專利名稱：：具有修飾的序列的呼腸孤病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及病毒，更具體地涉及具有修飾的序列的呼腸孤病毒。背景呼腸孤病毒的名稱來自呼吸和腸孤兒病毒的首字母縮寫，代表來自人類呼吸和腸道但不與嚴(yán)重疾病關(guān)聯(lián)的最初分離株(isolate)。呼腸孤病毒具有雙鏈、節(jié)段的RNA基因組。病毒體的直徑經(jīng)測(cè)量為60-80nm并具有兩層各自為二十面體的同心的衣殼。哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒基因組由10個(gè)不連續(xù)區(qū)段的雙鏈RNA組成，總基因組大小為23.5kbp。單獨(dú)RNA區(qū)段的大小不同。已經(jīng)從哺乳動(dòng)物物種回收三種血清學(xué)上不同但相關(guān)類型的呼腸孤病毒l型(代表性毒林包括例如，Lang(TlL))、2型(代表性毒抹包括例如，Jones(T2J))和3型(代表性毒林包括例如，Dearing或Abney(分別是T3D或T3A))。這三種血清型基于中和和血凝素抑制測(cè)定是易于鑒定的(參見例如,Sabin,1959,5Wewce,130:966;Fields等人,1996,Fwwfemewta/Wra/ogy,第3版，Lippincott-Raven;Rosen，1960,爿m./^g.,71:242;和Stanley,1967,5r.M^/.5w//.,23:150)。概述本文提供了具有修飾的核酸和多肽序列的呼腸孤病毒。序列修飾包括，例如在呼腸孤病毒一種或多種基因組區(qū)段中的修飾。還提供了包括具有修飾的序列的呼腸孤病毒的藥物組合物以及使用這種呼腸孤病毒的方法。一方面，本發(fā)明提供具有如下多肽的呼腸孤病毒具有一種或多種氨基酸修飾的X-3多肽；具有一種或多種氨基酸修飾的a-3多肽；具有一種或多種氨基酸修飾的p-l多肽；和/或具有一種或多種氨基酸修飾的in-2多肽。這種呼腸孤病毒可為例如，非天然產(chǎn)生的。另一方面，本發(fā)明提供具有一種或多種氨基酸修飾的呼腸孤病毒人-3多肽；具有一種或多種氨基酸修飾的呼腸孤病毒cj-3多肽；具有一種或多種氨基酸修飾的呼腸孤病毒多肽；和/或具有一種或多種氨基酸修飾的呼腸孤病毒|>2多肽。以示例的方式，X-3多肽中的一種或多種氨基酸修飾可為相對(duì)于GenBank登記號(hào)M24734.1編號(hào)的殘基214處的Val、殘基267處的Ala、殘基557處的Thr、殘基755處的Lys、殘基756處的Met、殘基926處的Pro、殘基963處的Pro、殘基979處的Leu、殘基1045處的Arg、殘基1071處的Val或其任何組合。注意到，當(dāng)氨基酸序列在殘基214處是Val或在殘基1071處是Val時(shí)，氨基酸序列進(jìn)一步包括氨基酸序列中的至少一種另外的改變。在一實(shí)施方案中，入-3多肽包括SEQIDNO:18中所示的序列。進(jìn)一步以示例的方式，cy-3多肽中的一種或多種氨基酸修飾可為相對(duì)于GenBank登記號(hào)K02739編號(hào)的殘基14處的Leu、殘基198處的Lys或其任何組合。注意到，當(dāng)氨基酸序列在殘基14處是Leu時(shí)，氨基酸序列進(jìn)一步包括氨基酸序列中的至少一種另外的改變。在一實(shí)施方案中，cj-3多肽包括SEQIDNO:14中所示的序列。進(jìn)一步以示例的方式，多肽中的一種或多種氨基酸修飾可為相對(duì)于GenBank登記號(hào)M20161.1編號(hào)的殘基73處的Asp。在一實(shí)施方案中，多肽包括SEQIDNO:16中所示的序列。還以示例的方式，)i-2多肽中的氨基酸修飾可為相對(duì)于GenBank登記號(hào)AF461684.1編號(hào)的殘基528處的Ser。在一實(shí)施方案中，pl多肽包括SEQIDNO:15中所示的序列。本文描述的具有一種或多種修飾的呼腸孤病毒可進(jìn)一步包括呼腸孤病毒cy-2多肽。這種a-2多肽可具有在相對(duì)于GenBank登記號(hào)NP一694684.1編號(hào)的位置70、127、195、241、255、294、296或340中的一個(gè)或多個(gè)位置處的Cys。在一實(shí)施方案中，a-2多肽包括SEQIDNO:12中所示的序列。另一方面，本發(fā)明提供具有如下基因組區(qū)段的呼腸孤病毒具有一種或多種核酸修飾的Ll基因組區(qū)段；具有一種或多種核酸修飾的S4基因組區(qū)段；具有一種或多種核酸修飾的M1基因組區(qū)段；和/或具有一種或多種核酸修飾的M2基因組區(qū)段。這種呼腸孤病毒可為例如，非天然產(chǎn)生的。另一方面，本發(fā)明提供具有一種或多種核酸修飾的Ll基因組區(qū)段；具有一種或多種核酸修飾的S4基因組區(qū)段；具有一種或多種核酸修飾的Ml基因組區(qū)段；和/或具有一種或多種核酸修飾的M2基因組區(qū)段。以示例的方式，Ll基因組區(qū)段中一種或多種核酸修飾可為相對(duì)于GenBank登記號(hào)M24734,1編號(hào)的位置660處的T、位置817處的G、位置1687處的A、位置2283處的G、位置2284-2286處的ATG、位置2794處的C、位置2905處的C、位置2953處的C、位置3153處的A或位置3231處的G。在一實(shí)施方案中，U基因組區(qū)段包括SEQIDNO:8中所示的序列。進(jìn)一步以示例的方式，S4基因組區(qū)段中的一種或多種核酸修飾可為相對(duì)于GenBank登記號(hào)K02739編號(hào)的位置74處的A和位置624處的A。在一實(shí)施方案中，S4基因組區(qū)段包括SEQIDNO:4中所示的序列。進(jìn)一步以示例的方式，M2基因組區(qū)段中的核酸修飾可為相對(duì)于GenBank登記號(hào)M20161.1編號(hào)的位置248處的C。在一實(shí)施方案中，M2基因組區(qū)段包括SEQIDNO:6中所示的序列。還以示例的方式，Ml基因組區(qū)段中的核酸修飾可為相對(duì)于GenBank登記號(hào)AF461684.1編號(hào)的位置1595處的T。在一實(shí)施方案中，Ml基因組區(qū)段包括SEQIDNO:5中所示的序列。本文描述的呼腸孤病毒可包括本文公開的任何修飾或修飾的組合。在一些實(shí)施方案中，本文描述的呼腸孤病毒是重配林(reassortant)。在某些實(shí)施方案中，本文描述的呼腸孤病毒包括具有SEQIDNO:1-10中所示的序列的基因組區(qū)段或SEQIDNO:11、12和16-21中所示的多肽以及SEQIDNQ:13或14中任一或兩者所示的多肽。在一實(shí)施方案中，本文公開的呼腸孤病毒鑒定為IDAC登記號(hào)190907-01。本文公開的呼腸孤病毒通常表現(xiàn)出超過不含有相應(yīng)修飾的呼腸孤病毒的生長(zhǎng)益處。代表性生長(zhǎng)益處包括但不限于溶解率增加；蝕斑形成的大小增加；RNA復(fù)制速率提高；RNA轉(zhuǎn)錄速率提高；翻譯速率提高；病毒組裝和/或包裝速率提高；病毒后代數(shù)目增加；呼腸孤病毒被宿主細(xì)胞獲取的能力提高；脫被(uncoat)的能力提高或增強(qiáng)；細(xì)胞溶解增強(qiáng)或誘導(dǎo)包括凋亡、壞死或自體吞噬的細(xì)胞死亡；感染、溶解和殺死人類瘤細(xì)胞系的能力增強(qiáng)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞中免疫原性降低；對(duì)干擾素敏感性的易感性不同；對(duì)宿主的毒性降低；藥物相互作用增強(qiáng)；放療相互作用增強(qiáng)；或釋放有效腫瘤表位的能力。本文描述的呼腸孤病毒可連同藥學(xué)上可接受的載體被包括在藥物組合物中。這種藥物組合物可包括，例如一種或多種化療劑和/或一種或多種免疫抑制劑。