專利名稱：生產(chǎn)軟骨素的細(xì)菌及生產(chǎn)軟骨素的方法
生產(chǎn)軟骨素的細(xì)菌及生產(chǎn)軟骨素的方法
背景技術(shù)：
軟骨素是一種包括葡糖醛酸(GlcUA)殘基和N-乙基-D-半乳糖胺 (GalNAc)殘基的二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的多糖(-GlcUA卩(1 -3)-GalNAc卩(1 -4)-,在
本說明書中，也稱為軟骨素糖骨架)。硫酸軟骨素是由軟骨素的硫酸化組 成的多糖。
傳統(tǒng)上從動物的軟骨、器官等提取和純化軟骨素和硫酸軟骨素。然 而，近年來，因?yàn)橹T如軟骨和器官之類的材料不足，已經(jīng)研究了人工合 成對于軟骨素和硫酸軟骨素而言常見的糖骨架的技術(shù)。
已知大腸桿菌K4林產(chǎn)生具有軟骨素骨架結(jié)構(gòu)的多糖作為莢膜。然 而，其結(jié)構(gòu)由包括GalNAc殘基、GlcUA殘基和果糖殘基的三糖的重復(fù) 單元組成，其中所述的果糖殘基與GlcUA殘基的C3-羥基連接。此外，在大腸桿菌中已經(jīng)檢測到了超過100種化學(xué)上不同的莢膜多糖。例如，
大腸桿菌K5抹產(chǎn)生具有肝素/硫酸乙酰肝素的糖骨架的莢膜多糖K5(J. Biol. Chem., 272(5), p2682-2687, 1997)。然而，還不知道有產(chǎn)生軟骨素本 身的大腸桿菌的存在。因此，應(yīng)用大腸桿菌生產(chǎn)軟骨素的方法是未知的。
盡管美國公開專利申請2007-0281342公開了通過應(yīng)用引入了衍生 自多殺性巴氏桿菌的軟骨素合酶基因的重組革蘭氏陽性菌生產(chǎn)軟骨素 的方法，然而期望在軟骨素的發(fā)酵生產(chǎn)中有更進(jìn)一步的發(fā)展。
發(fā)明的公開內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供能夠生產(chǎn)軟骨素的新微生物，以及應(yīng)用該 微生物生產(chǎn)軟骨素的新方法。
本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引入了書f生自大腸桿 菌K4抹kfoA和kfoC基因的產(chǎn)生UDP-葡糖醛酸的細(xì)菌諸如大腸桿菌 K5林高效地產(chǎn)生軟骨素，因此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供引入了衍生自大腸桿菌K4抹的kfoA基因 和衍生自大腸桿菌K4株的kfoC基因并且具有產(chǎn)生軟骨素的能力的產(chǎn)生 UDP-葡糖醛酸的細(xì)菌。
在本文中，所述的衍生自大腸桿菌K4抹的kfoA基因優(yōu)選為編碼選 自由以下(A)和(B)所組成的組的蛋白的基因
(A) 包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；以及
(B) 包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其包括一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸的替換、缺失、插入或添加并具有UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶活 性。
所述的書卞生自大腸桿菌K4一朱的kfoA基因優(yōu)選為選自由以下(a)和(b) 組成的組的DNA:
(a) 包含SEQ ID NO: 1的核普酸序列的DNA;和
(b) 在嚴(yán)格條件下與包含和SEQ ID NO: 1互補(bǔ)的核苷酸序列的DNA 雜交并編碼包含UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的DNA。
此外，所述的衍生自大腸桿菌K4林的kfoC基因優(yōu)選為編碼選自由 以下(C)和(D)所組成的組的蛋白的基因
5(C) 包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；以及
(D) 包含SEQIDNO:4氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其包括一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸的替換、缺失、插入或添加并具有軟骨素合酶活性。
此外，所述的衍生自大腸桿菌K4抹的kfoC基因優(yōu)選為選自由以下 (c)和(d)組成的組的DNA:
(c) 包含SEQIDNO:3的核苷酸序列的DNA;和
(d) 在嚴(yán)才各條件下與包含和SEQ ID NO: 3互補(bǔ)的核苷酸序列的 DNA雜交并編碼具有軟骨素合酶活性的蛋白的DNA。
此外，所述的衍生自大腸桿菌K4林的kfoC基因優(yōu)選為編碼選自由 以下(E)和(F)所組成的組的蛋白的基因
(E) 包含SEQIDNO:6氨基酸序列的蛋白質(zhì)；以及
(F) 包含SEQIDNO:6氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其包括一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸的替換、缺失、插入或添加并具有軟骨素合酶活性。
此外，所述的衍生自大腸桿菌K4抹的kfoC基因優(yōu)選為選自由以下 (e)和(f)組成的組的DNA:
(e) 包含SEQ ID NO: 5的核苷酸序列的DNA;和
