用于終止反應(yīng)。
(4) 半嵌套式多重PCR反應(yīng)
將通過上述工序得到的10 fil的合成cDNA產(chǎn)物添加到40pl的反應(yīng)混合物中。該反應(yīng)混合物包括1XPCR緩沖液、2mM的氯化鎂、0.25mMdNTPs、 1.25 U DNA聚合酶(Platinum Taq DNA Polymerase,200880013436.7
說明書第33/36頁
Invitrogen)、 5 nM的24種不同的Vp族特異性正向引物的混合物(如表1所示)以及5nM的3'-Cp反向引物
(5'-GCTTCTGATGGCTCAAACACAGC-3，(序列號3392))。 PCR的工序如下在95。C下預(yù)PCR加熱工序2分鐘，隨后是40循環(huán)的95。C下45秒的改性工序、57°C下45秒的退火工序以及72°C下50秒的延伸工序。[表l
S2TRBV2GGTCACACAGATGGGACAGGAAGT (序列號3393 )
S2TRBV3CCCAGACTCCAAAATACCTGGTCA (序歹'J號3394 )
S5TRBV4TACGCAGACACCAA<GA>ACACCTGGTCA (序列號3395 )
SlTRBV5ACAGCAAGTGAC<TAG>CTGAGATGCTC (序列號3396 )
S7TRBV6GTGTCACTCAGACCCCAAAATTCC (序列號3397 )
S4TRBV7-1GTGTGATCCAATTTCAGGTCATAC (序列號3398 )
S3TRBV7-3ATGTAACT<CT>TCAGGTGTGATCCAA (序列號3399 )
SlTRBV9ACAGCAAGTGAC<TAG>CTGAGATGCTC (序列號3400 )
SlTRBV10CCAAGACACAAGGTCACAGAGACA (序歹'J號3401 )
S4TRBV11CAGTCTCCCAGATATAAGATTATAGAG (序列號3402 )
S4TRBV12GGTGACAGAGATGGGACAAGAAGT (序列號3403 )
S8TRBV13CTGATCAAAGAAAAGAGGGAAACAGCC (序列號3404 )
S6TRBV14ATAGAAGCTGGAGTTACTCAGTTC (序列號3405 )
S8TRBV15CAAGATACCAGGTTACCCAGTTTG (序列號3406 )
S5TRBV18TGCAGAACCCAAGACACCTGGTCA (序列號3407)
S5TRBV19CACTCAGTCCCCAAAGTACCTGTT (序列號3408 )
S2TRBV20GAGTGCCGTTCCCTGGACTTTCAG (序列號3409 )
S6TRBV21AAGGTCACCCAGAGACCTAGACTT (序列號3410 )
S6TRBV23ACAAAGATGGATTGTACCCCCGAA (序歹'J號3411)
S7TRBV24GTTACCCAGACCCCAAGGAATAGG (序歹'J號3412 )
SlTRBV25GATCACTCTGGAATGTTCTCAAACC (序列號 3413 )
S3TRBV27GTGACCCAGAACCCAAGATACCTC (序歹'J號3414 )
S2TRBV28GTAACCCAGAGCTCGAGATATCTA (序歹'J號3415 )
S3TRBV29TCCAGTGTCAAGTCCATAGCCAAGTC (序歹'J號3416)
S5TRBV30GTCAGATCTCAGACTATTCATCAATGG (序歹'J號3417 )
接下來，將上述PCR產(chǎn)物供于篩選PCR。將上述PCR產(chǎn)物ljil分別置于8才艮單獨的管中，將24jil的反應(yīng)混合物加到每一個管中。該反應(yīng)混合物包含1XPCR緩沖液、2mM氯化鎂、0.2mMdNTPs、 1.0 U鉑Taq DNA聚合酶、選自表1所示的8個篩選組Sl至S8中的一組正向引物組、以及5'-Cp反向引物
(5'國GGAACACGTTTTTCAGGTCCT-3'(序列號3418))(各150nM)。PCR的工序如下在95。C下預(yù)PCR加熱工序2分鐘，隨后是35循環(huán)的94。C下45秒的改性工序、57。C下45秒的退火工序以及72。C下40秒的延伸工序。
為確認在該8個篩選PCR中的陽性反應(yīng)，將5^il的各篩選PCR產(chǎn)物供于2%瓊脂糖凝膠電泳。接著進行進一步PCR。該PCR使用各150nM的包含在被確認是陽性的篩選組中的Vp特異性正向引物進行35個循環(huán)。由2%瓊脂糖凝膠電泳確認了陽性反應(yīng)。使用無細胞系統(tǒng)以與上相同的方式制備三個孔用作陰性對照，以同樣的工序進行實驗。(5)TCR-p的互補性決定區(qū)域3(CDR3)的序列的確定和分析使用PCR純化試劑盒(kit)(Qiagen,瓦倫西亞，加利福尼亞州)對擴增的TCR-P基因片段進行純化。使用對應(yīng)的TCRVp特異性正向引物進4亍測序。ABI PRIAM BigDie Terminator v 3.1循環(huán)測序試劑盒(Applied Biosystems，福斯特市，加利福尼亞州，美國)被用于測序，ABI PRISM 3100遺傳分析儀(Applied Biosystems)被用于分析。CDR3上的序列數(shù)據(jù)通過將序列與那些從IMGT人類TCR基因數(shù)據(jù)庫(http:〃imgtcines.fr)中得到的序列進行比較來分析。