在又另一方面，本發(fā)明提供制備改良的呼腸孤病毒的方法。這種方法通常包括修飾呼腸孤病毒的核酸序列和選擇一種或多種改良的呼腸孤病毒的步驟。在一些實(shí)施方案中，修飾步驟包括例如，誘變呼腸孤病毒。代表性誘變類型包括但不限于位點(diǎn)定向誘變和化學(xué)誘變。在其它實(shí)施方案中，修飾步驟包括在人類細(xì)胞系中培養(yǎng)呼腸孤病毒。根據(jù)本文公開的方法制備的改良的呼腸孤病毒可根據(jù)以下選擇溶解率增加；蝕斑形成的大小增加；RNA復(fù)制速率提高；RNA轉(zhuǎn)錄速率提高；翻譯速率提高；病毒組裝和/或包裝速率提高；病毒后代數(shù)目增加；呼腸孤病毒被宿主細(xì)胞獲取的能力提高；脫被的能力提高或增強(qiáng)；細(xì)胞溶解增強(qiáng)或誘導(dǎo)包括凋亡、壞死或自體吞噬的細(xì)胞死亡；感染、溶解和殺死人類瘤細(xì)胞系的能力增強(qiáng)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞中免疫原性降低；對(duì)干擾素敏感性的易感性不同；對(duì)宿主的毒性降低；藥物相互作用增強(qiáng)；放療相互作用增強(qiáng)；或釋放有效腫瘤表位的能力。在又另一方面，本發(fā)明提供治療患者增生性病癥的方法。這種方法通常包括向患者施用如本文所迷的修飾的呼腸孤病毒或含有這種修飾的呼腸孤病毒的藥物組合物。通常，呼腸孤病毒以有效導(dǎo)致溶瘤作用的量施用，并可施用多于一次。代表性施用途徑包括例如，直接注射、靜脈內(nèi)、血管內(nèi)、鞘內(nèi)、^L內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、局部地、口服地、直腸地、陰道地、鼻地或通過吸入。本文所述的治療增生性病癥的方法可伴有諸如手術(shù)、化療、放療和免疫抑制療法的一種或(of)多種程序。另一方面，本發(fā)明提供一種藥盒(或制品)，其包括如本文所公開的具有修飾的序列或具有含修飾的序列的基因組區(qū)段的任何組合的呼腸孤病毒。藥盒還可包括如本文公開的一種或多種劑。除非另外限定，否則本文所用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的具有相同含義。下文描述了適合的方法和材料，盡管與本文描述的方法和材料相似或等價(jià)的方法和材料可用于實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明。此外，材料、方法和實(shí)例僅僅是示例性的并不意為限制。本文提到的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)通過引用以其全部?jī)?nèi)容并入本文。本發(fā)明一種或多種實(shí)施方案的詳細(xì)說明列于附圖和以下說明書。根據(jù)附圖、詳述和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征、目標(biāo)和益處將變得明顯。圖1是代表性S1區(qū)段(SEQIDNO:1)、S2區(qū)段(SEQIDNO:2)、S3區(qū)4殳(SEQIDNO:3)和S4區(qū)段(SEQIDNO:4)的核苷酸序列。圖2是代表性Ml區(qū)段(SEQIDNO:5)、M2區(qū)段(SEQIDNO:6)和M3區(qū)段(SEQIDNO:7)的核苷酸序列。圖3是代表性L1區(qū)段(SEQIDNO:8)、L2區(qū)4殳(SEQIDNO:9)和L3圖4是代表性a-l多肽(SEQIDNO:11)、cy-2多肽(SEQIDNO:12)、g-NS多肽(推定編碼序列1、SEQEDNO:13;推定編碼序列2、SEQIDNO:14)和d-3多肽(SEQIDNO:15)的氨基酸序列。圖5是代表性[i-2多肽(SEQIDNO:16)、(x-1多肽(SEQIDNO:17)和p-NS多肽(SEQIDNO:18)的氨基酉踏列。圖6是代表性多肽(SEQIDNO:19)、入-2多肽(SEQIDNO:20)和I-1多肽(SEQIDNO:21)的氨基酸序列。各圖中同樣的參考符號(hào)指示同樣的元件。詳迷本公開內(nèi)容描述了呼腸孤病毒的核苷酸和氨基酸序列中的修飾。任選地選擇這種修飾以影響病毒復(fù)制和/或包裝自身的能力，并從而改變呼腸孤病毒的感染性和/或復(fù)制率。^^7##^^/{/的呼厲孤病毒和錄務(wù)才法來自任何3型哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒(本文簡(jiǎn)稱為"呼腸孤病毒，，)的任何基因組區(qū)段可如本文公開的進(jìn)行修飾。代表性3型哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒包括但不限于Dearing和Abney毒林。參見例如，ATCC登記號(hào)VR-232和VR-824?？扇绫疚墓_的修飾的呼腸孤病毒包括天然產(chǎn)生的呼腸孤病毒(如分離自天然來源，如從患者分離)和重配的呼腸孤病毒(參見如美國專利第7,163,678號(hào))。對(duì)呼腸孤病毒不同基因組區(qū)段的代表性修飾和該修飾在編碼的多肽中的表現(xiàn)形式(manifestation)示于表1。表1中所示的修飾顯示編碼與RNA-依賴性RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄活性和/或RNA結(jié)合相關(guān)的多肽的區(qū)段序列中的修飾(修飾數(shù)目和許多修飾的非保守性質(zhì))。例如，本文公開的許多新型修飾位于Ll基因組區(qū)段。野生型Ll基因組區(qū)段編碼稱為X-3的1，267個(gè)氨基酸(142kDa)的蛋白。X-3代表呼腸孤病毒的RNA-依賴性RNA聚合酶的催化亞基，該酶介導(dǎo)呼腸孤病毒粒子中加鏈和減鏈RNA合成。在M2基因組區(qū)段中觀察到進(jìn)一步修飾。野生型M2基因組區(qū)段編碼稱為的708個(gè)氨基酸(76kDa)的蛋白，其牽涉在與粒子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)中。此外，還在S4和Ml基因組區(qū)段中觀察到修飾，所述區(qū)段分別編碼cj-3和(>2,并在轉(zhuǎn)錄或單鏈或雙鏈RNA結(jié)合中起作用。因此，本公開內(nèi)容提供在相應(yīng)基因組區(qū)段中含有一種或多種核酸修飾的L1、S4、Ml、M2或這種基因組區(qū)段的任何組合。本文提供具有一種或多種核酸修飾的呼腸孤病毒Ll基因組區(qū)段；具有一種或多種核酸修飾的呼腸孤病毒S4基因組區(qū)段；具有一種或多種核酸修飾的呼腸孤病毒Ml基因組區(qū)段；和/或具有一種或多種核酸修飾的M2基因組區(qū)段。呼腸孤病毒Ll基因組區(qū)段具有例如以下核苷酸中的一種或多種的任何組合位置660處的T、位置817處的G、位置1687處的A、位置2283處的G、位置2284-2286處的ATG、位置2794處的C、位置2905處的C、位置2953處的C、位置3153處的A或位置3231處的G(相對(duì)于GenBank登記號(hào)M24734.1編號(hào))。呼腸孤病毒S4基因組區(qū)段具有例如以下核苷酸中的一種或多種的任何組合位置74處的A或位置624處的A(相對(duì)于GenBank登記號(hào)K02739編號(hào))。呼腸孤病毒Ml基因組區(qū)段具有例如在位置1595處的T核苷酸(相對(duì)于GenBank登記號(hào)AF461684.1編號(hào))。呼腸孤病毒M2基因組區(qū)段具有例如在位置248處的C核苷酸(相對(duì)于GenBank登記號(hào)M20161.1編號(hào))。在指示位置的指示核苷酸表示與公共數(shù)據(jù)庫中可得的其它相應(yīng)序列(如GenBank登記號(hào)M24734.1、K02739、AF461684.1和M20161.1)相比時(shí)的修飾。