(f) 在嚴(yán)格條件下與包含和SEQIDNO: 5互補(bǔ)的核苷酸序列的DNA 雜交并編碼具有軟骨素合酶活性的蛋白的DNA。
所述的產(chǎn)生UDP-葡糖醛酸的細(xì)菌優(yōu)選為大腸桿菌K5抹。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)軟骨素的方法，其至少包括以下步驟
(1)和(2):
(1) 培養(yǎng)如上所述的細(xì)菌；以及
(2) 從該培養(yǎng)物中收集軟骨素。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法，其包括通過如 上所述的方法生產(chǎn)軟骨素；以及然后將該軟骨素碌^酸化以產(chǎn)生^L酸軟骨 素。
本發(fā)明的另 一 目的是提供包含衍生自大腸桿菌K4株的kfoA基因和 衍生自大腸桿菌K4抹的kfoC基因的載體。
附圖簡述
圖l是顯示了用于表達(dá)kfoA和kfoC基因的載體結(jié)構(gòu)的圖。
圖2是顯示了 kfoA和kfoC蛋白表達(dá)的圖(照片)。泳道1顯示沒有 引入質(zhì)粒的菌抹(對照)，泳道2顯示引入了 pTrcHis-kfoCA的菌抹，以 及M顯示分子量標(biāo)記。
圖3顯示了對于用軟骨素酶ABC(cABC)處理的級分L(A)、沒有用 cABC處理的級分L(B)以及用熱滅活的cABC處理的級分L(C),采用熒 光HPLC系統(tǒng)的二糖組成分析的結(jié)果。
圖4顯示了對于用cABC處理的級分E(A)、沒有用cABC處理的級 分E(B)以及用熱滅活的cABC處理的級分E(C)的熒光二糖分析的結(jié)果。
圖5顯示了對于用cABC處理的級分S(A)、沒有用cABC處理的級 分S(B)以及用熱滅活的cABC處理的級分S(C)的熒光二糖分析的結(jié)果。
圖6顯示了對于用cABC處理的軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品(A)、用cABC處理的 軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品和用cABC處理的級分L的混合物(B)的熒光二糖分析的結(jié) 果。
圖7是顯示了應(yīng)用(A)抗-KfoC抗體(EK-C)作為一抗、(B)抗-KfoA 抗體(EK-A)作為一抗以及(C)正常兔血清，KfoA、 KfoC和Kfo」C蛋白 表達(dá)的圖(照片)。泳道1和5顯示分子標(biāo)記MagicMarkXP標(biāo)準(zhǔn)品 (Invitrogen)，泳道2顯示引入了 pTrcHis-kfoCA的菌林，泳道3顯示引 入了 pTrcHis-kfo」CA的菌林，以及泳道4顯示引入了 pTrcHis-kfoA的 菌抹。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述
在下文中，將詳細(xì)地描述本發(fā)明。
<1〉本發(fā)明的細(xì)菌
本發(fā)明的細(xì)菌是引入了衍生自大腸桿菌K4抹的kfoA和kfoC基因 的產(chǎn)生UDP-葡糖醛酸且具有產(chǎn)生軟骨素的能力的細(xì)菌。
"產(chǎn)生UDP-葡糖醛酸的細(xì)菌，，提供了 UDP-葡糖醛酸，其可一皮用于 產(chǎn)生包含葡糖醛酸的多糖。對"產(chǎn)生UDP-葡糖醛酸的細(xì)菌，，沒有限制， 只要其產(chǎn)生UDP-葡糖醛酸，并且其實(shí)例包括屬于葡糖酸醋桿菌屬的細(xì) 菌,諸如漢森葡糖酸醋桿菌(G/wco"acefo6""er /za""m',j和木葡糖酸 醋斥干菌(G/wco77acefoZ)""e廠jc少/^2ws );屬于才艮瘤菌(i /n'zoZ^ww)屬的纟田菌,諸如W/nzc^wm we^7o〃；屬于醋酸桿菌(^4c"o^2"e。屬的細(xì)菌，諸如木 醋桿菌(Jceto6a"er xy/z力ww );屬于歐文氏菌(五nWwz'a)屬的細(xì)菌，諸如 解淀4分歐文氏菌(EnWm'a amy/ovora);屬于石克桿菌(77n'c^a"〃^)屬的細(xì) 菌，諸^口氧4b亞纟失石危斥干菌(T7n'c^ac,'〃ws /erroojdda"s ); 屬于木4干菌屬 (Zy/e〃")屬的細(xì)菌，諸如苛養(yǎng)木桿菌(Z;z/e〃a/^^Wa^);屬于中華 根瘤菌屬(S/woW2/zoZ^wm )屬的細(xì)菌，諸如苜蓿中華才艮瘤菌(5V"w/nzo6z"w we/z7o〃)；屬于紅J求菌CR/zc^ococcw力屬的細(xì)菌，諸如玫^鬼色紅5求菌 (朋otfococcztf Wzoc/oc/zto—; 屬于克雷伯氏菌(/eZ)we〃")屬的細(xì)菌,諸 ^t口產(chǎn)氣克雷^f白氏菌(AT/eZ^s7.e〃a aeroge"e力；屬于腸^干菌(五"ferc^acter)屬 的細(xì)菌，諸如產(chǎn)氣腸4干菌(五"/en9Z^c化r aeragewe》；屬于埃希氏^于菌 (五sc/zenc/zza)屬的細(xì)菌，諸如大腸桿菌。
"產(chǎn)生UDP-葡糖醛酸的細(xì)菌"優(yōu)選為屬于埃希氏桿菌屬并能產(chǎn)生 UDP-葡糖醛酸的細(xì)菌，以及更優(yōu)選為屬于大腸桿菌并能產(chǎn)生UDP-葡糖 醛酸的細(xì)菌。
其具體的實(shí)例包括大腸桿菌K5菌抹。K5菌抹被保藏在美國典型培 養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection) (ATCC: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108,美利堅(jiān)合眾國)，登錄號為ATCC23506并且可/人 ATCC的目錄或主頁上獲得。
