專利名稱：：低溫和/或低pH值在細(xì)胞培養(yǎng)中的使用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供對通過培養(yǎng)細(xì)胞、尤其哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)進(jìn)行改良的方法。具體地說，本發(fā)明涉及制備蛋白質(zhì)產(chǎn)物(例如糖蛋白產(chǎn)物)的方法，其中通過操縱細(xì)胞培養(yǎng)物環(huán)境來控制蛋白質(zhì)產(chǎn)物特征。本發(fā)明也涉及通過降低細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度和/或pH值來操縱蛋白質(zhì)糖基化且減少蛋白質(zhì)聚集和錯誤折疊，從而改良在例如哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)物(例如糖蛋白產(chǎn)物)的治療功效和/或免疫原性的方法。
背景技術(shù)：
：大部分市售的或在研制中的生物技術(shù)產(chǎn)物為蛋白質(zhì)治療劑。對于在動物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生蛋白質(zhì)和涉及所述產(chǎn)生的改良方法的需求較大，并逐漸增長。因為通常需要動物細(xì)胞的細(xì)胞機(jī)構(gòu)來產(chǎn)生多種形式的蛋白質(zhì)治療劑，例如經(jīng)翻譯后修飾的蛋白質(zhì)，尤其糖基化蛋白質(zhì)，所以需要所述改良方法。在大規(guī)模的治療性蛋白質(zhì)產(chǎn)生方法中遇到的常見問題是，大部分的蛋白質(zhì)產(chǎn)物以錯誤折疊或聚集形式(即，以高分子量聚集物("HMWA")形式)產(chǎn)生。舉例來說，多肽在細(xì)胞中的重組性過度表達(dá)可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)機(jī)構(gòu)超負(fù)荷，從而使得越來越多的錯誤折疊的蛋白質(zhì)和/或聚集蛋白質(zhì)避開降解途徑并離開ER。因此，當(dāng)前蛋白質(zhì)產(chǎn)生方法可產(chǎn)生大量聚集的無功能且由此無法以原樣使用的產(chǎn)物。錯誤折疊的蛋白質(zhì)和/或聚集蛋白質(zhì)的存在是不合需要的，這是因為其可導(dǎo)致在投藥后出現(xiàn)不良事件，包括(但不限于)可能在投藥后出現(xiàn)免疫原性(例如補(bǔ)體激活或過敏反應(yīng))。因此，過多的治療性蛋白質(zhì)錯誤折疊和/或聚集可能導(dǎo)致例如臨床試驗失敗。因此，此項技術(shù)中需要限制或減少蛋白質(zhì)錯誤折疊和/或聚集的新方法。蛋白質(zhì)糖基化是常見的翻譯后修飾過程，其中通過ER中的一系列專用酶(即糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶)的作用將復(fù)合糖部分添加到蛋白質(zhì)上。這一過程可控制新合成的多肽的適當(dāng)折疊，使得僅正確折疊的多肽離開ER，而錯誤折疊的蛋白質(zhì)則降解。蛋白質(zhì)糖基化模式會影響蛋白質(zhì)靶向輸送、結(jié)構(gòu)、熱力學(xué)穩(wěn)定性和酶活性(參見例如索拉(Soli)等人(2007)細(xì)胞和分子生命科學(xué)(Cell.Mol.LifeSci.)64:2133-52;索拉(Sol"和格力博諾(Griebenow)(2006)歐洲生物化學(xué)會聯(lián)盟期刊(FEBSLett.)580:1685-90)。舉例來說，N-聚糖唾液酸化可能導(dǎo)致糖蛋白壽命增加，這是因為靶向未唾液酸化的蛋白質(zhì)以供降解的去唾液酸糖蛋白受體無法識別所述糖蛋白(參見例如博克(Bork)等人(2007)歐洲生物化學(xué)會聯(lián)盟期刊(FEBSLetters)581:4195-98)。因此，蛋白質(zhì)糖基化的改變可影響產(chǎn)物的質(zhì)量和功效。此外，異常蛋白質(zhì)糖基化可導(dǎo)致最終治療性蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫原性。在非天然的次優(yōu)條件下產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可獲得人類蛋白質(zhì)上無法天然發(fā)現(xiàn)的糖和糖模式，且由此導(dǎo)致個體的免疫原性反應(yīng)(杰佛瑞(Jefferis)(2006)生物技術(shù)進(jìn)展(Biotechnol.Prog.)21:11-16)。所述非天然糖基化在蛋白質(zhì)治療劑中尤其普遍，例如抗體治療劑或Fc融合蛋白治療劑，例如可溶性受體Fc融合蛋白治療劑。由于這些原因，F(xiàn)DA要求將治療性蛋白質(zhì)的糖型概況維持在嚴(yán)格限度內(nèi)。因此，在制藥工業(yè)中需要一種在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)的方法，其使得能夠控制蛋白質(zhì)糖基化水平。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明為一種在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包含以下至少一個步驟(a)在較低的溫度下，使細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長；和(b)在較低的pH值下，使細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長；以便減少錯誤折疊的蛋白質(zhì)和/或聚集蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。在實(shí)施例中，在較低的溫度下且在較低的pH值下，使細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長。在優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明涉及改變pH值和溫度參數(shù)以在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物且尤其中國倉鼠卵巢("CHO")細(xì)胞培養(yǎng)物中減少錯誤折疊的蛋白質(zhì)和/或聚集蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。在優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生為可溶性受體的蛋白質(zhì)("所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)")，例如(不限于)TNFR-Fc或sIL-13R蛋白質(zhì)。在這些優(yōu)選實(shí)施例中，所述較低的溫度可在27.(TC到低于30.(TC的范圍內(nèi)。在其它的優(yōu)選實(shí)施例中，所述較低的pH值在6.80到小于7.00的范圍內(nèi)。也可使用在上述范圍內(nèi)的pH值和溫度的組合。另一方面，本發(fā)明為一種在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其中通過改變細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度和/或pH值來控制所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)糖基化水平。因此，可通過增加溫度和/或pH值來增加糖基化(例如(不限于)N-聚糖唾液酸化)水平，或通過降低溫度和/或pH值來降低糖基化水平。另一方面，本發(fā)明為一種通過控制上述參數(shù)來產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)的方法。另一方面，本發(fā)明為一種包含由所述方法制備的治療性蛋白質(zhì)和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑的醫(yī)藥組合物。圖1A表示在27.0°CW、28.0。C[A]、29.0°C[國]或30.0°C[o]下生長的經(jīng)TNFR-Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的總活細(xì)胞數(shù)目(Y軸；IVC[歸一化的69細(xì)胞*日/升])(歸一化為平均采集日IVC)與時間(X軸；培養(yǎng)時間以日[d]為單位)的關(guān)系；圖1B表示相同細(xì)胞的細(xì)胞活力(Y軸)與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖2A表示在27.0。C[令]、28.0。C[A]、29.0°C一]或30.0'C[o]下生長的經(jīng)TNFR-Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中的殘留葡萄糖概況(Y軸；葡萄糖[g/L])與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系；圖2B表示相同細(xì)胞的谷氨酰胺概況(Y軸；谷氨酰胺[mM])與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖3A表示在27.(TC[令〗、28.0。C[A〗、29.0。C[麗]或30.0。C[o]下生長的經(jīng)TNFR-Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中的乳酸鹽濃度(Y軸；乳酸鹽[g/L])與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系；圖3B表示相同細(xì)胞的銨概況(Y軸；NH4+[mM])與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖4A描述在27.0°C|>]、28.0°C|>]、29.0°C|>]或30.0°C[o]下生長的經(jīng)TNFR-Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的由累積平均Qp(X軸；累積平均Qp[歸一化的毫克/e9細(xì)胞/日])表示的細(xì)胞比生產(chǎn)率(歸一化為平均采集日累積平均Qp)與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系；而圖4B表示相同細(xì)胞的TNFR-Fc滴度(X軸；產(chǎn)物滴度[歸一化的mg/L])(歸一化為平均采集日滴度)與時間(培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖5A中顯示改變經(jīng)TNFR-Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中的生長溫度(X軸；[°C])對于錯誤折疊和/或聚集TNFR-Fc的產(chǎn)量(Y軸；錯誤折疊產(chǎn)物/聚集產(chǎn)物％)的影響；而圖5B中顯示溫度對于HMWA的產(chǎn)量(Y軸；高分子量物質(zhì)％)的影響。圖6A中顯示改變經(jīng)TNFR-Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中的生長溫度(X軸；溫度['C])對于TNFR-Fc的總唾液酸化(N-和O連接的唾液酸化)的百分率(Y軸；參考物質(zhì)的總唾液酸化的百分率)的影響。所使用的參考物質(zhì)為具有已知且優(yōu)選的糖基化模式的特定等分試樣的TNFR-Fc，檢驗結(jié)果可與所述已知且優(yōu)選的糖基化模式比較。圖6B顯示改變相同細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中的生長溫度(X軸；溫度['C])對于總唾液酸化(口)或未唾液酸化()N連接聚糖的百分率(Y軸；總N連接聚糖的百分率)的影響。圖7顯示在不同溫度(27.0'C[命]、28.(TC[A]、29.0。