專利名稱：嵌合的新城疫病毒vlp的制作方法
嵌合的新城疫病毒VLP 相關(guān)申請本申請要求2007年2月21日提交的美國申請60/902，337的優(yōu)先權(quán)，本文通 過提及而收錄其全部內(nèi)容用于所有目的。發(fā)明背景接種是基于一項簡單的免疫原理 一旦暴露于傳染原(infectious agent)， 動物便啟動免疫防御，其能提供針對由同一媒介物(agent)所引起的疾病的終 身保護(hù)。接種的目標(biāo)是誘導(dǎo)動物在感染之前啟動防御。按照慣例，這已經(jīng)經(jīng) 由使用活體減毒或完全滅活形式的傳染原作為免疫原而實現(xiàn)。這些方法的成 功取決于天然抗原的呈遞，其可引發(fā)天然感染中獲得的整個系列的免疫應(yīng) 答。盡管它們相當(dāng)?shù)爻晒?，但是常?guī)的疫苗方法受到許多潛在的限制。滅活 不充分的疫苗可能引起它們被設(shè)計來預(yù)防的疾病。減毒林可以突變成更具毒 性或非免疫原性。另外，特別擔(dān)憂能建立潛伏期的病毒，諸如皰疹病毒，因 為不知道減毒抹的潛伏性感染是否有任何長期的負(fù)面后果。最后，缺乏培養(yǎng) 許多類型的病毒的有效手段。重組DNA技術(shù)的進(jìn)展提供了基于使用確定的抗原作為免疫原，而不是完 整傳染原來開發(fā)疫苗的潛力。這些包括肽疫苗，其由化學(xué)合成的、免疫反應(yīng) 性表位組成；亞基疫苗，其通過在重組異源細(xì)胞中表達(dá)病毒蛋白而生成；和 活病毒載體用于呈遞一種或多種確定抗原的使用。肽和亞基疫苗都受到許多潛在的限制。主要的問題在于難以確保工程化 蛋白質(zhì)的構(gòu)象模擬抗原在其天然環(huán)境中的構(gòu)象。必須使用合適的佐劑和(在 肽的情況中)載體蛋白來加強(qiáng)免疫應(yīng)答。另外，這些疫苗主要引發(fā)體液應(yīng)答， 如此可能不能引起有效的免疫。亞基疫苗對于其中可證明是由完全滅活病毒 提供保護(hù)的疾病通常是無效的。病毒樣顆粒(virus like particle; VLP)極類似成熟的病毒體，但是它們不含 病毒基因組物質(zhì)(例如病毒基因組RNA)。因此，VLP實質(zhì)上是非復(fù)制性的，這使它們安全用于以免疫原性組合物(例如疫苗)形式施用。另外，VLP可以進(jìn)行工程化改造以在其最天然的生理學(xué)構(gòu)型的VLP表面上表達(dá)病毒包膜糖 蛋白。此外，因為VLP類似完整的病毒體而且是多價的顆粒結(jié)構(gòu)，所以VLP 可能比可溶性包膜蛋白抗原更有效地誘導(dǎo)針對包膜糖蛋白的中和性抗體。進(jìn) 一步，不像許多重組疫苗方法，VLP可以安全而重復(fù)地給所接種的宿主施用。許多有包膜RNA病毒的基質(zhì)樣蛋白質(zhì)在病毒裝配和釋放中發(fā)揮樞要的 作用(Pornillos等(2002) Trends Cell Biol.， 12， 569-579)。這些蛋白質(zhì)通常足夠 用于釋放顆粒。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒Gag前體蛋白在沒有其它病毒成分的情況 下的表達(dá)導(dǎo)致Gag病毒樣顆粒的裝配和釋放(Delchambre等(1989) EMBO J. 8,2653-2660)。來自依波拉病毒(Ebola virus)、皰滲性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)、和流感病毒的基質(zhì)蛋白在單獨表達(dá)時以VLP釋方文(Jasenosky 等(2004) Virus Res. 106， 181-188; Jayakar等Vims Res. 106, 117-132; Gomez-Puertas等J. Virol. 74, 11538-11547)。單獨表達(dá)的人副流感病毒l型 (PIV1)和仙臺病毒(Sendai virus, SV) M蛋白誘導(dǎo)VLP的釋放(Coronel等(1999) J. Virol. 73， 7035-7038; Sakaguchi等Virology 263， 230-243)。猿猴病毒5 VLP (SV5)形成也需要M蛋白的表達(dá)(Schmitt等(2002) J. Virol. 76， 3952-3964),盡 管還可能需要其它蛋白質(zhì)。新城疫病毒(Newcastle disease virus) M蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)時誘導(dǎo) VLP的形成和釋放(Pantua等(2006) J. Virol, 80, 11062-11073)。發(fā)明人利用了 NDVM蛋白的特性，并已經(jīng)設(shè)計了新型VLP、抗原性配制劑和疫苗以幫助預(yù) 防、治療、控制(manage)和/或改善脊推動物中的傳染病。發(fā)明概述本發(fā)明包含嵌合病毒樣顆粒(VLP),其包含新城疫病毒(NDV)核心蛋白 (M)和至少一種來自不同傳染原的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述來自傳 染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白。在另 一個實施方案中，所述病毒蛋白是包膜結(jié)合蛋白(envelope associated protein)。在另一個實施方案中，包膜結(jié)合蛋白在所述VLP的表面 上表達(dá)。在另一個實施方案中，所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白 包含與副流感病毒(PIV)蛋白融合的所述來自不同傳染原的蛋白質(zhì)。在另 一個 實施方案中，所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含與NDV蛋白融合的所述病毒蛋白。
本發(fā)明還包括一種生成嵌合的VLP的方法，其包括轉(zhuǎn)染編碼新城疫病毒 (NDV)核心蛋白(M)和至少 一種來自不同傳染原的蛋白質(zhì)的載體，并在容許 VLP形成的條件下表達(dá)所述載體。在一個實施方案中，所述來自傳染原的蛋 白質(zhì)是病毒蛋白。在另 一個實施方案中，所述病毒蛋白來自選自下組的病毒 流感病毒、登革病毒、黃病毒(yellow virus)、單純皰滲病毒I和II、狂犬病病 毒、副流感病毒、水痘帶狀皰滲病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、人免 疫缺陷病毒、冠狀病毒和肝炎病毒。
本發(fā)明還包括一種抗原性配制劑，其包含嵌合的VLP，所述嵌合的VLP 包含新城疫病毒(NDV)核心蛋白(M)和至少 一種來自不同傳染原的蛋白質(zhì)。 在一個實施方案中，所述病毒蛋白在所述VLP的表面上表達(dá)。在另一個實施 方案中，所述病毒蛋白包含會在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的表位。在 另一個實施方案中，所述病毒蛋白的部分包含會在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性免 疫應(yīng)答的表位。在另一個實施方案中，所述抗原性配制劑包含佐劑。在另一 個實施方案中，所述佐劑是Novasomes。
本發(fā)明還包括一種疫苗，其包含嵌合的VLP，所述嵌合的VLP包含新城 疫病毒(NDV)核心蛋白(M)和至少一種來自不同傳染原的蛋白質(zhì)。在一個實 施方案中，來自傳染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白。在另一個實施方案中，所述病 毒蛋白包含會在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的表位。在另一個實施方案 中，所述疫苗包含佐劑。在另一個實施方案中，所述佐劑是Novasomes。在 另 一個實施方案中，所述VLP被混合在一起以產(chǎn)生多價配制劑。
本發(fā)明還包括一種在脊推動物中誘導(dǎo)免疫的方法，包括給所述脊推動物 施用嵌合的VLP,所述嵌合的VLP包含新城疫病毒(NDV)核心蛋白(M)和至少 一種來自不同病毒的病毒蛋白。在一個實施方案中，來自傳染原的所述蛋白 質(zhì)是病毒蛋白。在另一個實施方案中，其中所述免疫應(yīng)答是體液免疫應(yīng)答。 在另一個實施方案中，所述免疫應(yīng)答是細(xì)胞免疫應(yīng)答。
附圖簡述
圖l表示用于制備包含流感蛋白的嵌合NDV VLP的構(gòu)建體。
發(fā)明詳述定義
如本文中所使用的，術(shù)語"佐劑"指這樣的化合物，在其與特定的免疫
原(例如VLP)在配制劑中組合使用時，會提升或以其它方式改變或修飾由此 所致的免疫應(yīng)答。對免疫應(yīng)答的修飾包括對抗體和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)化或 使其特異性增寬。對免疫應(yīng)答的修飾還可以意味著降低或抑制某些抗原特異 性免疫應(yīng)答。
如本文中所使用的，"有效劑量" 一般指足以誘導(dǎo)免疫、預(yù)防和/或改善 感染或減輕至少一種與感染癥狀、和/或增強(qiáng)另一劑VLP的功效的本發(fā)明VLP 的量。有效劑量可以指足以延遲感染發(fā)作或使之最小化的VLP的量。有效劑 量還可以指在感染的治療或控制中提供治療益處的VLP的量。此外，有效劑 量是就單獨的或與其它療法組合在感染的治療或控制中提供治療益處的本 發(fā)明VLP而言的量。有效劑量還可以是足以增強(qiáng)受試者(例如人)自己針對后 來向傳染原暴露的免疫應(yīng)答的量。免疫水平可以通過例如測量中和性分泌抗 體和/或血清抗體的量來加以監(jiān)測，所述測量例如通過噬斑中和(plaque neutralization),補(bǔ)體結(jié)合(complement fixation),酶聯(lián)免疫吸附、或樣t中和 (microneutralization)測定法來進(jìn)行。在疫苗的情況中，"有效劑量"是預(yù)防疾 病和/或降低癥狀嚴(yán)重性的劑量。
如本文中所使用的，術(shù)語"有效量，，指實現(xiàn)想要的生物學(xué)效應(yīng)所必需的 或足以實現(xiàn)想要的生物學(xué)效應(yīng)的VLP的量。組合物的有效量將是達(dá)到選定結(jié) 果的量，并且該量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員按常規(guī)確定。例如，用于預(yù)防、治 療和/或改善感染的有效量可以是引起免疫系統(tǒng)活化所必需的量，其導(dǎo)致在暴 露于本發(fā)明VLP時形成抗原特異性免疫應(yīng)答。該術(shù)語也是"足夠量"的同義 詞。
如本文中所使用的，術(shù)語"多價"指具有針對多種媒介物(agent)類型或 毒抹的多種抗原性蛋白質(zhì)的VLP。
如本文中所使用的，術(shù)語"免疫刺激物"指經(jīng)由身體自身的化學(xué)信使(細(xì) 胞因子)增強(qiáng)免疫應(yīng)答的化合物。這些分子包括具有免疫刺激、免疫強(qiáng)化和 促炎癥活性的各種細(xì)胞因子、淋巴因子和趨化因子，諸如白介素(例如IL-I、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL匿6、 IL-12、 IL畫13);生長因子(例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(GM) 集落刺激因子(CSF));及其它免疫刺激分子，諸如巨噬細(xì)胞炎性因子、Flt3 配體、B7.1; B7.2、 CD28等。免疫刺激物分子可以在與本發(fā)明VLP相同的配制劑中施用，或者可以分開施用?？梢允┯玫鞍踪|(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的表達(dá)載 體來產(chǎn)生免疫刺激效應(yīng)。
如本文中所使用的，術(shù)語"保護(hù)性免疫應(yīng)答"或"保護(hù)性應(yīng)答"指由脊 推動物(例如人)所展現(xiàn)出的、由針對傳染原的抗體所介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，其預(yù)
防或改善感染或減輕其至少一種癥狀。本發(fā)明的VLP可以刺激如下抗體的生
成，所述抗體例如中和傳染原、阻斷傳染原進(jìn)入細(xì)胞、阻斷所述傳染原的復(fù) 制、和/或保護(hù)宿主細(xì)胞免于感染和破壞。該術(shù)語還可以指由脊推動物(例如
人)所展現(xiàn)出的、由T淋巴細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞介導(dǎo)的針對傳染原的免疫應(yīng) 答，其預(yù)防或改善RSV感染或減輕其至少一種癥狀。
如本文中所使用的，術(shù)語"傳染原"指引起脊推動物中的感染的微生物。 通常，所述生物體是病毒、細(xì)菌、寄生物和/或真菌。
如本文中所使用的，術(shù)語"抗原性配制劑"或"抗原性組合物"指在向 脊推動物(例如哺乳動物)施用時會誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的制備物。
如本文中所使用的，術(shù)語"疫苗"指含有本發(fā)明VLP的配制劑，其處于 能夠向脊推動物施用的形式，而且其誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答足以誘導(dǎo)免疫以 預(yù)防和/或改善感染和/或減輕至少一種感染癥狀和/或增強(qiáng)另一劑VLP的功 效。通常，疫苗包含本發(fā)明組合物懸浮或溶解于其中的常規(guī)鹽水或緩沖的水 溶液介質(zhì)。處于這種形式，便可以方便地使用本發(fā)明的組合物以預(yù)防、改善 或以其它方式治療感染。導(dǎo)入宿主中后，疫苗能夠引起免疫應(yīng)答，包括但不 限于抗體和/或細(xì)胞因子的生成和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、輔助T 細(xì)胞、樹突細(xì)胞的活化和/或其它細(xì)胞應(yīng)答。
如本文中所使用的，術(shù)語"脊推動物，，或"受試者"或"患者"指脊推 動物亞門(subphylum cordata)的任何成員，包括但不限于人和其它靈長類， 包括非人靈長類，諸如黑猩猩(cgunoabzee)和其它猿類(apes)和猴物種 (monkey species)。 家畜(farm animal)(諸如牛、纟帛羊、豬、山羊和馬)；家養(yǎng) 哺乳動物(domestic mammal)(諸如狗和貓)；實-驗動物(包括嚙齒動物，諸如小 鼠、大鼠(包括棉鼠)和豚鼠)；鳥類(包括家禽、野鳥和獵禽，諸如雞、火雞 及其它鶉雞類鳥類、鴨、鵝)等也是非限制性例子。該定義中包括術(shù)語"哺 乳動物"和"動物"。意圖涵蓋成體和新生個體兩者。具體地，嬰幼兒是RSV 疫苗合適的受試者或患者。
如本文中所使用的，術(shù)語"病毒樣顆粒"(VLP)指在至少一種屬性上類
