專利名稱：前列腺癌遺傳檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
前列腺癌遺傳檢測試劑盒
本實用新型屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種前列腺癌遺傳風(fēng)險基因位點檢測試劑盒，是通過利用熒光 定量PCR，檢測男性基因組DNA樣本中的三個前列腺癌遺傳風(fēng)險基因SNP位點基因型的試劑盒。
背景技術(shù)：
前列腺是男性生殖系統(tǒng)的一個腺體，位于膀胱下面，直腸的前面。呈胡桃大小，包圍著部分尿道。其 產(chǎn)生的液體組成精液的一部分。良性的前列腺腫大和前列腺炎產(chǎn)生的癥狀和癌癥相似。前列腺癌的主要原 發(fā)部位為后側(cè)包膜下腺體，呈潛伏性緩慢生長，腫瘤很小時無任何臨床表現(xiàn)。因此前列腺癌一般到晚期才 表現(xiàn)出癥狀。前列腺癌的典型癥狀包括①排尿障礙。早期常有短時的尿頻及夜尿，后可出現(xiàn)尿流變細(xì)或 尿流偏歪或尿流分叉，尿程延長、尿急、尿痛、尿意未盡感，嚴(yán)重時發(fā)生尿潴留。②疼痛。常見腰痛和后 背痛或有坐骨神經(jīng)痛，可向會陰部或直腸部放射，疼痛劇烈難忍。患者日漸衰弱，消瘦，倦怠乏力，進(jìn)行 性貧血，惡病質(zhì)或腎功能衰竭等。
國內(nèi)外大量關(guān)聯(lián)研究及流行病學(xué)研究表明，前列腺癌與遺傳因素關(guān)系密切，該疾病的遺傳易感性研究 主要集中于性激素作用途徑相關(guān)基因以及常見的腫瘤易感基因。通過基因檢測可以確定遺傳高風(fēng)險人群， 并可相應(yīng)制定有針對性的預(yù)防和治療策略，對降低前列腺癌的發(fā)病和死亡都具有重要作用。
國內(nèi)外大量的關(guān)聯(lián)研究表明，前列腺癌的發(fā)病與雄激素受體基因(AR)上的Stu I位點、細(xì)胞色素P450 17Al基因(CYP17A1)上的MspAl I位點和鈣粘蛋白E基因(CDH1)上的A-160C位點這三個SNP位點基因 型有很密切的關(guān)系。
研究顯示，雄激素具有維持前列腺生長發(fā)育的功能，在無雄激素的環(huán)境中前列腺細(xì)胞會自發(fā)凋亡，而 在正常雄激素水平的環(huán)境中前列腺細(xì)胞能持續(xù)生長分化。因此，有研究認(rèn)為雄激素的過量分泌以及雄激素 受體反應(yīng)性過強都會造成前列腺細(xì)胞生長不受抑制，是前列腺癌發(fā)生發(fā)展的危險因素。而機體的雄激素受 體的活性及表達(dá)水平與雄激素受體基因(AR)多態(tài)性有關(guān)，所以雄激素受體基因(AR)多態(tài)性也是前列腺 癌的風(fēng)險因素之一。Stu I位點是第1號外顯子上的一個A/G多態(tài)位點(G1733A),引起雄激素受體基因(AR) 編碼的蛋白第211個氨基酸發(fā)生Glu/Glu同義替換。該位點與第1號外顯子上(CAG)n和(GGN)n微衛(wèi)星多 態(tài)連鎖不平衡，大量研究表明后二者與AR基因的表達(dá)水平有關(guān)。Stul位點的基因型有三種M、 AG、 GG， 當(dāng)個體攜帶M風(fēng)險基因型時，AR基因表達(dá)水平上調(diào)，使得AR對雄激素的敏感性增強，這相當(dāng)于雄激素的 水平升高，造成由AR誘導(dǎo)的下游基因的表達(dá)量增加，引起前列腺癌細(xì)胞的生長、分化加速，同時突變導(dǎo) 致的細(xì)胞凋亡作用被削弱，最終易導(dǎo)致前列腺癌的發(fā)生和惡化，與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移也有一定聯(lián)系。
細(xì)胞色素P450 17Al基因(CYP17A1)是P450酶家族成員之一，定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在全身各組織器 官都有表達(dá)，其中肝和腎表達(dá)量較多。由于CYP17A1基因參與性激素的生物合成，因此該基因多態(tài)性會直 接影響性激素在體內(nèi)的合成水平，從而影響其作用途徑和作用效果。研究證實該基因的突變與類固醇-17 a-羥化酶缺陷、17 a -羥化酶/17， 20-裂解酶缺陷、假兩性畸形和腎上腺增生以及性激素失調(diào)的各類疾病 有關(guān)。M印A1I酶切位點是5' UTR端上的一個C/T多態(tài)位點(T27C), T、 C是該位點的兩個等位基因，后者 可增加該基因的轉(zhuǎn)錄效率，提高酶活性。該多態(tài)位點的基因型有TT、 TC、 CC，當(dāng)個體攜帶CC基因型時， CYP17A1的轉(zhuǎn)錄效率上調(diào)，合成的蛋白水平上升，相當(dāng)于酶活性提高，因此雄激素的合成量也增加，促進(jìn) 前列腺細(xì)胞的增殖，間接增加了前列腺癌的患病風(fēng)險。