待引入kfoA和kfoC基因的菌抹可以是大腸桿菌K5菌抹的衍生菌 抹，并且此類衍生菌抹可通過遺傳重組將基因突變引入該大腸桿菌K5 抹或?qū)⒒蛞朐摯竽c桿菌K5抹而獲得。也就是說，本發(fā)明的細(xì)菌的 一方面包括通過將衍生自大腸桿菌K4抹的kfoA和kfoC基因引入大 腸桿菌K5株而獲得的菌抹；通過將衍生自大腸桿菌K4林的kfoA和kfoC 基因引入大腸桿菌K5抹并進(jìn)一步引入基因突變而獲得的菌株；以及通 過將衍生自大腸桿菌K4抹的kfoA和kfoC基因引入大腸桿菌K5林并進(jìn) 一步引入另一基因而獲得的菌抹。
衍生自大腸桿菌K4抹的kfoA基因的實(shí)例包括編碼包含SEQ ID NO: 2氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA,以及包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列 的DNA。
一般而言，在一個(gè)或幾個(gè)組成蛋白質(zhì)的氨基酸中的替換、缺失、插 入或添加對該蛋白質(zhì)的活性沒有影響，因此，許多情況下，衍生自大腸桿菌K4抹的kfoA基因可以是編碼這樣的蛋白的基因，所述蛋白包含 SEQIDNO:2氨基酸序列，并且包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的替換、缺失、 插入或添加并具有UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶活性。
本文所使用的短語"一個(gè)或幾個(gè)氨基酸"是指可能引起替換、缺失、 插入或添加，但不會損害UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶活性的氨基酸數(shù)目。 具體而言，該數(shù)目例如是1至20的整數(shù)，優(yōu)選為1至10的整數(shù)，更優(yōu) 選為1至5的整數(shù)。
同時(shí)，衍生自大腸桿菌K4林的kfoA基因可以是編碼這樣的蛋白的 基因，所述蛋白包含與SEQIDNO:2的整個(gè)序列的同一性不少于900/。、 優(yōu)選同一性不少于95%、更優(yōu)選同一性不少于98%的氨基酸序列，并具 有UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶活性。
可通過PCR應(yīng)用大腸桿菌K4抹的染色體DNA作為才莫版獲得衍生 自大腸桿菌K4林的kfoA基因。
大腸桿菌K4抹已被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏所(Amencan Type Culture Collection) (ATCC),登錄號為ATCC23502并且可從ATCC的目 錄或主頁上獲得。
可通過點(diǎn)特異性裔變(Kramer, W.和Frits, H. J., Meth. Enzymol., 154, 350(1987); Kunkel, T.A.等,Meth. Enzymol., 154, 367(1987》等修飾SEQ IDNO: 1的核苦酸序列以將一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的替換、缺失、插入或添 加引入到SEQ ID NO: 2的氨基酸序列上，從而獲得編碼包括一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸的替換、缺失、插入或添加的包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列， 或與SEQ ID NO: 2的整個(gè)序列的同一性不少于90%的氨基酸序列，且 具有UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的基因。
還可通過以下方法獲得該基因通過在嚴(yán)格條件下與包含和SEQ ID NO: 1的核香酸序列或其部分序列互補(bǔ)的核苷酸序列的DNA雜交來篩 選編碼具有UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
術(shù)語"嚴(yán)格條件，，是指在其中形成所謂的特異性雜交、且不形成非 特異性雜交的條件(參見Sambrook, J.等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)，等)。"嚴(yán)才各條件"的具 體實(shí)例包括這樣的條件在42。C在含有50。/c)甲酰胺、4 x SSC、 50 mM HEPES (pH 7.0)、 10 x Denhardt溶液、100昭/ml鮭精DNA的溶液中雜
9交，在室溫下用2 x SSC、 0.1% SDS溶液洗滌，并且然后在60。C用0.1 x SSC、 0.1。/。SDS洗滌。
可通過將得到的基因引入到合適的宿主中以表達(dá)該蛋白并然后根 據(jù)J. Biol. Chem., 277(24), p21567-21575, 2002中描述的方法測量UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶活性，從而判斷如上所述獲得的基因是否編碼具有 UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白。