呼腸孤病毒X-3多肽具有例如一種或多種氨基酸殘基的任何組合殘基214處的Val、殘基267處的Ala、殘基557處的Thr、殘基755處的Lys、殘基756處的Met、殘基926處的Pro、殘基963處的Pro、殘基979處的Leu、殘基1045處的Arg或殘基1071處的Val(相對(duì)于GenBank登記號(hào)M24734.1編號(hào))。應(yīng)注意，當(dāng)多肽序列包括殘基214處的Val或殘基1071處的Val時(shí)，該多肽序列進(jìn)一步包括氨基酸序列中至少一種另外的改變。呼腸孤病毒cj-3多肽具有例如一種或多種氨基酸殘基的任何組合殘基14處的Leu或殘基198處的Lys(相對(duì)于GenBank登記號(hào)K02739編號(hào))。應(yīng)注意，當(dāng)多肽序列包括殘基14處的Leu時(shí)，該多肽序列進(jìn)一步包括氨基酸序列中至少一種另外的改變。呼腸孤病毒多肽具有例如在殘基73處的Asp(相對(duì)于GenBank登記號(hào)AF461684.1編號(hào))。呼腸孤病毒|_i-2多肽指示位置的指^氨基酸表示與公共數(shù)據(jù)庫中的其它:應(yīng)序列(如GenBank登記號(hào)M24734.1、K02739、AF461684.1和M20161.1)相比時(shí)的修飾。本文所用的"非天然產(chǎn)生的"呼腸孤病毒是與來自例如天然分離抹(fieldisolate)(如患者)的野生型序列相比具有至少一種核酸或氨基酸修飾的呼腸孤病毒。"非天然產(chǎn)生的"呼腸孤病毒是指已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室中操縱或修飾的病毒。這種操縱的或修飾的呼腸孤病毒包括實(shí)驗(yàn)室毒林或誘變形式。這些形式的核酸和/或氨基酸序列與例如Dearing和Abney毒林(分別如ATCCVR-824和VF-232)是可區(qū)別的。本文公開了對(duì)一種或多種基因組區(qū)段、編碼的多肽或兩者的代表性修飾。除了含有一種或多種本文描述的修飾的基因組區(qū)段或多肽，呼腸孤病毒任選地含有編碼ct-2多肽的S2基因組區(qū),殳。cj-2多肽例如在以下位置中的一個(gè)或多個(gè)或所有位置處具有Cys:70、127、195、241、255、294、296或340(相對(duì)于GenBank登記號(hào)NP—694684.1編號(hào))。修飾通常在核酸水平發(fā)生，該修飾可在或可不在編碼的多肽中表現(xiàn)自身。對(duì)核酸的修飾包括但不限于，單個(gè)或多個(gè)核苷酸轉(zhuǎn)變(嘌呤到嘌呤或嗜。定到嘧啶)或顛換(噪呤到嘧啶或反之亦然)和單個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失或插入。核酸中的修飾可導(dǎo)致編碼的多肽中一種或多種保守性或非保守性氨基酸取代，翻譯讀碼框中位移("移碼)導(dǎo)致從該位點(diǎn)起開始編碼的完全不同的多肽，提前終止密碼子導(dǎo)致平截的多肽("平截")，或呼腸孤病毒核酸中的修飾完全不改變編碼的多肽("沉默，，或"無義，，)。參見例如，Johnson&Overington,1993,Mo/.所o/.,233:716-38;Henikoff&Henikoff,1992,尸rac.扁.,，89:10915-19;和美國專利第4,554,101號(hào)公開的保守性和非保守性氨基酸取代。例如，使用可購得的標(biāo)準(zhǔn)方法從呼腸孤病毒粒子分離核酸。還參見例如，Schiff等人，"OrthoreovirusesandTheirReplication(正呼腸孤病毒和其復(fù)制),"第52章，MeMsMTO/ogy(費(fèi)氏病毒學(xué))，Knipe&Howley編輯，2006,LippincottWilliams&Wilkins。本文所用的"分離的"核酸是指與通常伴隨它們的其它核酸實(shí)質(zhì)上分開的核酸。因此，"分離的"核酸包括但不限于基本上沒有非-呼腸孤病毒(如宿主細(xì)胞)核酸的呼腸孤病毒核酸，或基本上沒有對(duì)應(yīng)其它基因組區(qū)段的核酸的呼腸孤病毒基因組區(qū)段。此外，分離的核酸包括工程化核酸諸如重組或合成核酸。使用本領(lǐng)域已知的任何多種方法在呼腸孤病毒的核酸中產(chǎn)生修飾。例如，位點(diǎn)定向誘變可用于修飾呼腸孤病毒的核酸序列。位點(diǎn)定向誘變的一種最常用方法是針對(duì)寡核苷酸的誘變。在針對(duì)寡核苷酸的誘變中，將編碼序列中期望改變的寡核苷酸退火到目標(biāo)DNA的一條鏈，并作為開始DNA合成的引物。以這種方式，將含有序列改變的寡核苷酸并入新合成的鏈。參見例如，Kunkel,1985,尸rac.Ato/.爿cafi.5W.L/5^，82:488;Kunkel等人,1987,M"A.五"，o/"154:367;Lewis&Thompson,1990,M/c/.^c/^sto.，18:3439;Bohnsack，1996，Me/A.Mo/.Ao/.，57:1;Deng&Nickoloff，1992，v4朋/.Aoc/^m.，200:81;和Shimada，1996,M"A.Mo/.所o/"57:157。本領(lǐng)域中例行使用其它方法來將修飾引入序列。例如，使用PCR或化學(xué)合成來產(chǎn)生修飾的核酸，或可化學(xué)合成氨基酸序列中具有期望改變的多肽。參見例如，Bang&Kent,2005,iVoc.〗VW/.<Sd.102:5014-9和其中的參考文獻(xiàn)。在呼腸孤病毒通常不在其上生長(zhǎng)的細(xì)胞類型(如人類細(xì)胞)上選擇和/或化學(xué)誘變(參見例如，Rudd&Lemay,2OO5,Gew.Wra/ogy,86:1489-97)也可用于產(chǎn)生呼腸孤病毒的核酸中的修飾。例如，通過在人類細(xì)胞(如人類胚胎腎(HEK)293細(xì)胞)上培養(yǎng)呼腸孤病毒產(chǎn)生表1中所示的修飾，該細(xì)胞在本領(lǐng)域中通常不用于培養(yǎng)呼腸孤病毒。相反，通常用于培養(yǎng)呼腸孤病毒的細(xì)胞描述于例如，Tyler,"MammalianReoviruses(哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒),"第53章，第1731-2頁，F(xiàn)z'e/^sMra/ogy(費(fèi)氏病毒學(xué))，Knipe&Howley編輯，2006,LippincottWilliams&Wilkins。本文描述的修飾代表呼腸孤病毒對(duì)人類細(xì)胞的適應(yīng)。在各個(gè)蝕斑純化步驟還有通過選擇最大蝕斑(三重蝕斑純化)的選擇步驟，從而選擇這些細(xì)胞中的生長(zhǎng)或毒力益處。在已將一種或多種修飾引入呼腸孤病毒核酸或多肽后，使用本領(lǐng)域已知方法重殺斤構(gòu)成病毒粒子。參見例如，Schiff等人，"OrthoreovirusesandTheirReplication(正呼腸孤病毒和其復(fù)制),"第52章，WeMsMra/ogy(費(fèi)氏病毒學(xué))，Knipe&Howley編輯，2006,LippincottWilliams&Wilkins;Smith等人，1969,Virology,39(4):791掘;和美國專利第7,186,542;7,049,127;6,808,916和6,528,305號(hào)。序列中具有一種或多種修飾的呼腸孤病毒培養(yǎng)于例如小鼠L929細(xì)胞或瘤細(xì)胞(如MCF7(ATCC登記號(hào)HTB-22)、SKBR3(ATCC登記號(hào)HTB-30)或MDAMB468(ATCC登記號(hào)HTB132)細(xì)胞)，并基于任何多種可能指示例如，超過不含有一種或多種修飾的呼腸孤病毒的生長(zhǎng)益處的特征來選擇。