C[國]或30.0°C[o])下使細(xì)胞生長對于CHO細(xì)胞培養(yǎng)物的pH值的影響(Y軸)與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖8A表示在7.20[O]、7.10[醒]、7.00[令]、6.90[]或6.80[A]pH值設(shè)定點(diǎn)下生長的經(jīng)TNFR-Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的總活細(xì)胞數(shù)目(Y軸；IVC[歸一化的69細(xì)胞*日/升])(歸一化為平均采集日IVC)與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系；而圖8B表示相同細(xì)胞的細(xì)胞活力(Y軸)與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖9A表示在7.20[^]、7.10[國]、7.00[令]、6.90[*]或6.80[A]pH值設(shè)定點(diǎn)下生長的經(jīng)TNFR-Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的葡萄糖概況(Y軸；葡萄糖[g/L])與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系；而圖9B表示相同細(xì)胞的谷氨酰胺概況(Y軸；谷氨酰胺)與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖10A表示在7.20[^]、7.10[]、7.00[令]、6.90[*]或6.80[A]pH值設(shè)定點(diǎn)下生長的經(jīng)TNFR-Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中的乳酸鹽濃度(Y軸；乳酸鹽)與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系；而圖IOB表示相同細(xì)胞的銨概況(Y軸；NH4+[mM])與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖IIA表示在7.20[O]、7.10[司、7.00[令]、6.90[]或6.80[A]pH值設(shè)定點(diǎn)下使經(jīng)TNFR-Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞生長時細(xì)胞培養(yǎng)物的pH值與pH值設(shè)定點(diǎn)的偏差(X軸；培養(yǎng)物的pH值)與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖IIB表示在7.20[O]、7.10[國]、7.00[令]、6.90[]或6.80[A]pH值設(shè)定點(diǎn)下生長的相同細(xì)胞的摩爾滲透壓濃度(X軸；摩爾滲透壓濃度[mOsm/kg])與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖12A表示在7.20[O]、7.10[國]、7-00[令]、6.90[*]或6.80[A]pH值設(shè)定點(diǎn)下生長的經(jīng)TNFR-Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的由累積平均Qp(X軸；Cum.Avg.Qp[歸一化的毫克/^細(xì)胞/日])表示的細(xì)胞比生產(chǎn)率(歸一化為平均采集日累積平均Qp)與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系；而圖12B表示相同細(xì)胞的TNFR-Fc滴度(X軸；產(chǎn)物滴度[歸一化mg/L])(歸一化為平均采集日滴度)與時間(培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖13A表示改變經(jīng)TNFR-Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)物的pH值設(shè)定點(diǎn)(X軸；pH值)對于錯誤折疊/聚集TNFR-Fc的產(chǎn)量(Y軸；錯誤折疊產(chǎn)物/聚集產(chǎn)物％)的影響。圖13B表示改變細(xì)胞培養(yǎng)物的pH值設(shè)定點(diǎn)(X軸；pH值)對于HMWA的產(chǎn)量(Y軸；高分子量物質(zhì)％)的影響。圖14A中顯示改變經(jīng)TNFR-Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)物中的pH值設(shè)定點(diǎn)(X軸；pH值)對于TNFR-Fc的總唾液酸化的百分率(Y軸；參考物質(zhì)的總唾液酸化的百分率)的影響。圖14B顯示改變相同細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞培養(yǎng)物pH值設(shè)定點(diǎn)(X軸；pH值)對于總唾液酸化(□)或未唾液酸化()N連接聚糖的百分率(Y軸；總N連接聚糖的百分率)的影響。圖15描述如通過使肼釋放的2-氨基苯甲酰胺-(2-AB)-標(biāo)記的蛋白質(zhì)糖型經(jīng)受正相色譜所觀察到的描述N連接聚糖唾液酸化的典型熒光(Y軸；熒光以mV為單位測量)相較于保留時間(X軸；分鐘)的概況。圖16描述如通過經(jīng)TNFR-Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物在培養(yǎng)物的不同pH值設(shè)定點(diǎn)下使肼釋放的2-氨基苯甲酰胺-(2-AB)-標(biāo)記的蛋白質(zhì)糖型經(jīng)受正相色譜所觀察到的描述N連接聚糖唾液酸化的熒光(Y軸；mV)相較于保留時間(X軸；分鐘)的概況。圖17表示在37.0。C[令]、33.0。C[園]、32.0°C[,]、31.0°C[O]、29.0。C[A]或RT[口]下生長的過度表達(dá)sIL-13R的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的(A)活細(xì)胞密度(Y軸；細(xì)胞/毫升)、(B)包括活細(xì)胞和非活細(xì)胞的總細(xì)胞密度(Y軸；細(xì)胞/毫升)、(C)細(xì)胞活力(Y軸)和(D)總活細(xì)胞數(shù)目(IVC)(Y軸；^細(xì)胞*日/升)與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖18表示在37.0'C[令]、33.0。C[隱]、32.0°C[*]、31.0°C[O]、29.0。C[A]或RT[口]下生長的過度表達(dá)sIL-13R的細(xì)胞培養(yǎng)物的二聚物和HMWAsIL-13R滴度(Y軸；sIL-13R[mg/L])與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖19A表示在37.0°C、33.0°C、32.0°C、31.0°C、29.0。C或RT下生長的過度表達(dá)sIL-13R的細(xì)胞培養(yǎng)物在各個時段(X軸)期間的每日比sIL-13R生長速率(Y軸；Qp[微克/e9細(xì)胞/日])。圖19B表示在37.0°C、33.0°C、32.0°C、31.0°C、29.0°C或RT下生長的過度表達(dá)sIL-13R的細(xì)胞培養(yǎng)物的累積平均細(xì)胞比生產(chǎn)率(Y軸；Cum.Avg.Qp[毫克/eS細(xì)胞/日])與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖20表示在37.0。C、33.0。C、32.0。C、31.(TC、29.(rC或RT下生長的過度表達(dá)sIL-13R的細(xì)胞培養(yǎng)物的不同時段(X軸)的每日比葡萄糖消耗率(Y軸；Qglc[克/^細(xì)胞/日])。圖21表示在37.0。C、33.0。C、32.0。C、31.0'C、29.0。C或RT下生長的過度表達(dá)sIL-13R的細(xì)胞培養(yǎng)物的不同時段(X軸)的每日比谷氨酰胺消耗率(Y軸；Qglc[毫摩爾/eS細(xì)胞/日])。圖22表示在37.0。C[令]、33,0。C[國]、32.0°C[]、31.0。C[外29.0°C[A]或RT[口]下生長的過度表達(dá)sIL-13R的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中的乳酸鹽濃度(Y軸；乳酸鹽[g/L])與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖23表示在37.0。C[命]、33.0。C[國]、32.0°C[*]、31.0。C[C>]、29.0。C[A]或RT[口]下生長的過度表達(dá)sIL-13R的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中的銨濃度(Y軸；銨[mM])與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖24表示在過度表達(dá)sIL-13R的細(xì)胞的培養(yǎng)第9日，細(xì)胞培養(yǎng)物溫度(X軸；生長溫度['C])對于HMWA產(chǎn)量(Y軸；高分子量物質(zhì)％)的影響。圖25表示在過度表達(dá)sIL-13R的細(xì)胞的培養(yǎng)第18日，細(xì)胞培養(yǎng)物溫度(X軸；生長溫度['C])對于HMWA產(chǎn)量(Y軸；高分子量物質(zhì)％)的影響。圖26A表示由在37.0。C[令]、33.0。C[b]、32.0°C[*]、31.0。C[O]、29.0°C[A]或RT[口]下生長的過度表達(dá)sIL-13R的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中產(chǎn)生的總sIL-13R蛋白質(zhì)回收的sIL-13R二聚物的百分率(Y軸；sIL-13R二聚物。/。)與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖26B表示過度表達(dá)sIL-13R的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中相對于總sIL-13R的HMWA的百分率(Y軸；高分子量物質(zhì)％)與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。圖27表示在37.0。C[令]、33.0。C[國]、32.0°C[*]、31.0°C[O]、29.0。C[A]或RT[口〗下生長的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的sIL-13R二聚物滴度(Y軸；僅sIL-13R二聚物[mg/L])與時間(X軸；培養(yǎng)時間[d])的關(guān)系。具體實(shí)施例方式在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)的普遍常識為，生長階段期間的溫度應(yīng)為至少30.0'C且pH值應(yīng)為至少7.00。然而，在生長階段期間，在高于30.(TC的溫度下且在高于7.00的pH值下使細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長可導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集(在本文中也稱為高分子量聚集物或HMWA形成)和蛋白質(zhì)錯誤折疊增多，且因此產(chǎn)生較少量的功能性可用蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供一種在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的新穎方法，其中所述方法導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯誤折疊減少和/或蛋白質(zhì)聚集減少。另一方面，本發(fā)明提供控制蛋白質(zhì)糖基化水平的方法。由本發(fā)明方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)如本文中所用，短語"多肽"或"多肽產(chǎn)物"分別與術(shù)語"蛋白質(zhì)"和"蛋白質(zhì)產(chǎn)物"同義，且如此項技術(shù)中通常所理解，是指至少一個通過連續(xù)肽鍵連接的氨基酸鏈。在某些實(shí)施例中，"所關(guān)注的蛋白質(zhì)"或"所關(guān)注的多肽"等為由已經(jīng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中(例如瞬時或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中)的外源核酸分子編碼的蛋白質(zhì)。在已轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的外源性DNA編碼"所關(guān)注的蛋白質(zhì)"的某些實(shí)施例中，外源DNA的核酸序列決定氨基酸序列。這一序列可為天然存在的序列，或者可為由人類工程改造的序列。在某些實(shí)施例中，"所關(guān)注的蛋白質(zhì)"為由宿主細(xì)胞的內(nèi)源性核酸分子編碼的蛋白質(zhì)。這類所關(guān)注的內(nèi)源性蛋白質(zhì)的表達(dá)可通過用外源性核酸分子轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞而改變，所述外源性核酸分子可例如含有一個或多個調(diào)節(jié)序列和/或編碼會增強(qiáng)所關(guān)注的蛋白質(zhì)的表達(dá)的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，在例如細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生所關(guān)注的10多肽，隨后進(jìn)行純化。術(shù)語"糖蛋白"、"糖基化蛋白質(zhì)"等是指天冬酰胺側(cè)鏈(N-糖基化)或絲氨酸和/或蘇氨酸側(cè)鏈(O-糖基化)上連接有糖部分(例如寡糖部分)的蛋白質(zhì)。舉例來說，一種常見類型的蛋白質(zhì)N-糖基化為蛋白質(zhì)唾液酸化(也稱為N-聚糖唾液酸化)。ER和/或高爾基體(Golgiapparatus)中的大多數(shù)分泌蛋白和膜蛋白(例如膜受體)經(jīng)糖基化。此項技術(shù)中已知，糖基化可控制ER中的蛋白質(zhì)折疊和釋放。另外，高爾基體中也發(fā)生多個步驟的糖基化/去糖基化。以下文獻(xiàn)中評述目前對于ER和高爾基體中的蛋白質(zhì)糖基化過程的了解海倫尼斯(Helenius)等人(2001)辟學(xué)^c/e"ceJ291:2364-69;帕羅迪(Parodi)(2000)主激眾,學(xué)叛r5/ocAe附.JJ348:1-13;和帕羅迪(Parodi)(2000)主激眾學(xué)年,64""".iev.5z'oc/2emJ69:69-93。因此，在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，所關(guān)注的多肽為所關(guān)注的糖蛋白，且所關(guān)注的糖蛋白是在例如細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生，隨后進(jìn)行純化。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所關(guān)注的糖蛋白為受體，且可能為可溶性受體?？墒褂帽景l(fā)明的方法和組合物來產(chǎn)生所關(guān)注的任何蛋白質(zhì)，包括(但不限于)具有醫(yī)藥性質(zhì)、診斷性質(zhì)、農(nóng)藝性質(zhì)和/或可在商業(yè)、實(shí)驗和/或其它應(yīng)用中使用的各種其它性質(zhì)中的任一性質(zhì)的蛋白質(zhì)。另外，所關(guān)注的蛋白質(zhì)可為蛋白質(zhì)治療劑。換句話說，蛋白質(zhì)治療劑(或治療性蛋白質(zhì))為對于承受作用的身體區(qū)域具有生物效應(yīng)或?qū)τ谕ㄟ^中間物遠(yuǎn)距離地承受作用的身體區(qū)域具有生物效應(yīng)的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中，可加工和/或修飾使用本發(fā)明的方法和/或組合物所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，然后將其作為治療性蛋白質(zhì)投與個體?？