衍生自大腸桿菌K4抹的kfoC基因的實(shí)例包括編碼包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA以及包含SEQ ID NO: 3的核苷酸序列 的DNA。衍生自大腸桿菌K4抹的kfoC基因的實(shí)例還包括編碼包含SEQ ID NO: 6氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA以及包含SEQ ID NO: 5的核苷酸 序列的DNA。
衍生自大腸桿菌K4林的kfoC基因可以是編碼這樣的蛋白的基因， 所述蛋白包含SEQ ID NO: 4或6的氨基酸序列，并且包括一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸的替換、缺失、插入或添加并且具有軟骨素合酶活性。
衍生自大腸桿菌K4抹的kfoA基因可以是編碼這樣的蛋白的基因， 所述蛋白包含與SEQ ID NO: 4或6的整個(gè)序列的同一性不少于90%、 優(yōu)選同一性不少于95%、更優(yōu)選同一性不少于98%的氨基酸序列，并具 有軟骨素合酶活性。
本文所使用的術(shù)語"軟骨素合酶活性"是指將GlcUA從GlcUA供 體或?qū)alNAc從GalNAc供體交替地轉(zhuǎn)移至糖鏈的非還原端的活性。
可通過PCR應(yīng)用大腸桿菌K4抹的染色體DNA作為沖莫版來獲得衍 生自大腸桿菌K4抹的kfoC基因。此外，還可根據(jù)WO2007/145197中 描述的方法獲得編碼SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的kfoC基因，諸如包 含SEQ ID NO: 5的核苷酸序列的DNA。
可通過點(diǎn)特異性誘變等修飾SEQ ID NO: 3或5的核苷酸序列以將 一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的替才灸、缺失、插入或添加引入到SEQIDNO:4或6 的氨基酸序列上，從而獲得編碼包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的替換、缺失、 插入或添加的包含SEQ ID NO: 4或6的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 4 或6的整個(gè)序列的同一性不少于90%的氨基酸序列，并且具有軟骨素合 酶活性的蛋白質(zhì)的基因。還可通過以下方法獲得該基因通過在嚴(yán)才各條件下與包含和SEQ ID NO: 3或5的核苷酸序列或其部分序列互補(bǔ)的核普酸序列的DNA雜交來 篩選編碼具有軟骨素合酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
術(shù)語"一個(gè)或幾個(gè)"和"嚴(yán)格條件"的定義與上面描述的相同。 可通過將得到的基因引入至合適的宿主以表達(dá)該蛋白并然后根據(jù) US 2003-0109693 (JP 2003-199583 A)中描述的方法測量專允骨素合酶活 性，從而判斷如上所述獲得的基因是否編碼具有軟骨素合酶活性的蛋 白。
可通過將衍生自大腸桿菌K4抹的kfoA基因和衍生自大腸桿菌K4 抹的kfoC基因引入至如上所述的產(chǎn)生UDP-葡糖醛酸的細(xì)菌中而獲得本 發(fā)明的細(xì)菌。
在本發(fā)明中使用的術(shù)語"引入"包括應(yīng)用載體諸如質(zhì)?；蚴删w將 兩個(gè)基因引入到產(chǎn)生UDP-葡糖醛酸的細(xì)菌中，以及通過同源重組等將 兩個(gè)基因引入到產(chǎn)生UDP-葡糖醛酸的細(xì)菌的染色體上。
對在本文中應(yīng)用的載體諸如質(zhì)?；蚴删w沒有特別地限制，只要它 們可以用于將基因引入到大腸桿菌中，它們的實(shí)例包括pTrcHis (Invitrogen 公司)、pET 載體(Novagen)和 pGEX 載體(Amersham Pharmacia)。
在引入衍生自大腸桿菌K4抹的kfoA基因和衍生自大腸桿菌K4抹 的kfoC基因時(shí)，可以-使用該基因的天然啟動子，但優(yōu)選應(yīng)用在大腸桿 菌中強(qiáng)有力的啟動子，諸如lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、PR啟 動子或lacUV啟動子。
K4抹的kfoA基因和kfoC基因。更優(yōu)選應(yīng)用攜帶kfoA和kfoC基因兩 者的載體，諸如質(zhì)粒或噬菌體，因?yàn)榭梢匀菀椎赝瓿伤龌虻囊牒?表達(dá)。
可以這樣引入衍生自大腸桿菌K4林的kfoA和kfoC基因，以使得 將它們表達(dá)為與其它肽的融合蛋白。
其它肽的實(shí)例包括聚組氨酸標(biāo)簽和GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)簽。 以融合蛋白形式表達(dá)基因產(chǎn)物是優(yōu)選的，因?yàn)檫@樣可以很容易地進(jìn)行基 因產(chǎn)物的檢測(表達(dá)的確認(rèn))。可通過已知的轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行基因的引入。所述方法的實(shí)例包括電穿
孔方法、DEAE-葡聚糖方法和^粦酸鈣方法。
可通過以下方法確^人基因的引入；險(xiǎn)測基因的方法，例如RT-PCR 或RNA印跡；特別地;險(xiǎn)測重組蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，諸如蛋白質(zhì)印跡； 以及如上所述的活性測量方法。