在細(xì)胞系(瘤或其它)中培養(yǎng)后和/或感染動(dòng)物模型系統(tǒng)后選擇呼腸《瓜病毒。這種特征包括但不限于，溶解率增加；蝕斑形成的大小增加；RNA復(fù)制速率提高；RNA轉(zhuǎn)錄速率提高；翻譯速率提高；病毒組裝和/或包裝速率提高；病毒后代數(shù)目增加；呼腸孤病毒被宿主細(xì)胞獲取的能力提高；脫被的能力提高或增強(qiáng)；細(xì)胞溶解增強(qiáng)或誘導(dǎo)包括凋亡、壞死或自體吞噬的細(xì)胞死亡；感染、溶解和殺死人類瘤細(xì)胞系的能力增強(qiáng)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞中免疫原性降低；對(duì)干擾素敏感性的易感性不同；對(duì)宿主的毒性降低；藥物相互作用增強(qiáng)；放療相互作用增強(qiáng)；或釋放有效腫瘤表位的能力。另外，根據(jù)例如溶解地感染具有活性Ras途徑的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力選擇具有修飾的序列的呼腸孤病毒。參見例如，美國專利第7,052,832號(hào)。使用本領(lǐng)域已知的任何多種方法獲得呼腸孤病毒粒子。例如，將呼腸孤病毒培養(yǎng)于L929小鼠成纖維細(xì)胞或人類細(xì)胞(如HEK293),并使用標(biāo)準(zhǔn)方法純化病毒粒子。參見例如，Schiff等人，"OrthoreovirusesandTheirReplication(正呼腸孤病毒和其復(fù)制),"第52章，尸,e/^Kra/0g7(費(fèi)氏病毒學(xué))，Knipe&Howley編輯，2006，LippincottWilliams&Wilkins;Smith等人,1969,Virology,39(4):791掘;和美國專利第7,186,542;7,049,127;6,808,916和6,528,305號(hào)。本文所用的"純化的"病毒粒子是指已經(jīng)實(shí)質(zhì)上從天然伴隨其的細(xì)胞組分分離的病毒粒子。通常，當(dāng)至少70%(如至少75%、80%、85%、90%、95%或99%)干重的病毒粒子不含天然伴隨該病毒的蛋白和其它細(xì)胞組分時(shí)，認(rèn)為病毒粒子是"純化的"。具有圖1、2和3(SEQIDNO:l-10)所示的核酸序列和圖4、5和6(SEQIDNO:11-20)所示的氨基酸序列，并含有表1所示的核苷酸和氨基酸修飾的呼腸孤病毒，在2007年9月19日保藏于加拿大國際保藏管理局(IDAC,加拿大公共衛(wèi)生部國家微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，1015ArlingtonSt.,Winnipeg,ManitobaCanadaR3E3R2)，并指定登記號(hào)190907-01。該保藏物將才艮據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序目的的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的條款進(jìn)行保存。該保藏是示范性的并僅用于方便本領(lǐng)域技術(shù)人員，并不承認(rèn)保藏物是專利性所需的(如根據(jù)35U.S.C.§112)。炎力鼻^"滲謬^的呼應(yīng)孤;##^才法如以前所述(參見例如，美國專利第6,110,461;6,136,307;6,261,555;6,344,195;6,576,234和6,811,775號(hào))，呼腸3瓜病毒使用宿主細(xì)胞的Ras途徑機(jī)制來下調(diào)雙鏈RNA-活化的蛋白激酶(PKR)并因此在細(xì)胞中復(fù)制?；谶@些發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)開發(fā)了使用呼腸孤病毒來治療哺乳動(dòng)物增生性病癥的方法。代表性哺乳動(dòng)物包括小鼠、犬、貓、綿羊、山羊、牛、馬、豬、非-人類靈長(zhǎng)類和人類。本文所用的"患者"包括患有增生性病癥的任何哺乳動(dòng)物。"增生性病癥，，是任何細(xì)胞病癥，其中細(xì)胞增殖比正常組織生長(zhǎng)更快。因此"增殖細(xì)胞"是比正常細(xì)胞增殖更快的細(xì)胞。增生性病癥包括但不限于瘤，也稱為腫瘤。.瘤包括但不限于胰腺癌、乳腺癌、腦癌(如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、曱狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、神經(jīng)纖維瘤病和白血病。瘤包括實(shí)體瘤(如肉瘤或癌瘤)或影響造血系統(tǒng)的癌性生長(zhǎng)(如淋巴瘤或白血病)。其它增生性病癥包括但不限于神經(jīng)纖維瘤病。通常，在呼腸;瓜病毒用作療法的增生性病癥中，至少一些增殖細(xì)胞具有突變，其中Ras基因(或Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的元件)被直接地(如通過活化Ras中的突變)或間接地(如通過活化Ras途徑中的上游或下游元件)活化?；罨疪as途徑中的上游元件包括，例如藉由表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)或Sos的轉(zhuǎn)化。參見例如，Wiessmuller&Wittinghofer,1994,Ce〃w/arSz'gna/z'"g，6(3):247國267;和Barbacid，1987,爿朋.歷ocAew.,56,779-827。活化Ras途徑中的下游元件包括，例如B-Raf內(nèi)的突變。參見例如，Brose等人，2002,Owcer7^&,62:6997-7000。此外，呼腸孤病毒可用于治療PKR突變或失調(diào)引起的增生性病癥。參見例如，Strong等人，1998,五ilffiOJ.，17:3351-662。具有本文公開的修飾的序列的呼腸孤病毒施用于患有增生性病癥的哺乳動(dòng)物。本文所用的施用是指遞送呼腸孤病毒以使呼腸孤病毒接觸增殖細(xì)胞。施用呼腸孤病毒的途徑取決于病癥類型和增殖細(xì)胞的位置。可采用多種施用途徑。例如，對(duì)于可接近的實(shí)體瘤，通過直接注射施用呼腸孤病毒。對(duì)于造血的瘤，例如，靜脈內(nèi)或血管內(nèi)施用呼腸孤病毒。對(duì)于某些瘤，如在體內(nèi)不易接近的瘤諸如轉(zhuǎn)移或腦瘤，呼腸孤病毒以經(jīng)由哺乳動(dòng)物身體系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)從而到達(dá)瘤的方式施用(如鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi))。還區(qū)域地施用呼腸《瓜病毒，包括例如，局部地(如對(duì)于黑素瘤)、口地(如對(duì)于口瘤或食管瘤)、直腸地(如對(duì)于結(jié)腸直腸瘤)、陰道地(如對(duì)于子宮頸或陰道瘤)、鼻地或通過吸入(如對(duì)于肺瘤)。任選地由多于一種途徑施用呼腸孤病毒和/或施用呼腸孤病毒到個(gè)體中多于一處位置。靶向施用可用于施用呼腸"瓜病毒。例如，可向受治療者施用含有呼腸孤病毒的樹突細(xì)胞。參見例如，美國專利公布第2008/0014183號(hào)。在靶向遞送的另一實(shí)例中，遞送細(xì)胞可用于靶向增生性病癥的細(xì)^Jf防止免疫識(shí)別它們所攜帶的呼腸孤病毒。參見例如，Qiao等人，2008,A^wwMW.,14:37-44;和W02008/009115。具有本文公開的修飾的序列的呼腸孤病毒以足以治療增生性病癥的量施用(如"有效量")。