12似病毒但是已經(jīng)證明其沒有感染性的結(jié)構(gòu)。依照本發(fā)明的病毒樣顆粒不攜帶編碼病毒樣顆粒的蛋白質(zhì)的遺傳信息。 一般而言，病毒樣顆粒缺乏病毒基因組，因此是非感染性的。另外，病毒樣顆粒通?？梢酝ㄟ^異源表達(dá)來大量生產(chǎn)，而且可以容易地純化。
如本文中所使用的，術(shù)語"嵌合的VLP"指含有來自至少兩種不同媒介
物的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分的VLP。通常，蛋白質(zhì)之一衍生自能驅(qū)動VLP從宿主細(xì)胞形成的病毒。出于例示目的的例子是新城M和/或流感M蛋白。術(shù)語新城VLP和嵌合的VLP可以在適當(dāng)時互換使用。
如本文中所使用的，術(shù)語"NDV基質(zhì)"、"NDV M"或"NDV核心"蛋白指NDV膜蛋白，其在宿主細(xì)胞中表達(dá)時誘導(dǎo)有包膜VLP的形成。代表性NDVM蛋白是SEQIDNo. 1。所述術(shù)語還包括NDV M的任何變體、衍生物和/或片段，其在宿主細(xì)胞中表達(dá)時誘導(dǎo)VLP形成。該術(shù)語還涵蓋編碼NDV M和/或其任何變體、衍生物和/或片段的核苷酸序列，其在轉(zhuǎn)染(或感染)入宿主細(xì)胞中時會表達(dá)NDV M蛋白，并誘導(dǎo)VLP形成。
本發(fā)明的VLP及制備VLP的方法
一般而言，病毒樣顆粒缺乏病毒基因組，因此是非感染性的。另外，病毒樣顆粒通?？梢酝ㄟ^異源表達(dá)來大量生產(chǎn)，而且可以容易地純化。病毒樣顆粒("VLP，，)至少包含病毒核心蛋白。這種核心蛋白會驅(qū)動出芽，并從宿主細(xì)胞釋放顆粒。此類蛋白質(zhì)的例子包括RSVM、流感M1、 HIVgag、和皰疹性口炎病毒(VSV) M蛋白。最近，已經(jīng)顯示了，在新城疫病毒(NDV)的M蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)時，形成并釋放顆粒(Pantua等(2006) J. Virol, 80，11062-11073)。然而，作為免疫原的有用VLP通常會需要至少一種在VLP表面上的蛋白質(zhì)。這些VLP對于誘導(dǎo)針對所述蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答或者對于將VLP靶向至特定細(xì)胞會是有用的。雖然包含來自相同病毒的核心蛋白和蛋白質(zhì)的VLP是有用的，但是這種類型的VLP將限于特異性針對所迷病毒的疫苗和其它用途。會有用的是這樣的平臺，其中能夠制備其表面上的蛋白質(zhì)來自不同媒介物的VLP。就本發(fā)明而言，此類VLP稱為"嵌合的VLP"。這些VLP對于設(shè)計針對由不同媒介物引起的疾病的疫苗等會是有用的。
如此，本發(fā)明包含嵌合病毒樣顆粒(VLP),其包含新城疫病毒(NDV)核心蛋白(M)和至少一種來自不同傳染原的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述來自傳染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白。在另一個實施方案中，所述病毒蛋白是包膜結(jié)合蛋白。在另一個實施方案中，所述包膜結(jié)合蛋白是在VLP的表面上表達(dá)的。在另一個實施方案中，所述包膜結(jié)合蛋白包含會在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的表位。
本發(fā)明的VLP對于制備疫苗和免疫原性組合物是有用的。VLP的一個重要特征在于呈遞表面蛋白以使得脊推動物的免疫系統(tǒng)針對所述蛋白質(zhì)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。然而，不是所有的蛋白質(zhì)都可以在VLP的表面上表達(dá)或呈遞。某些蛋白質(zhì)不能在VLP的表面上表達(dá)或呈遞，或者表達(dá)或呈遞不佳可能有許多原因。 一種原因是所述蛋白質(zhì)不定向于宿主細(xì)胞膜，或者所述蛋白質(zhì)沒有跨膜域。然而，病毒確實具有在其結(jié)構(gòu)的表面上表達(dá)某些蛋白質(zhì)的天然能力。
如此，在一個實施方案中，本發(fā)明包含含有嵌合蛋白的VLP,其中所述嵌合蛋白包含與NDV或副流感病毒(PIV)蛋白融合的來自傳染原的蛋白質(zhì)。PIV與NDV有關(guān)。如此，PIV成分可以容易地指向VLP的表面，因為NDV蛋白是定向的。用PIV或NDV病毒蛋白(諸如融合物(F)或血凝素(hemeagglutinin;HN)或其片段)構(gòu)建嵌合蛋白是有利的，因為所述嵌合蛋白可以將細(xì)胞機(jī)器(cell machinery)指導(dǎo)成向VLP中摻入所述嵌合蛋白。在另一個實施方案中，所述PIV蛋白選自由PIV HN和F蛋白或其片段組成的組。在另一個實施方案中，所述來自傳染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白。在另一個實施方案中，所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述PIV蛋白的一部分。在另 一個實施方案中，病毒蛋白的所述部分在VLP的表面上表達(dá)。在另一個實施方案中，病毒蛋白的所述部分包含會在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的表位。在另一個實施方案中，PIV蛋白的所述部分直接或間接地與NDVM蛋白結(jié)合。
在另一個實施方案中，本發(fā)明包含含有嵌合蛋白的嵌合的VLP,其中所述嵌合蛋白包含與NDV蛋白融合的來自傳染原的蛋白質(zhì)。在另 一個實施方案中，所述來自傳染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白。在另一個實施方案中，所述NDV蛋白選自由NP、 F、和HN蛋白組成的組。在另一個實施方案中，所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述NDV蛋白的一部分。在另 一個實施方案中，病毒蛋白的所述部分在VLP的表面上表達(dá)。在另一個實施方案中，病毒蛋白的所述部分包含會在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性抗體應(yīng)答的表位。在另一個實施方案中，NDV蛋白的所述部分直接或間接地與NDV M蛋白結(jié)合。在另一個實施方案中，所述嵌合NDVVLP包含這樣一種嵌合蛋白，其中NDVHN 和/或F蛋白的跨膜和/或C末端域與傳染原(諸如流感、VZV、 RSV和/或登革 病毒)蛋白質(zhì)的外部域融合。在另一個實施方案中，所述嵌合NDVVLP包含 這樣一種嵌合蛋白，其包含流感HA和/或NA蛋白的外部域和NDV HN和/或F 蛋白的跨膜和/或C末端域(參見例如SEQIDNO 10)。在另一個實施方案中， 所述嵌合的VLP包含SEQ ID NO 10。
傳染原可以是病毒、細(xì)菌和/或寄生物。可在嵌合的NDV VLP的表面上 表達(dá)的蛋白質(zhì)可以衍生自病毒、細(xì)菌和/或寄生物。自病毒、細(xì)菌和/或寄生
預(yù)防、治療、控制和/或改善所述脊推動物中的傳染病。
可以衍生所述傳染原蛋白質(zhì)的病毒的非限制性例子如下季候性流感、 禽流感或大流行性流感(pandemic influenza) (A和B,例如HA和/或NA)、冠狀 病毒(例如SARS)、曱型、乙型、丙型、丁型和戊3型肝炎病毒、人免疫缺陷 病毒(HIV)、皰滲病毒l、 2、 6和7,巨細(xì)胞病毒、水痘帶狀皰滲、乳頭瘤病 毒、i矣巴病毒(Epstein Barr vims)、富"t感病毒、A夂病毒、布尼亞病毒(bunya virus)(例如漢坦病毒(hanta virus))、柯薩奇病毒(coxsakie virus)、 小RNA病毒 (picoma vims)、 4侖^l犬病毒、鼻病毒、風(fēng)滲病毒(mbella virus)、月思&,炎病毒、 麻滲病毒(measles virus)、風(fēng)滲病毒(Rubella virus)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(多種類 型)、腺病毒(多種類型)、副流感病毒(多種類型)、禽流感(各種類型)、運輸 熱病毒(shipping fever virus)、 西方和東方馬月鹵脊髓炎(Western and Eastern equine encephalomyelitis)、 日本月鹵脊ft炎(Japanese encephalomyelitis)、 雞痘、 狂犬病病毒、月S十曼病毒(slow brain virus)、 勞#々肉瘤病毒(rous sarcoma virus)、 乳多空病毒科(Papovaviridae)、 細(xì)小病毒科(Parvoviridae) 、 'J 、 RNA病毒科 (Pkomaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)(諸如天花或牛痘)、呼腸孤病毒科 (Reoviridae)(例如輪狀病毒)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)(HTLV-I、 HTLV-II、 慢病毒屬(Lentivirus))、披膜病毒科(Togaviridae)(例如風(fēng)滲病毒屬 (Rubivirus))、呼吸道合胞病毒(RSV)、西尼羅河熱病毒(West Nile fever virus)、 蜱媒腦炎(Tick borne encephalitis)、黃熱病、屈曲病毒(chikungunya virus)、和 登革病毒(所有血清型)。
在另一個實施方案中，來自病毒的特定蛋白質(zhì)可以包含來自RSV的F 和/或G蛋白、來自流感病毒(包括禽流感病毒或大流行性流感病毒)的HA和/或NA、來自冠狀病毒的S蛋白、來自HIV的gp160、 gpWO和/或gp41,來自水 痘帶狀皰疹的gpI至IV和Vp,來自黃熱病毒的E和preM/M、登革病毒(所有血 清型)或任何黃病毒(flavivims)。還包括的是能在脊推動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(細(xì) 胞的和/或體液的)的來自病毒的任何蛋白質(zhì)，其可以預(yù)防、治療、控制和/或 改善所述脊推動物中的傳染病。

圖1中顯示了上文構(gòu)建體的例子。
可以從中衍生所述傳染原蛋白質(zhì)的細(xì)菌的非限制性例子可以從下列各 項衍生百日咳桿菌(及/ eWww'j)、波摩那鉤端螺旋體(丄e/ toi^/ra尸owo"")、 曱型和乙型副傷寒沙門氏菌(&para(y;^)、白喉棒桿菌(C. c^Mzen'ae)、破傷 風(fēng)梭菌(C. tetom')、肉毒梭菌(C, 6o/w//""m)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C. pe^7'"gms)、 費氏梭菌(C7^e〃')及其它氣性壞疽細(xì)菌，炭疽芽孢桿菌C5. flw^rac&)、鼠疫 巴斯德氏菌CP / e幼'力、多殺巴斯德氏菌(P ww/tocWfl)、腦膜炎奈瑟氏球菌 (A^'Merz,a附em'"g/Z7.(i&s)、 淋病奈瑟氏王求菌(iV. go"o/r/7e"e)、 流感嗜血菌 (//emo/ /n7iw /"y7wewzae)、 》丈線菌屬(Actinomyces)(例如i若卡氏菌屬 (Norcardia))、不動桿菌屬(v4c/"eto^ac&r)、芽胞桿菌科(Bacillaceae)(例如炭疽 才干菌(fiac/〃ws aW/7rac&)) 、 #以4干菌屬(Bacteroides)(例長口脆弱4以^干菌(BacterazVfes /rag/to))、芽生菌病(Blastomycosis)、博德特氏菌屬(Bordetella)、疏螺旋體屬 (Borrelia)(例如布氏疏螺旋體(^ 玎￡//" 6z^gdor/en'))、布魯氏菌屬(Brucella)、 彎曲桿菌屬(Campylobacter)、 衣原體屬(Chlamydia) 、 ^求孢子菌屬 (Coccidioides)、斗奉才干菌屬(Corywe6acfen'wm)(例^口白口娛才奉^干菌(Cor;yne6acten,Mm ^^/2en'ae))、大腸桿菌(五.co/Z)(例如腸產(chǎn)毒性大腸桿菌和腸出血性大腸桿菌)、 腸桿菌屬(Enterobacter)(例如產(chǎn)氣腸桿菌(￡"/era6ac&r aeragew"))、腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)(克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、沙門氏菌屬(Salmonella)(例如 4方寒沙、門氏菌(iSa/wo"e〃a (yp/n')、腸炎沙、門氏菌(5"a/mo"e/Za e",en'"(ifs))、沙、雷 氏菌屬(Serratia)、耶爾森菌屬(Yersinia)、志賀氏菌屬(Shigella))、丹毒絲菌屬 (Erysipelothrix)、 嗜血桿菌屬(Haemophilus)(例如乙型流感嗜血屬 (//aemo/ /H7w type B))、 螺片干菌屬(Helicobacter)、 軍團(tuán)菌屬
(Legionella)(例如4曼月申軍團(tuán)菌(Zeg/owe〃a /wewwo; /n7a))、 鉤端螺S走體屬 (Leptospira)、利斯特菌屬(Listeria)(例如單核細(xì)胞增生利斯特菌("WeWfl mowoqytogewe力)、斗支^^、體屬(Mycoplasma)、分才支斥干菌屬(Mycobacterium)(l列^口 麻風(fēng)分斗支#干菌(綺coZ)"cfen.ww /epr"e)和纟吉斗亥分斗支4干菌(踏cofe""en'ww m/ ercM/cw;y))、弧菌屬(Vibrio)(例如霍亂弧菌(WZWo c/7o/erae))、巴斯德氏菌屬OPoytewe〃acea)、變形菌屬(Proteus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(例如銅綠假 單月包菌CPseMcfomowas aen/g/"oya))、 立克次氏體牙牛(Rickettsiaceae)、蟲累體屬 (Spirochetes)(例長口密蟲累》走體(Treponema spp.)、 4勾端蟲累i走體(Leptospira spp.)、 疏螺旋體(Borrelia spp.))、志賀氏菌(Shigella spp.)、腦膜炎球菌屬 (Meningiococcus)、月申炎王求菌屬(Pneumococcus)禾口《連3求菌屬(Streptococcus)(1"列 如肺炎4連i求菌OS^eptococcw /7"ewmo"/ae)和A組、B組、和C組鏈3求菌)、尿枝 原體屬(Ureaplasmas)、蒼白密螺旋體(7 epo"emapo〃/血w)、金黃色葡萄球菌 (5Vop/^/ococcws ai/re—、溶血巴斯德氏菌(尸a他wre〃a /zae,/,'—、白喉棒桿 菌類毒素(Cbr_y"e6acten-Mw (iz^/zen'ae toxoid)、 腦月莫炎球菌多糖 (Meningococcal polysaccharide)、 百曰咳桿菌(Borafete〃a peWwwi)、肺炎鏈3求 菌(&re/ tococc ^ / we"wo"/"e)、石皮"f另風(fēng)沖麥菌類毒素(C7o^〃W/wm feto"/ toxoid)、 和牛分枝桿菌(鄉(xiāng)coZ acte"'訓(xùn)6ov/力。