如果所導(dǎo)入的衍生自大腸桿菌K4抹的kfoA基因和衍生自大腸桿菌 K4株的kfoC基因在產(chǎn)生UDP-葡糖醛酸的細(xì)菌中工作的話，則該細(xì)菌 獲得了產(chǎn)生軟骨素作為莢膜多糖的能力。
<2〉生產(chǎn)軟骨素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的生產(chǎn)軟骨素的方法至少包括以下步驟(1)和(2)。
(1) 培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌。
(2) 從該培養(yǎng)物收集軟骨素。
可通過用于培養(yǎng)屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌的一般方法進(jìn)行所述培養(yǎng)。
對培養(yǎng)基沒有特別的限制，只要其能用于培養(yǎng)屬于埃希氏桿菌屬的 細(xì)菌，并且其優(yōu)選實(shí)例包括LB培養(yǎng)基(Luria-Bertam培養(yǎng)基)(每升含有 10.0 g的細(xì)菌用胰蛋白胨、5.0 g的細(xì)菌用酵母提取物和5.0g的NaCl) 和CYG培養(yǎng)基(2.0%酪蛋白氨基酸、0.5%酵母提取物和0.2%葡萄糖， 高壓滅菌前調(diào)節(jié)pH至7.0)。在應(yīng)用含有抗生素抗性基因的載體來引入 基因的情況下，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有相應(yīng)于該基因的抗生素。
對培養(yǎng)條件沒有特別地限制，只要屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌能夠生 長即可，為了能高效地生產(chǎn)軟骨素，優(yōu)選在20至4CTC培養(yǎng)8至72小時(shí)。
為了高效地生產(chǎn)專欠骨素，可以在4反或流體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)細(xì)菌。
對從培養(yǎng)物中收集軟骨素的方法沒有特別地限制，只要能收集軟骨 素即可，并且其實(shí)例包4舌以下中描述的方法。具體而言，將收集的重組 細(xì)胞重懸在PBS(磷酸鹽緩沖的鹽水)等中；用溶菌酶、DNA酶I和蛋白 酶K處理該細(xì)胞；并且移除蛋白質(zhì)。例如可通過用軟骨素酶處理該級分 并進(jìn)行二糖組成分析來^:測軟骨素。<3〉生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法
可通過進(jìn)一 步把從本發(fā)明中公開的重組細(xì)菌中制備的軟骨素碌u酸 化而制備硫酸軟骨素。
可通過已知的硫酸化糖胺聚糖的方法來進(jìn)行所述的硫酸化，對所述
方法沒有特別地限制，其實(shí)例包括在JP 61 -47701 A中描述的方法。
此外，可應(yīng)用用于將硫酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至軟骨素的酶(磺基轉(zhuǎn)移酶)來進(jìn) 行所述硫酸化。在存在3，-磷酸腺苷5，-磷酰硫酸(PAPS)作為硫酸根供體 的情況下，磺基轉(zhuǎn)移酶能通過對由本發(fā)明公開的重組細(xì)菌產(chǎn)生的軟骨素 作出反應(yīng)而產(chǎn)生硫酸軟骨素。用于將硫酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至軟骨素的已知的磺 基轉(zhuǎn)移酶的實(shí)例包括軟骨素6-0-硫酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶(J. Biol. Chem., 275(28): 210乃-21080 (2000))和半乳糖胺基聚糖4-硫酸根基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶(JP 2000-4877 A).
實(shí)施例
下面，將參考實(shí)施例詳細(xì)地描述本發(fā)明。
實(shí)施例1:制備KfoC/KfoA共表達(dá)載體 〈KfoA基因的擴(kuò)增〉
應(yīng)用大腸桿菌K4菌抹的染色體DNA作為;t莫板，根據(jù)J. Biol. Chem., 277巻，24期，21567-21575中描述的方法進(jìn)行PCR，然后將得到的PCR 產(chǎn)物插入到pTrcHis (組氨酸融合蛋白表達(dá)載體，Invitrogen)中，由此產(chǎn) 生pTrcHis-kfoA。
所使用的引物如下
K4A隱SP: 5'-CGGGATCCCGATGAGTATTCTTAATCAAGC國3' (SEQ ID NO: 7)和
K4A-AS: 5'-GGAATTCCGGCCAGTCTACATGTTTATCAC-3' (SEQ ID NO: 8)。
〈KfoC基因的擴(kuò)增〉
應(yīng)用大腸桿菌K4菌抹的染色體DNA作為模板，根據(jù)P 2003-199583 A中描述的方法進(jìn)4亍PCR,然后將得到的PCR產(chǎn)物插入到pTrcHis中， 由此產(chǎn)生pTrcHis-kfoC。所使用的引物如下
K4C-SP: 5'-CGGGATCCCGATGAGTATTCTTAATCAAGC陽3' (SEQID NO: 9)和
K4C-AS: 5'國GGAATTCCGGCCAGTCTACATGTTTATCAC國3' (SEQID NO: 10).