當(dāng)與不存在治療的癥狀或臨床體征相比，向增殖細(xì)胞施用具有修飾的序列的呼腸孤病毒影響增生性病癥的一種或多種癥狀或臨床體征時(shí)，認(rèn)為"治療"了該病癥，所述癥狀或臨床體征包括如細(xì)胞溶解(如"溶瘤作用，，)增加、增殖細(xì)胞數(shù)目減少、瘤大小減小或進(jìn)展減少、瘤相關(guān)的疼痛減少。本文所用的術(shù)語"溶瘤作用"是指溶解至少10%的增殖細(xì)胞(如溶解至少20%、30%、40%、50%或75%的細(xì)胞)?？纱_定溶解百分比，例如，通過測(cè)量哺乳動(dòng)物中瘤大小的減小或增殖細(xì)胞數(shù)目的減少，或通過體外測(cè)量溶解的細(xì)胞的量(如根據(jù)增殖細(xì)胞的活組織檢查)。在個(gè)體基礎(chǔ)上確定具有修飾的序列的呼腸孤病毒的有效量，至少部分地基于所用的具體呼腸孤病毒；個(gè)體的尺寸、年齡、性別；和增殖細(xì)胞的大小和其它特征。例如，對(duì)于治療人類，使用大約103至1012個(gè)蝕斑形成單位(PFU)的呼腸孤病毒，這取決于增殖細(xì)胞或存在的瘤的類型、大小和數(shù)目。有效量可為從約1.0PFU/kg體重至約1015PFU/kg體重(如從約102PFU/kg體重至約1013PFU/kg體重)。以單劑量或多劑量(如二、三、四、六或更多劑量)施用呼腸孤病毒。同時(shí)或連續(xù)地(如經(jīng)過數(shù)天或數(shù)周時(shí)間)施用多劑量。具有修飾的序列的呼腸孤病毒的治療持續(xù)數(shù)天至數(shù)月，或直到實(shí)現(xiàn)減少疾病。預(yù)期具有本文公開的修飾的序列的呼腸孤病毒任選地聯(lián)合手術(shù)或除去增殖細(xì)胞(如瘤)施用。還預(yù)期具有修飾的序列的呼腸孤病毒任選地聯(lián)合放療施用或除放療以外施用。進(jìn)一步預(yù)期具有修飾的序列的呼腸孤病毒任選地Jf關(guān)合已知抗癌化合物、化療劑和/或免疫抑制劑施用或除已知抗癌化合物、化療劑和/或免疫抑制劑以外施用。這種劑包括但不限于5-氟尿嘧啶、絲裂霉素C、曱氨蝶呤、羥基脲、吉西他濱、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、米托蒽醌、蒽環(huán)類(表柔比星、伊立替康和多柔比星(Doxurubicin));針對(duì)受體的抗體諸如赫賽汀、拓樸異構(gòu)酶抑制劑諸如依托泊苷或喜樹堿、pregnasome、鉑化合物諸如碳鉑和順鉑、紫杉烷類諸如紫杉醇(taxol)和多西紫杉醇(taxotere)、激素治療劑諸如他莫昔芬和抗雌激素、白介素、干擾素、芳香酶抑制劑、促孕劑、LHRH類似物、mTOR抑制劑(如雷帕霉素和其衍生物；參見例如，Homicsko等人，2005，Omceri饑，65:6882-90;和Rao等人,2004,Cwr.C""cerZ>wgT^ge&,4:621-35)和其組合。進(jìn)一步預(yù)期具有修飾的序列的呼腸孤病毒聯(lián)合可增加內(nèi)皮通透性和/或減少間質(zhì)液壓的劑施用。這種劑包括例如TNF-a。參見例如，Sacchi等人，2006,Omceri仏，12:175-182。預(yù)期具有修飾的序列的呼腸孤病毒可聯(lián)合本文描述的療法和劑的任何組合施用。提供包括一種或多種呼腸孤病毒的藥物組合物，其中至少一種呼腸孤病毒具有如本文描述的《f飾的序列。參見例如，美國專利第6,576,234號(hào)。除了其中至少一種具有修飾的序列的一種或多種呼腸孤病毒，藥物組合物通常包括藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體包括作為呼腸孤病毒的運(yùn)載體、載體或介質(zhì)的固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)材料。因此，例如，含有具有修飾的序列的呼腸孤病毒的組合物為以下形式片劑、丸劑、粉末劑、錠劑、囊劑、扁嚢劑、酏劑、懸浮劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑、氣溶膠(作為固體或在液態(tài)介質(zhì)中)、含有例如達(dá)10%的重量的活性化合物的軟膏劑、軟和硬明膠膠嚢、栓劑、無菌注射溶液和無菌包裝粉末。適合載體的一些實(shí)例包括磷酸鹽緩沖鹽水或另一種生理上可接受的緩沖劑、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃芪膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無菌水、糖漿和甲基纖維素。藥物組合物另外可包括但不限于，潤(rùn)滑劑諸如滑石、硬脂酸鎂和礦物油；潤(rùn)濕劑；乳化劑和懸浮劑；防腐劑諸如苯曱酸曱酯和苯曱酸丙基鞋基酯；甜味劑和調(diào)味劑。本發(fā)明的藥物組合物可配制為在通過采用本領(lǐng)域已知程序施用后，提供具有修飾的序列的呼腸孤病毒的快速、持續(xù)或延遲的釋放。除了下述的代表性制劑，用于藥物纟且合物的其它適合制劑見于iewz'w^o":7TzeSc/e"cePraCceo/尸/^rwflcX雷氏藥學(xué)理論和實(shí)踐)(2003，Gennaro&Gennaro編輯，LippincottWilliams&Wilkens)。對(duì)于制備固態(tài)組合物諸如片劑，將具有修飾的序列的呼腸孤病毒與藥物載體混合以形成固態(tài)組合物。任選地，片劑或丸劑被包衣或以其它方式復(fù)合以提供給予延長(zhǎng)作用的益處的劑型。例如，片劑或九劑包括內(nèi)劑量組分和外劑量組分，后者為包封前者的形式。這兩種組分，例如，被腸衣層分開，腸衣層用于抵抗胃中的崩解并允許內(nèi)組分完整地進(jìn)入十二指腸或延遲釋放。多種材料用于這種腸衣層或包衣，這種材料包括多種聚合物酸(polymericacid)和聚合物酸與諸如蟲膠、十六醇和醋酸纖維素等材料的混合物。用于口服施用或用于注射的包括具有修飾的序列的呼腸孤病毒的液態(tài)制劑通常包括水性溶液、適當(dāng)調(diào)味的糖漿劑、水性或油性懸浮液和帶有可食用油諸如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油的調(diào)味乳劑、以及酏劑和類似藥物運(yùn)載體。用于吸入或吹入的組合物包括藥學(xué)上可接受的水性溶劑或有機(jī)溶劑或其混合物中的溶液和懸浮液，和粉末。這些液態(tài)或固態(tài)組合物任選地包含如本文所述的合適的藥學(xué)上可接受的賦形劑。為了區(qū)域或系統(tǒng)作用，這種組合物例如通過口或鼻呼吸途徑施用。藥學(xué)上可接受的溶劑中的組合物通過使用惰性氣體霧化。例如直接從霧化裝置、從附帶的面罩幕(facemasktent)、或從間歇性正壓呼吸機(jī)吸入霧化溶液。例如，從以合適方式遞送制劑的裝置口地或鼻地施用溶液、懸浮液或粉末組合物。用于本文教導(dǎo)方法的另一種制劑采用經(jīng)皮遞送裝置("貼片")。這種經(jīng)皮貼片用于提供連續(xù)或不連續(xù)的具有修飾的序列的呼腸孤病毒的輸入。根據(jù)本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行遞送藥物劑的經(jīng)皮貼片的構(gòu)造和使用。參見例如，美國專利第5,023,252號(hào)。這種貼片構(gòu)造為連續(xù)、脈動(dòng)性或按需地遞送具有修飾的序列的呼腸孤病毒。在施用之前(如在包含到藥物組合物中之前)，具有修飾的序列的呼腸孤病毒任選地被化學(xué)或生物化學(xué)預(yù)處理(如由蛋白酶諸如糜蛋白酶或胰蛋白酶處理)。蛋白酶預(yù)處理除去病毒的外部包被或衣殼并可用于增加病毒感染性。另外或替代性地，將具有修飾的序列的呼腸孤病毒包被在脂質(zhì)體或膠束中以減少或防止在對(duì)呼腸孤病毒有建成的免疫的哺乳動(dòng)物中的免疫應(yīng)答。這種呼腸孤病毒稱為"免疫保護(hù)的呼腸孤病毒"。