可以從中衍生所述傳染原蛋白質(zhì)的寄生物的非限制性例子如下利什曼 病(leishmaniasis)(墨西哥熱帶利什曼原蟲(丄e^/zmam'a /rap/ca mex/caw")、熱帶 利"f十曼原蟲(丄e&Zzmam'a /ra/ /c")、石貞大利ff"曼原蟲(丄e^/2mam'a wq/or)、 i矣塞 #1比亞利fl"曼原、蟲(丄e/s/zmam-" ae^z/op/ca)、 巴西利4十曼原、蟲(丄e^/zwaw'a 、杜氏利什曼原蟲(丄e^/zmaw'a cfo"ova"0 、嬰兒利什曼原蟲 (丄ez^/zm(3W'(3 /w/a"/wm)、十合氏利ff"曼原蟲(丄ez、/2ma"/a c/zagaw')) 、 4,蟲病 (trypanosomiasis)(岡比亞布氏《,蟲(7>_y/7a"osoma Z rwcez' gam6/erae)、 羅4尋西亞 布氏4,蟲(7>_y/7(3mwoma 6race/ r/ odew'erae))、弓形體病(toxoplasmosis)(剛i也弓 開j體(7bxo/ /oym(3 gcwW/))、血吸蟲病(schistosomiasis)(i矣及血吸蟲(Sc/z/Wosoma Zz(3e附atoZu'w附)、日本血'吸蟲((Sc/2Z.Wosoma 7."PO附'cw附)、曼森氏血吸蟲 (5"c/n.Woyoma mawsom')、 湄公血吸蟲(Sc/n.Wasoma weA:owg/)、 間4翁血吸蟲 (Sc/7&tosowa /"&rca/a^/m))、疰疾(間曰疾原蟲(尸/osmo^Y/m Wrax)、 惡寸生癥原 蟲(P/asmo(i/Mm y^/c7》(3n'Mm)、三日癡原、蟲(尸/osTWO(i/MW ma/an.ae)和卵形疾原蟲 (尸/aywoAMm ova/e))、阿米巴病(;容組織內(nèi)阿米巴(五"towwek /^to(v〃ca))、巴 貝西蟲病(Babesiosis)(田鼠巴貝西蟲(^36ew'a^ wz'cra"))、 隱孑包子蟲病 (Cryptosporidiosis)(農(nóng)i小隱孑包子蟲(CV7/ to5pon.&wm p"n;MW))、 雙沖亥P可米巴病 (Dientamoebiasis)(脆弱雙核阿米巴(Z)/ewtomoe6a yhs^'fc))、 賈第蟲病 (Giardiasis)(蘭氏賈第鞭毛蟲(G/ani/a /amW/a))、蠕蟲病(Helminthiasis)和毛滴 蟲屬(Trichomonas)(陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis))。上文所歹'J意圖例示，決不意圖將本發(fā)明局限于這些特定的細(xì)菌、病毒或寄生生物體。
本發(fā)明還涵蓋本發(fā)明VLP之上或之中所表達(dá)的所述蛋白質(zhì)的變體。所述 變體可含有在組分蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的變化。術(shù)語"變體"就蛋白質(zhì)而
言指相對于參考序列改變了 一個或多個氨基酸的氨基酸序列。變體可以具有 "保守的"變化，其中用于替代的氨基酸具有類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性，例如 用異亮氨酸替換亮氨酸?；蛘?，變體可以具有"非保守的，，變化，例如用色 氨酸替換甘氨酸。類似的次要變化還可以包括氨基酸缺失和/或插入。使用本
領(lǐng)域公知的計算機(jī)程序，例如DNASTAR軟件，可以找到確定哪些氨基酸殘 基可供替代、插入或缺失而不消除生物學(xué)活性或免疫學(xué)活性的指導(dǎo)。
天然變體可由于蛋白質(zhì)中的突變而發(fā)生。這些突變可能導(dǎo)致各組傳染原 (例如流感)內(nèi)的抗原變異性(antigenic variability)。如此，感染了流感毒抹的 人形成針對該病毒的抗體，在更新的病毒株出現(xiàn)時，針對較舊毒抹的抗體不 再識別較新的病毒，而可以發(fā)生再感染。本發(fā)明涵蓋用于制備VLP的來自傳 染原的所有抗原變異性和遺傳變異性。
描述可應(yīng)用于本發(fā)明的分子生物學(xué)技術(shù)(諸如克隆、突變、細(xì)胞培養(yǎng)等) 的通用孝丈牙+書包才舌Berger禾口Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods于Enzymology巻152 Academic Press, Inc., San Diego， Calif. (Berger); Sambrook等，Molecular Cloning—A Laboratory Manual (第3版),巻l-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y" 2000 ("Sambrook，，)和 Current Protocols in Molecular Biology, R M. Ausubel等編,Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., ("Ausubel")。這些教科書描述了誘變、載體的應(yīng)用、啟動子和許多其它 相關(guān)的題目，所述題目涉及例如RSV的F和/或G分子的克隆和突變等。如此， 本發(fā)明還涵蓋使用已知的蛋白質(zhì)工程和重組DNA技術(shù)的方法來改進(jìn)或改變 在本發(fā)明VLP之上或之中表達(dá)的蛋白質(zhì)的特性。可使用多種類型的誘變來產(chǎn) 生和/或分離編碼蛋白質(zhì)分子的變體核酸和/或進(jìn)一步修飾/突變本發(fā)明VLP之 中或之上的蛋白質(zhì)。它們包括但不限于定點誘變、隨機(jī)點誘變、同源重組 (DNA改組)、使用含尿嘧咬模板進(jìn)行的誘變、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變、硫代磷 酸修飾的DNA誘變、使用缺口雙鏈體DNA的誘變等。其它合適的方法包括 點錯配修復(fù)(point mismatch repair)、使用修復(fù)缺陷的宿主抹的誘變，限制選 擇和限制純化、缺失誘變、通過全基因合成的誘變、雙鏈斷裂修復(fù)等。誘變
18(例如牽涉嵌合構(gòu)建體的誘變)也包括在本發(fā)明中。在一個實施方案中，可通 序列比較、物理7生質(zhì)、'晶體i構(gòu)等)來指導(dǎo)誘變。 '、
活性(例如能夠引發(fā)有效的抗體應(yīng)答)的蛋白質(zhì)變體。這樣的變體包括缺失、 插入、倒位、重復(fù)、和替代，根據(jù)本領(lǐng)域已知的一般規(guī)則來選擇它們，使得 其對活性基本沒有影響。突變的實例是去除蛋白質(zhì)中的切割位點。
克隆所述蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，編碼特定新城蛋白的基 因可以作為合成基因以化學(xué)方法合成，或者可以從感染了所述病毒的細(xì)胞提
取多聚腺普酸化mRNA，通過RT-PCR從中分離出編碼特定新城蛋白的基因。 所得的基因產(chǎn)物可以作為DNA插入物克隆入載體中。術(shù)語"載體"指可用于 擴(kuò)增(propagate)核酸和/或在生物體、細(xì)胞、或細(xì)胞組分之間轉(zhuǎn)移核酸的工具。 載體包括自主復(fù)制或可整合入宿主細(xì)胞的染色體中的質(zhì)粒、病毒、噬菌體、 原病毒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子、人工染色體等。載體還可以是非自主復(fù)制性的棵 RNA多核苷酸、棵DNA多核普酸、在同一條鏈內(nèi)由DNA和RNA兩者組成的 多核苷酸、聚賴氨酸綴合的DNA或RNA、肽綴合的DNA或RNA、脂質(zhì)體綴 合的DNA等。在許多但不是所有的常見實施方案中，本發(fā)明的載體是質(zhì)?；?桿粒(bacmid)。
如此，本發(fā)明包括這樣的核香酸，它們編碼克隆入可在細(xì)胞中表達(dá)的表 達(dá)載體中的蛋白質(zhì)(包括嵌合蛋白)，誘導(dǎo)本發(fā)明VLP的形成。"表達(dá)載體"是 能夠促進(jìn)摻入其中的核酸的表達(dá)以及復(fù)制的載體，諸如質(zhì)粒。通常，要表達(dá) 的核酸與啟動子和/或增強(qiáng)子"可操作連接"，并受該啟動子和/或增強(qiáng)子的轉(zhuǎn) 錄調(diào)控。在一個實施方案中，所述核苷酸編碼嵌合蛋白(例如如上文所討論 的PIV或NDV嵌合蛋白)。在另一個實施方案中，所述載體包含編碼NDV M 蛋白和至少一種來自傳染原的蛋白質(zhì)的核苦酸。在另一個實施方案中，所述 載體包含編碼NDV M蛋白和與PIV或NDV或其部分融合的至少一種來自傳 染原的蛋白質(zhì)、或其部分。在另一個實施方案中，所述表達(dá)載體是桿狀病毒 載體。
在一些實施方案中，突變含有這樣的變化，其產(chǎn)生沉默的替代、添加或 缺失，但是不改變被編碼蛋白質(zhì)的特性或活性或者生成這些蛋白質(zhì)的方式。 可以出于多種原因而產(chǎn)生核苷酸變體，例如為了針對特定宿主優(yōu)化密碼子表達(dá)(將密碼子改變?yōu)槔ハx細(xì)胞諸如Sf9細(xì)胞優(yōu)選的那些密碼子，參見SEQ ID NO 5、 6、 7和8)。參見美國專利公開文本2005/0118191,將其通過提述而完 整收錄于本文中用于所有目的。
另外，可對核苷酸測序以確保正確的編碼區(qū)得到克隆，且不含有任何不 想要的突變?？梢詫⑺龊塑账醽喛寺∪氡磉_(dá)載體(例如桿狀病毒)中用于在 任意細(xì)胞中表達(dá)。上文僅僅是如何能夠克隆用于嵌合的VLP的蛋白質(zhì)的一個 例子。本發(fā)明技術(shù)人員理解，其它方法也是可用和可能的。
本發(fā)明還提供這樣的構(gòu)建體和/或載體，其包含編碼NDV結(jié)構(gòu)基因(包括 M、 F、 HN和/或NP)或其部分，和/或PIV F和/或HN或其部分，和/或上文所 述的任何嵌合蛋白的核苷酸。載體可以是例如噬菌體、質(zhì)粒、病毒、或逆轉(zhuǎn) 錄病毒載體。構(gòu)建體和/或包含上文構(gòu)建體的載體應(yīng)當(dāng)與合適的啟動子可操作 連接，諸如AcMNPV多角體蛋白啟動子(或其它桿狀病毒)、入噬菌體PL啟動 子、大腸桿菌lac、 phoA和tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子、和逆轉(zhuǎn)錄LTR 的啟動子是非限制性例子。根據(jù)想要的宿主細(xì)胞和/或表達(dá)率，本領(lǐng)域技術(shù)人 員會知道其它合適的啟動子。表達(dá)構(gòu)建體將進(jìn)一步含有轉(zhuǎn)錄起始位點、終止 位點、以及被轉(zhuǎn)錄區(qū)中用于翻譯的核糖體結(jié)合位點。所述構(gòu)建體所表達(dá)的轉(zhuǎn) 錄物的編碼部分優(yōu)選在要翻譯的蛋白質(zhì)的起始處包含翻譯起始密碼子，而在 該蛋白質(zhì)末尾處的合適位置上含有終止密碼子。
表達(dá)載體將優(yōu)選包含至少一種選擇標(biāo)志。此類標(biāo)志物包括用于真核細(xì)胞 培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶、G418或新霉素抗性，以及用于培養(yǎng)大腸桿菌和其它 細(xì)菌的四環(huán)素、卡那霉素或氨千青霉素抗性基因。優(yōu)選的載體包括病毒載體， 諸如桿狀病毒、痘病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒(avipox virus)、金絲雀痘病 毒、禽痘病毒(fowlpoxvims)、浣熊痘病毒、豬痘病毒等)、腺病毒(例如犬腺 病毒)、皰滲病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒?？膳c本發(fā)明一起使用的其它載體包括用于 細(xì)菌的載體，包括pQE70、 pQE60和pQE-9， pBluescript載體、Phagescript載 體、pNH8A、 pNH16a、 pNH18A、 pNH46A、 ptrc99a、 pKK223畫3、 pKK233-3、 pDR540 、 pRIT5 。優(yōu)選的真核載體包括pFastBacl pWINEO 、 pSV2CAT、 pOG44 、 pXTl和pSG、 pSVK3、 pBPV、 pMSG、和pSVL。其它合適的載體是本領(lǐng)域 技術(shù)人員顯而易見的。在一個實施方案中，包含NDV、 M、 F、 HN和/或NP 或其部分，和/或PIV F和/或HN或其部分，和/或上文所迷的任何嵌合蛋白的 所述載體是pFastBac。在一個實施方案中，基本上由NDV、 M、 F、 HN和/
20或NP或其部分，和/或PIVF和/或HN或其部分，和/或上文所述的<壬何嵌合蛋 白組成的所述載體是pFastBac。在一個實施方案中，由NDV、 M、 F、 HN和/ 或NP或其部分，和/或PIVF和/或HN或其部分，和/或上文所述的4壬何嵌合蛋 白組成的所述載體是pFastBac。
接下來，上文所提及的重組構(gòu)建體可以用來轉(zhuǎn)染、感染、或轉(zhuǎn)化，并且 可以在真核細(xì)胞和/或原核細(xì)胞中表達(dá)NDV M蛋白和NDV、 F、 HN和/或NP 或其部分，和/或PIV F和/或HN或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白。 如此，本發(fā)明提供了包含載體(或多個載體)的宿主細(xì)胞，所述載體含有的核 酸在容許形成VLP的條件下于所述宿主細(xì)胞中表達(dá)上文所述構(gòu)建體。
真核宿主細(xì)胞包括酵母、昆蟲、禽類、植物、秀麗隱桿線蟲(C. e/egam) (或線蟲)和哺乳動物宿主細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞的非限制性例子有草地夜蛾 OS; odc^era/n/g^e^G) (Sf)細(xì)i包、例如Sf9、 Sf21， 4分紋夜蛾(7Hc/zo; /ws/a 細(xì)胞，例如HighFive細(xì)胞，和果蠅(Z)myo/7/w7a)S2細(xì)胞。真菌(包括酵母)宿主 細(xì)胞的例子有釀酒酵母OS. cwevWae)、乳克魯維酵母(幻z^wramyces /ac他；K. /acto)、假絲酵母屬(Candida)物種包括白色假絲酵母(C. a/^c""力和光滑假絲 酵母(C g/"6rato)、構(gòu)巢曲霉(A; erg/〃w "/tMara)、粟酒裂殖酵母 (Sc/n'zo^cc/2ara附y(tǒng)ces尸函Z e; S. / 麵6e)、巴斯德畢赤酵母(尸/c/z/a; astoKs)、和 解脂西洋蓍霉(KwwWa/ipo/;^ca)。哺乳動物細(xì)胞的例子有COS細(xì)胞、幼倉鼠 腎細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞、LNCaP細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、人胚腎(HEK) 細(xì)胞和非洲綠猴細(xì)胞、CV1細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、Vero和Hep-2細(xì) 胞。非洲爪蟾(Xe"o; w/aev&)卵母細(xì)胞，或兩棲動物來源的其它細(xì)胞也可以 使用。原核宿主細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(5. 和分枝一干菌。