鈣粘蛋白E基因(CDH1)是鈣粘蛋白E(E-cadherin)的編碼基因，該蛋白為I型鈣粘蛋白超家族的跨 膜糖蛋白分子，其主要生物學(xué)作用在于介導(dǎo)上皮細(xì)胞的粘附，胚胎發(fā)育以及正常上皮組織中上皮細(xì)胞層的 形成和維持，是細(xì)胞連接的重要分子。研究顯示，鈣粘蛋白E與癌癥惡性程度有關(guān)。當(dāng)癌組織中鈣粘蛋白 E表達(dá)完全缺失或僅表達(dá)而無粘附#用時，則癌細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力。相比惡性程度高的癌細(xì)胞，惡 性程度低的癌細(xì)胞中鈣粘蛋白E表達(dá)較高。A-160C位點是5' UTR端上的一個A/C多態(tài)位點，A、 C是該位 點的兩個等位基因，前者會降低CDH1的轉(zhuǎn)錄效率。該位點有三種基因型，分別為M、 AC、 CC，其中M和
3AC被確定為前列腺癌的風(fēng)險基因型，當(dāng)攜帶風(fēng)險基因型時，影響CDH1基因正常轉(zhuǎn)錄，其的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生 下調(diào)，表達(dá)量降低，細(xì)胞粘附作用被削弱，細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也減弱，使得癌細(xì)胞的分化降低、侵襲性升高、 轉(zhuǎn)移性增強，癌癥的惡性程度也升高，預(yù)后變差。
熒光定量PCR是近幾年來興起的生物學(xué)技術(shù)，具有準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好等特點，已廣泛用于基因表達(dá) 研究、SNP位點分析等諸多領(lǐng)域，該方法采用完全閉管檢測，省去了對PCR產(chǎn)物后處理，避免了交叉污染， 結(jié)果判斷有計算機完成，簡化了操作步驟，并增加了結(jié)果的可靠性。是一種簡便快速檢測SNP位點基因型 的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本實用新型針的目的是提供一種采用熒光定量PCR技術(shù)同時檢測三個前列腺癌遺傳風(fēng)險基因SNP位點 的試劑盒。該試劑盒由包裝盒體、襯墊、裝有檢測三個SNP位點的熒光定量PCR反應(yīng)液的三個試管、裝有 陽性對照品的一個試管、裝有陰性對照品的一個試管組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分別放置三管熒光定量PCR 反應(yīng)液、陽性對照品和陰性對照品。
其中熒光定量PCR反應(yīng)液的成分主要包含PCR緩沖液、MgCh、 dNTPs、 SNP位點檢測用上游引物、SNP 位點檢測用下游引物、SNP位點基因型一熒光探針、SNP位點基因型二熒光探針、TaqDNA聚合酶。
其中，
雄激素受體基因(AR)上的Stu I位點檢測引物和探針為 上游引物序列5' - CCTGGTGGACATGGTGAATGAC -3' 下游引物序列5' - CCGCCTCATAGTTGGTGTAGATG -3' 基因型一熒光探針序列5' -FAM - TGCAAATACaTCTCCC - TAMRA -3' 基因型二熒光探針序列5' -VIC - TGCAAATACgTCTCCC - TAMRA -3， 細(xì)胞色素P450 17Al基因(CYP17A1)上的MspAl I位點檢測引物和探針為 上游引物序列5， - TMCTGGCATCTTCACTTCT _3， 下游引物序列5' - TCCAGATTCCTGGCATTGC -3， 基因型一熒光探針序列5' - FAM - TGCCCTCCCaGAG - TAMRA -3， 基因型二熒光探針序列5' - VIC - GCCCTCCCgGAG - TAMRA -3， 鈣粘蛋白E基因(CDH1)上的A-160C位點檢測引物和探針為 上游引物序列5， - TAACTGGCATCTTCACTTCT -3' 下游引物序列5， - TCCAGATTCCTGGCATTGC -3' 基因型一熒光探針序列5' - FAM - TGCCCTCCCaGAG -TAMRA -3， 基因型二熒光探針序列5' - VIC - GCCCTCCCgGAG -TAMRA -3'
對照品分為陽性對照品和陰性對照品，陰性對照品為無菌雙蒸水樣品，陽性對照品為口腔粘膜細(xì)胞DNA 樣品。
本試劑盒保存于-2(TC，盡量減少反復(fù)凍融。 本實用新型試劑盒使用方法 每次檢測均應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照。
擴增檢測在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，分為9個反應(yīng)管，每一個SNP位點檢測使用3個反應(yīng)管，其中1 個反應(yīng)管為被檢測樣品，陽性對照和陰性對照各使用1個反應(yīng)管，每管中總體積10u 1，其中8y 1 PCR反 應(yīng)液，2yl檢測樣品(基因組DNA、陽性對照或陰性對照)。反應(yīng)條件為50。C、 2分鐘，95°C、 10分鐘， 再進(jìn)行60個循環(huán)的95'C、 30秒，6(TC、 1分鐘。反應(yīng)完成后在熒光定量PCR儀上進(jìn)行終點熒光讀取，根 據(jù)得到的二維熒光圖和實時擴增曲線讀取被檢測樣品的SNP位點基因型。本實用新型提供的該試劑盒主要用于檢測被檢測者對于前列腺癌的遺傳得病風(fēng)險和患病機理，從而指 導(dǎo)被檢測者選擇正確的生活飲食習(xí)慣避免疾病的發(fā)生，對于已患病者可指導(dǎo)醫(yī)師針對其患病機理選擇正確 的臨床治療方案，有利于患者進(jìn)行個體化治療。