參見例如，美國專利第6,565,831和7,014,847號(hào)。具有修飾的序列的呼腸孤病毒或包含這種呼腸孤病毒的藥物組合物可包裝到藥盒中。預(yù)期任選地包含一種或多種化療劑和/或免疫抑制劑(如抗-抗呼腸孤病毒抗體)的藥盒。藥物組合物，例如配制為單位劑型。術(shù)語"單位劑型，，是指適合作為用于人類受治療者和其它哺乳動(dòng)物的單一劑量的物理上離散的單位，各單位含有預(yù)先確定量的具有修飾的序列的呼腸孤病毒連同適合的藥學(xué)上可接受的載體，該量是計(jì)算以產(chǎn)生期望治療效果的量。根據(jù)本發(fā)明，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)和重組DNA技術(shù)。這種技術(shù)在文獻(xiàn)中充分闡釋。在以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，以下實(shí)施例不限制本發(fā)明范圍，本發(fā)明范圍描述于權(quán)利要求書。實(shí)施例實(shí)施例1-測(cè)序和分析從適應(yīng)懸浮的HEK293SMasterCellBank(MCB)開始用于產(chǎn)生呼腸孤病毒的培養(yǎng)。HEK293細(xì)胞維持在補(bǔ)充L-谷氨酰胺的無血清培養(yǎng)基(HEK293SFMII)中。擴(kuò)增(expand)HEK293細(xì)胞并接種到三個(gè)15L轉(zhuǎn)瓶(spinnerflask)，進(jìn)一步擴(kuò)增直到三個(gè)瓶中各有12L。呼腸孤病毒感染HEK293細(xì)胞通過直接接種病毒到細(xì)胞培養(yǎng)物中而進(jìn)行。當(dāng)HEK293S細(xì)胞的存活力在感染后降低20-50%時(shí)收獲病毒。將來自所有三個(gè)轉(zhuǎn)瓶的病毒物質(zhì)匯集到單個(gè)無菌容器中并攪動(dòng)以產(chǎn)生均勻混合物。移出三升匯集的細(xì)胞懸浮液，轉(zhuǎn)移到錐形管，并在3000rpm離心15分鐘。隨后以100mL澄清條件培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在醇-干水浴中快速冷凍三次，并隨后裝入無菌帶標(biāo)簽的冷凍管以用作接種母液(seedstock)。通過進(jìn)行三次蝕斑純化制備病毒母液。將粘附的HEK293S細(xì)胞鋪板到6-孔組織培養(yǎng)板上，以上述接種母液感染，并挑出兩個(gè)最大蝕斑。分別擴(kuò)增這兩個(gè)蝕斑并收獲，再次挑出兩個(gè)最大蝕斑。再次重復(fù)該程序，共三次。兩個(gè)蝕斑中的一個(gè)選為接種母液用于隨后的擴(kuò)增。從上述的相同的適應(yīng)懸浮的HEK293SMCB開始培養(yǎng)并維持在補(bǔ)充L-谷氨酰胺的相同HEK293無血清培養(yǎng)基(HEK293SFMII)中。細(xì)胞從方瓶擴(kuò)增到多個(gè)3L轉(zhuǎn)瓶中。通過首先在HEK293SFM培養(yǎng)基稀釋蝕斑-純化的病毒并隨后加入8至12mL的稀釋病毒到細(xì)胞培養(yǎng)物中而進(jìn)行感染。當(dāng)HEK293S細(xì)胞的存活力在感染后P爭(zhēng)低20-50。/。時(shí)收獲病毒，并且顯微鏡檢查每個(gè)轉(zhuǎn)瓶證實(shí)不存在微生物污染且細(xì)胞中存在細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。細(xì)胞具有腫脹和粒狀外觀指示CPE。將來自轉(zhuǎn)瓶的物質(zhì)匯集到單個(gè)無菌容器中并攪動(dòng)以產(chǎn)生均勻混合物，移出大量收集樣品。將剩余的匯集的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到錐形管，并在3000rpm離心15分鐘。隨后以400mL澄清條件培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在醇-干冰浴中快速冷凍濃的細(xì)胞懸浮液三次以溶解細(xì)胞，并隨后裝入無菌帶標(biāo)簽的冷凍管以用于測(cè)序反應(yīng)。/人兩個(gè)方向?qū)蓷lRNA鏈測(cè)序，并從重疊iB比連序列群(overlappingcontig)組裝各10個(gè)基因組區(qū)段的序列。各基因組區(qū)段的組裝序列用于BLAST搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(萬維網(wǎng)上ncbi.nlm.nih.gov)。檢查與見于NCBI數(shù)據(jù)庫的三種或四種不同呼腸孤病毒序列的比對(duì)且將具有最高量同源性的比對(duì)用于進(jìn)一步分析。與其它報(bào)道序列比較的多態(tài)性或修飾示于表1。對(duì)所選呼腸孤病毒毒林獨(dú)特的那些修飾在表1中標(biāo)以星號(hào)。表1.鑒定的修飾<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>*表示獨(dú)特修飾；斜體殘基表示沉默修飾；位置號(hào)是相對(duì)于所示的GenBank登記號(hào)應(yīng)理解的是，盡管已經(jīng)結(jié)合其詳細(xì)的說明書描述了本發(fā)明，但是如上的說明書意為闡釋而不是限制本發(fā)明范圍，本發(fā)明由所附權(quán)利要求書的范圍限定。其它方面、益處和修飾在如下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。公開了這樣的材料、組合物和組分——其可用于公開的方法和組合物，可聯(lián)合公開的方法和組合物使用，可用于制備公開的組合物，或是公開的方法和組合物的產(chǎn)物。本文公開了這些和其它材料，應(yīng)理解當(dāng)公開這些材料的組合、子集、相互作用、組等時(shí)，盡管可能沒有明確地公開所具體提到的這些化合物中的每一種不同的個(gè)體和集合的組合和排列，但是本文具體地預(yù)期和描述了每一個(gè)。例如，如果^Hf和討論了呼腸孤病毒的具體修飾或治療方案，且討論了可對(duì)呼腸孤病毒或治療方案進(jìn)行多種修飾，那么除非明確地另外指出，否則明確地包含呼腸^瓜病毒和治療方案的每種和所有組合和排列。類似地，還明確地包含和公開這些的任何子集或組合。權(quán)利要求1.一種包含具有一種或多種氨基酸修飾的λ-3多肽的呼腸孤病毒，其中所述一種或多種氨基酸修飾選自相對(duì)于SEQIDNO23(GenBank登記號(hào)M24734.1)編號(hào)的殘基214處的Val、殘基267處的Ala、殘基557處的Thr、殘基755處的Lys、殘基756處的Met、殘基926處的Pro、殘基963處的Pro、殘基979處的Leu、殘基1045處的Arg、殘基1071處的Val或其任何組合所組成的組，其中當(dāng)所述氨基酸序列包括殘基214處的Val或殘基1071處的Val時(shí)，所述氨基酸序列進(jìn)一步包括在所述氨基酸序列中的至少一種另外的修飾。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呼腸孤病毒，其中所述人-3多肽包括SEQIDNO:18。3.—種包含具有一種或多種氨基酸修飾的cj-3多肽的呼腸孤病毒，其中所述一種或多種氨基酸修飾選自相對(duì)于SEQIDNO:25(GenBank登記號(hào)K02739)編號(hào)的殘基14處的Leu、殘基198處的Lys或其任何組合所組成的組，其中當(dāng)所述氨基酸序列包括殘基14處的Leu時(shí)，所述氨基酸序列進(jìn)一步包括在所述氨基酸序列中的至少一種另外的修飾。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的呼腸孤病毒，其中所述a-3多肽包括SEQIDNO:14。