本發(fā)明包括一種生成嵌合的VLP的方法，其包括轉(zhuǎn)染編碼新城疫病毒 (NDV)核心蛋白(M)和至少 一種來自不同病毒的病毒蛋白的載體，并在容許 VLP形成的條件下表達(dá)所述載體。在另一個實施方案中，所述病毒蛋白是包 膜結(jié)合蛋白。在另一個實施方案中，所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合 蛋白包含與副流感病毒(PIV)蛋白融合的所述病毒蛋白。在另一個實施方案 中，所述PIV蛋白選自由HN和F蛋白組成的組。在另一個實施方案中，所述 嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述PIV蛋白的一部分。在另 一個實 施方案中，PIV蛋白的所述部分與NDVM蛋白結(jié)合。在另一個實施方案中，所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含與NDV蛋白融合的所述病毒 蛋白。在另一個實施方案中，所述NDV蛋白選自由NP、 F、和HN蛋白組成 的組。在另一個實施方案中，所述病毒蛋白來自選自下組的病毒流感病毒、 登革病毒、黃病毒、單純皰滲病毒I和II、狂犬病病毒、副流感病毒、水痘帶 狀皰滲病毒、呼吸道合l包病毒、狂犬病病毒、人免疫缺陷病毒、冠狀病毒和 肝炎病毒。
在另 一個實施方案中，所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述 NDV蛋白的一部分。在另一個實施方案中，NDV蛋白的所述部分與NDV M 蛋白結(jié)合。在另一個實施方案中，所述病毒蛋白來自選自下組的病毒流感 病毒、登革病毒、黃病毒、單純皰滲病毒I和II、狂犬病病毒、副;危感病毒、 水痘帶狀皰滲病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、人免疫缺陷病毒、冠狀 病毒和肝炎病毒。在另一個實施方案中，所述流感病毒蛋白是HA和/或NA。 在另一個實施方案中，所述呼吸道合胞病毒病毒蛋白是F和/或G。在另一個 實施方案中，所述登革病毒病毒蛋白是E和/或preM/M。在另 一個實施方案中， 所述嵌合NDV VLP包含這樣一種嵌合蛋白，其中NDVHN和/或F蛋白的跨膜 和/或C末端域與傳染原(諸如流感、VZV、 RSV和/或登革病毒)的蛋白質(zhì)的外 部域融合。在另 一個實施方案中，所述嵌合NDV VLP包含這樣一種嵌合蛋白， 其包含流感HA和/或NA蛋白的外部域和NDV HN和/或F蛋白的跨膜和/或C末 端域(參見例如SEQIDNO 10)。在另一個實施方案中，所述嵌合的VLP包含 SEQIDNOIO。
可以依照本領(lǐng)域公知的方法將載體(例如包含編碼上文構(gòu)建體的多核苷 酸的載體)轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中。例如，可通過磷酸鈣共沉淀、電穿孔、顯微 注射、脂轉(zhuǎn)染和利用多胺轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染來將核酸導(dǎo)入真核細(xì)胞中。在一個 實施方案中，所述載體是重組桿狀病毒。在另一個實施方案中，所述重組桿 狀病毒被轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述細(xì)胞是昆蟲細(xì) 胞。在另一個實施方案中，所述昆蟲細(xì)胞是Sf9細(xì)胞。
在另一個實施方案中，所述載體和/或宿主細(xì)胞包含這樣的核苷酸，所述 核苦酸編碼NDVM蛋白和NDVF、 HN和/或NP蛋白、或其部分，和/或PIVF 和/或HN蛋白、或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白。在另一個實施方 案中，所述載體和/或宿主細(xì)胞基本上由NDV M蛋白和NDV F、 HN和/或NP 蛋白、或其部分，和/或PIV F和/或HN蛋白、或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白組成。在一個進(jìn)一步的實施方案中，所述載體和/或宿主細(xì)胞由
NDV M蛋白和NDV F、 HN和/或NP蛋白或其部分，和/或PIV F和/或HN蛋白 或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白組成。含有上文構(gòu)建體的這些載體 和/或宿主細(xì)胞還可含有其它細(xì)胞組分諸如細(xì)胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質(zhì)、 碳水化合物等，但不含有其它的NDV蛋白(除了上文所述構(gòu)建體的片段之外)。
本發(fā)明還提供了會增加VLP生產(chǎn)效率的構(gòu)建體和方法。例如，向上文所 述構(gòu)建體添加前導(dǎo)序列可以改善蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的效率。例如，可將異 源信號序列與NDVM蛋白和NDVF、 HN和/或NP蛋白、或其部分，和/或PIV F和/或HN蛋白、或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白融合。在一個實 施方案中，所述信號序列可衍生自昆蟲細(xì)胞的基因。在另一個實施方案中， 信號肽是幾丁質(zhì)酶信號序列，其可在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中高效地工作。
蛋白和NDV F、 HN和/或NP蛋白、或其部分，和/或PIV F和/或HN蛋白、或 其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白的核苷酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化。例如，為 在Sf9細(xì)胞中表達(dá)而對核酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化，參見SEQIDN0 5、 6、 7和8及 美國專利公開文本2005/0118191，本文通過提述而將其完整收錄用于所有目的。
本發(fā)明還提供生產(chǎn)VLP的方法，所述方法包括在容許VLP形成的條件下 表達(dá)NDV M蛋白和NDV F、 HN和/或NP蛋白、或其部分，和/或PIV F和/或 HN蛋白、或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白。根據(jù)所選的表達(dá)系統(tǒng) 和宿主細(xì)胞，在表達(dá)重組蛋白和形成VLP的條件下通過培養(yǎng)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化 的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生VLP。在一個實施方案中，本發(fā)明包括一種生成VLP的方 法，其包括將至少編碼NDVM蛋白的載體轉(zhuǎn)染入合適的宿主細(xì)胞中，并在容 許VLP形成的條件下表達(dá)所述蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，所述VLP包含 NDVM蛋白和NDVF、 HN和/或NP蛋白、或其部分，和/或PIV F和/或HN蛋 白、或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白。在另一個實施方案中，所述 真核細(xì)胞選自酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、兩棲動物細(xì)胞、禽類細(xì)胞和哺乳動物細(xì)
在另一個實施方案中，所述方法包括制備包含NDVM蛋白和至少一種來 自另一傳染原的蛋白質(zhì)的VLP。在另一個實施方案中，所述來自另一種傳染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白。在另一個實施方案中，所述來自傳染原的蛋白質(zhì)是 包膜結(jié)合蛋白。在另一個實施方案中，所述來自另一種傳染原的蛋白質(zhì)在 VLP的表面上表達(dá)。在另一個實施方案中，所述來自傳染原的蛋白質(zhì)包含會 在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的表位。在另一個實施方案中，所述來自
另一種傳染原的蛋白質(zhì)可與NDVM蛋白結(jié)合。
批、分批補(bǔ)料、連續(xù)和灌流(perfusion)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)意思是在生 物反應(yīng)器(發(fā)酵室)中使細(xì)胞生長和增殖，細(xì)胞在生物反應(yīng)器中增殖并表達(dá)蛋 白(例如重組蛋白)以供純化和分離用。典型地，細(xì)胞培養(yǎng)在生物反應(yīng)器中無 菌、受控的溫度和大氣條件下進(jìn)行。生物反應(yīng)器是用于培養(yǎng)細(xì)胞的腔室 (chamber),其中可以監(jiān)控環(huán)境條件諸如溫度、大氣、攪拌和/或pH。在一個 實施方案中，所述生物反應(yīng)器是不銹鋼室。在另一個實施方案中，所述生物 反應(yīng)器是預(yù)滅菌的塑料袋(例如Cellbag⑧，Wave Biotech, Bridgewater， NJ)。在 其它實施方案中，所述預(yù)滅菌的塑料袋為約50 L至1000 L的袋子。
然后使用保持VLP完整性的方法來分離VLP,諸如通過梯度離心，例如 氯化銫、蔗糖和碘克沙醇(iodixanol)梯度離心，以及標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)，包括例 如離子交換和凝膠過濾層析。
下面是如何能夠制備、分離和純化本發(fā)明VLP的一個例子。通常VLP是 由重組細(xì)胞系產(chǎn)生的，所述細(xì)胞系經(jīng)過工程化改造從而當(dāng)所述細(xì)胞在細(xì)胞培 養(yǎng)(見上文)中生長時產(chǎn)生VLP。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，可以使用其它的 方法來制備和純化本發(fā)明的VLP,如此本發(fā)明不限于所述的方法。
本發(fā)明VLP的生產(chǎn)可首先將Sf9細(xì)胞(未感染的)接種到搖瓶中，使細(xì)胞隨 著生長繁殖而擴(kuò)增和規(guī)模放大(例如從125ml燒瓶到50L Wave袋)。培養(yǎng)細(xì)胞所 用的培養(yǎng)基是為合適的細(xì)胞系配制的(優(yōu)選無血清培養(yǎng)基，例如昆蟲培養(yǎng)基 ExCell-420, JRH)。接著，用重組桿狀病毒以效率最高的感染復(fù)數(shù)(例如每個 細(xì)胞約1個到約3個噬斑形成單位)感染所述細(xì)胞。 一旦發(fā)生感染，NDVM蛋 白和NDV F、 HN和/或NP蛋白、或其部分，和/或PIV F和/或HN蛋白、或其 部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋白即從病毒基因組表達(dá)，自裝配成VLP, 并在感染后大約24到72小時從細(xì)胞分泌。通常，在細(xì)胞處于生長的對數(shù)中期 (mid-logphase)(4-8x 106個細(xì)胞/1111)且至少約90%存活時，感染效率最高。
可以在感染后大約48到96小時，在細(xì)胞培養(yǎng)基中VLP水平接近最大值但在廣泛的細(xì)胞溶解之前收獲本發(fā)明的VLP。收獲時的Sf9細(xì)胞密度和生存力可
以為約0.5 x 106個細(xì)胞/ml至約1.5 x 106個細(xì)胞/ml,生存力至少為20%,如 染料排除測定法所示。接著，取出培養(yǎng)基并將其澄清。可以向培養(yǎng)基添加NaCl 至濃度為約0.4至約1.0M，優(yōu)選至約0.5M，以避免VLP聚集?？衫靡淮涡?使用的預(yù)滅菌中空纖維0.5或1 .OOpm筒式濾器或類似的裝置，通過切向流過
接著，可以使用一次性的、預(yù)滅菌的500，000分子量截留中空纖維筒通過 超濾來濃縮經(jīng)過澄清的培養(yǎng)基中的VLP?？梢詫⒔?jīng)過濃縮的VLP對10倍體積 的含0.5 M NaCl的pH 7.0至8.0的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進(jìn)行滲濾來除去殘余
的培養(yǎng)基成分。
可以將經(jīng)過濃縮、滲濾的VLP在含0.5MNaCl的pH7.2PBS緩沖液中 20%-60%不連續(xù)蔗糖梯度上，于約4。C至約IO'C以6,500 xg離心18小時來 進(jìn)一步純化。通常，VLP將在約30%到至約40%蔗糖之間或者在界面上(在 20%和60%的分步梯度中)形成顯著可見的條帶，可從該梯度中收集該條帶并 保存?？上♂屧摦a(chǎn)物使其包含200mMNaCl，以準(zhǔn)備純化過程的下一步。該 產(chǎn)物含有VLP,并可能含有完整的桿狀病毒顆粒。
可以通過陰離子交換層析或者44%等密度蔗糖墊層(cushion)離心來實現(xiàn) VLP的進(jìn)一步純化。在陰離子交換層析中，將來自蔗糖梯度(見上文)的樣品 上樣入含有帶陰離子的介質(zhì)(例如Matrix Fractogel EMD TMAE)的柱中，并經(jīng) 由鹽梯度(從約0.2 M至約l.O MNaCl)洗脫，該梯度可以將VLP與其它雜質(zhì)(例 如桿狀病毒和DNA/RNA)分開。在蔗糖墊層方法中，將包含VLP的樣品添加 到44%蔗糖墊層，并在30，000g離心約18小時。VLP在44。/。蔗糖的頂部形成條 帶，而桿狀病毒沉淀于底部，其它污染蛋白停留在頂部的0%蔗糖層中。收 集VLP峰或VLP帶。
若想要的話，可以將完整的桿狀病毒滅活。可以通過化學(xué)方法，例如曱 醛或P-丙內(nèi)酯(BPL)滅活。還可以使用本領(lǐng)域已知的選擇性沉淀和層析方法， 如上文例示的，來大部分實現(xiàn)完整桿狀病毒的除去和/或滅活。滅活方法包括 將含有VLP的樣品在0.2。/。 BPL中于約25。C至約27。C溫育3小時。還可以通過 將含有VLP的樣品在0.05。/。BPL于4。C溫育3天，然后在37。C溫育1小時，來滅 活^N犬病毒。
滅活/除去步驟后，可使含有VLP的產(chǎn)物流過另 一滲濾步驟以除去任何來
25自滅活步驟的試劑和/或任何殘余的蔗糖，并將VLP置入期望的緩沖液(例如
PBS)中。包含VLP的溶液可以通過本領(lǐng)域已知的方法(例如無菌過濾)滅菌，