墒褂帽景l(fā)明來培養(yǎng)細(xì)胞以有利地產(chǎn)生任何治療性蛋白質(zhì)，例如醫(yī)藥學(xué)上或商業(yè)上相關(guān)的酶、受體、受體融合體、可溶性受體、可溶性受體融合體、抗體(例如單克隆和/或多克隆抗體)、抗體的抗原結(jié)合片段、Fc融合蛋白、SMIP、細(xì)胞因子、激素、調(diào)節(jié)因子、生長因子、凝血因子(coagulation/clottingfactor)或抗原結(jié)合劑。以上蛋白質(zhì)清單事實(shí)上僅為示范性的，且不打算作限制性列舉。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解可根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的其它蛋白質(zhì)，且應(yīng)能夠使用本文中所揭示的方法來產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)。術(shù)語"抗體"包括包含至少一個且通常兩個VH結(jié)構(gòu)域或其部分和/或至少一個且通常兩個VL結(jié)構(gòu)域或其部分的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中，抗體為兩個免疫球蛋白重鏈和兩個免疫球蛋白輕鏈的四聚物，其中免疫球蛋白重鏈和輕鏈通過例如二硫鍵互連?？贵w或其一部分可從任何起源獲得，所述起源包括(但不限于)嚙齒動物、靈長類動物(例如人類和非人類靈長類動物)、駱駝科動物、鯊魚，以及重組產(chǎn)生的抗體，例如嵌合抗體、人類化抗體和/或例如通過所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的方法活體外產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明也涵蓋"抗體的抗原結(jié)合片段"，其包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含兩個在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段；(vi)駱駝科動物或駱駝科動物化可變域，例如VHH結(jié)構(gòu)域；(vii)單鏈Fv(scFv);(viii)雙特異性抗體；和(ix)免疫球蛋白的一個或多個與Fc區(qū)融合的抗原結(jié)合片段。此外，雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH是由獨(dú)立基因編碼，但可使用重組方法由合成連接子使其連接，所述合成連接子使其能夠制成VL和VH區(qū)配對形成單價分子的單一蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv);參見例如博德(Bird)等人(1988)^學(xué)c/e"cej242:423-26;休斯頓(Huston)等人(1988)夷,辟學(xué)腐學(xué)叛(TVoc.iV。".爿cW.t/.SU85:5879-83)。術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合片段"也打算涵蓋所述單鏈抗體。使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的常規(guī)技術(shù)獲得這些抗體片段，且以與完整抗體相同的方式評測所述片段的功能。本發(fā)明也涵蓋單域抗體。單域抗體可包括互補(bǔ)決定區(qū)為單域多肽的一部分的抗體。實(shí)例包括(但不限于)重鏈抗體、天然缺乏輕鏈的抗體、來源于常規(guī)的4鏈抗體的單域抗體、經(jīng)工程改造的抗體和單域支架(來源于抗體的單域支架除外)。單域抗體可為此項技術(shù)中的任何單域抗體，或?qū)沓霈F(xiàn)的任何單域抗體。單域抗體可來源于任何物種，包括(但不限于)老鼠、人類、駱駝、美洲駝、山羊、兔、母牛和鯊魚。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，如本文中所用的單域抗體為天然存在的單域抗體，其已知為缺乏輕鏈的重鏈抗體。所述單域抗體揭示于例如WO9404678中。為清楚起見，本文中將這一來源于天然缺乏輕鏈的重鏈抗體的可變域稱為VHH或納米抗體(nanobody)，以便將其與四鏈免疫球蛋白的常規(guī)VH相區(qū)分。這類VHH分子可來源于在駱駝科(Camelidae)物種中培殖的抗體，例如在駱駝、美洲駝、單峰駝(dromedary)、羊駝(alpaca)和原駝(guanaco)中培殖的抗體。除駱駝科以外，其它物種也可產(chǎn)生天然缺乏輕鏈的重鏈抗體；所述VHH在本發(fā)明的范疇內(nèi)。單域抗體也包括鯊魚IgNAR;參見例如多利(Dooley)等人，夷房辟學(xué)腐學(xué)叛a(bǔ)腦淑/.爿c^.Sc/,t/.SU，103:1846-1851(2006)。應(yīng)了解，除"雙特異性"或"雙功能"抗體以外，抗體所具有的各結(jié)合位點(diǎn)是相同的。"雙特異性"或"雙功能抗體"為具有兩個不同的重鏈/輕鏈對和兩個不同結(jié)合位點(diǎn)的人工雜交抗體。雙特異性抗體可由多種方法產(chǎn)生，所述方法包括使雜交瘤融合或連接Fab'片段。參見例如宋斯維萊和拉切曼(Songsivilai&Lachmann)，游i浙實(shí)驗力資學(xué)fC""./w附M"o/J79:315-321(1990);科斯托尼(Kostelny)等人，:^婆學(xué)染,吉a/w/m/"o/J148，1547-1553(1992)。12在蛋白質(zhì)為抗體或其片段的實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)可包括至少一個或兩個全長重鏈，和至少一個或兩個輕鏈?；蛘?，抗體或其片段可僅包括抗原結(jié)合片段(例如Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv片段)?？贵w或其片段可為單克隆或單特異性抗體?？贵w或其片段也可為人類、人類化、嵌合、CDR移植或活體外產(chǎn)生的抗體。在其它實(shí)施例中，抗體具有選自例如IgGl、IgG2、IgG3或lgG4的重鏈恒定區(qū)。在另一個實(shí)施例中，抗體具有選自例如K或l的輕鏈。在一個實(shí)施例中，使恒定區(qū)變化(例如突變)以改變抗體性質(zhì)(例如增加或減少以下一者或多者Fc受體結(jié)合、抗體糖基化、半胱氨酸殘基的數(shù)目、效應(yīng)細(xì)胞功能或補(bǔ)體功能)。通常，抗體或其片段特異性地結(jié)合預(yù)定抗原，例如可能導(dǎo)致病癥(例如神經(jīng)退行性、代謝性、發(fā)炎性、自身免疫性和/或惡性病癥)的抗原。本文所描述的蛋白質(zhì)任選地另外包括增強(qiáng)以下一者或多者的部分例如穩(wěn)定性、效應(yīng)細(xì)胞功能或補(bǔ)體結(jié)合。舉例來說，抗體或抗原結(jié)合蛋白可另外包括聚乙二醇化部分、白蛋白或重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)。通常，例如通過傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)(科勒(Kohler)等人，自然(Nature)256:495499(1975))、重組DNA方法(美國專利第4,816,567號)或使用抗體文庫的噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)(克拉克遜(Clackson)等人，自然(Nature)352:624628(1991);馬克斯(Marks)等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)222:581597(1991))來制造抗體。至于各種其它的抗體產(chǎn)生技術(shù)，參見抗體實(shí)驗室手冊(Antibodies:ALaboratoryManual),哈露(Harlow)等人編，冷泉港實(shí)驗室出版社(ColdSpringHarborLaboratory),1988。另外，可用可檢測或功能標(biāo)記來標(biāo)記抗體。這些標(biāo)記包括放射性標(biāo)記(例如1311或99Tc)、酶標(biāo)記(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)和其它化學(xué)部分(例如生物素)。"小模塊化免疫醫(yī)藥(SmallModularImmunoPharmaceutical)"或(SMIPTM)藥物(崔比安醫(yī)藥公司(TrubionPharmaceuticals),華盛頓州西雅圖(Seattle,WA))為由同源結(jié)構(gòu)(例如抗原、反受體等)的結(jié)合域、具有一個半胱氨酸殘基或不具有半胱氨酸殘基的鉸鏈區(qū)多肽和免疫球蛋白CH2和CH3結(jié)構(gòu)域組成的單鏈多肽(也參見www.trubion.com)。SMIP和其使用和應(yīng)用是揭示于例如美國公開專利申請案第2007/002159號、第2003/0118592號、第2003/0133939號、第2004/0058445號、第2005/0136049號、第2005/0175614號、第2005/0180970號、第2005/0186216號、第2005/0202012號、第2005/0202023號、第2005/0202028號、第2005/0202534號和第2005/0238646號和其有關(guān)的專利族成員中，所有專利都是以全文引用的方式并入本文中。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所關(guān)注的蛋白質(zhì)為可溶性受體，例如可溶性受體融合蛋白。例如受體等膜蛋白通常為糖基化蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明方法尤其有利于產(chǎn)生未聚集的經(jīng)適當(dāng)折疊且經(jīng)糖基化的可溶性受體融合蛋白?？筛鶕?jù)此項技術(shù)中所熟知的方法產(chǎn)生可溶性蛋白質(zhì)，例如可溶性受體。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，可溶性受體包含受體的細(xì)胞外區(qū)域或受體的細(xì)胞外區(qū)域的片段。在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，可溶性受體包含兩個多肽。第一多肽包含全長受體；或者，第一多肽包含不足全長的受體，例如受體的細(xì)胞外部分。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，第一多肽為全長細(xì)胞因子受體；或者，第一多肽為不足全長的細(xì)胞因子受體，例如細(xì)胞因子受體的細(xì)胞外部分。這類可溶性受體也可包含其它多肽，例如GST、Lex-A、MBP多肽序列，或免疫球蛋白鏈，包括例如Fc片段、各種同型(包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD和IgE)的重鏈恒定區(qū)。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，第二多肽優(yōu)選為可溶性的。在一些實(shí)施例中，第二多肽會增強(qiáng)所連接多肽的半衰期(例如血清或循環(huán)半衰期)。在優(yōu)選實(shí)施例中，第二多肽包括免疫球蛋白多肽的至少一個區(qū)域。免疫球蛋白融合多肽在此項技術(shù)中為已知的且描述于例如美國專利第5,516,964號、第5,225,538號、第5,428,130號、第5,514,582號、第5，714，147號和第5,455,165號中。已知可溶性融合蛋白在產(chǎn)生期間易于聚集，因此本發(fā)明方法針對產(chǎn)生這一類型的蛋白質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)物提供特殊益處。在一些實(shí)施例中，第二多肽包含全長免疫球蛋白多肽?；蛘撸诙嚯陌蛔闳L的免疫球蛋白多肽，例如重鏈、輕鏈、Fab、Fab2、Fv或Fc。第二多肽可包括免疫球蛋白多肽的重鏈。第二多肽可包括免疫球蛋白多肽的Fc區(qū)。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，可溶性受體融合蛋白包含腫瘤壞死因子抑制劑。在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)和方法(關(guān)于評述，參見以全文引用的方式并入本文中的奈史密斯(Naismith)和斯普蘭(Sprang),炎i^"染孟",/"^ZawmJ47(1-2):1-7,1995-96)來表達(dá)呈腫瘤壞死因子a和p受體形式的腫瘤壞死因子抑制劑(TNFR-1;1991年3月20日公開的EP417,563;和TNFR-2，1991年3月20日公開的EP417,014，其各自以全文引用的方式并入本文中)。根據(jù)一些實(shí)施例，腫瘤壞死因子抑制劑包含可溶性TNF受體。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的TNF抑制劑為TNFRI和TNFRII的可溶性形式。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的TNF抑制劑為可溶性TNF結(jié)合蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的TNF抑制劑為TNFR融合蛋白，例如TNFR-Ig或TNFR-Fc。如本文中所用，"依那西普(etanercept)"是指TNFR-Fc，其為p75TNF-a受體的細(xì)胞外部分的兩個分子的二聚物，各分子由人類IgGl的235個氨基酸的Fc部分組成。根據(jù)本發(fā)明，在較低的溫度和/或較低的pH值下，使表達(dá)TNFR-Fc的細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長，以減少TNFR-Fc14產(chǎn)生期間錯誤折疊的蛋白質(zhì)和/或高分子量聚集物的量。