5.—種包含具有至少一種氨基酸修飾的多肽的呼腸孤病毒，其中所述至少一種氨基酸修飾包括相對(duì)于SEQIDNO:27(GenBank登記號(hào)M20161.1)編號(hào)的殘基73處的Asp。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的呼腸孤病毒，其中所述|>1多肽包括SEQIDNO:16。7.—種包含具有至少一種氨基酸修飾的多肽的呼腸孤病毒，其中所述至少一種氨基酸修飾包括相對(duì)于SEQIDNO:29(GenBank登記號(hào)AF461684.1)編號(hào)的殘基528處的Ser。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的呼腸孤病毒，其中所述p-l多肽包括SEQIDNO:15。9.根據(jù)權(quán)利要求l、3、5或7所述的呼腸孤病毒，其中所述呼腸孤病毒進(jìn)一步包括呼腸孤病毒cj-2多肽。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的呼腸孤病毒，其中所述cj-2多肽包括在相對(duì)于SEQIDNO:30(GenBank登記號(hào)NP—694684.l)編號(hào)的位置70、127、195、241、255、294、296或340中的一個(gè)或多個(gè)位置處的Cys。11.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的呼腸孤病毒，其中所述cj-2多肽包括SEQIDNO:12。12.根據(jù)權(quán)利要求l-ll中任一項(xiàng)所述的呼腸孤病毒，其中所述呼腸孤病毒是重配林。13.—種包含具有一種或多種核酸修飾的U基因組區(qū)段的呼腸孤病毒，其中所述一種或多種核酸修飾選自相對(duì)于SEQIDNO:22(GenBank登記號(hào)M24734.1)編號(hào)的位置660處的T、位置817處的G、位置1687處的A、位置2283處的G、位置2284-2286處的ATG、位置2794處的C、位置2905處的C、位置2953處的C、位置3153處的A、位置3231處的G所組成的組。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的呼腸孤病毒，其中所述L1基因組區(qū)段包括SEQIDNO:8。15.—種包含具有一種或多種核酸修飾的S4基因組區(qū)段的呼腸孤病毒，其中所述S4基因組區(qū)段中的所述一種或多種核酸修飾選自相對(duì)于SEQIDNO:24(GenBank登記號(hào)K02739)編號(hào)的位置74處的A和位置624處的A所組成的組。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的呼腸孤病毒，其中所述S4基因組區(qū)段包括SEQIDNO:4。17.—種包含具有至少一種核酸修飾的M2基因組區(qū)段的呼腸孤病毒，其中所述至少一種核酸修飾包括相對(duì)于(SEQIDNO:26(GenBank登記號(hào)M20161.1)編號(hào)的位置248處的C。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的呼腸孤病毒，其中所述M2基因組區(qū)段包括SEQIDNO:6。19.一種包含具有至少一種核酸修飾的Ml基因組區(qū)段的呼腸孤病毒，其中所述至少一種核酸修飾包括相對(duì)于SEQIDNO:28(GenBank登記號(hào)AF461684.1)編號(hào)的位置1595處的T。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的呼腸孤病毒，其中所述M1基因組區(qū)段包括SEQIDNO:5。21.根據(jù)權(quán)利要求13-20中任一項(xiàng)所述的呼腸孤病毒，其中所述呼腸孤病毒是重配抹。22.—種包含呼腸孤病毒X-3多肽的氨基酸序列的多肽，其中所述呼腸孤病毒X-3多肽的序列包括一種或多種氨基酸修飾，其中所述一種或多種氨基酸修飾選自相對(duì)于SEQIDNO:23(GenBank登記號(hào)M24734.l)編號(hào)的殘基214處的Val、殘基267處的Ala、殘基557處的Thr、殘基755處的Lys、殘基756處的Met、殘基926處的Pro、殘基963處的Pro、殘基979處的Leu、殘基1045處的Arg、殘基1071處的Val或其任何組合所組成的組，其中當(dāng)所述氨基酸序列包括殘基214處的Val或殘基1071處的Val時(shí)，所述氨基酸序列進(jìn)一步包括在所述氨基酸序列中的至少一種另外的改變。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的多肽，其中所述X-3多肽包括SEQIDNO:18。24.—種包含呼腸孤病毒ct-3多肽的氨基酸序列的多肽，其中所述呼腸孤病毒a-3多肽的序列包括一種或多種氨基酸修飾，其中所述一種或多種氨基酸修飾選自相對(duì)于SEQIDNO:25(GenBank登記號(hào)K02739)編號(hào)的殘基14處的Leu、殘基198處的Lys或其任何組合所組成的組，其中當(dāng)所述氨基酸序列包括殘基14處的Leu時(shí)，所述氨基酸序列進(jìn)一步包括在所述氨基酸序列中的至少一種另外的改變。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的多肽，其中所述cr-3多肽包括SEQIDNO:14。26.—種包含呼腸孤病毒)>1多肽的氨基酸序列的多肽，其中所述呼腸孤病毒p-l多肽的序列包括至少一種氨基酸修飾，其中所述至少一種氨基酸修飾包括相對(duì)于SEQIDNO:27(GenBank登記號(hào)M20161.1)編號(hào)的殘基73處的Asp。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的多肽，其中所述pi多肽包括SEQIDNO:16。28.—種包含呼腸孤病毒多肽的氨基酸序列的多肽，其中所述呼腸孤病毒多肽的序列包括至少一種氨基酸修飾，其中所述至少一種氨基酸修飾包括相對(duì)于SEQIDNO:29(GenBank登記號(hào)AF461684.1)編號(hào)的殘基528處的Ser。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的多肽，其中所述^i-l多肽包括SEQIDNO:15。30.—種呼腸孤病毒，其包含權(quán)利要求22-29所述的多肽中的一種或多種。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的呼腸孤病毒，其中所述呼腸孤病毒進(jìn)一步包括cj-2多肽，所述cj-2多肽包含在相對(duì)于SEQIDNO:30(GenBank登記號(hào)NP—694684.1)編號(hào)的位置70、127、195、241、255、294、296或340中的一個(gè)或多個(gè)位置處的Cys。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的呼腸孤病毒，其中所述a-2多肽包括SEQIDNO:12。33.根據(jù)權(quán)利要求30-32中任一項(xiàng)所述的呼腸孤病毒，其中所述呼腸孤病毒是重配林。34.—種包含呼腸孤病毒L1基因組區(qū)段的核酸序列的核酸分子，其中所述呼腸孤病毒L1基因組區(qū)段的所述核酸序列包括一種或多種核酸修飾，其中所述一種或多種核酸^ff飾選自相對(duì)于SEQIDNO:22(GenBank登記號(hào)M24734.1)編號(hào)的位置660處的T、位置817處的G、位置1687處的A、位置2283處的G、位置2284-2286處的ATG、位置2794處的C、位置2905處的C、位置2953處的C、位置3153處的A、位置3231處的G所組成的組。