< pTrcHis國kfoCA的制備〉
按下列方式從上述pTrcHis-kfoA和 pTrcHis-kfoC制備pTrcHis-kfoCA。
首先，通過PCR將Notl-Sall位點(diǎn)引入pTrcHis國kfoC的C端序列。應(yīng)用以下所示的引物進(jìn)4亍PCR,以/人kfoC的C端側(cè)擴(kuò)增pTrcHis-kfoC的全長，然后使得到的PCR產(chǎn)物自身連接，由此產(chǎn)生質(zhì)粒pTrcHis畫kfoC-Notl畫Sall。
所使用的引物如下
NotSal-pTrcHisC-rev:5，國GCGGCCGCAAAACAGCCAAGCTTCGAATTC-3' (SEQ ID NO: 11)和
NotSal-pTrcHisC-for:5，-ACGCGTCGACGGCGGATGAGAGAAGATTTTCA畫3' (SEQ ID NO:
12)
然后分別在核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的上游以及pTrcHis-kfoA的kfoA的 C 端 區(qū) 域設(shè)計(jì) 引 物 (Notl-RBS-KfoA-N:
ID NO: 13)和SalI國KfoA-C: 5，匿GTCGACCTCTCATCCGCCAAAACA陽3，(SEQIDNO: 14》，并用于使用pTrcHis-kfoA作為模版的PCR。然后，將得到的PCR產(chǎn)物插入到pCR4-TOPO (Invitrogen),由此產(chǎn)生pCR4畫TOPO-kfoA。
用Notl-Sall從pCR4-TOPO-kfoA切除含有kfoA的插入片段，并引入到pTrcHis-kfoC-Notl-Sall的Notl-Sall位點(diǎn)上，并且將得到的質(zhì)粒命名為pTrcHis-kfoCA(

圖1)。實(shí)施例2
重組的KfoC和KfoA的共表達(dá)
通過電穿孔(細(xì)月包100 |iL, 200 。， 25 jiF, 2.5 kV,小池0.1 cm)將表達(dá)載體pTrcHis-kfoCA引入到大腸桿菌K5抹中，由此產(chǎn)生大腸桿菌K5/pTrcHis-kfoCA株。將克隆轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有100 ppm氨卡青霉素的LB培養(yǎng)基中，并且然后將種子培養(yǎng)物在37。C溫育過夜。將lmL所述種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至20 mL補(bǔ)充有100 ppm氨千青霉素的CYG培養(yǎng)基中。將重組的細(xì)菌在37。C培養(yǎng)3小時(shí)(OD600 = 1.8, 1.7-2.0),并且然后往該培養(yǎng)物中添加IPTG,終濃度為1.0mM。將得到的培養(yǎng)物在37。C再培養(yǎng)5小時(shí)，以誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。
通過離心從900 培養(yǎng)物中收集細(xì)菌細(xì)胞。使得到的細(xì)胞懸浮于90 ^LLaemmli緩沖液(xl)中。在沸水浴中加熱10分鐘后，使10 jiL上清液在5/20%滴度凝膠中進(jìn)行SDS-PAGE,并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，隨后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析以檢測重組蛋白的表達(dá)。應(yīng)用稀釋至1/2，000的抗-Penta-His-HRP (QIAGEN)檢測重組的組氨酸融合蛋白。結(jié)果，確認(rèn)了重組蛋白KfoA和KfoC的表達(dá)(圖2)。
實(shí)施例3
制備多糖及通過二糖分析;險(xiǎn)測多糖<細(xì)菌細(xì)月包的制備>
在補(bǔ)充有100 ppm氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸#干菌K5/pTrcHis-kfoCA抹作為種子培養(yǎng)物。然后將該種子培養(yǎng)物(750jiL)轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充有100ppm氨千青霉素的CYG培養(yǎng)基(15mL)中，然后在37。C培養(yǎng)3小時(shí)。往該培養(yǎng)物中加入IPTG(終濃度1 mM),并且再培養(yǎng)5小時(shí)。
<培養(yǎng)物上清液的制備>
將該種子培養(yǎng)物(l mL)轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有100 ppm氨芐青霉素的CYG培養(yǎng)基(20 mL)中，并且然后在37。C培養(yǎng)3小時(shí)。往該培養(yǎng)物中加入IPTG(終濃度O.lmM),并且再培養(yǎng)5小時(shí)。
通過離心收集培養(yǎng)上清液。
<多糖級分的制備〉通過以下三種方法從重組的細(xì)胞和培養(yǎng)物上清液制備多糖。
制備1)將上述得到的細(xì)菌重懸于PBS中，并在37。C用溶菌酶和DNA酶I處理1小時(shí)，隨后在37。C用蛋白酶K處理1小時(shí)。然后，加熱使酶失活，并且通過用70%硫酸銨沉淀來除去蛋白質(zhì)。將得到的上清液級分針對10 mM Tris-HCl (pH 8.0)透析，產(chǎn)生樣本L。
制備2)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，順序地使用用于純化質(zhì)粒的試劑Pl (含有溶菌酶)、P2和P3 (QIAGEN)處理上述得到的細(xì)菌。通過離心收集后，將上清液進(jìn)行乙醇沉淀。通過離心收集沉淀，并且將沉淀重懸于100pL無菌水中。在37。C用DNA酶I處理該懸浮液1小時(shí)以消化DNA,隨后在37。C用蛋白酶K處理1小時(shí)。然后，加熱使酶失活，并且通過用70%硫酸銨沉淀來除去蛋白質(zhì)。將得到的上清液級分針對10 mMTris-HCl (pH 8.0)透析，產(chǎn)生樣本E。
制備3)蒸發(fā)培養(yǎng)物上清液(20 mL)至干燥。將干燥的物質(zhì)溶解于1ml蒸餾水中。將得到的溶液針對10 mM Tris-HCl (pH 8.0)透析，產(chǎn)生樣本S。 .