在某些實(shí)施例中，在較低的溫度和/或較低的pH值下，使表達(dá)TNFR-Fc的細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長以調(diào)節(jié)TNFR-Fc產(chǎn)生期間的糖基化。在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，可溶性受體融合蛋白為sIL-13R。如本文中所用，可溶性IL-13受體(sIL-13R)是指包括人類白細(xì)胞介素(IL)-13-CX2受體的細(xì)胞外域(ECD)和人類IgGl重鏈的Fc區(qū)的重組融合蛋白。sIL-13R由兩個似乎通過分子間二硫鍵連接的相同多肽鏈組成(即兩個多肽鏈的二聚物)。sIL-13R可溶性受體融合蛋白和其使用揭示于美國專利第5，710，023號中，所述專利以全文引用的方式并入本文中。在一些實(shí)施例中，第二多肽具有比野生型免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)的效應(yīng)功能少的效應(yīng)功能。Fc效應(yīng)功能包括例如Fc受體結(jié)合、補(bǔ)體結(jié)合和T細(xì)胞耗盡活性(參見例如美國專利第6，136，310號)。分析T細(xì)胞耗盡活性、Fc效應(yīng)功能和抗體穩(wěn)定性的方法在此項技術(shù)中為已知的。在一個實(shí)施例中，第二多肽對于Fc受體具有較低親和力或無親和力。在另一個實(shí)施例中，第二多肽對于補(bǔ)體蛋白Clq具有較低親和力或無親和力。融合蛋白(例如可溶性受體融合蛋白)可另外包括使可溶性受體或其片段與第二部分連接的連接序列。舉例來說，融合蛋白可包括肽連接子，例如約2到20個、更優(yōu)選約5到IO個氨基酸長度的肽連接子。在其它實(shí)施例中，可將其它氨基酸序列添加到融合蛋白的N末端或C末端以有助于表達(dá)、檢測和/或分離或純化。舉例來說，可溶性受體融合蛋白可與一個或多個其它部分(例如GST、His6標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽)連接。舉例來說，融合蛋白可另外與融合蛋白序列與GST(即谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)序列的C末端融合的GST融合蛋白連接。所述融合蛋白可有助于溶解性，即增加準(zhǔn)確折疊，且由此改良融合蛋白的純化。在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法如本文中所用，術(shù)語"培養(yǎng)"和"細(xì)胞培養(yǎng)物"是指在適于存活和/或生長的條件下與細(xì)胞培養(yǎng)基接觸的細(xì)胞群體。如本文中所用，這些術(shù)語可指包含細(xì)胞群體(例如動物細(xì)胞培養(yǎng)物)和與所述群體接觸的培養(yǎng)基的組合。本發(fā)明中所用的細(xì)胞可為重組宿主細(xì)胞(例如真核宿主細(xì)胞)，即經(jīng)含有編碼所關(guān)注的多肽的核酸的表達(dá)構(gòu)筑體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，包括動物細(xì)胞。短語"動物細(xì)胞"涵蓋無脊椎動物、非哺乳動物脊椎動物(例如鳥類、爬行動物和兩棲動物)和哺乳動物細(xì)胞。無脊椎動物細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括以下昆蟲細(xì)胞草地貪夜蛾(印c^o/^rayh^;peWa;毛蟲)、埃及伊蚊(爿e^^sae幻/pf/;蚊子)、白紋伊蚊(爿edesa/6o//c^y;蚊子)、黑腹果蠅(_Draso//7a附e/a"ogcwfer;果蟲黽)禾口家蠶(5om6y;c附on';桑蠶/蠶蛾)。在優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)物為哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物。許多哺乳動物細(xì)胞系為適于重組表達(dá)所關(guān)注的多肽的宿主細(xì)胞。哺乳動物宿主細(xì)胞系包括例如COS、PER.C6、TM4、VER0076、MDCK、BRL-3A、W138、HepG2、MMT、MRC5、FS4、CHO、293T、A431、3T3、CV-1、C3H10T1/2、Colo205、293、海拉細(xì)胞(HeLa)、L細(xì)胞、BHK、HL隱60、FRhL國2、U937、HaK、Jurkat細(xì)胞、Rat2、BaF3、32D、FDCP-1、PC12、Mlx、鼠科動物骨髓瘤(例如SP2/0和NSO)和C2C12細(xì)胞，以及經(jīng)轉(zhuǎn)化的靈長類動物細(xì)胞系、雜交瘤、正常二倍體細(xì)胞和來源于初始組織和初始外植體的細(xì)胞外培養(yǎng)物的細(xì)胞株。任何能夠表達(dá)所關(guān)注的多肽的真核細(xì)胞都可用于所揭示的方法中。許多細(xì)胞系可以從商業(yè)來源中獲得，所述來源為例如美國菌種保藏中心(AmericanTypeCultureCollection;ATCC)。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)物(例如大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)物)使用CHO細(xì)胞。雖然在某些實(shí)施例中細(xì)胞培養(yǎng)物包含哺乳動物細(xì)胞，但所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，有可能在低等真核生物(例如酵母)中或在原核生物(例如細(xì)菌)中重組產(chǎn)生所關(guān)注的多肽。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，酵母和細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)條件將不同于動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件，且應(yīng)理解將需要如何調(diào)整這些條件以便使細(xì)胞生長和/或蛋白質(zhì)產(chǎn)生最優(yōu)化。合適菌株包括大腸桿菌(￡^er/c/'aco/z')、枯草桿菌(5ac///1^raZ^7/s)、鼠傷寒沙門氏菌(5Wwo"e//ai^pWwwv'ww)，或任何能夠表達(dá)所關(guān)注的多肽的菌株。細(xì)菌中的表達(dá)可導(dǎo)致形成合并有重組蛋白的包涵體。因此，可能需要對重組蛋白進(jìn)行再折疊以便產(chǎn)生活性或更具活性的物質(zhì)。此項技術(shù)中已知多種從細(xì)菌包涵體獲得正確折疊的異源蛋白質(zhì)的方法。這些方法通常包括溶解來自包涵體的蛋白質(zhì)，然后利用離液劑使所述蛋白質(zhì)完全變性。當(dāng)半胱氨酸殘基存在于蛋白質(zhì)的初始氨基酸序列中時，通常有必要在允許正確形成二硫鍵的環(huán)境(氧化還原系統(tǒng))中完成再折疊。再折疊的一般方法在此項技術(shù)中為已知的且揭示于例如科諾(Kohno)(1990)朦學(xué)^"法￡"z;/7o/J185:187-95、EP0433225和美國專利第5,399,677號中。適于產(chǎn)生多肽的酵母菌株包括釀酒酵母(&cc/2flraw;;cescerev!;^e)、粟酒裂殖酵母(iSc/n'zosacc/zflTO附;;ce51po附6e)、巴斯f惠畢赤酵母(尸/c/n.a/a"or/s)、克魯纟隹酵母(幻2^ve/w^c^)菌株、假絲酵母(Cam^/fl)或任何能夠表達(dá)所關(guān)注的多肽的酵母菌株。如本文中所用，術(shù)語"生物反應(yīng)器"是指任何用于使真核細(xì)胞培養(yǎng)物(例如動物細(xì)胞培養(yǎng)物，例如哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物)生長的容器。生物反應(yīng)器可具有任何大小，只要其適用于培養(yǎng)細(xì)胞，例如哺乳動物細(xì)胞。通常，生物反應(yīng)器應(yīng)為至少30ml且可為至少1、10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、IO，OOO、12,000升或12,000升以上，或任何中間體積。通常，在培養(yǎng)期期間控制生物反應(yīng)器的內(nèi)部條件，包括(但不限于)pH值和溫度。如本文中所用，術(shù)語"產(chǎn)生生物反應(yīng)器"是指用于產(chǎn)生所關(guān)注的多肽或蛋白質(zhì)的最終生物反應(yīng)器。大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生生物反應(yīng)器的體積一般大于約100ml，通常為至少約10升，且可為500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000升或12,000升以上，或任何中間體積。合適的生物反應(yīng)器或產(chǎn)生生物反應(yīng)器可由任何適于將懸浮在培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng)物保持在本發(fā)明的培養(yǎng)條件下且有助于細(xì)胞生長和活力的物質(zhì)組成(即由其構(gòu)成)，所述物質(zhì)包括玻璃、塑料或金屬；所述物質(zhì)不應(yīng)該干擾所產(chǎn)生的產(chǎn)物(例如治療性蛋白質(zhì)產(chǎn)物)的表達(dá)或穩(wěn)定性。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解且能夠選擇適用于實(shí)踐本發(fā)明的生物反應(yīng)器。如本文中所用，術(shù)語"培養(yǎng)基"和"細(xì)胞培養(yǎng)基"是指含有養(yǎng)育正在生長的動物細(xì)胞(例如哺乳動物細(xì)胞)的營養(yǎng)物的溶液，且也可指與細(xì)胞組合的培養(yǎng)基。術(shù)語"接種培養(yǎng)基"是指用于形成細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。接種培養(yǎng)基的組成可能與剩余細(xì)胞生長期期間所使用的培養(yǎng)基不同，或者也可能與剩余細(xì)胞生長期期間所使用的培養(yǎng)基并無不同。通常，培養(yǎng)基溶液提供(不限于)細(xì)胞的至少最低限度生長和/或存活所需要的必需和非必需氨基酸、維生素、能源、脂質(zhì)和微量元素。溶液也可含有高于最低標(biāo)準(zhǔn)來增強(qiáng)生長和/或存活的組分，包括激素和生長因子。優(yōu)選將溶液調(diào)配到對于細(xì)胞存活和增殖最為理想的pH值和鹽濃度。在至少一個實(shí)施例中，培養(yǎng)基為成分明確培養(yǎng)基。成分明確培養(yǎng)基為所有組分都具有已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)基。在本發(fā)明的其它實(shí)施例中，培養(yǎng)基可含有來源于此項技術(shù)中已知的任何來源或方法的氨基酸，包括(但不限于)來源于單純氨基酸添加或來源于蛋白胨或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物添加(包括動物或植物來源)的氨基酸。在本發(fā)明的其它實(shí)施例中，細(xì)胞生長期期間所使用的培養(yǎng)基可含有濃縮培養(yǎng)基，即含有較高濃度的通常為生長培養(yǎng)物所必需且通常提供給生長培養(yǎng)物的營養(yǎng)物的培養(yǎng)基。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)確認(rèn)哪些細(xì)胞培養(yǎng)基、接種培養(yǎng)基等等適于培養(yǎng)特定細(xì)胞(例如動物細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞)，和培養(yǎng)基應(yīng)含有的葡萄糖和其它營養(yǎng)物(例如谷氨酰胺、鐵、微量D元素)或設(shè)計用于控制其它培養(yǎng)物變量(例如泡沫量、摩爾滲透壓濃度)的試劑的量(參見例如J.P.馬瑟(Mather，J.P.)等人(1999)"培養(yǎng)基，動物細(xì)胞，大規(guī)模產(chǎn)生(Culturemedia,animalcells,largescaleproduction),"主^OT藝^"術(shù)^"與全齊.'J^廩，主激,眾浙主激分庸(^五wc^c/oped/a！o/5z.o/roce5ss7fec/wo/ogy..Ferme"/a"o"，5/ocafa/^57'51,Wos印a"a"cw義第2巻:777-85;美國公開專利申請案第2006/0121568號；這兩個文獻(xiàn)都是以全文引用的方式并入本文中)。本發(fā)明也涵蓋所述已知培養(yǎng)基的變化形式，包括例如所述培養(yǎng)基的營養(yǎng)物富集的變化形式。如本文中所用，術(shù)語"細(xì)胞密度"是指存在于指定體積的培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)目。如本文中所用，術(shù)語"活細(xì)胞密度"是指在一組指定的實(shí)驗條件下存在于指定體積的培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)目。如本文中所用，術(shù)語"細(xì)胞活力"是指所培養(yǎng)的細(xì)胞在一組指定的培養(yǎng)條件或?qū)嶒炞兓问较麓婊畹哪芰?。如本文中所用，所述術(shù)語也指在特定時間存活的那部分細(xì)胞占當(dāng)時培養(yǎng)物中的活細(xì)胞和死細(xì)胞的總數(shù)的比例。如本文中所用，術(shù)語"總活細(xì)胞密度"、"總活細(xì)胞數(shù)目"或"IVC"是指培養(yǎng)過程中活細(xì)胞的平均密度乘以培養(yǎng)物運(yùn)作的時間量。