并保存在冰箱或冷凍箱中。
上文的技術(shù)可以在多種規(guī)模上實施。例如，T形瓶(T-flasks)、搖瓶、轉(zhuǎn) 瓶(spinnerbottle)、乃至工業(yè)尺寸的生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器可包括不銹鋼槽 或預(yù)滅菌的塑料袋(例如，Wave Biotech, Bridgewater, NJ出售的系統(tǒng))。本領(lǐng)域 技術(shù)人員會知道用于其目的的最佳選擇。
桿狀病毒表達(dá)載體的擴(kuò)增和生產(chǎn)，以及用重組桿狀病毒感染細(xì)胞以生產(chǎn) 嵌合NDVVLP,可以在昆蟲細(xì)胞，例如前文所述的Sf9昆蟲細(xì)胞中實現(xiàn)。在 一個實施方案中，所述細(xì)胞是用經(jīng)工程化以生成嵌合NDVVLP的重組桿狀病 毒感染的SF9細(xì)胞。
藥物或疫苗配制劑和施用
本文中有用的藥物組合物含有藥學(xué)可接受的載體和本發(fā)明的VLP，其中 所述載體，包括任何合適的稀釋劑或賦形劑，包括本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該 組合物的脊推動物有害的免疫應(yīng)答、并且可以不帶有異常毒性地施用的任何 藥劑。如本文中所使用的，術(shù)語"藥學(xué)可接受的"指獲得聯(lián)邦或州政府監(jiān)管 部門批準(zhǔn)，或者在美國藥典、歐洲藥典或其它公認(rèn)的藥典中列出的用于哺乳 動物，更具體地用于人類中。這些組合物可以用作疫苗和/或抗原性組合物， 用于在脊推動物中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的一個實施方案包括一種抗原性配制劑，其包含嵌合的VLP,所 述嵌合的VLP包含新城疫病毒(NDV)核心蛋白(M)和至少一種來自不同傳染 原的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述來自傳染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白。在 另一個實施方案中，所述病毒蛋白在所述VLP的表面上表達(dá)。在另一個實施 方案中，所述病毒蛋白包含會在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性抗體應(yīng)答的表位。在 另一個實施方案中，所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含與副流 感病毒(PIV)蛋白融合的所述病毒蛋白。在另一個實施方案中，所述PIV蛋白 選自由HN和F蛋白組成的組。在另一個實施方案中，所述嵌合蛋白包含所述 病毒蛋白的一部分和所述PIV蛋白的一部分。在另一個實施方案中，病毒蛋 白的所述部分在所述VLP的表面上表達(dá)。在另一個實施方案中，病毒蛋白的 所述部分包含會在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性抗體應(yīng)答的表位。在另一個實施方案中，PIV蛋白的所述部分與所述NDVM蛋白結(jié)合。在另一個實施方案中， 所述VLP包含嵌合嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含與NDV蛋白融合的所述 病毒蛋白。在另一個實施方案中，所述NDV蛋白選自由NP、 F、和HN蛋白 組成的組。在另一個實施方案中，所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分 和所述NDV蛋白的一部分。在另一個實施方案中，病毒蛋白的所述部分在所 迷VLP的表面上表達(dá)。在另一個實施方案中，病毒蛋白的所述部分包含會在 脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性抗體應(yīng)答的表位。在另一個實施方案中，NDV蛋白的 所述部分與所述NDV M蛋白結(jié)合。
本發(fā)明的另一個實施方案包括一種疫苗，其包含嵌合的VLP,所述嵌合 的VLP包含新城疫病毒(NDV)核心蛋白(M)和至少 一種來自不同傳染原的蛋 白質(zhì)。在一個實施方案中，所述來自傳染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白。在一個實 施方案中，所述病毒蛋白在所述VLP的表面上表達(dá)。在一個實施方案中，所 述病毒蛋白包含會在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性抗體應(yīng)答的表位。在一個實施方 案中，所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含與副流感病毒(PIV) 蛋白融合的所述病毒蛋白。在一個實施方案中，所述PIV蛋白選自由HN和F 蛋白組成的組。在一個實施方案中，所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部 分和所述PIV蛋白的一部分。在一個實施方案中，病毒蛋白的所述部分在所 述VLP的表面上表達(dá)。在一個實施方案中，病毒蛋白的所述部分包含會在脊 推動物中產(chǎn)生保護(hù)性抗體應(yīng)答的表位。在一個實施方案中，PIV蛋白的所述 部分與所述NDVM蛋白結(jié)合。在另一個實施方案中，所述VLP含有嵌合蛋白， 其中所述嵌合蛋白包含與NDV蛋白融合的所述病毒蛋白。在一個實施方案 中，所述NDV蛋白選自由NP、 F、和HN蛋白組成的組。在一個實施方案中， 所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述NDV蛋白的一部分。在一個 實施方案中，病毒蛋白的所述部分在所述VLP的表面上表達(dá)。在一個實施方 案中，病毒蛋白的所述部分包含會在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性抗體應(yīng)答的表 位。在一個實施方案中，NDV蛋白的所述部分與所述NDVM蛋白結(jié)合。
本發(fā)明的一個實施方案包括一種抗原性配制劑，其包含嵌合的VLP,所 述嵌合的VLP包含NDV M蛋白和至少一種來自不同傳染原的蛋白質(zhì)。在一個 實施方案中，所述來自傳染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白。在另一個實施方案中， 其中所述病毒蛋白選自下組流感病毒、登革病毒、黃病毒、單純皰疹病毒 I和II、狂犬病病毒、副流感病毒、水痘帶狀皰滲病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、人免疫缺陷病毒、冠狀病毒和肝炎病毒。在另一個實施方案中，
所述流感病毒蛋白是HA和/或NA。在另一個實施方案中，所述呼吸道合胞病 毒病毒蛋白是F和/或G。在另一個實施方案中，所述登革病毒病毒蛋白是E 和/或preM/M。在另一個實施方案中，所述嵌合NDVVLP包含這樣一種嵌合 蛋白，其中NDV HN和/或F蛋白的跨膜和/或C末端域與傳染原(諸如流感、 VZV、 RSV和/或登革病毒)的蛋白質(zhì)的外部域融合。在另一個實施方案中， 所述嵌合NDV VLP包含這樣一種嵌合蛋白，其包含流感HA和/或NA蛋白的 外部域和NDV HN和/或F蛋白的跨膜和/或C末端域(參見例如SEQ ID NO 10)。在另一個實施方案中，所述嵌合的VLP包含SEQIDNO 10。
本發(fā)明的另 一個實施方案包括將不同的嵌合的VLP混合在一起以產(chǎn)生 多價配制劑。在另一個實施方案中，所述抗原性、疫苗和/或多價配制劑是給 脊推動物口服、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用的。
本發(fā)明的所述配制劑包括這樣的配制劑，其包含上文所述的包含NDV M 蛋白和至少一種來自不同傳染原的蛋白質(zhì)的嵌合的VLP和藥學(xué)可接受的載 體或賦形劑。藥學(xué)可接受的載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、 甘油、無菌等張緩沖水溶液，和它們的組合。對藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑 和其它貝武開j劑的全面討i侖呈J見于Remington，s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N丄current edition)中。配制劑應(yīng)當(dāng)適合施用模式。在一個優(yōu)選的實 施方案中，配制劑適于給人施用，優(yōu)選制劑是無菌、非顆粒性(non-particulate) 和/或非熱原性的。
若想要的話，組合物還可以含有小量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。 組合物可以是固體形式，諸如適于重構(gòu)的凍干粉末；液體溶液；懸液；乳液； 片劑；丸劑；膠嚢；持續(xù)釋放配制劑；或粉劑?？诜渲苿┛砂瑯?biāo)準(zhǔn)的載 體，諸如藥品級的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳
酸鎂等。
本發(fā)明還4是供藥物包(pharmaceutical pack)或試劑盒，其包含一個或多個 容器，所述容器裝有本發(fā)明疫苗配制劑的一種或多種成分。在一個優(yōu)選的實 施方案中，所述試劑盒包含兩個容器，其一裝有VLP，另一個裝有佐劑。所 述容器還可以伴有通告，該通告采取由監(jiān)管藥品或生物制品的生產(chǎn)、使用或 銷售的政府部門規(guī)定的形式，反映該部門對于為了人體施用而生產(chǎn)、使用或 銷售的許可。
28本發(fā)明還提供VLP配制劑包裝在標(biāo)示組合物量的密封容器諸如安瓿或
小藥嚢(sachette)中。在一個實施方案中，VLP組合物作為液體提供，在另一 個實施方案中，作為密封容器中的干燥無菌凍干粉末或無水濃縮物提供，并 且可以用例如水或鹽水重構(gòu)為用于向受試者施用的合適濃度。
在一個備選的實施方案中，在標(biāo)示VLP組合物的量和濃度的密封容器中 以液體形式提供VLP組合物。優(yōu)選地，在密封容器中以至少約50pg/ml、更優(yōu) 選至少約100嗎/ml、至少約200pg/ml、至少500嗎/ml、或至少lmg/ml提供液 體形式的VLP組合物。
一般而言，本發(fā)明的嵌合的NDV VLP以足以刺激針對一種或多種傳染原 的免疫應(yīng)答的有效量或數(shù)量(如上文定義的)施用。優(yōu)選地，施用本發(fā)明的VLP 引發(fā)針對傳染原的免疫。典型地，可以根據(jù)例如年齡、身體健康狀況(physical condition),體重、性別、飲食、施用時間和其它臨床因素，在該范圍內(nèi)調(diào)節(jié) 該劑量。預(yù)防性疫苗配制劑是全身施用的，例如通過使用針頭和注射器或無 針頭注射裝置進(jìn)行皮下或肌內(nèi)注射來施用?；蛘?，疫苗配制劑是鼻內(nèi)施用的， 通過滴劑、大顆粒氣溶膠(大于約10微米)、或噴霧入上呼吸道中。雖然上文 的任何遞送途徑均導(dǎo)致免疫應(yīng)答，但鼻內(nèi)施用還帶來額外的益處，即在許多 病毒(包括RSV和流感)進(jìn)入的部位引發(fā)粘膜免疫。
如此，本發(fā)明還包括誘導(dǎo)哺乳動物中針對感染或其至少一種癥狀的免疫 的疫苗或抗原性組合物的配制方法，包括向所述配制劑添加有效劑量的嵌合 的NDV VLP。
包含VLP的組合物(疫苗和/或抗原性配制劑)的施用方法包括，但不限 于，胃腸外施用(例如皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮下)、硬膜外、和粘膜(例如鼻 內(nèi)和口腔或肺途徑或通過栓劑)。在一個具體實施方案中，本發(fā)明的組合物 通過肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、透皮或皮內(nèi)施用。組合物可以通過任何方便的途 徑施用，例如通過輸注或推注，通過經(jīng)由上皮或粘膜皮膚襯里(例如口腔粘 膜、結(jié)腸、結(jié)膜、鼻咽、口咽、陰道、尿道、膀胱和腸粘膜等)的吸收，并 且可以與其它生物學(xué)活性劑一起施用。在一些實施方案中，含本發(fā)明VLP的 組合物的鼻內(nèi)或其它粘膜施用途徑所誘導(dǎo)的抗體或其它免疫應(yīng)答可顯著高 于其它施用途徑。在另一個實施方案中，含本發(fā)明VLP的組合物的鼻內(nèi)或其 它粘膜施用途徑可誘導(dǎo)這樣的抗體或其它免疫應(yīng)答，所述抗體或其它免疫應(yīng) 答會誘導(dǎo)針對引起感染的其它毒抹或生物體的交叉保護(hù)。例如，包含流感蛋白的嵌合的NDV VLP在給脊推動物施用時可以誘導(dǎo)針對數(shù)種流感毒抹的交 叉保護(hù)。施用可以是全身性的或者是局部的。
在又一個實施方案中，所述疫苗和/或抗原性配制劑以這樣的方式施用， 使得其靶向粘膜組織，以在免疫部位引發(fā)免疫應(yīng)答。例如，可以通過采用含 有具備特定粘膜靶向性質(zhì)的佐劑的組合物的口服施用，來靶向粘膜組織例如 腸相關(guān)淋巴樣組織(GALT)進(jìn)行免疫。還可以耙向其它粘膜組織，例如鼻咽淋 巴樣組織(NALT)和支氣管相關(guān)淋巴樣組織(B ALT)。
本發(fā)明的疫苗和/或抗原性配制劑還可以按照劑量日程表(dosage schedule)來施用，例如用疫苗組合物進(jìn)行一次初次施用，隨后進(jìn)行多次加強(qiáng) 施用。在具體的實施方案中，第二劑組合物在初次施用后大約兩周至一年的 任何時間，優(yōu)選約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月到約6個月 施用。另外，可以在第二劑之后，且在距初次施用后約3個月至約兩年甚至 更長時間，優(yōu)選約4個月、約5個月、或者約6個月、或者約7個月至約1年施 用第三劑。在第二劑后在受試者的血清和/或尿或者粘膜分泌物中沒有檢測到 或者檢測到低水平的特異性免疫球蛋白時，可任選地施用第三劑。在一個優(yōu) 選的實施方案中，第二劑在第一次施用后約l個月施用，而第三劑在第一次 施用后約6個月施用。在另一個實施方案中，第二劑在第一次施用后約6個月 施用。在另一個實施方案中，所述本發(fā)明的VLP可用作為聯(lián)合療法的一部分 施用。例如，本發(fā)明的VLP可以與其它免疫原性組合物、抗病毒劑和/或抗生 素一起配制。
技術(shù)人員可以容易地確定藥物配制劑的劑量，例如通過首先鑒定可有效 引發(fā)預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答的劑量，例如通過測量病毒特異性免疫球蛋白 的血清效價或通過測量血清樣品或尿樣品或粘膜分泌物中抗體的抑制比。所 述劑量可以由動物研究確定。用于研究疫苗功效的動物的非限制性目錄包括 豚鼠、倉鼠、雪貂(ferret)、小鼠和棉鼠。大多數(shù)動物不是傳染原的天然宿主， 但仍可用于該疾病的各個方面的研究。例如，可以對任何上文的動物定量給 予疫苗候選物，例如本發(fā)明的VLP,以部分地表征所誘發(fā)的免疫應(yīng)答，和/ 或確定是否生成了任何中和性抗體。例如，已經(jīng)在小鼠模型中進(jìn)行了許多研 究，因為小鼠體型小，而且它們的成本低使得研究者可以進(jìn)行更大規(guī)模研究。