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的核酸分子，其中所述L1基因組區(qū)段包括SEQIDNO:8。36.—種包含呼腸孤病毒S4基因組區(qū)段的核酸序列的核酸分子，其中所述呼腸孤病毒S4基因組區(qū)段的所述核酸序列包括一種或多種核酸修飾，其中所述一種或多種核酸{,飾選自相對(duì)于SEQIDNO:24(GenBank登記號(hào)K02739)編號(hào)的位置74處的A和位置624處的A所組成的組。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的核酸分子，其中所述S4基因組區(qū)段包括SEQIDNO:4。38.—種包含呼腸孤病毒Ml基因組區(qū)段的核酸序列的核酸分子，其中所述呼腸孤病毒Ml基因組區(qū)段的所述核酸序列包括至少一種核酸修飾，其中所述至少一種核酸修飾包括相對(duì)于SEQIDNO:26(GenBank登記號(hào)AF461684.1)編號(hào)的位置1595處的T。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的核酸分子，其中所述M1基因組區(qū)段包括SEQIDNO:5。40.—種包含呼腸孤病毒M2基因組區(qū)段的核酸序列的核酸分子，其中所述呼腸孤病毒M2基因組區(qū)段的所述核酸序列包括至少一種核酸修飾，其中所述至少一種核酸修飾包括相對(duì)于SEQIDNO:28(GenBank登記號(hào)M20161.1)編號(hào)的位置248處的C。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的核酸，其中所述M2基因組區(qū)段包括SEQIDNO:6。42.—種呼腸孤病毒，其包含權(quán)利要求34-41所述的核酸分子中的一種或多種。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的呼腸孤病毒，其中所述呼腸孤病毒是重配抹。44.一種呼腸孤病毒，其中所述呼腸孤病毒包括具有如SEQIDNO:1-10所列的序列的基因組區(qū)段。45.—種呼腸孤病毒，其中所述呼腸孤病毒包括如SEQIDNO:11、12和16-21所列的多肽以及SEQIDNO:13或14中至少一個(gè)所列的多肽。46.根據(jù)權(quán)利要求44或45所述的呼腸孤病毒，其具有IDAC登記號(hào)190907-01。47.根據(jù)權(quán)利要求1-21、30-33、42-46中任一項(xiàng)所述的呼腸孤病毒，其中所述呼腸孤病毒表現(xiàn)出超過不包含修飾的呼腸孤病毒的生長(zhǎng)益處。48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的呼腸孤病毒，其中所述生長(zhǎng)益處選自以下所組成的組溶解率增加；蝕斑形成的大小增加；RNA復(fù)制速率提高；RNA轉(zhuǎn)錄速率提高；翻譯速率提高；病毒組裝和/或包裝速率提高；病毒后代數(shù)目增加；呼腸孤病毒被宿主細(xì)胞獲取的能力提高；脫被的能力提高或增強(qiáng)；細(xì)胞溶解增強(qiáng)或誘導(dǎo)包括凋亡、壞死或自體吞噬的細(xì)胞死亡；感染、溶解和殺死人類瘤細(xì)胞系的能力增強(qiáng)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞中免疫原性降低；對(duì)干擾素敏感性的易感性不同；對(duì)宿主的毒性降低；藥物相互作用增強(qiáng)；放療相互作用增強(qiáng)；或釋放有效腫瘤表位的能力。49.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求l-21、30-33或42-48中任一項(xiàng)所述的呼腸孤病毒和藥學(xué)上可接受的載體。50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含一種或多種化療劑和/或一種或多種免疫抑制劑。51.—種制備改良的呼腸孤病毒的方法，其包括如下步驟jf飾所述呼腸瓜病毒的核酸序列，和選擇一種或多種改良的呼腸孤病毒。52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述修飾包括誘變所述呼腸孤病毒。53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述誘變包括位點(diǎn)定向誘變。54.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述誘變包括化學(xué)誘變。55.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述修飾包括在人類細(xì)胞系中培養(yǎng)所述呼腸孤病毒。56.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述改良的呼腸孤病毒根據(jù)以下選擇溶解率增加；蝕斑形成的大小增加；RNA復(fù)制速率提高；RNA轉(zhuǎn)錄速率提高；翻譯速率提高；病毒組裝和/或包裝速率提高；病毒后代數(shù)目增力口；呼腸孤病毒被宿主細(xì)胞獲取的能力提高；脫被的能力提高或增強(qiáng)；細(xì)胞溶解增強(qiáng)或誘導(dǎo)包括凋亡、壞死或自體吞噬的細(xì)胞死亡；感染、溶解和殺死人類瘤細(xì)胞系的能力增強(qiáng)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞中免疫原性降低；對(duì)干擾素敏感性的易感性不同；對(duì)宿主的毒性降低；藥物相互作用增強(qiáng)；放療相互作用增強(qiáng)；或釋放有效腫瘤表位的能力。57.—種治療患者增生性病癥的方法，其包括向所述患者施用權(quán)利要求1-21、30-33或42-48中任一項(xiàng)所述的呼腸孤病毒或權(quán)利要求49或50所述的藥物組合物。58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述呼腸孤病毒以有效導(dǎo)致溶瘤作用的量施用。59.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其進(jìn)一步包括至少一種選自手術(shù)、化療、放療和免疫抑制療法所組成的組的程序。60.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述呼腸孤病毒或藥物組合物施用多于一次。61.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述呼腸孤病毒或藥物組合物靜脈內(nèi)、血管內(nèi)、鞘內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、局部地、口服地、直腸地、陰道地、鼻地、通過直接注射或通過吸入而施用。62.—種藥盒，其包含權(quán)利要求1-21、30-33或42-48中任一項(xiàng)所述的呼腸孤病毒。63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的藥盒，其進(jìn)一步包含一種或多種劑。全文摘要本發(fā)明提供修飾的呼腸孤病毒核酸序列和修飾的呼腸孤病毒多肽序列以及含有這種修飾的核酸序列或多肽序列的呼腸孤病毒。本發(fā)明還提供包括具有修飾的序列的呼腸孤病毒的藥物組合物以及制備和使用這種呼腸孤病毒的方法。文檔編號(hào)C12N15/46GK101627122SQ200880007670公開日2010年1月13日申請(qǐng)日期2008年3月11日優(yōu)先權(quán)日2007年3月12日發(fā)明者M(jìn)·C·科菲申請(qǐng)人:昂科利蒂克斯生物科技公司