B.結(jié)果
在圖1-1至1-36中示出了從健康者和癌癥患者(AML1到AML4、MDS1到MDS5)獲得的WT1特異性CTL的Vp鏈基因的序列、J區(qū)序列、D區(qū)序列、N區(qū)序列、CDR3核苦酸序列和CDR3氨基酸序列。在圖2-1至2-36中示出了各WT1特異性CTL的克隆能力。CDR3核苷酸序列示于序列號l-1695(因為克隆# 24.29和# 28.92有相同的CDR3核苷酸序列，所以在序列表中只示出了克隆#24.29)， CDR3氨基酸序列在序列號1696-3389中示出(因為克隆# 2.53和#28.58有相同的CDR3氨基酸序列、以及克隆# 24.29和# 28.92有相同的CDR3氨基酸序列，所以在序列表中只示出了克隆#2.53和#24.19)。在AML患者中，AML1和AML2對治療有反應(yīng)，但AML3和AML4沒有。沒有判定MDS患者對治療的反應(yīng)。
從圖2-1至2-36可知，在健康者(HV1到HV4)中，對幾乎所有的克隆來說，具有任意CDR3多核苷酸或CDR3肽的WT1特異性CTL的克隆能力是l,對極少的克隆是2或3;然而，在治療前所有的癌癥患者(AML和MDS)中，具有任意CDR3多核苷酸或CDR3肽的WT1
37特異性CTL的克隆能力均為多重。與健康人相比，克隆能力的數(shù)目更大，這樣的細胞種類也更多。
治療前患者中的克隆能力的增加、以及具有多重克隆能力的細胞的種類的增加，表明了在患者體內(nèi)對癌細胞的防護與攻擊已經(jīng)開始的可能性，提示了癌細胞可能已經(jīng)存在于患者體內(nèi)。
還有，從圖2-1至2-36可知，對WT1肽免疫療法有反應(yīng)的AML患者比正常人和無反應(yīng)患者有更多的具有多重克隆能力的克隆的種類。AML1(反應(yīng)者)10種(總克隆能力為58); AML2(反應(yīng)者)12種(總克隆能力為93); AML3(無反應(yīng)者)9種(總克隆能力為27);和AML4(無反應(yīng)者)3種(總克隆能力為10)。健康人HVl-5中具有多重克隆能力的克隆種類為0至2種的范圍。
在治療前已經(jīng)有多重克隆能力的克隆，傾向于通過WT1肽免疫療法進一步增加克隆能力、或保持其克隆能力。還認為，當有盡可能多種類的克隆，使得在總體上有效的WT1特異性CTL克隆的數(shù)目和種類增加時，WT1免疫療法更可能成功。
從圖2-1到2-36可知，發(fā)現(xiàn)了在AML患者中在WT1肽免疫療法期間克隆能力暫時或持續(xù)增加的WT1特異性CTL(包括克隆能力從O上升到l以上的情況)。表現(xiàn)出這種行為的示例性克隆包括來自AML(患者1-反應(yīng)者)的克隆# 02.28、 #05.034、 #05.135、 #05.219、#09.65、 #12.04、 #13.13、 # 27.016和# 28.83;以及來自AML(患者2-反應(yīng)者)的克隆#02.27、 #05.035、 #05.141、 #05.219、 #06.009、 #12.04、 #12.20、 #15.44、 # 20.068和#27.032。例如，從來自AML患者1的克隆#02.28的克隆能力的變化，發(fā)現(xiàn)在治療初期和第4周的治療效果大。
認為某些克隆的克隆能力的增加，顯示出WT1肽免疫療法在一定期間奏效。如果某些克隆的克隆能力暫時增加而之后下降，那么其他克隆的克隆能力將增加以補充效果?？紤]到對癌細胞的效果，更希望克隆能力有較大的增加。因此，在WT1肽免疫療法之后，克隆能力的增加比例越大、或具有增加的克隆能力的克隆的種類越多，則可以判定患者對WT1肽免疫療法的反應(yīng)性越高。
工業(yè)適用性本發(fā)明可提供有用的抗癌治療用藥物、癌癥測試試劑盒或試劑、用于癌癥研究的試劑等。因此，本發(fā)明可在癌癥治療用的藥物、癌癥測試試劑盒或試劑、以及癌癥研究等領(lǐng)域得以應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.多核苷酸，該多核苷酸具有編碼WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)的Vβ鏈的CDR3的核苷酸序列，其中，該多核苷酸具有DNA、與該DNA互補的RNA、或它們的互補序列，所述DNA具有序列號1-1695中示出的任意的CDR3核苷酸序列。
2. 權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸由DNA、其 互補的RNA、或它們的互補序列組成，所述DNA包含序列號1-1695 中示出的任意的CDR3核苷酸序列。