另外，技術(shù)人員可以進(jìn)行人體臨床研究來確定用于人的優(yōu)選有效劑量。 這樣的臨床研究是常規(guī)的，且為本領(lǐng)域公知。要使用的確切劑量還將依賴于施用途徑?？梢詮脑醋泽w外或動物試驗系統(tǒng)的劑量-應(yīng)答曲線外推得到有效劑量。
如本領(lǐng)域中還公知的，可以使用免疫應(yīng)答的非特異性刺激物來增強(qiáng)特定 組合物的免疫原性，這樣的刺激物稱為佐劑。實驗上已經(jīng)使用佐劑來促進(jìn)針
對未知抗原的免疫的普遍增力口(例如美國專利號4,877,611)。免疫規(guī)程使用佐 劑來刺激應(yīng)答已有多年，因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對佐劑是熟知的。有些 佐劑影響抗原呈遞的方式。例如，在蛋白抗原被明礬沉淀時，免疫應(yīng)答增加。 抗原的乳化也可延長抗原呈遞的持續(xù)時間。本發(fā)明的范圍意圖涵蓋Vogel等， "A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients(第2片反),，，(本文通過才是述 收錄該文獻(xiàn)全部內(nèi)容用于所有目的)中所述任何佐劑的引入。
例示性的佐劑包括完全弗氏佐劑(一種免疫應(yīng)答的非特異性刺激物，含 有已殺死的結(jié)核分枝桿菌(聊cc^a"eWwm /w6ercM/cw》)、不完全弗氏佐劑和 氫氧化鋁佐劑。其它佐劑包括GMCSP、 BCG、氫氧化鋁、MDP化合物諸如 thur-MDP和nor-MDP、 CGP (MTP-PE)、脂質(zhì)A和單磷酰脂質(zhì)A (MPL)。還設(shè) 想使用RIBI，其在2。/。角鯊烯/Tween 80乳液中含有從細(xì)菌提取的3種成分 MPL、海藻糖二霉菌酸(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)。還可以使用MF-59、 Novasomes 、 MHC抗原。
在本發(fā)明的 一 個實施方案中，所述佐劑是少片層(paucilamellar)脂質(zhì)d 、 泡，其具有大約2到10個雙層，它們排列成多個基本呈球形的殼的形式， 其由水性層隔開，所述水性層圍繞著不含脂質(zhì)雙層的無定形中心大空腔。少 片層脂質(zhì)小泡可以通過數(shù)種方式起作用來刺激免疫應(yīng)答作為非特異性刺激 物、作為抗原載體、作為其它佐劑的載體，以及這些方式的組合。例如，在 通過混合抗原與預(yù)先形成的小泡，使得抗原相對于小泡保持在胞外的方法制 備疫苗時，少片層脂質(zhì)小泡起非特異性免疫刺激物的作用。通過將抗原包嚢 在小泡的中心空腔中，小泡起到免疫刺激物和抗原載體兩方面的作用。在另 一個實施方案中，小泡主要由非磷脂小泡構(gòu)成。在其它實施方案中，小泡是 Novasomes。 Novasomes⑧是約100nm到約500nm范圍的少片層非磷脂小泡。 它們包含Brij 72 、膽固醇、油酸和角篁烯。Novasomes已被證明是流感抗原 的有效佐劑(參見美國專利5，629,021、 6,387,373和4,911,928，本文通過提述 收錄它們的全部內(nèi)容用于所有目的)。
31-1、
IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-12、 IL-13);生長因子(例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(GM)集落 刺激因子(CSF));和其它免疫刺激性分子，諸如巨噬細(xì)胞炎性因子，F(xiàn)lt3配 體、B7.1、 B7.2等。免疫刺激性分子可以與RSVVLP在同一配制劑中施用， 或者可以分開施用。可以施用蛋白質(zhì)或者編碼該蛋白質(zhì)的表達(dá)載體來產(chǎn)生免 疫刺激效應(yīng)。如此，在一個實施方案中，本發(fā)明包括包含佐劑和/或免疫刺激 物的抗原性配制劑和疫苗配制劑。
如此，本發(fā)明的一個實施方案包括這樣的配制劑，其包z含、嵌合的VLP和 佐劑和/或免疫刺激物，所述嵌合的VLP包含新城疫病毒(NDV)核心蛋白(M), 至少一種來自傳染原的蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，所述佐劑是 Novasomes。在另一個實施方案中，所述配制劑適用于人施用。在另一個實 施方案中，所述配制劑是給脊推動物口服、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜 脈內(nèi)或皮下施用的。在另一個實施方案中，將不同的嵌合的VLP混合在一起 以產(chǎn)生多價配制劑。
雖然優(yōu)選用單劑刺激免疫，但是可以通過相同或不同路徑施用額外的劑 量，以達(dá)到想要的效果。例如在新生兒和嬰兒中，可能需要多次施用來引發(fā) 足夠的免疫水平。按照維持足夠水平的抗感染保護(hù)的需要，可以在整個兒童 期以一定間隔繼續(xù)進(jìn)行施用。類似地，特別容易受到反復(fù)或嚴(yán)重的感染的成 年人，例如衛(wèi)生保健工作者、日間護(hù)理工作者、幼兒的家人、老年人、以及 心月申功能受4員的個體(individuals with compromised cardiopulmonary flmction) 等，可能需要進(jìn)行多次免疫來建立和/或維持保護(hù)性免疫應(yīng)答?？梢酝ㄟ^例如 測量中和性分泌和血清抗體的量來監(jiān)測誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫的水平，并按照S1發(fā) 和維持期望的保護(hù)水平的需要來調(diào)整劑量或重復(fù)接種。
刺激免疫應(yīng)答的方法
如上文所提及，本發(fā)明的VLP可用于制備刺激免疫應(yīng)答的組合物，所述 免疫應(yīng)答賦予針對傳染原的免疫或?qū)嵸|(zhì)的免疫。粘膜免疫和細(xì)胞免疫均可貢 獻(xiàn)于針對傳染原和疾病的免疫。在上呼吸道中局部分泌的抗體是針對自然感 染的抗性中的主要因素。分泌型免疫球蛋白A (slgA)參與上呼吸道的保護(hù)，而血清IgG參與下呼吸道的保護(hù)。感染所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答:fe御同一病毒或抗 原性類似的病毒抹的再次感染。例如，流感經(jīng)歷頻繁而不可預(yù)測的變化，因 此，自然感染后，針對人群中流行的新病毒抹，宿主免疫提供的有效保護(hù)期 可能僅有少數(shù)幾年。
本發(fā)明的嵌合的NDV VLP在施用于脊推動物(例如人)時可以在所述脊 推動物中誘導(dǎo)實質(zhì)的免疫。實質(zhì)的免疫由針對本發(fā)明的VLP的免疫應(yīng)答導(dǎo) 致，在所述脊推動物中保護(hù)或改善感染或者至少減輕感染的癥狀。在一些情 況下，如果所述脊推動物被感染，所述感染將是無癥狀的。所述應(yīng)答可能不 是完全保護(hù)性的應(yīng)答。在此情況下，如果所述脊推動物感染了傳染原，該脊時間。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括誘導(dǎo)受試者體內(nèi)針對感染或其至少一種 癥狀的實質(zhì)免疫的方法，包括施用至少一個有效劑量的嵌合的NDVVLP。在 另 一個實施方案中，本發(fā)明包括一種針對RSV對哺乳動物進(jìn)行接種的方法， 包括給所述哺乳動物施用誘導(dǎo)保護(hù)的量的包含嵌合NDV VLP的VLP。在一個 實施方案中，所述方法包括施用這樣的VLP，其包含NDVM蛋白和NDVF、 HN和/或NP蛋白、或其部分，和/或PIV F和/或HN蛋白、或其部分，和/或上 文所述的任何嵌合蛋白。
在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種在受試者中誘導(dǎo)針對感染或其至 少一種癥狀的保護(hù)性抗體應(yīng)答的方法，包括施用至少一個有效劑量的嵌合的 NDV VLP,其中所述VLP包含NDV M蛋白和NDV F、 HN和/或NP蛋白、或 其部分，和/或PIV F和/或HN蛋白、或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋 白。
如本文所使用的，術(shù)語"抗體"是包含一個或多個基本上或者部分地由 免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的多肽的蛋白質(zhì)。公認(rèn)的免疫球 蛋白基因包括k、 x、 a、 y、 S、 s和ia恒定區(qū)基因和眾多免疫球蛋白可變區(qū)基 因。輕鏈分為K或人。重鏈分為y、 p、 a、 S或s，它們繼而分別定義了免疫球 蛋白的類型IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單 位包含四聚體。每個四聚體由同樣的兩對多肽鏈組成，每對具有一條"輕" (大約25kD)鏈和一條"重"(大約50-70kD)鏈。每條鏈的N末端定義一個約 100-110個或更多氨基酸的可變區(qū)，它主要負(fù)責(zé)抗原識別。抗體作為完整的免
33疫球蛋白存在，或者作為若干通過各種肽酶消化而產(chǎn)生的、已充分表征的片 段存在。
在另 一個實施方案中，本發(fā)明包括一種在受試者中誘導(dǎo)針對感染或其至 少一種癥狀的保護(hù)性細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括施用至少一個有效劑量的嵌合的
NDVVLP,其中所述VLP包含NDV M蛋白和NDV F、 HN和/或NP蛋白、或 其部分，和/或PIV F和/或HN蛋白、或其部分，和/或上文所述的任何嵌合蛋 白。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫也在從感染的恢復(fù)中起作用，并可以預(yù)防別的并發(fā)癥， 并有助于長期免疫。
如上文所提及，本發(fā)明的VLP預(yù)防或減輕受試者中感染的至少 一種癥 狀。大多數(shù)感染的大多數(shù)癥狀是本領(lǐng)域公知的。如此，本發(fā)明的方法包括預(yù) 防或減輕與感染有關(guān)的至少 一種癥狀。癥狀的減輕可以主觀地或者客觀地確 定，例如通過受試者的自我評估、由內(nèi)科醫(yī)生評估、或通過實施合適的測定 或測量(例如體溫)，包括例如生活質(zhì)量評1^介、RSV感染或其它癥狀的進(jìn)展減 慢、RSV癥狀的嚴(yán)重程度降低或者合適的測定法(例如抗體效價和/或T細(xì)胞活 化測定法)?？陀^評價包括動物和人的評價。
通過下面的實施例進(jìn)一步例示本發(fā)明，這些實施例不應(yīng)解釋為限制性 的。本文通過提述收錄本申請中引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和已公開的專利 申請，以及附圖和序列表用于所有目的。
實施例
實施例l
包含流感蛋白的嵌合的NDV VLP
構(gòu)建來自新城疫病毒的膜(M)蛋白和/或核蛋白(NP)蛋白的構(gòu)建體，和包 含與NDV HN和/或F的跨膜和/或C末端域融合的流感HA和/或NA蛋白序列外 部域的嵌合蛋白(參見例如SEQ ID NO 10)。圖l中顯示了這些構(gòu)建體。對構(gòu) 建體進(jìn)行密碼子優(yōu)化，然后經(jīng)由一系列步驟(如上文所述的)而克隆入桿粒載 體中，接著通過噬斑分離來挽救重組桿狀病毒。然后感染昆蟲細(xì)胞，并在容 許VLP形成的條件下培養(yǎng)。對VLP進(jìn)行分離和純化，如上文所述的。
實施例2嵌合的NDVVLP
為了形成具有NDV核心的用于其它靶物的VLP,將天然和/或嵌合分子克隆入桿狀病毒中。通過表達(dá)來自NDV的M和NP基因及包含與來自傳染原 (諸如VZV、 RSV、登革病毒)的蛋白質(zhì)的外部域融合的NDVHN或F蛋白跨膜 和C末端域的嵌合蛋白來制備嵌合的VLP。對此類構(gòu)建體進(jìn)行密碼子優(yōu)化， 并經(jīng)由一系列步驟(上文所述的)而克隆入桿粒中，接著通過噬斑分離來挽救 重組桿狀病毒。
如上文所述，通過借助于重組桿狀病毒的共感染來挽救這些靶物中每一 個的VLP，所述重組桿狀病毒(l)表達(dá)用于VLP核心形成的NDV M和/或NP， 并(2)表達(dá)如上所述的嵌合蛋白。下文是可以在制備嵌合NDV VLP中使用的 代表性NDV蛋白序列。 NDV M蛋白(SEQ ID NO : 1 )
mdssrtIGL YFDSALPSSNliLAFP IVLRDVGDGKKQ ITPQY'R I服LDSWTDSKEDSVF ittygfIFQVGNEEVTV cmindnpkrei,L,SA腦LCLGSVPWVGDPVEI,ARACLTMWTC鵬ATNTERMVFSWQAPRVLQSCRWADKYSS VNAVKHVKAPEKIPGSETLEYKVNFVSLTWPKKDVYKIPTAVLKVSGSSLYNLALNVTIDVEVDPKSPLVKSLS RSDSGYYAMljFMIGLiMSTVDKRGKKyTFDOljERKTRRLD.LSVGljSDVTjGPSVLVKARGARTRLLAPFFSNSCTA CYPIANASPQVAKILWSQTACIjRSVKIIIQAGTQRAVAVTADHEVTSTKIEKRHTIAKYNPFKK*
NDV F蛋白 (SEQ ID NO : 2)
mgprsstripvplmljtiritijalsyvrltssldgrpliaaagiwtgdkavniytssargsiivklijpnmpkdkka cakapleaynrtlttli/tplgdsirriqesvttsggrrqrrfigaiigsvalgvataaqitaasaliqanqnaan ilrlkesiaatneavhevtgglsqiavavgkmqqftoidqfnntaqeldcikiaqqtovelnlyltemtvfgpqi tspmjqijtvqalymlaggnvdyixltklgvgnnqljssligsgijitgnpifydsqtqlligiqvtusvgnlninmra ty:lst:lsvsitkgpasalvpkwtgvgsvieelotsyctem);ldIjYctr.ivtfpmspgiysclsgntsacmyskt
EGAL,TTPYMTIjKGSWANCQMTTCRCADPPGIISONYGEAVS:LIDKHSCNWSLDGIT:LRLSGEFDATYQKNISI mykqkaqrktllwlgnntldqmrattkm*
對ND V—F的跨膜區(qū)預(yù)測
開始 結(jié)束 外部 1 502
跨膜螺旋 503 525
內(nèi)部(胞質(zhì)的) 526 553
NDV HN蛋白 (SEQ ID NO: 3)
YLALGVLRTSATGRVFFSTLRSINLDDAQNRKSCSVSATPLGCDMLCSKITETEEEDYKSVIPTSMVH
NDTCPDEQDYQIRMAKSSYKPGRFGGKRVQQAIIiSIKVSTSLGEDPVLTVPPNTVALMGAEGRVLTVG
TSi!