當(dāng)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量與培養(yǎng)過程中存在的活細(xì)胞數(shù)目成比例時，總活細(xì)胞密度為估算培養(yǎng)過程中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量的有用工具。本發(fā)明方法可適用于在分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)、改良的補(bǔ)料分批培養(yǎng)(參見美國臨時申請案第60/954,922號)、分批重新補(bǔ)料培養(yǎng)或其任何組合中生長的細(xì)胞。如本文中所用，術(shù)語"分批培養(yǎng)"是指一種培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其中最終將用于培養(yǎng)細(xì)胞的所有組分(包括培養(yǎng)基以及細(xì)胞自身)都是在培養(yǎng)過程開始時提供。通常，在某一時間停止分批培養(yǎng)，并采集培養(yǎng)基中的細(xì)胞和/或組分且任選純化。如本文中所用，術(shù)語"補(bǔ)料分批培養(yǎng)"是指一種培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其中在培養(yǎng)過程開始后的某一時間將額外組分提供給培養(yǎng)物。所提供的組分通常包含己在培養(yǎng)過程期間耗盡的用于細(xì)胞的營養(yǎng)補(bǔ)充物。通常，在某一時間停止補(bǔ)料分批培養(yǎng)，并采集培養(yǎng)基中的細(xì)胞和/或組分且任選純化。如本文中所用，術(shù)語"灌注培養(yǎng)"是指一種培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其中在某一段時間內(nèi)連續(xù)地或在某一段時間內(nèi)間歇地將額外的新鮮培養(yǎng)基提供給培養(yǎng)物(在培養(yǎng)過程開始后)，且同時去除失效的培養(yǎng)基。新鮮培養(yǎng)基通常提供已在培養(yǎng)過程期間耗盡的用于細(xì)胞的營養(yǎng)補(bǔ)充物。任選純化可能存在于失效的培養(yǎng)基中的多肽產(chǎn)物。灌注也容許從生物反應(yīng)器中生長的細(xì)胞培養(yǎng)物中去除細(xì)胞廢產(chǎn)物(沖洗)。如本文中所用，術(shù)語"改良的補(bǔ)料分批培養(yǎng)"是指一種培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其將補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法與灌注培養(yǎng)方法相結(jié)合。改良的補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法描述于美國臨時申請案第60/954,922號中，所述申請案以全文引用的方式并入本文中。本發(fā)明也可用分批重新補(bǔ)料方法來實(shí)踐。據(jù)信在這一類型的細(xì)胞培養(yǎng)中，較低的pH值對于減少蛋白質(zhì)錯誤折疊和/或聚集以及對于改良糖基化將提供良好控制。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述方法包含首先在細(xì)胞培養(yǎng)物的生長期期間用接種培養(yǎng)基來接種細(xì)胞培養(yǎng)物，和隨后將細(xì)胞轉(zhuǎn)換到生長階段，其中將細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度和/18或pH值調(diào)整到較低的溫度和/或較低的pH值。如本文中所用，生長期是指使細(xì)胞生長并達(dá)到對于蛋白質(zhì)產(chǎn)生最為理想的細(xì)胞密度的細(xì)胞培養(yǎng)階段。在另一個實(shí)施例中，在生長期后，可將細(xì)胞轉(zhuǎn)換到生長階段，所述階段可在與生長期不同的溫度和/或不同的pH值(例如較低的溫度和/或較低的pH值)下延續(xù)。在實(shí)施例中，可在接種后一天，將細(xì)胞培養(yǎng)物從生長期轉(zhuǎn)換到生長階段。在其它實(shí)施例中，可在接種后五天，將細(xì)胞培養(yǎng)物從生長期轉(zhuǎn)換到生長階段。當(dāng)將細(xì)胞培養(yǎng)物從生長期轉(zhuǎn)變到生長階段時，所述轉(zhuǎn)變可為相對漸進(jìn)的。或者，所述轉(zhuǎn)變可為突然的。在漸進(jìn)變化下，可穩(wěn)定地調(diào)整(例如降低)溫度和/或pH值?；蛘撸梢圆贿B續(xù)時間間隔調(diào)整溫度和/或pH值。細(xì)胞培養(yǎng)物的生長階段是在對于所關(guān)注的多肽(例如治療性蛋白質(zhì))的產(chǎn)生最為理想的條件下使細(xì)胞生長的細(xì)胞培養(yǎng)階段。在生長階段期間，可以細(xì)胞培養(yǎng)物保持存活、產(chǎn)生高水平蛋白質(zhì)、代謝性廢產(chǎn)物(例如乳酸和氨)的產(chǎn)生和累積降到最低程度、蛋白質(zhì)的產(chǎn)物質(zhì)量得到適當(dāng)控制所處的溫度和/或pH值，和/或從業(yè)者認(rèn)為重要的這些或其它因素的任何組合為基礎(chǔ)來選擇細(xì)胞培養(yǎng)物的較低的溫度和/或pH值。在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，本發(fā)明的方法包含在較低的溫度和/或較低的pH值下接種細(xì)胞培養(yǎng)物，從而不需要在生長階段開始時轉(zhuǎn)變溫度或pH值。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度和pH值以使得溫度和pH值不偏離既定溫度和pH值設(shè)定點(diǎn)。舉例來說，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解使用堿(例如碳酸鈉堿)來防止培養(yǎng)物偏離到低于設(shè)定pH值。在下文實(shí)例中，細(xì)胞培養(yǎng)基在高于目標(biāo)pH值設(shè)定點(diǎn)的pH值下開始且不打算對pH值設(shè)定點(diǎn)進(jìn)行調(diào)整。然而，如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解，也可包括在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中利用pH值調(diào)整。同樣地，也可能在低溫下開始培養(yǎng)而不進(jìn)行調(diào)整。舉例來說，所述方法可僅包含生長階段。如本文中所用，"較低的溫度"是指比所述細(xì)胞類型的細(xì)胞生長的常規(guī)溫度(細(xì)胞生長的典型溫度)低的溫度。舉例來說，在細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞的本發(fā)明的實(shí)施例中，生長階段的細(xì)胞培養(yǎng)物優(yōu)選處于24.0'C到低于30.0。C的范圍中，且更優(yōu)選處于27.0'C到低于30.0'C的范圍中。舉例來說，細(xì)胞培養(yǎng)物的較低的溫度為24.0°C、24.5°C、25.0°C、25.5°C、26.0。C、26.5°C、27.0。C、27.5°C、28.0°C、28.5°C、29.0°C、29.5°C、29.6°C、29.7°C、29.8'C和29.9°C。在本文中描述的本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)物的較低的溫度為約29.5'C的溫度。除哺乳動物以外的細(xì)胞的較低的溫度可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)不同情況確定。如本文中所用，"較低的pH值"是指比所述特定細(xì)胞類型的細(xì)胞生長的常規(guī)pH值(細(xì)胞生長的典型pH值)低的pH值設(shè)定點(diǎn)。在細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞的本發(fā)明的實(shí)施例中，生長階段的細(xì)胞培養(yǎng)物的較低的pH值低于7.00。在本發(fā)明實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)物的較低的pH值在6.50到小于7.00的范圍中，優(yōu)選在6.80到小于7.00的范圍中。舉例來說，細(xì)胞培養(yǎng)物的較低的pH值為6.80、6.85、6.90、6.95、6.96、6.97、6.98和6.99。在本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)物的較低的pH值為約6.95。除哺乳動物以外的細(xì)胞的較低的pH值可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)不同情況確定。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，取決于細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞類型，常規(guī)溫度和pH值(與較低的溫度和pH值相區(qū)別)是不同的。舉例來說，大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)的常規(guī)溫度和pH值分別高于30.0°C(例如37.0'C)且高于7.00(例如7.20)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員也應(yīng)理解，因為其它細(xì)胞類型(例如昆蟲細(xì)胞)的常規(guī)溫度和pH值不同于哺乳動物細(xì)胞的常規(guī)溫度，所以本發(fā)明方法對于所述細(xì)胞利用不同的較低的溫度和不同的較低的pH值。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，從業(yè)者可能發(fā)現(xiàn)定期監(jiān)測生長的細(xì)胞培養(yǎng)物的特定狀況為有利的或必要的。作為非限制性實(shí)例，監(jiān)測例如溫度、pH值、溶解氧、細(xì)胞密度、細(xì)胞活力、總活細(xì)胞密度、乳酸鹽水平、銨水平、葡萄糖水平、谷氨酰胺水平、摩爾滲透壓濃度、所表達(dá)多肽的滴度等等可能為有利的或必要的。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知用于測量所述狀況/標(biāo)準(zhǔn)的許多方法。舉例來說，可使用血細(xì)胞計數(shù)器、自動細(xì)胞計數(shù)裝置(例如庫爾特計數(shù)器(Coultercounter),貝克曼庫爾特公司(BeckmanCoulterInc.)，加利福尼亞州富勒敦(Fullerton，CA))或細(xì)胞密度檢査(例如賽迪斯(CEDEX)，羅氏公司(Innovatis)，賓夕法尼亞州莫爾文(Malvern,PA))來測量細(xì)胞密度。可通過用錐蟲藍(lán)(Trypanblue)將培養(yǎng)樣本染色來測定活細(xì)胞密度。可例如使用測量細(xì)胞培養(yǎng)基中的關(guān)鍵營養(yǎng)物、代謝產(chǎn)物和氣體的拜爾普400(BioProfile400)化學(xué)分析器(諾華生物醫(yī)學(xué)公司(NovaBiomedical),馬薩諸塞州沃爾瑟姆(Waltham,MA))來測量乳酸鹽、銨、葡萄糖和谷氨酰胺水平以及溶解氧和pH值。也可使用例如血?dú)夥治銎?例如拜耳瑞匹萊博(BayerRapidlab)248pH值/血?dú)夥治銎?拜耳醫(yī)藥保健有限公司(BayerHealthcareLLC),馬薩諸塞州東沃爾波爾(EastWalpole,MA))來測量溶解氧和pH值。也可通過例如各種類型的原位探針來測量溫度、pH值和溶解氧?？赏ㄟ^例如冰點(diǎn)滲透壓計來測量細(xì)胞培養(yǎng)物的摩爾滲透壓濃度?？墒褂肏PLC來測定例如乳酸鹽、銨或所表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的水平。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，可通過使用例如蛋白質(zhì)AHPLC來測定所表達(dá)多肽的水平?；蛘?，所表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的水平可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來測定，例20如SDS-PAGE凝膠的考馬斯(Coomassie)染色、免疫蛋白印跡(Westernblotting)、布雷德福(Bradford)分析、洛里(Lowry)分析、雙縮脲分析和UV吸光度。監(jiān)測所表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(例如糖基化)可能為必要的。監(jiān)測蛋白質(zhì)的其它翻譯后修飾(例如磷酸化作用等等)可能也為有利的。為了監(jiān)測某些細(xì)胞培養(yǎng)物狀況，移出較小等分試樣的培養(yǎng)物以進(jìn)行分析可能為必要的。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解所述移出可能潛在地將污染引入細(xì)胞培養(yǎng)物中，且應(yīng)適當(dāng)謹(jǐn)慎行事以使所述污染的風(fēng)險降到最低程度。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，從業(yè)者監(jiān)測在較低的細(xì)胞培養(yǎng)物溫度和/或較低的pH值下的總活細(xì)胞數(shù)目。優(yōu)選在較低的溫度和/或較低的pH值下使細(xì)胞生長的總活細(xì)胞密度降低20%，更優(yōu)選低于20%(例如15%)。在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，從業(yè)者監(jiān)測在較低的細(xì)胞培養(yǎng)物溫度和/或較低的pH值下的細(xì)胞活力。