<通過二糖分析檢測軟骨素〉
在37。C用在含有50 mM NaOAc的50 mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中的cABC (軟骨素酶ABC,由Seikagaku公司生產(chǎn))處理樣本L、 E和S(每一個(gè)為100 pL)過夜。
作為對照，制備了沒有用cABC處理的樣本L、 E和S以及用熱失活的cABC處理的樣本L、 E和S。進(jìn)4亍超濾以除去大小等于或大于10,000的大分子，并且通過應(yīng)用熒光HPLC系統(tǒng)(J Biol Chem. 2000 Jul21;275(29):2269-2275)的二糖成分分析來分析所述樣本(圖3、 4和5)。在HPLC系統(tǒng)中應(yīng)用Senshu Pak Decosil C22 (4.6 ID. xi50mm)作為分離柱，并將熒光檢測器的激發(fā)和發(fā)射波長分別設(shè)置為346nm和410nm。
結(jié)果，僅在用cABC處理的樣本的情況下檢測到特定峰。每一樣本的二糖組分特征與圖6(A)所示的用cABC處理軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品獲得的樣本的特征接近一致。同時(shí)，在將用cABC處理的軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品和用cABC處理的樣本L混合的情況下，僅一企測到一個(gè)峰，因此確定樣本L含有軟骨素(圖6(B))。在樣本E和S的情況下，得到了相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未給出)。
實(shí)施例4
制備Kfo JC/KfoA共表達(dá)載體〈Kfo」C基因的擴(kuò)增〉
根據(jù)WO2007/145197中描述的方法，克隆了編碼N-端截短的KfoC、包含SEQ ID NO: 5核苷酸序列的DNA(Kfo」C基因)。將該Kfo」C基因插入到pTrcHis中以獲得pTrc扭s-kfo」C。
<pTrcHis-kfo」CA的制備>
應(yīng)用限制性酶Sphl和Smal切割實(shí)施例1中制備的質(zhì)粒pTrcHis-kfoCA。
通過使用相同的限制性酶消化質(zhì)粒pTrcHis-kfo」C而得到DNA片段(2.9 kDa)。按照常規(guī)方法將該DNA片段插入到切割后的質(zhì)粒的Sphl-Smal位點(diǎn)中，然后將得到的質(zhì)粒命名為pTrcHis-kfo」CA。
實(shí)施例5
抗-KfoA和抗-KfoC抗體的制備〈抗-KfoA抗體的制備〉
合成包含SEQ ID No: 15的肽序列的寡肽(CIVSR RDGDI AESWSSPEKA NK,純度〉70 % ),并通過常規(guī)方法將4 mg該寡肽與KLH(鑰孔蟲戚血蘭素)綴合。通過與完全佐劑混合來制備抗原溶液后，以2周的間隔進(jìn)行免疫5次。確認(rèn)了抗體滴度后，收集全血。從每一只兔的血液中分別獲得48 mL(樣本A)和60 mL (樣本B)的抗-KfoA血清。應(yīng)用蛋白A柱純化后，從樣本A中獲得32 ml IgG級分EK-A(IgG濃度5.30mg/mL)。
〈抗-KfoC抗體的制備〉
合成了包含SEQ ID No: 16肽序列的寡肽(CQEPP GKENE TDRAAGK,純度〉70 % )，并通過常規(guī)方法將4 mg該寡肽與KLH(鑰孔蟲戚血蘭素)綴合。通過與完全佐劑混合來制備抗原溶液后，以2周的間隔進(jìn)行免疫5次。確認(rèn)了抗體滴度后，收集全血。從每一只兔的血液中分別獲得65 mL(樣本A)和39mL(樣本B)的抗-KfoA血清。應(yīng)用蛋白A柱純化后，從樣本A中獲得了 39 ml IgG級分EK-A(IgG濃度4.41 mg/mL)。
17
實(shí)施例6
以與實(shí)施例2中相同的方法將pTrcHis-kfo J CA引入到大腸桿菌K5 林中，得到大腸桿菌K5/pTrcHis-kfo」CA抹，并且培養(yǎng)該重組抹以評估 重組蛋白的表達(dá)。
將在補(bǔ)充有100 ppm氨千青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的種子培養(yǎng)物 (0.5 mL)轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充有100 ppm氨千青霉素的CYG培養(yǎng)基(IO mL)中， 并隨后在37。C培養(yǎng)1.5小時(shí)。加入IPTG(終濃度為1 mM)后，再繼續(xù) 培養(yǎng)4小時(shí)。從900 該培養(yǎng)物中收集細(xì)菌細(xì)胞，并懸浮于90 pL Laemmli緩沖液(xl)中。在廢水浴中加熱10分鐘后，將lO(iL該上清液 在7.5 %凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE,并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，隨后進(jìn)行蛋白 質(zhì)印跡分析以檢測重組蛋白的表達(dá)。應(yīng)用稀釋至1/1,000的抗-KfoA抗 體(EK-A)和抗-KfoC抗體(EK-C)用作用于檢測重組蛋白KfoA、 KfoC和 kfoJC的一抗。用抗-兔免疫球蛋白HRP(DAKO^P0448)作為二抗。此 外，應(yīng)用大腸桿菌K5/pTrcHis-kfoCA和大腸桿菌K5/pTrcHis-kfoA進(jìn)行 相同的檢驗(yàn)，以比較重組蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果，在大腸桿菌 K5/pTrcHis-kfoCA和大腸桿菌K5/pTrcHis-kfoA之間的kfoA和kfoC(kfo 」C)的表達(dá)水平?jīng)]有大的區(qū)別(圖7)。
實(shí)施例7
制備多糖及通過二糖分析檢測多糖 <細(xì)菌細(xì)胞的制備〉
以與實(shí)施例3中相同的方式，在121。C高壓滅菌5分鐘后，從大腸 桿菌K5/pTrcHis-kfo」CA抹、大腸桿菌K5/pTrcHis-kfoCA和大腸桿菌 K5/pTrc扭s-kfoA株制備細(xì)菌細(xì)胞和上清液。
<多糖級分的制備>
針對流動的自來水透析所述上清液(l mL)過夜，并然后冷凍干燥透 析的溶液。將冷凍干燥的材料溶解于100|LiL 50mM Tris-HCl(pH8.0)，以 用作多糖級分。
<通過二糖分析來檢測軟骨素〉
以與實(shí)施例3中相同的方法，通過二糖成分分析來分析所獲得的級分。通過熒光HPLC分析軟骨素標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 ju g/mL和100 ju g/mL)以制 得軟骨素的校準(zhǔn)曲線。在軟骨素濃度和不飽和二糖的峰面積」Di-OS之 間的關(guān)系如等式-1所示。二 (0.000591x[峰面積]+ 1.219)/[濃度比率]