3. 肽，該肽具有WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體 (TCR)的Vp鏈的CDR3的氨基酸序列，其中，該肽具有序列號 1696-3389中示出的任意的CDR3氨基酸序列。
4. 權(quán)利要求3所述的肽，該肽由序列號1696-3389中示出的任意 的CDR3的氨基酸序列組成。
5. 權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸或者權(quán)利要求3或4所述的肽 作為癌標記的用途。
6. 診斷HLA-AA2402陽性患者中的癌癥的方法，該方法包括評估 在治療前從所述患者處取得的樣本中的WT1特異性CTL克隆能力， 所述WT1特異性CTL具有權(quán)利要求1或2所述的任意的多核苷酸或 者權(quán)利要求3或4所述的任意的肽，其中，當具有多重克隆能力的WT1 特異性CTL存在時，判定該患者有患癌癥的可能性。
7. 權(quán)利要求6所述的方法，其中，在治療前的患者中當具有任意 的CDR3多核苦酸或任意的CDR3肽且具有3以上的克隆能力的WT1 特異性CTL的克隆能力越大、或者當具有3以上的克隆能力的WT1 特異性CTL的種類越多時，判定該患者患癌癥的可能性越高。
8. 檢測HLA-A* 2402陽性患者對WT1肽免疫療法的敏感性的方 法，該方法包括評估在治療前從所迷患者處取得的樣本中的WT1特異 性CTL的克隆能力和種類數(shù)，所述WT1特異性CTL具有權(quán)利要求1 或2所述的任意的多核苷酸或者權(quán)利要求3或4所述的任意的肽，其 中，當所述患者中具有多重克隆能力的WT1特異性CTL的種類比對 WT1肽免疫療法無反應(yīng)的主體中更多時，判定該患者對WT1肽免疫 療法具有敏感性。
9. 權(quán)利要求8所述的方法，其中，在治療前的患者中當具有多重克隆能力的WT1特異性CTL克隆的種類越多或者克隆能力越大時， 判定該患者對WT1肽免疫療法的敏感性越高。
10. 監(jiān)測HLA-A* 2402陽性患者中的WT1肽免疫療法的方法，該 方法包括評估在治療前和治療后從所述患者處取得的樣本中的WT1特 異性CTL克隆的克隆能力，所述WT1特異性CTL克隆具有權(quán)利要求 1或2所述的任意的多核苦酸或者權(quán)利要求3或4所述的任意的肽，其 中，當任意WT1特異性CTL克隆的克隆能力在治療后比治療前增加 時，判定該患者對WT1肽免疫療法有反應(yīng)。
11. 權(quán)利要求10所述的方法，其中，在WT1肽免疫療法之后，當 克隆能力的增加率越大、或者具有增加的克隆能力的克隆的種類越多 時，判定患者對WT1肽免疫療法的反應(yīng)性越高。
12. 抗體，該抗體抗權(quán)利要求3或4所述的肽。
13. 芯片，該芯片含有權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸、權(quán)利要求 3或4所述的肽、或者權(quán)利要求12所述的抗體。
14. CDR3多肽擴增用引物，該引物具有選自序列號3389-3416中 所示序列中的序列。
15. 用于診斷癌癥的試劑盒、用于檢測患者對WT1肽免疫療法的 敏感性的試劑盒、或用于監(jiān)測WT1肽免疫療法的試劑盒，所述試劑盒 包括用于檢測具有權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸或者權(quán)利要求3或4 所述的肽的WT1特異性CTL的手段。
16. 用于診斷癌癥的裝置、用于檢測患者對WT1肽免疫療法的敏 感性的裝置、或用于監(jiān)測WT1肽免疫療法的裝置，所述裝置包括用于 檢測具有權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸或者權(quán)利要求3或4所述的肽 的WT1特異性CTL的手段。
17. 權(quán)利要求15所述的試劑盒，該試劑盒包括權(quán)利要求13所述的 芯片或權(quán)利要求14所述的引物。
18. 權(quán)利要求16所述的裝置，其中在裝置中使用權(quán)利要求13所述 的芯片或權(quán)利要求14所述的引物。
19. HLA-A* 2402陽性癌癥患者的淋巴細胞，所述淋巴細胞中引入 了含有權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸序列的T細胞受體基因。
全文摘要
本發(fā)明提供對WT1蛋白的WT1特異性細胞毒性T細胞(CTL)的T細胞受體(TCR)基因的CDR3區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列；使用這些核苷酸序列或氨基酸序列來檢測或治療癌癥的方法；用于檢測含有這些核苷酸序列或氨基酸序列的癌癥的芯片、引物組、試劑盒、裝置等。
文檔編號C12N15/00GK101668853SQ20088001343
公開日2010年3月10日 申請日期2008年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月5日
發(fā)明者杉山治夫 申請人:株式會社癌免疫研究所