優(yōu)選在較低的溫度和/或較低的pH值下使細(xì)胞生長的細(xì)胞活力降低小于15%，更優(yōu)選小于5%。葡萄糖為細(xì)胞培養(yǎng)物的主要能量來源。細(xì)胞培養(yǎng)物中葡萄糖消耗量的顯著偏差可指示細(xì)胞培養(yǎng)物條件對于細(xì)胞培養(yǎng)物的健康狀態(tài)有消極影響。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，使細(xì)胞在較低的溫度和/或較低的pH值下生長所引起的細(xì)胞培養(yǎng)物的葡萄糖消耗量的變化(例如減少)程度最少。谷氨酰胺為細(xì)胞培養(yǎng)物的另一能量來源，且為細(xì)胞培養(yǎng)物中各種分子(例如氨基酸)的重要氮源。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，使細(xì)胞在較低的溫度和/或較低的pH值下生長所引起的細(xì)胞培養(yǎng)物的谷氨酰胺消耗量的變化(例如減少)程度最少。在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，作業(yè)人員監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)物中廢產(chǎn)物的產(chǎn)生(例如乳酸鹽和氨產(chǎn)生)。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，使細(xì)胞在較低的溫度和/或pH值下生長所引起的乳酸鹽和氨產(chǎn)生的變化(例如增加)程度最小。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，使細(xì)胞在較低的溫度和/或pH值下生長可使乳酸鹽和氨產(chǎn)生降到最低程度。另外，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，使細(xì)胞在較低的溫度和/或pH值下生長所引起的累積平均生產(chǎn)率和產(chǎn)物滴度的降低程度最小。如本文中所用，術(shù)語"滴度"是指由細(xì)胞培養(yǎng)物(例如動物細(xì)胞培養(yǎng)物)產(chǎn)生的所關(guān)注的多肽(例如所關(guān)注的糖蛋白)的總量除以既定量的培養(yǎng)基體積；因此"滴度"是指濃度。滴度通常以每升培養(yǎng)基中的多肽毫克數(shù)為單位來表示。優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)物所經(jīng)歷的細(xì)胞生產(chǎn)率和產(chǎn)物滴度的任何降低都由聚集或錯誤折疊的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的產(chǎn)量減少(例如HMWA的產(chǎn)量減少)所抵消。如本文中所用，術(shù)語"聚集蛋白質(zhì)"是指產(chǎn)生非功能性的次優(yōu)或不需要的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)群組(即高分子量聚集物)。術(shù)語"錯誤折疊的蛋白質(zhì)"是指不恰當(dāng)折疊的蛋白質(zhì)，通常為不再顯示正常生物活性(例如正常酶活性)的蛋白質(zhì)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解蛋白質(zhì)聚集物可包含正確折疊和/或錯誤折疊的蛋白質(zhì)中的任一種或兩種。聚集或錯誤折疊的蛋白質(zhì)通常是在過度表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)物(例如過度表達(dá)所關(guān)注的蛋白質(zhì)(例如所關(guān)注的糖蛋白)的細(xì)胞培養(yǎng)物)中形成。舉例來說，可由未折疊多肽鏈的非特異性疏水性相互作用或由折疊中間物的相互作用引起聚集。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，使細(xì)胞在較低的溫度和/或較低的pH值下生長使得蛋白質(zhì)錯誤折疊/聚集減少至少50%，優(yōu)選地使得蛋白質(zhì)錯誤折疊/聚集減少約60%。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解監(jiān)測蛋白質(zhì)聚集/錯誤折疊所需要的技術(shù)，例如疏水性相互作用HPLC(HIC-HPLC)。術(shù)語"高分子量聚集物"(HMWA)是指由至少兩個蛋白質(zhì)之間的締合所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)生中的不合需要的副產(chǎn)物。"高分子量聚集物"可為至少兩個相同蛋白質(zhì)之間的締合和/或所關(guān)注的蛋白質(zhì)與在細(xì)胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的其它蛋白質(zhì)(例如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì))之間的締合。締合可由包括(但不限于)以下的任何方法所引起共價、非共價、二硫鍵和/或非還原性交聯(lián)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在呈多聚物形式(例如二聚物形式)時具活性時，即當(dāng)需要一個以上多肽鏈來產(chǎn)生蛋白質(zhì)活性時，術(shù)語"高分子量聚集物"是指兩個或更多所述多聚物形式之間的締合。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，呈多聚物形式的活性蛋白質(zhì)為受體，例如細(xì)胞因子受體(例如sIL-13R)。在一個實(shí)施例中，使細(xì)胞在較低的溫度和/或pH值下生長導(dǎo)致高分子量聚集物減少至少約10%、優(yōu)選減少約40%、更優(yōu)選減少約50%、并且甚至更優(yōu)選減少約80%或更多，或任何中間值。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解監(jiān)測高分子量聚集物的產(chǎn)生所需要的技術(shù)，例如尺寸排阻高效液相色譜法(SEC-HPLC)。在本發(fā)明的另一個方面中，使用細(xì)胞培養(yǎng)物中的溫度和/或pH值將蛋白質(zhì)糖基化(例如蛋白質(zhì)唾液酸化)改變到預(yù)定水平。舉例來說，降低細(xì)胞培養(yǎng)物的pH值和/或溫度可導(dǎo)致N-和O-連接的糖基化的減少，例如N-聚糖唾液酸化減少。蛋白質(zhì)糖基化(例如唾液酸化)的變化可影響治療性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、酶活性、循環(huán)壽命和免疫原性。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可監(jiān)測糖基化(例如唾液酸化)的程度以確保改變溫度和/或pH值達(dá)到所需類型和水平的蛋白質(zhì)糖基化。例如正相色譜法(NPC)的色譜技術(shù)可用來監(jiān)測蛋白質(zhì)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)糖基化。在生長階段結(jié)束時，采集細(xì)胞且收集和純化所關(guān)注的多肽。優(yōu)選在生長階段結(jié)束時，所關(guān)注的多肽顯示較少的錯誤折疊和/或聚集，同時保持可接受的糖基化模式。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，在產(chǎn)生過程結(jié)束時所關(guān)注的多肽呈可溶性形式(例如所關(guān)注的多肽為可溶性受體，例如可溶性細(xì)胞因子受體)?？蓮臈l件培養(yǎng)基純化所述可溶性形式的多肽?？赏ㄟ^由表達(dá)細(xì)胞制備總膜部分且用例如特立頓(TRITON)X-100(儀艾姆迪生物科學(xué)(EMDBiosciences),加利福尼亞圣迭哥(SanDiego,CA))的非離子洗漆劑萃取膜來純化膜結(jié)合形式的多肽?？赏ㄟ^溶解宿主細(xì)胞(經(jīng)由機(jī)械力、帕爾高壓容器(Parrbomb)、超聲波處理、洗滌劑等等)，通過離心去除細(xì)胞膜部分，且保留上清液，來制備胞漿蛋白或核蛋白?？墒褂盟鶎兕I(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它方法純化多肽。舉例來說，可使用市售的蛋白質(zhì)濃縮過濾器(例如阿米康(AMICON)⑧或派立康(PELLICON)⑧超濾單元(密理博(Millipore)，馬薩諸塞州比爾里卡(Billerica，MA))濃縮由所揭示的方法產(chǎn)生的多肽。在濃縮步驟之后，可將濃縮物施加到純化基質(zhì)上，例如凝膠過濾介質(zhì)?；蛘?，可使用陰離子交換樹脂(例如莫諾克(MonoQ)柱，安瑪西安生物科學(xué)(AmershamBiosciences),新澤西州皮斯卡塔韋(Piscataway,NJ));所述樹脂含有具有二乙氨基乙基(DEAE)或聚乙烯亞胺(PEI)側(cè)基的基質(zhì)或底物。用于純化的基質(zhì)可為丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或蛋白質(zhì)純化常用的其它類型?；蛘?，可將陽離子交換步驟用于純化蛋白質(zhì)。合適的陽離子交換劑包括各種包含磺丙基或羧甲基的不溶性基質(zhì)(例如斯-賽佛若斯(S-SEPHAROSE)③柱，西格馬-阿爾里奇(Sigma-Aldrich),密蘇里州圣路易(St.Louis,MO))。從培養(yǎng)物上清液純化多肽也可包括一個或多個在親和性樹脂上進(jìn)行的柱步驟，所述親和性樹脂例如伴刀豆凝集素A(concanavalinA)-瓊脂糖、AF-黑珀琳(HEPARIN)650、肝素-托躍坡(TOYOPEARL)⑧或汽巴藍(lán)(Cibacronblue)3GA賽佛若斯(SEPHAROSE)(托實(shí)生物科學(xué)(TosohBiosciences),加利福尼亞州舊金山(SanFrancisco,CA));使用例如苯基醚、丁基醚或丙基醚的樹脂的疏水性相互作用色譜柱；或使用針對經(jīng)標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗體的免疫親和柱。最后，可使用一個或多個利用疏水性HPLC介質(zhì)(例如具有甲基或其它脂族基側(cè)基的硅膠，例如Ni-NTA柱)的HPLC步驟來進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)?；蛘?，可以有助于純化的形式重組表達(dá)多肽。舉例來說，可以與例如麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或硫氧還蛋白(TRX)的蛋白融合的形式表達(dá)多肽；表達(dá)且純化所述融合蛋白的試劑盒可分別從新英格蘭生物實(shí)驗室(NewEnglandBioLabs)(馬薩諸塞州貝弗利(Beverly,MA))、法瑪西亞(Pharmacia)(新澤西州皮斯卡塔韋(Piscataway,NJ))和英杰(Invitrogen)(加利福尼亞州卡爾斯巴德(Carlsbad,CA))購得。也可用較小抗原決定基(例如His、myc或Flag標(biāo)簽)來標(biāo)記蛋白質(zhì)且隨后使用針對所選抗原決定基的特異性抗體來進(jìn)行識別或純化。針對常見抗原決定基的抗體可以從許多商業(yè)來源獲得?？墒褂靡恍┗蛩猩鲜黾兓襟E的各種組合或利用其它已知方法23的一些或所有上述純化步驟來純化由本發(fā)明方法所產(chǎn)生的所關(guān)注的多肽，例如治療性蛋白質(zhì)。醫(yī)藥組合物在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，根據(jù)一種或多種本發(fā)明方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可用于制備藥物。根據(jù)一種或多種本發(fā)明方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可投與個體，或可首先經(jīng)調(diào)配以便通過任何可用途徑遞送，所述途徑包括(但不限于)例如不經(jīng)腸(例如靜脈內(nèi))、皮內(nèi)、皮下、口服、經(jīng)鼻、經(jīng)支氣管、經(jīng)眼、透皮(表面)、經(jīng)粘膜、經(jīng)直腸和經(jīng)陰道途徑。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物通常包括從哺乳動物細(xì)胞系表達(dá)的經(jīng)純化蛋白質(zhì)、遞送劑(例如，如上所述的陽離子聚合物、肽分子轉(zhuǎn)運(yùn)體、表面活性劑等等)以及醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。如本文中所用，措辭"醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑"包括不干擾活性成分的生物活性的有效性且可與醫(yī)藥投藥相容的無毒物質(zhì)，例如溶劑、分散介質(zhì)、涂料、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。載劑特征將取決于投藥途徑。也可將補(bǔ)充活性化合物并入組合物中。調(diào)配醫(yī)藥組合物以使其與其預(yù)定的投藥途徑可相容。當(dāng)根據(jù)一種或多種本發(fā)明方法產(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)以口服形式投與時，醫(yī)藥組合物應(yīng)呈片劑、膠囊、散劑、溶液或酏劑形式。當(dāng)以片劑形式投與時，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可另外含有固體載劑，例如明膠或佐劑。片劑、膠囊和散劑將含有約5%到95%結(jié)合劑，且優(yōu)選約25%到90%結(jié)合劑。當(dāng)以液體形式投與時，可添加液體載劑，例如水、石油、來源于動物或植物的油類，例如芝麻油、花生油(考慮到在群體中會發(fā)生過敏性反應(yīng))、礦物油或大豆油或芝麻油，或合成油。