(r2=0.9984) (等式-1 )
在乂人大腸桿菌K5/pTrcHis-kfo」CA、大腸桿菌K5/pTrcHis-kfoCA制 備的樣本中檢測與不飽和二糖一致的峰(」Di-OS)(數(shù)據(jù)未顯出)。表1顯 示了應(yīng)用等式-1計(jì)算的重組培養(yǎng)物中的軟骨素濃度的結(jié)果。
表l在重組菌抹的培養(yǎng)物中軟骨素含量的比較
濃度 峰面積軟骨素[昭/mL]
K5/pTrcHis-kfoA 10 K5/pTrcHis-kfoCA 10 K5/pTrcHis-kfoZlCA 10
10,187.4 0.7 505，032.3 30.0 888,677.6 52.6
通過比4支大腸桿菌 K5/pTrcHis-kfo」CA和大腸桿菌 K5/pTrcHis-kfoCA之間的軟骨素產(chǎn)率，重組菌抹K5/pTrcHis-kfoJCA更 適于通過發(fā)酵生產(chǎn)軟骨素。這一結(jié)果提示可通過應(yīng)用編碼N-端截短的 KfoC的kfo」C基因來提高軟骨素產(chǎn)量。
[0041J
工業(yè)實(shí)用性
通過應(yīng)用本發(fā)明的細(xì)菌，可以高效且廉4介地生產(chǎn)軟骨素和石克酸軟骨素。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生UDP-葡糖醛酸的細(xì)菌，為該細(xì)菌引入了衍生自大腸桿菌K4株的kfoA基因和衍生自大腸桿菌K4株的kfoC基因，并且所述細(xì)菌具有產(chǎn)生軟骨素的能力。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的細(xì)菌，其中所述的kfoA基因編碼選自由以下 (A)和(B)所組成的組的蛋白質(zhì)(A) 包含SEQIDNO:2氨基酸序列的蛋白質(zhì)；以及(B) 包含SEQIDNO:2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其包括一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸的替換、缺失、插入或添加并具有UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶活性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述的kfoA基因是選自由以下(a) 和(b)組成的組的DNA:(a) 包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的DNA;和(b) 在嚴(yán)才各條件下與包含和SEQ ID NO: 1互補(bǔ)的核苷酸序列的 DNA雜交并編碼具有UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的DNA。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的細(xì)菌，其中所述的kfoC基因編碼 選自由以下(C)和(D)所組成的組的蛋白(C) 包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；以及(D) 包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其包括一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸的替換、缺失、插入或添加并具有軟骨素合酶活性。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的細(xì)菌，其中所述的kfoC基因是 選自由以下(c)和(d)組成的組的DNA:(c) 包含SEQIDNO: 3的核苷酸序列的DNA;和(d) 在嚴(yán)才各條件下與包含和SEQ ID NO: 3互補(bǔ)的核苷酸序列的 DNA雜交并編碼具有軟骨素合酶活性的蛋白的DNA。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的細(xì)菌，其中所述的kfoC基因編 碼選自由以下(E)和(F)所組成的組的蛋白(E) 包含SEQIDNO:6氨基酸序列的蛋白質(zhì)；以及(F) 包含SEQIDNO:6氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其包括一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸的替換、缺失、插入或添加并具有軟骨素合酶活性。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的細(xì)菌，其中所述的kfoC基因是 選自由以下(e)和(f)組成的組的DNA:(e) 包含SEQ ID NO: 5的核苷酸序列的DNA;和(f)在嚴(yán)才各條件下與包含和SEQ ID NO: 5互補(bǔ)的核苷酸序列的DNA 雜交并編碼具有軟骨素合酶活性之蛋白的DNA。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的細(xì)菌，其中所述的細(xì)菌是大腸 桿菌K5菌株。
9. 生產(chǎn)軟骨素的方法，其至少包括以下步驟(1)和(2):(1) 培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的細(xì)菌；以及(2) 從該培養(yǎng)物中收集軟骨素。
10. 生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法，其包括通過根據(jù)權(quán)利要求9的方法 生產(chǎn)軟骨素；以及將所述軟骨素硫酸化以產(chǎn)生硫酸軟骨素。
11. 包含衍生自大腸桿菌K4株的kfoA基因和衍生自大腸桿菌K4 林的kfoC基因的載體。
全文摘要
通過如下方法生產(chǎn)軟骨素培養(yǎng)引入了衍生自大腸桿菌K4株的kfoA基因和衍生自大腸桿菌K4株的kfoC基因并具有產(chǎn)生軟骨素之能力的產(chǎn)生UDP-葡糖醛酸的細(xì)菌；以及從該細(xì)菌中收集軟骨素。
文檔編號C12N9/90GK101679955SQ20088001307
公開日2010年3月24日 申請日期2008年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月24日
發(fā)明者宮本健太郎, 忰山博美, 鈴木喜義 申請人:生化學(xué)工業(yè)株式會社