IAEISNTLFGEFRIVPLLVEILKDGGV*
NDV NP蛋白 (SEQ ID NO: 4)
MSSVFDEYEOLLAAQTRPNGAHGGGEKGSTLKVEVPVFTLNSDDPEDRWNFAVFCLRIAVSEDANKPLRQGALIS LLCSHBQVMRNHVALAGKQNEATLAVLEIDGFTNSVPQFNNRSGVSEERAQRFIjMIAGSLPRACSNCTPFTTAGV EDDAPEDITDTLERIISIQAQVWVTVAKAMTAYETADESETORINKYMQQGRVQKKYIIjHPVCRSAIQIjTIRQSIjavriflvselkrgrkrtaggsstyyslvgdidsyirntgltaffltlkygintktsalalsslagdigkmkqlmrl '/rmkgdnapymtllgdsdqmsfapaeyaqlysfamgmasvldkgtgkyqfardfmstsfwrlgveyaraqgssin
edmaae.lkltpaar:rg:laaaaq:raseetgsmdiptqqagv:ltgls;dggpqapqgglnrsqgqpdagdgetqfld.l mravansmreapnsvqnttqqeppstpgpsqdkiotdwgy*
經(jīng)過密碼子優(yōu)化的NDV M蛋白(SEQ ID NO : 5)
atggactcttctagaaccatcggtttgtacttcgactctgctttgccatcttctaacttgttggctttcccaatc gttttgagagacgttsgtgacggtaagaagcaaatcaccccacaatacagaatcagaagattggactcttggacc
gactctaaggaagactctgttttcatcaccacctacggtttcatcttccaagttggtaacgaagaagitaccgtt GGTATGATCAACGACAACCCAAACmGAGAATTGTTGTCTGCTCCTATGTTGTGTTraGGTTCTGTTCCAAACGTT G:S.rGACCCAGTTGAATTGGCTAGAGCTTGTTTGACCATGGTTGTTACCTGTAAGAAGTCTGCTACCAACACCGAA ASAATGGTTTTCTCTGTTGTTCAAGCTCCAAGAGTTTTCCAATCTTGTAGAGTTCTTGCTGACAAGTACTCTTCT
G1TTCTTTC3ACCGTTGTTCCAAAGAAGGACGTTTACAAGATCCCAACCGCTGTTTTGAAGGTTTCTGCTTCTTCT TTG'tacaacttggctttgaacgttaccatcgacgttgaagttgacccaaagtctccattggttaagtctttotct agatctgactctggttactacgctaacttgttcttgcacatcggtitgatgtctaccgttgacaagagaggtaag AAC;gttaccttcgaccaattcgaaagaaagatcagaagattggacttgtctgttggtttgtctgacgttttgggt CCATCTGTTTTGSGTTAAGGCTAGAGGTGCTAGAACCAffiVTTGTTGGCTCCMTCTTCTCTAACTCTGGTACCGCT ■TGTTACCCAATCGCTAACGC'rTCTCCACAAGrraCTAAGATCTTCTGGTCTCAAACCGCTTCTTTGAGATCTGTT
GAAAAGAGACACACCATCGCTAAGTACAACCCATTCAAGAAGTC3A
經(jīng)過密碼子優(yōu)化的NDV F蛋白(SEQIDNO: 6)
ATGGGTCCAAi3ATCTTCTACC'agaatcccagttccatt(3ATGTTGACCATCAGAATCACCTTGGCTTTGTCTTAC gttagattgacctcttctttogacggtagaccattggctgctgctggtatcgttgttaccggtgacaaggctgtt aacatctacacctcttctcaaaccggttctatcatcgttaagttgttcccaaacatgccaaaggacaaggaagct tgtgctaaggctccattggaagcttacaacagaaccttgaccaccttgttgaccccattggctgactctatcaga AGAATCCAAGAATCTGTTACCACCTCTGGTGGITAGAAGACAAAGAAGATTCATCGGTCCTATCATCGGTTCTGTT GCTTTGGGTGT3'GCTACC(3CTGCTCAAATCACC(3CTGCTTCTGCTTTGA'rCCAAGCTAACCAAAACGCTGCTAAC ATCTTGAGATTGAAGGAATCTATCGCTGCTACCAACGAAGCTGTTCACGAAGT'mCCGGTGGTTTCTCTCAATTG GCTGTTGCTGirGGTAAGATGCAACAATTCCTTAACGACCAATTCAACAACACCGCTCAAGAATTGGACTGTATC aagatcgctcaacaagttggtgttgaattgaacttgtacttgaccgaattgaccaccgttttcggtccacaaatc
accaagttgggtgttggtaacaaccaattgtcttctttgatcggttctggtttgatcaccggtaacccaatcttc TACGACTCTCAAACCCAA:ttgttgggtatccaagttaccttgccatctgttggtaacttgaacaacatgagagct ACCTACTTGGAAACCTTGTC'tgttoctaccaccaagggtttcgcttctgctttggttccaaaggttgttacccaa STTGCTTCTGTTATCGAAGAATTGGACACCTCTTACTGTATCGAAGCTGACTTGGACTTGTACTGTACCAGAATC G'rrACCTTCCCAATGTCTCCAGGTATCTACTCTTGTTTGTCTGGTAACACCTCTGCTTGTATCTACTCTAAGACC C;AAGGTG(二T工'TGACCACCCCATACM'gaccttgaaggcttctgttgttgctaactgtcaaatgaccacctgta(3a tgtgctgacccaccaggtatcatctctcaaaactacgctgaagctgtttctttgatcgacaagcactcttgtaac cttgtttctttggacggtatcaccttgagattgtctgctgaattcgacgctacctaccaaaagaacatctctatc ttggactctcaagttttgcttaccggtaacttggacatctctaccgaattgggtaacgttaaccactctatctct aacgotttggacaagttggaagaatctaactctaagttggacaaggitaacgttagattgacctctacctctgct ttgatcacctacatcgttttgaccgttatctcttt03ttttgggtatgttctctttggttttggcttgttacttg
經(jīng)過密碼子優(yōu)化的NDV HN蛋白(SEQ ID NO: 7)
ATC;gactctgctgtttctcaagttgctttggaaaacgacagaagagaagctaaggacacctggagattgcttttc AGAATCGCTGCTTTCT'tgttgatggttatcaccttggctgtttctgctgttgctttggcttactctatggaagct tctaccccaggtgacttggtttctatcccaaccgctatctacagagctgaagaaagaatcacctctgctttgggt 'rCTAACCAft(3acgttgttgacagaatctacaagcaagttgctttggaatctccattggctttgttgaacaccgaa TCTATCATCATGAACGCTATCACCTCTTTGTCTTACCAAATCAACGGTGCTACCAACAACTCTGGTTGTGGTGCT CCAGTTCACGACCCAGAC'tacatcggtggtatcgotaaggamtgatcgttgacgacacctctgacgttacctct ttctacccatctgctttccaagaacacttgaacttcatcccagctccaaccaccggttctggttgtaccagsatc ccatctttcgacatgtctgctacccactactgttacacccacaacgttatcttgtctggttgtagagaccactct cactctcaccaatacttggctttgggtgttttgagaacctctgctaccggtagagttttcttctctaccttgaga rC'rATCAACTTGGACGACGCTCAAAACAGAAAGTCTTGTTCTCTTTCTGCTACCCCATTGGGTTGTGACMGTTG tgttctaagatcaccgaaaccgaagaagaagactacaagtctgtttvtcccaacctctmggttcacggtagattg ggtttcgacggtcaataccacgaaaaggacttggacgttaccaccttgttcagagactgggttgctaactaccca ::;stgttsgtggtggttctttcatcaacaacagagtttggttcccagtttacggtggtttgaagccatcttctcca
36TCTGACACCGCTCAAGAAGGTAGATACGTTATCTACAAGAGATACAACGACACCTGTCCAGACGAACAAGACTAC CflAATCAGaATGGCTAM3TCTTCTTACAAGCCAGGTAGATTCGGTGCTAAGAGM31TCAACAAGCTATCTTGTCT ATCAAGGTTTCTACCTCTTTGGGTGAAGACCCAGTTTTGACCGTTCCACCAAACACCGTTGCTTTGATGGGTGCT GAAGGTAGAG'TTTTOACCGTTGGTACCTCTCACTTCTTGTACCAAAGAGGTTCTTCTTACTTCTCTCCAGCTTTG TTGTACCCAATG'ACCGTTAACflACAAGACCGCTACCTTOCACAACCCATACACCTTCAACGCTTTCACCM3ACCA GGTTCTGTTCCAT(3TCAAGCTTCTGCTAGATGTCCAAACTCTTGTCTTACCGGTGTTTACACCC3ACCCATACCCA TTGGTTTTCCACAGAAACCACACCTTGAGAGGTGTTTTCGGTACCATGTTGGACGACAAGCAAGCTAGATTGAAC CCAGTTTCTGCTGTTTTCGACAACATCTCTAGATCTAGAATCACCAGAGTTTCTTCTTCTTCTACCAGAGCTGCT TACACCAC'CTCTACCTGTTTCAAGGTTGTTAAGACCAACAAGACCTACTGTTTGTCTATCGCTGAAATCTCTAAC ACCTTC3TTCGGTGAATTCAGAATCGTTCCMTGTTGGTTGAAATCTTGAAGGACGGTGGTGTTTGA
經(jīng)過密碼子優(yōu)化的NDV NP蛋白(SEQ ID NO : 8)
ATGTCTTCTGTTTTCGACGAATACGAACAATTGTTGGCTGCTCAAACCAGACCAAACGCTGCTCACGGTGGTGCT gaaaagggttctaccttgaaggttgaagttccagttttcaccttgaactctgacgacccagaagacagatggaac TTCGCTGTTTTCTGTTTGAGAATCGCTCTTTCTGAAGACGCTAaCAAGCCATTGAGACAAOSTGCTTTGATCTCT TTGTTGTC3TTCTCACTCTCAAGTTATGAGAAACCACGTTGCTTTGGCTGGTAAGCAAAAC(3AAGCTACCTTGGCT GTTTTGGAAA'rCGACGGTTTCACCAACTCTGTTCCACAATTCAACAACAGATCTGGTGTTTCTGAAGAAAGAGCT CAAAGATTCTTGATGATCGCTGGTTCT1TGCCAAGAGCTTGTTCTAACGGTACCCCATTCACCACCGCTGGTGTT GAAGACGACGCTCCAGAAGACATCACCGACACCTTGGAAAGAATCATCTCTATCCAAGCTCAAGTTTGGCTTACC GTTGCTAAGGCTATGACCGCTTACGAAACCGCTGACGAftTOTGAAACCAGAAGAATCAACAAGTACATGCAACAA GGTAGAGTTCAAAAGA船mCATCTTGCACCCACTTTCTAGATCTGCTATCCAATTGACCATCAGACAATCTTTG GCT'GTTAGAA'rCTTCTTGGTTTCTGAATTGAAGAGAGGTAGAAACACCGCTGGTGGTTCTTCTACCTACTACTCT TT.SGTTGGTGACATCGACTCTmCATCAGAAACACCGGTTTGACCGCTTTCTTCTTGACCTTGAAGTACGGTATC aacaccaagacctctgctttggctttgtcttctttggctgctgacatccaaaagatoaagcaattgatgagattg TACAGAATGAAGGGTGACAACGCTCCATACATGACCTTGTTGGGTGACTCTGACCAAATCTCTTTCGCTCCAGCT GflATACGCTCAATTGTACTCTTTCGCTATGGCTATGGCTTCTCTTTTGGACAAGGCTACCGGTAAGTACCAATTC GCTAGAGACTTCATGTCTACCTCTTTCTGGAGATTGGGTGTTGAATACGCTAGAGCTCAAGGTTCTTCTATCAAC GAA:GACATGGCTGCT(5AATTG皿G1TGACCCCAGCTGCTAGAAGAGGTTTGGCTGCTGCTC5CTCAAAGA0CTTCT gaagaaaccggttctatcgacatcccaacccaacaagctggtgttttgaccggtttctctgacggtggtccacaa GCTCCACM(3GTGG'rrre緒CAGATCTCAAGGTCAACCAGACGCTGGTGACGGTGAAACCCAATTCTTGGACTTG
ACCCCAGGTCCATCTCAAGACAACGACACCGACTGGGGTTACTGA
流感HA序列(SEQ ID NO 9)
EVTNATEIjVG DIjFVERSKAY TSSACK皿SN
TIVKPGDIIxL NGSIPNDKPF IAGFIE眼ffi IGKTNEKFHQ ■HTIDIjTDSEM TTOHDVYRDE
IjCIjVFAQKLP SSSTGGICDS SNCYPYDVPD KSFFSKLNWIi YAQASGRITV INSTGNIjIAP GN聰MTYGA GMVDGWYGFR 工EKEFSEVEG NKLFERTKKQ ALN服FQIKG RCNICI*
GNDNSTATLC PHQIIjDGENC YASIjRSLjVAS thlkykypal STKRSQQTV工 RGYFKIRSGK CPRYIKQNTL HQKISEGTGQA RIQDIjEICYVE LRENABDMGN ■VELKSGYKDW
IjG朋AVPNGT TLIDALiGDP SGTLEF麗es NVTMPNNEKF PNIGSRPRVR SSIMRSDAPI KLATGMRNVP ADLjKSTQAA工 DTKI'DLWSYN GCFKIYHKCD ILWISFAISC
ivktitndqi QCDGFQNKKW
FNWTGVTQNG DKLYIWGV1H 房SSR工SIYW
gkcnsecitp ekqtrgifga nqingklnrl ae:llvalenq nacigsirng
FliLCTALiliGF
對曱型流感H3N2 (福建毒抹)HA蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測
開始 結(jié)束 外部 1 529
TM (跨膜)螺旋 530 552
內(nèi)部(胞質(zhì)的) 552 566
提議的嵌合[流感HA]-[NDV F]蛋白(SEQ ID NO 10)MKTimLSYI .LCLVFAQKLP GNDNSTATLC LGHHAVPNGT iwtitmdqi evtnatelvq ssstggicds phqildgenc tlidallgdp 。cdgf。nkkw dlf'vsrskay sncypyt'TOD Yfl^RS'LVAS SGTLEFNNES FNWTGVTQNG tssackrrsn ksffsri週i—, THI..,kykypal; NVTMP,EKF DKLYIWGVLH