醫(yī)藥組合物的液體形式可另外含有生理鹽水溶液、右旋糖或其它糖溶液，或二醇，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。當(dāng)以液體形式投與時，醫(yī)藥組合物含有以重量計約0.5%到90%的結(jié)合劑，且優(yōu)選以重量計約1%到50%的結(jié)合劑。當(dāng)根據(jù)一種或多種本發(fā)明方法產(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)是通過靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射投與時，治療性蛋白質(zhì)應(yīng)呈無熱原、不經(jīng)腸可接受的水溶液形式。適當(dāng)顧及pH值、等滲性、穩(wěn)定性等，所述不經(jīng)腸可接受的蛋白質(zhì)溶液的制備在所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的技能范圍之內(nèi)。用于靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射的優(yōu)選醫(yī)藥組合物除治療性蛋白質(zhì)之外，也應(yīng)含有等滲媒劑，例如氯化鈉注射液、林格注射液(Ringer'sinjection)、右旋糖注射液、右旋糖和氯化鈉注射液、乳酸鹽林格注射液或此項技術(shù)中已知的其它媒劑。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物也可含有穩(wěn)定劑、防腐劑、緩沖劑、抗氧化劑或所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它添加劑。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知包含通過一種或多種本發(fā)明法產(chǎn)生的治療性蛋白醫(yī)藥組合物的其它配方。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員也應(yīng)了解根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的適當(dāng)?shù)膯挝粍┝空{(diào)配物。本申請案通篇引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和專利申請案的全部內(nèi)容都是以引用的方式并入本文中。實(shí)例闡述以下實(shí)例以幫助理解本發(fā)明，但是無論如何不打算且不應(yīng)該解釋為限制本發(fā)明范疇。實(shí)例不包括常規(guī)方法的詳細(xì)描述，例如克隆(cloning)、轉(zhuǎn)染和在細(xì)胞系中過度表達(dá)蛋白質(zhì)的方法的基本方面。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知所述方法。實(shí)例1TNFR-Fc蛋白質(zhì)產(chǎn)生實(shí)例1.1:較低的溫度對于重組CHO細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)效能和對于TNFR-Fc融合蛋白的產(chǎn)物質(zhì)量的影響實(shí)例l丄l:材料和方法在37.0'C下，將過度表達(dá)重組糖蛋白TNFR-Fc的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞在相同濃度和條件下接種于四個獨(dú)立的實(shí)驗室規(guī)模生物反應(yīng)器中。在補(bǔ)料分批培養(yǎng)物中使細(xì)胞生長一天，然后溫度轉(zhuǎn)變?yōu)?0.0°C、29.0°C、28.0'C或27.(TC。培養(yǎng)物的初始pH值設(shè)定點(diǎn)下限為7.00。每天從培養(yǎng)物中移除細(xì)胞樣本以測量細(xì)胞培養(yǎng)物的各種狀況，例如總活細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞活力、殘留葡萄糖概況、殘留谷氨酰胺概況、乳酸鹽和氨濃度、累積平均細(xì)胞生產(chǎn)率(Qp)、產(chǎn)物滴度、錯誤折疊產(chǎn)物/聚集產(chǎn)物水平、高分子量聚集物水平、唾液酸化水平和pH值。通過使用細(xì)胞密度檢査(例如賽迪斯(CEDEX)，羅氏公司(Innovatis)，賓夕法尼亞州莫爾文(Malvern,PA))測量細(xì)胞密度來計算總活細(xì)胞數(shù)目(IVC)且歸一化為平均采集日IVC。通過計算所有所測試的實(shí)驗條件下采集日(例如第10日)總活細(xì)胞密度的算術(shù)平均值來測定平均采集日IVC。然后將所有個別IVC值相對于平均采集IVC進(jìn)行調(diào)整以產(chǎn)生歸一化值。通過使用細(xì)胞密度檢査(例如賽迪斯(CEDEX)，羅氏公司(Innovatis)，賓夕法尼亞州莫爾文(Malvern,PA))用錐蟲藍(lán)染色來測量細(xì)胞活力。另外，使用BioProfile化學(xué)分析器(諾華生物醫(yī)學(xué)公司(NovaBiomedical),馬薩諸塞州沃爾瑟姆(Waltham，MA))來測量細(xì)胞培養(yǎng)物中的殘留葡萄糖概況和殘留谷氨酰胺概況。使用BioProfile化學(xué)分析器(諾華生物醫(yī)學(xué)公司(NovaBiomedical),馬薩諸塞州沃爾瑟姆(Waltham,MA))來測量廢產(chǎn)物、乳酸鹽和氨的濃度。使用蛋白AHPLC來測量累積平均細(xì)胞生產(chǎn)率(Qp)和產(chǎn)物滴度且歸一化為平均采集日累積平均Qp和滴度。通過計算所有所測試的實(shí)驗條件下采集日(例如第10日)滴度來測定平均采集日滴度。然后將所有個別滴度值相對于平均采集日滴度進(jìn)行調(diào)整以產(chǎn)生歸一化值。通過計算所有所測試的實(shí)驗條件下采集日累積平均Qp來測定平均采集曰累積平均Qp。然后將所有個別值相對于平均采集日滴度進(jìn)行調(diào)整以產(chǎn)生歸一化值。使用HIC-HPLC來測量錯誤折疊產(chǎn)物/聚集產(chǎn)物的水平，且使用SEC-HPLC來測量高分子量聚集物的水平。通過使2-氨基苯甲酰胺-(2-AB)-標(biāo)記的蛋白質(zhì)糖型經(jīng)受正相色譜(NPC)來測量總體N連接的聚糖唾液酸化水平?？偼僖核峄?N和O連接)的量是定義為相對于參考物質(zhì)(即具有已知且優(yōu)選唾液酸化模式的TNFR-Fc等分試樣)的總唾液酸化的量的百分率。通過經(jīng)由血液氣體分析器(BayerRapidlab248pH值/血液氣體分析器(拜耳醫(yī)藥保健有限公司(BayerHealthcareLLC),馬薩諸塞州東沃爾波爾(EastWalpole,MA))離線測量來測定細(xì)胞培養(yǎng)物的pH值。實(shí)例L1.2:結(jié)果在較低的溫度下使細(xì)胞生長對IVC數(shù)目具有最低限度的影響。具體地說，較低的操作溫度產(chǎn)生較低的最終IVC數(shù)目；然而，將細(xì)胞培養(yǎng)物溫度降低到27'C所產(chǎn)生的影響較小，觀察到IVC數(shù)目僅減少約20。/。(圖1A)。細(xì)胞活力并未明顯受到溫度降低影響；最低溫度條件(即27。C)具有低5%的采集日活力(圖IB)。另外，較低的操作溫度導(dǎo)致較高的殘留葡萄糖概況，其指示細(xì)胞培養(yǎng)物的葡萄糖消耗量較低(圖2A);然而，谷氨酰胺概況沒有因溫度降低而顯著變化(圖2B)。在一些情況下，在細(xì)胞培養(yǎng)后期，細(xì)胞培養(yǎng)物也可消耗乳酸和氨。乳酸和氨產(chǎn)生的停止或乳酸和氨的消耗促進(jìn)細(xì)胞活力、細(xì)胞生產(chǎn)率，且可具有增加多肽產(chǎn)物滴度的影響。在較低的溫度下使細(xì)胞生長具有在補(bǔ)料分批培養(yǎng)的后半段改變?nèi)樗猁}的凈消耗量的影響(圖3A)。較低的溫度也導(dǎo)致較高的氨產(chǎn)量(圖3B)。較低的溫度導(dǎo)致較低的細(xì)胞比生產(chǎn)率(較低Qp)(圖4A)和較低的產(chǎn)物滴度(圖4B)。較低的產(chǎn)物滴度是由較低的細(xì)胞比生產(chǎn)率和較低的總活細(xì)胞數(shù)目所引起。然而，較低的產(chǎn)物滴度和細(xì)胞生產(chǎn)率由顯著降低比例的錯誤折疊產(chǎn)物和聚集產(chǎn)物所抵消(圖5A)。此外，降低細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度會顯著地減小細(xì)胞培養(yǎng)物中的高分子量聚集物的比例(圖5B)。因此，降低溫度導(dǎo)致TNFR-Fc蛋白質(zhì)產(chǎn)物改良。這一溫度降低可引起總產(chǎn)物唾液酸化(N和O連接的唾液酸化)減少(圖6A)。事實(shí)上，在降低細(xì)胞培養(yǎng)物溫度與降低唾液酸化N連接聚糖的比例之間存在直接的關(guān)系(圖6B)，這表明必須選擇生產(chǎn)溫度以平衡減少HMWA和蛋白質(zhì)錯誤折疊的有利影響與減少糖基化的不利影響。舉例來說，使細(xì)胞在29.5'C的較低溫度下生長會顯著地降低錯誤折疊和聚集TNFR-Fc的濃度，同時對于TNFR-Fc糖基化具有最低程度的影響。在不同溫度下生長的細(xì)胞培養(yǎng)物之間的乳酸鹽凈消耗量的差異導(dǎo)致在收獲時細(xì)胞培養(yǎng)物的pH值存在差異(圖7)。這是因為，由于從環(huán)境中去除了酸，較大的乳酸鹽(乳酸)凈消耗量導(dǎo)致培養(yǎng)物pH值的較大升高。實(shí)例1.2:較低的pH值對重組CHO細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)效能和對TNFR-Fc融合蛋白的產(chǎn)物質(zhì)量的影響實(shí)例1.2.1:材料和方法在37.0。C下且在pH值設(shè)定點(diǎn)7.20、7.10、7.00、6.90或6.80下，以相同濃度接種過度表達(dá)重組糖蛋白TNFR-Fc的CHO細(xì)胞。利用添加碳酸鈉堿來防止培養(yǎng)物偏離到低于設(shè)定點(diǎn)pH值。所使用的pH值對照均不超過設(shè)定點(diǎn)pH值。在第l日(接種后一天，即實(shí)驗開始后一天)，生物反應(yīng)器的溫度轉(zhuǎn)變?yōu)?0.0°C。如實(shí)例l丄l中所描述，測量細(xì)胞培養(yǎng)物的各種條件。實(shí)例1.2.2:結(jié)果在與pH7.00偏離0.2個pH值單位的pH值設(shè)定點(diǎn)下使細(xì)胞生長會導(dǎo)致IVC稍微減少；具體地說，在pH6.80下使細(xì)胞生長導(dǎo)致與在pH7.00下生長的細(xì)胞相比IVC減少約15。/。(圖8A)。另外，在pH7.20下使細(xì)胞生長會導(dǎo)致較低的細(xì)胞活力(圖8B)。另外，較低的操作pH值設(shè)定點(diǎn)會導(dǎo)致較低的葡萄糖消耗量(圖9A)。谷氨酰胺概況沒有因在6.80到7.10的pH值設(shè)定點(diǎn)下使細(xì)胞生長而顯著地變化(圖9B)。毫不意外地，較高的操作pH值設(shè)定點(diǎn)會導(dǎo)致較高的乳酸鹽產(chǎn)量(圖10A)。在pH值設(shè)定點(diǎn)6.80下，在補(bǔ)料分批的后半段并未發(fā)生乳酸鹽的凈消耗。較低的操作pH值設(shè)定點(diǎn)導(dǎo)致較高的氨產(chǎn)量(圖10B)。在實(shí)驗的后半段乳酸鹽的凈消耗量的差異導(dǎo)致培養(yǎng)物的pH值偏離操作pH值設(shè)定點(diǎn)，這是因為僅使用堿添加而非酸添加來保持pH值(圖11A)。由于pH值設(shè)定點(diǎn)、乳酸鹽概況和滴定劑添加存在差異，所以在各pH條件之間，摩爾滲透壓濃度也有所不同(圖IIB)。在與pH7.00偏離0.2個pH值單位的pH值設(shè)定點(diǎn)下操作培養(yǎng)物導(dǎo)致細(xì)胞比生產(chǎn)率(即Qp)稍微降低(圖12A)。利用pH值設(shè)定點(diǎn)6.80或7.20導(dǎo)致較低的產(chǎn)物滴度，這是因為細(xì)胞比生產(chǎn)率降低且總活細(xì)胞數(shù)目也降低(圖12B)。然而，較低的操作pH值設(shè)定點(diǎn)會導(dǎo)致產(chǎn)物錯誤折疊和聚集減少(圖13A)。另外，在較低pH值設(shè)定點(diǎn)下觀察到高分子量聚集物的比例顯著減小(圖13B)。較低的操作pH值設(shè)定點(diǎn)導(dǎo)致較低的總唾液酸化(N和O連接的聚糖)(圖14A)以及較低比例的N連接聚糖唾液酸化(圖14B)。因為總唾液酸化(N和O連接)的量是定義為相對于參考物質(zhì)的總唾液酸化的量的百分率，所以任何低于100%的值都表示總唾液酸化減少且超過100%的值都表示總唾液酸化增加。糖基化模式可描述糖蛋白的聚糖概況(圖15)。在較低的pH值下使細(xì)胞生長導(dǎo)致總糖基化概況顯著變化(圖16)。雖然在較低的pH值下未檢測到新的糖型，但是存在的糖型比率顯著變化；在較低的pH值下使細(xì)胞生長導(dǎo)致復(fù)合二唾液酸化和單唾液酸化糖型減少。由于較低的pH值對于蛋白質(zhì)糖基化的潛在不利影響，因此必須以使得對于蛋白糖基化的有害影響與減少錯誤折疊和/或聚集蛋白質(zhì)的有利影響達(dá)到平衡的方式來選擇細(xì)胞培養(yǎng)物的pH值。舉例來說，在較低的pH值6.95下使細(xì)胞生長已顯著地降低錯誤折疊和聚集TNFR-Fc蛋白質(zhì)的比例，同時對于TNFR-Fc的糖基化具有最低程度的影響。實(shí)例1.3:討論這些研究顯示在27.0'C到30.0°C的溫度范圍內(nèi)或在6.80到7.20的pH值設(shè)定點(diǎn)范圍內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞生長和比生產(chǎn)率可受到顯著影響。然而，雖然溫度僅改變1-2°C且pH值設(shè)定點(diǎn)僅改變0.1-0.2并未顯著地影響細(xì)胞生長和比生產(chǎn)率，但是可在蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)聚集方面觀察到顯著(有利)差異。因此，未顯著影響細(xì)胞生長、活力或生產(chǎn)率的細(xì)胞培養(yǎng)條件的較小差異可能顯著地改變產(chǎn)物質(zhì)量，例如減少蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)聚集或影響糖基化。實(shí)例2溫度對于sIL-13R產(chǎn)量的影響和新的產(chǎn)生sIL-13R的細(xì)胞系的評估實(shí)例2.1:材料和方法在Applikon生物反應(yīng)器中，將過度表達(dá)重組糖蛋白sIL-13R的經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞以3xl()S個細(xì)胞/毫升接種于具有消泡劑(Antifoam;道康寧公司(DowCorningCorporation),密歇根州米德蘭(Midland,MI))的接種培養(yǎng)基中。必要時，添加額外消泡劑。降濃縮營養(yǎng)物培養(yǎng)基用作補(bǔ)料培養(yǎng)基。pH值設(shè)定點(diǎn)下限為6.80。d02設(shè)定點(diǎn)為23%，其利用7%<:02/93%空氣噴射氣體，同時攪動為200rpm。在第5日，使生物反應(yīng)器的溫度從37.0'C進(jìn)行轉(zhuǎn)變。生長階段溫度為37.0°C、33.0°C、32.0°C、28.0°C或室溫(RT;約24.0'C)。實(shí)驗條件的補(bǔ)料時程概述于表1中。補(bǔ)料體積以生物反應(yīng)器中培養(yǎng)物體積的百分率形式列出。在約6><106個細(xì)胞/毫升下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度轉(zhuǎn)變。表1.生物反應(yīng)器補(bǔ)料時程<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實(shí)例2.2.結(jié)果與較高溫度(約8xl(^個細(xì)胞/毫升)下相比，在RT(約6xl(^個細(xì)胞/毫升)和29.0°C(約7"06個細(xì)胞/毫升)下，在溫度轉(zhuǎn)變之后所獲得的活細(xì)胞密度略低(圖17A)。同樣地，與較高溫度(約8到9xl(^個細(xì)胞/毫升)下相比，在RT(約6.5xl()6個細(xì)胞/毫升)禾口29.0'C(約7>106個細(xì)胞廣升)下，在溫度轉(zhuǎn)變之后所獲得的總細(xì)胞密度略低(圖17B)。在較低溫度下，在整個補(bǔ)料分批過程中較好地保持活力(圖17C)?；盍Φ南陆邓俾孰S溫度而變化；RT和29.0'C培養(yǎng)物的活力概況顯著高于31.0'C、32.0°C、33.(TC和37.(TC下的剩余培養(yǎng)物(圖17C)。在18天補(bǔ)料分批培養(yǎng)結(jié)束時，由3L0'C培養(yǎng)物實(shí)現(xiàn)最高滴度(組合sIL-13R二聚物和HMWA滴度)，其后為32.0。C培養(yǎng)物(188mg/L)、29.0。C培養(yǎng)物(178mg/L)和33.0°C培養(yǎng)物(151mg/L)(圖18)。RT和37.0'C培養(yǎng)物具有顯著較低的滴度。在RT和37.0°C下，產(chǎn)生sIL-13R的細(xì)胞系的細(xì)胞比生產(chǎn)率或每日比sIL-13R生產(chǎn)率(Qp)顯著降低(圖19A)。另外，在37.0。C和RT下，累積平均比生產(chǎn)率或累積平均Qp也較低(圖19B)。有趣的是，沿37.0'C、33.0°C、32.0'C和31.0'C培養(yǎng)物的引述順序所發(fā)現(xiàn)的比生產(chǎn)率的較大增加與培養(yǎng)物活力的顯著減小相對應(yīng)(數(shù)據(jù)未展示)。比葡萄糖消耗量(Qglc)隨著溫度降低而減少(圖20)。比谷氨酰胺消耗量(Qgln)也似乎隨著溫度降低而減少(圖21)。然而，應(yīng)注意關(guān)于比谷氨酰胺消耗量的數(shù)據(jù)并未顧及培養(yǎng)基中的谷氨酰胺降解，所述降解在較大程度上會隨著溫度增加而發(fā)生。因此，溫度對于比谷氨酰胺消耗量的影響可能有偏差。RT、29.0°C、31.(TC和32.0'C培養(yǎng)物的乳酸鹽濃度概況為相似的，且乳酸鹽濃度在溫度轉(zhuǎn)變之日或其前后到達(dá)最高點(diǎn)，隨后在第18日降低到0.7與2.0,g/L之間(圖22)。對于33.(TC和37.0'C培養(yǎng)物來說，生長期期間的乳酸鹽概況與其它培養(yǎng)物類似，但在生長階段期間存在顯著不同。對于33.(TC培養(yǎng)物來說，乳酸鹽濃度在溫度轉(zhuǎn)變之后并未降低，且實(shí)際上保持基本上恒定。對于37.0°C29培養(yǎng)物來說，乳酸鹽在補(bǔ)料分批的整個持續(xù)時間內(nèi)增加。在生長階段期間，氨濃度根據(jù)溫度而變化(圖23)。對于29.0'C培養(yǎng)物來說，氨濃度在溫度轉(zhuǎn)變之日或其前后到達(dá)最高點(diǎn)，在補(bǔ)料分批的中間階段期間降低，且隨后在補(bǔ)料分批的后期期間增加。隨著溫度增加到超過29.0'C,在補(bǔ)料分批的后期氨濃度的增加更大且更早發(fā)生。對于37.0'C培養(yǎng)物來說，氨濃度在整個補(bǔ)料分批過程中增加。對于RT培養(yǎng)物來說，氨水平在溫度轉(zhuǎn)變后保持大致恒定。通過批料結(jié)合蛋白A洗出液的尺寸排阻色譜法(SEC)來分析來自這些生物反應(yīng)器運(yùn)作的條件培養(yǎng)基樣本的高分子量聚集物(HMWA)。根據(jù)細(xì)胞系的結(jié)果顯而易見的趨勢為，存在于條件培養(yǎng)基中的HMWA的百分率隨著溫度增加而相對增大(圖24和圖25)。因此，在較低溫度下操作細(xì)胞培養(yǎng)物導(dǎo)致sIL-13R產(chǎn)物聚集減少。sIL-13R二聚物的百分率減小可能導(dǎo)致HMWA的百分率增大。(圖26A和26B)。與其它培養(yǎng)物相比，RT培養(yǎng)物具有較低的HMWA。/。(圖26B)，以及較高百分率的二聚物形成(圖26A)。RT培養(yǎng)物和31.0'C培養(yǎng)物獲得相似的凈二聚物滴度，而29.0'C培養(yǎng)物獲得最高的凈二聚物滴度(圖27)。為了證實(shí)來自SEC分析的結(jié)論，使用西方印跡法來分析條件培養(yǎng)基樣本。檢査以HMWA物質(zhì)形式存在的sIL-13R的量相較于二聚物的定性差異。西方印跡法顯示存在于條件培養(yǎng)基中的HMWA聚集物的量相較于所存在的二聚物的量隨溫度增加而增大的趨勢(數(shù)據(jù)未展示)。這些實(shí)驗證實(shí)活力和活細(xì)胞密度、比生產(chǎn)率和HMWA形成的溫度依賴性變量對于sIL-13R二聚物的體積生產(chǎn)率的重要性。雖然31.(TC培養(yǎng)物達(dá)到最高滴度(測量數(shù)據(jù)包括HMWA和二聚物)，但當(dāng)僅依據(jù)二聚物測量時，較低溫度(例如29.0'C)下的培養(yǎng)物可獲得可相當(dāng)或改良的體積生產(chǎn)率。權(quán)利要求1.一種在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包含以下至少一個步驟(a)在較低的溫度下，使細(xì)胞在所述細(xì)胞培養(yǎng)物中生長；和(b)在較低的pH值下，使細(xì)胞在所述細(xì)胞培養(yǎng)物中生長；以減少錯誤折疊的蛋白質(zhì)和/或聚集蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其包含在較低的溫度和較低的pH值下使細(xì)胞在所述細(xì)胞培養(yǎng)物中生長。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物為大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)物。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物為補(bǔ)料分批細(xì)胞培養(yǎng)物。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物為哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物為CHO細(xì)胞培養(yǎng)物。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述較低的溫度在27.(rC到低于30.(TC的范圍內(nèi)。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述較低的pH值在6.80到小于7.00的范圍內(nèi)。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)為可溶性受體。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述可溶性受體為TNFR-Fc。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述較低的溫度為29.5'C。12.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述較低的pH值為6.95。13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述可溶性受體為sIL-13R。14.一種在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包含以下至少一個步驟(a)通過改變所述細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度使所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)糖基化水平改變?yōu)轭A(yù)定水平；和(b)通過改變所述細(xì)胞培養(yǎng)物的pH值使所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)糖基化水平改變?yōu)轭A(yù)定水平。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)糖基化為N-聚糖唾液酸化。16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物為大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)物。17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物為補(bǔ)料分批細(xì)胞培養(yǎng)物。18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物為哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物為CHO細(xì)胞培養(yǎng)物。20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述方法包括在介于27.(TC到低于30.0'C的范圍內(nèi)的溫度下使所述細(xì)胞培養(yǎng)物生長。21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述方法包括在介于6.80到小于7.00的范圍內(nèi)的pH值下使所述細(xì)胞培養(yǎng)物生長。22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)為可溶性受體。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述可溶性受體為TNFR-Fc。24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述可溶性受體為sIL-13R。25.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)為治療性蛋白質(zhì)。26.—種醫(yī)藥組合物，其包含由根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法制備的治療性蛋白質(zhì)和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。27.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)為治療性蛋白質(zhì)。28.—種醫(yī)藥組合物，其包含由根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法制備的治療性蛋白質(zhì)和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。29.根據(jù)權(quán)利要求1至25或27中任一權(quán)利要求所述的方法，其另外包含從所述細(xì)胞培養(yǎng)物中分離所述蛋白質(zhì)的步驟。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)另外經(jīng)純化或加工以供調(diào)配。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中將所述蛋白質(zhì)調(diào)配成醫(yī)藥組合物。全文摘要本發(fā)明提供一種通過使細(xì)胞培養(yǎng)物在較低的溫度和/或較低的pH值下生長來減少細(xì)胞培養(yǎng)物中的蛋白質(zhì)錯誤折疊和聚集的新穎方法。由此，可極大地改良細(xì)胞培養(yǎng)物中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的質(zhì)量。因此，本發(fā)明有助于改良細(xì)胞培養(yǎng)物中所產(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)的功效。文檔編號C12N5/00GK101679943SQ200880013275公開日2010年3月24日申請日期2008年4月22日優(yōu)先權(quán)日2007年4月23日發(fā)明者喬斯·曼紐爾·戈梅斯,格雷戈里·沃爾特·希勒申請人:惠氏公司