PGTDSDQISIj yaqasgritv stkrsqqtvi pnigsrprvr dvssrisiyw tivkpgdill instgnliap rgyfkirsgk ssimrsdapi gkcnsecitp ngsipndkpf ，vnrityga cprytkqntl klatcmrnvp ekqtrgifga 工agfiengwe gmvdgwy'gfr hqnsectgqa adlkstqaai nqingklnkl igktnekfhq iekefseveg riqdleicyve dtkidlwsyn aeklvalewq htidltdsem nklpertkko lrenae:dmgn gcfkiyhkcd nacigsirng
TYDHDVYRDE ALNNRFQIKG VEIjKSGYKDT YIVLTVISIA/ LGMLSIiVLAC
■yj—'MYK:QKAQR K.TI..,L,WI.,G麗T I.,DQMRATTKJJ~" ~
氨基酸殘基
1-529 福建HA
530-580NDVF(跨膜螺旋加雙下劃線，而胞質(zhì)域加單下劃線)
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38
權(quán)利要求
1.一種嵌合的病毒樣顆粒(VLP)，其包含新城疫病毒(NDV)核心蛋白(M)和至少一種來自不同傳染原的蛋白質(zhì)。
2. 權(quán)利要求1的VLP，其中所述來自傳染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白。
3. 權(quán)利要求2的VLP，其中所述病毒蛋白是包膜結(jié)合蛋白。
4. 權(quán)利要求3的VLP,其中所述包膜結(jié)合蛋白在所述VLP的表面上表達(dá)。
5. 權(quán)利要求3的VLP，其中所述包膜結(jié)合蛋白包含會在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的表位。
6. 權(quán)利要求1的VLP，其中所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含與副流感病毒(PIV)蛋白或其片段融合的所述來自不同傳染原的蛋白質(zhì)。
7. 權(quán)利要求6的VLP，其中所述來自不同傳染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白。
8. 權(quán)利要求6的VLP，其中所述PIV蛋白選自由PIVHN和F蛋白組成的組。
9. 權(quán)利要求7的VLP，其中所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述PIV蛋白的一部分。
10. 權(quán)利要求9的VLP，其中病毒蛋白的所述部分在所述VLP的表面上表達(dá)。
11. 權(quán)利要求10的VLP，其中病毒蛋白的所述部分包含會在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的表位。
12. 權(quán)利要求9的VLP，其中PIV蛋白的所述部分與NDVM蛋白結(jié)合。
13. 權(quán)利要求2的VLP,其中所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含與NDV蛋白或其片段融合的所述病毒蛋白。
14. 權(quán)利要求13的VLP，其中所述NDV蛋白選自由NP、 F、和HN蛋白組成的組。
15. 權(quán)利要求13的VLP，其中所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述NDV蛋白的一部分。
16. 權(quán)利要求15的VLP，其中病毒蛋白的所述部分在所述VLP的表面上表達(dá)。
17. 權(quán)利要求15的VLP，其中病毒蛋白的所述部分包含會在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的表位。
18. 權(quán)利要求15的VLP,其中NDV蛋白的所述部分與NDVM蛋白結(jié)合。
19. 權(quán)利要求2的VLP，其中所述病毒蛋白來自選自下組的病毒流感病毒、登革病毒、黃病毒、單純皰滲病毒I和II、狂犬病病毒、副流感病毒、水痘帶狀皰滲病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、人免疫缺陷病毒、冠^)犬病毒禾P肝炎病毒。
20. 權(quán)利要求19的VLP，其中所述流感病毒蛋白是HA和/或NA。
21. 權(quán)利要求19的VLP，其中所述呼吸道合胞病毒病毒蛋白是F和/或G。
22. 權(quán)利要求19的VLP,其中所述登革病毒病毒蛋白是E和/或preM/M。
23. —種生成嵌合的VLP的方法，其包括轉(zhuǎn)染編碼新城疫病毒(NDV)病毒核心蛋白(M)和至少 一種來自不同傳染原的蛋白質(zhì)的載體，并在容許VLP形成的條件下表達(dá)所述載體。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述來自傳染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白。
25. 權(quán)利要求24的方法，其中所述病毒蛋白是包膜結(jié)合蛋白。
26. 權(quán)利要求24的方法，其中所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含與副流感病毒(PIV)蛋白或其片段融合的所述病毒蛋白。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述PIV蛋白選自由HN和F蛋白組成的組。
28. 權(quán)利要求26的方法，其中所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述PIV蛋白的一部分。
29. 權(quán)利要求26的方法，其中PIV蛋白的所述部分與NDVM蛋白結(jié)合。
30. 權(quán)利要求24的方法，其中所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含與NDV蛋白融合的所述病毒蛋白。
31. 權(quán)利要求30的方法，其中所述NDV蛋白選自由NP、 F、和HN蛋白組成的組。
32. 權(quán)利要求30的方法，其中所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述NDV蛋白的一部分。
33. 權(quán)利要求30的方法，其中NDV蛋白的所述部分與NDVM蛋白結(jié)合。
34. 權(quán)利要求24的方法，其中所述病毒蛋白來自選自下組的病毒流感病毒、登革病毒、黃病毒、單純皰滲病毒I和II、狂犬病病毒、副流感病毒、水痘帶狀皰療病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、人免疫缺陷病毒、冠狀病毒和肝炎病毒。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中所述流感病毒蛋白是HA和/或NA。
36. 權(quán)利要求34的方法，其中所述呼吸道合胞病毒病毒蛋白是F和/或G。
37. 權(quán)利要求34的方法，其中所述登革病毒病毒蛋白是E和/或preM/M。
38. —種抗原性配制劑，其包含嵌合的VLP，所述嵌合的VLP包含新城疫病毒(ND V)核心蛋白(M)和至少一種來自不同傳染原的蛋白質(zhì)。
39. 權(quán)利要求38的抗原性配制劑，其中所述來自傳染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白。
40. 權(quán)利要求39的抗原性配制劑，其中所述病毒蛋白在所述VLP的表面上表達(dá)。
41. 權(quán)利要求40的抗原性配制劑，其中病毒蛋白包含會在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的表位。
42. 權(quán)利要求39的抗原性配制劑，其中所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含與副流感病毒(PIV)蛋白或其片段融合的所述病毒蛋白。
43. 權(quán)利要求42的抗原性配制劑，其中所述PIV蛋白選自由HN和F蛋白組成的組。
44. 權(quán)利要求42的抗原性配制劑，其中所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述PIV蛋白的 一部分。
45. 權(quán)利要求44的抗原性配制劑，其中病毒蛋白的所述部分在所述VLP的表面上表達(dá)。
46. 權(quán)利要求42的抗原性配制劑，其中病毒蛋白的所述部分包含會在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的表位。
47. 權(quán)利要求42的抗原性配制劑，其中PIV蛋白的所述部分與所述NDVM蛋白結(jié)合。
48. 權(quán)利要求39的抗原性配制劑，其中所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含與NDV蛋白融合的所述病毒蛋白。
49. 權(quán)利要求48的抗原性配制劑，其中所述NDV蛋白選自由NP、 F、和HN蛋白組成的組。
50. 權(quán)利要求48的抗原性配制劑，其中所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所述NDV蛋白的一部分。
51. 權(quán)利要求50的抗原性配制劑，其中病毒蛋白的所述部分在所述VLP的表面上表達(dá)。
52. 權(quán)利要求50的抗原性配制劑，其中病毒蛋白的所述部分包含會在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的表位。
53. 權(quán)利要求50的抗原性配制劑，其中NDV蛋白的所述部分與所述NDV M蛋白結(jié)合。
54. 權(quán)利要求39的抗原性配制劑，其中所述病毒蛋白選自下組流感病毒、 登革病毒、黃病毒、單純皰滲病毒I和II、狂犬病病毒、副流感病毒、水 痘帶狀皰疹病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、人免疫缺陷病毒、冠 ^j犬病毒和肝炎病毒。
55. 權(quán)利要求54的抗原性配制劑，其中所述流感病毒蛋白是HA和/或NA。
56. 權(quán)利要求54的抗原性配制劑，其中所述呼吸道合胞病毒病毒蛋白是F和/ 或G。
57. 權(quán)利要求54的抗原性配制劑，其中所述登革病毒病毒蛋白是E和/或 preM/M。
58. 權(quán)利要求38的抗原性配制劑，其進(jìn)一步包含佐劑。
59. 權(quán)利要求58的抗原性配制劑，其中所述佐劑是Novasomes。
60. 權(quán)利要求38的抗原性配制劑，其中所述配制劑適合于人施用。
61. 權(quán)利要求38的抗原性配制劑，其中不同嵌合的VLP被混合在一起以產(chǎn)生多價配制劑。
62. 權(quán)利要求38的抗原性配制劑，其中所述配制劑是給脊推動物口服、皮內(nèi)、 鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用的。
63. —種疫苗，其包含嵌合的VLP,所述嵌合的VLP包含新城疫病毒(NDV) 核心蛋白(M)和至少一種來自不同傳染原的蛋白質(zhì)。
64. 權(quán)利要求63的疫苗，其中所述來自傳染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白。
65. 權(quán)利要求64的疫苗，其中所述病毒蛋白在所述VLP的表面上表達(dá)。
66. 權(quán)利要求65的疫苗，其中所述病毒蛋白包含會在脊推動物中產(chǎn)生保護(hù)性 免疫應(yīng)答的表位。
67. 權(quán)利要求64的疫苗，其中所述VLP包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包 含與副流感病毒(PIV)蛋白或其片段融合的所述病毒蛋白。
68. 權(quán)利要求67的疫苗，其中所述PIV蛋白選自由HN和F蛋白組成的組。
69. 權(quán)利要求67的疫苗，其中所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所 述PIV蛋白的一部分。
70. 權(quán)利要求69的疫苗，其中病毒蛋白的所述部分在所述VLP的表面上表 達(dá)。
71. 權(quán)利要求69的疫苗，其中病毒蛋白的所述部分包含會在脊推動物中產(chǎn)生 保護(hù)性免疫應(yīng)答的表位。
72. 權(quán)利要求69的疫苗，其中PIV蛋白的所述部分與所述NDVM蛋白結(jié)合。
73. 權(quán)利要求64的疫苗，其中所述VLP含有嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包 含與NDV蛋白融合的所述病毒蛋白。
74. 權(quán)利要求73的疫苗，其中所述NDV蛋白選自由NP、 F、和HN蛋白組成的組。
75. 權(quán)利要求73的疫苗，其中所述嵌合蛋白包含所述病毒蛋白的一部分和所 述NDV蛋白的一部分。
76. 權(quán)利要求75的疫苗，其中病毒蛋白的所述部分在所述VLP的表面上表達(dá)。
77. 權(quán)利要求75的疫苗，其中病毒蛋白的所述部分包含會在脊推動物中產(chǎn)生 保護(hù)性免疫應(yīng)答的表位。
78. 權(quán)利要求75的疫苗，其中NDV蛋白的所述部分與所述NDVM蛋白結(jié)合。
79. 權(quán)利要求64的疫苗，其中所述病毒蛋白選自下組流感病毒、登革病毒、 黃病毒、單純皰滲病毒I和II、狂犬病病毒、副流感病毒、水痘帶狀皰滲 病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、人免疫缺陷病毒、冠狀病毒和肝 炎病毒。
80. 權(quán)利要求79的疫苗，其中所述流感病毒蛋白是HA和/或NA。
81. 權(quán)利要求79的疫苗，其中所述呼吸道合胞病毒病毒蛋白是F和/或G。
82. 權(quán)利要求79的疫苗，其中所述登革病毒病毒蛋白是E和/或preM/M。
83. 權(quán)利要求63的疫苗，其進(jìn)一步包含佐劑。
84. 權(quán)利要求63的疫苗，其中所述佐劑是Novasomes。
85. 權(quán)利要求63的疫苗，其中不同嵌合的VLP被混合在一起以產(chǎn)生多價配制劑。
86. 權(quán)利要求63的疫苗，其中所述配制劑是給脊推動物口服、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、 肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用的。
87. —種在脊推動物中誘導(dǎo)免疫的方法，包括給所述脊推動物施用嵌合的 VLP,所述嵌合的VLP包含新城疫病毒(NDV)病毒核心蛋白(M)和至少一 種來自不同病毒的病毒蛋白。
88. 權(quán)利要求87的方法，其中所述來自傳染原的蛋白質(zhì)是病毒蛋白。
89. 權(quán)利要求87的方法，其中所述免疫應(yīng)答是體液免疫應(yīng)答。
90. 權(quán)利要求87的方法，其中所述免疫應(yīng)答是細(xì)胞免疫應(yīng)答。
91. 一種誘導(dǎo)針對抗原組合物的免疫應(yīng)答的方法，所述抗原組合物包含嵌合的VLP，所述嵌合的VLP包含新城疫病毒(NDV)病毒核心蛋白(M)和至少一種來自不同病毒的病毒蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開并要求保護(hù)表達(dá)和/或含有新城疫基質(zhì)蛋白的嵌合病毒樣顆粒(VLP)。本發(fā)明包括包含所述蛋白質(zhì)的載體構(gòu)建體、包含所述構(gòu)建體的細(xì)胞、包含本發(fā)明的嵌合的VLP的配制劑和疫苗。本發(fā)明還包括制備嵌合的VLP和給脊椎動物施用嵌合的VLP的方法，包括誘導(dǎo)針對感染的免疫的方法。
文檔編號C12N15/63GK101668857SQ200880012924
公開日2010年3月10日 申請日期2008年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月21日
發(fā)明者庫塔布·馬穆德, 彼得·普什科, 蓋爾·史密斯 申請人:諾瓦瓦克斯股份有限公司