本實用新型的特點是:該試劑盒運用熒光定量PCR技術(shù)實現(xiàn)了同時檢測三個前列腺癌遺傳風(fēng)險基因SNP 位點基因型的目的，相對于現(xiàn)有的熒光定量PCR試劑盒只檢測一個SNP位點，本實用新型試劑盒將與同一 疾病相關(guān)的三個SNP位點檢測整合在一個試劑盒內(nèi)，使用更方便而且成本更低，對前列腺癌遺傳風(fēng)險的結(jié) 果分析也更便捷。


圖1為本實用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為雄激素受體基因(AR)上的Stu I位點被檢測樣品的二維熒光圖。
圖3為細(xì)胞色素P450 17A1基因(CYP17A1)上的MspAl I位點被檢測樣品的二維熒光圖。
圖4為鈣粘蛋白E基因(CDH1)上的A-160C位點被檢測樣品的二維熒光圖。
圖5為所有位點被檢測樣品的實時擴增曲線。
具體實施方式
本實用新型結(jié)合附圖和具體實施例作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解，這些實施例僅用于說明目的，而不用于 限制本實用新型范圍。
實施例l
參見圖l,本實用新型試劑盒由包裝盒體1、襯墊2、裝有檢測三個SNP位點的熒光定量PCR反應(yīng)液的 三個試管3、裝有陽性對照品的一個試管4、裝有陰性對照品的一個試管5組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分 別放置三管熒光定量PCR反應(yīng)液3、陽性對照品4和陰性對照品5。
其中熒光定量PCR反應(yīng)液的成分主要包含PCR緩沖液、MgCl2、 dNTPs、 SNP位點檢測用上游引物、SNP 位點檢測用下游引物、SNP位點基因型一熒光探針、SNP位點基因型二熒光探針、Taq DNA聚合酶。
本試劑盒保存于-2(TC，盡量減少反復(fù)凍融。
實施例2熒光定量PCR法同時檢測三個前列腺癌遺傳風(fēng)險基因SNP位點基因型
1. 材料
血樣總DNA提取試劑盒購于美國Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR相關(guān)試劑購于美國Promega 公司，7900型熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。
2. 引物及探針設(shè)計與合成
分別針對三個SNP位點設(shè)計熒光定量PCR引物和探針，根據(jù)引物和探針的設(shè)計原則以及基因組DNA序 列情況，從中選擇最佳組合。引物和探針均由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。 雄激素受體基因(AR)上的Stu I位點檢測引物和探針為 上游引物序列5' - CCTGGTGGACATGGTGAATGAC -3' 下游引物序列5' - CCGCCTCATAGTTGGTGTAGATG -3' 基因型一熒光探針序列5， -FAM - TGCAMTACaTCTCCC - TAMRA -3， 基因型二熒光探針序列5' -VIC - TGCAMTACgTCTCCC - TAMRA -3' 細(xì)胞色素P450 17Al基因(CYP17A1)上的MspAl I位點檢測引物和探針為 上游引物序列5' - TMCTGGCATCTTCACTTCT -3， 下游引物序列5' - TCCAGATTCCTGGCATTGC -3'基因型一熒光探針序列5' - FAM - TGCCCTCCCaGAG - TAMRA -3' 基因型二熒光探針序列5' - VIC - GCCCTCCCgGAG - TAMRA -3' 鈣粘蛋白E基因(CDH1)上的A-160C位點檢測引物和探針為 上游引物序列5' - TAACTGGCATCTTCACTTCT -3' 下游引物序列5' - TCCAGATTCCTGGCATTGC -3' 基因型一熒光探針序列5' - FAM - TGCCCTCCCaGAG -TAMRA -3' 基因型二熒光探針序列5' - VIC _ GCCCTCCCgGAG -TAMRA -3'
3. 樣本檢測
選取30例男性血液樣本，其中已確診患上前列腺癌的為18例。樣本用血樣總DNA提取試劑盒提取總 DNA。每一例檢測為9個反應(yīng)管，每管中總體積10ul，其中8ul PCR反應(yīng)液，每一個SNP位點檢測使用 3個反應(yīng)管，1個反應(yīng)管中加入2y 1被檢測DNA，另外2個反應(yīng)管中加入1陽性對照和陰性對照，在 ABI7900熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴增。反應(yīng)條件為50。C、 2分鐘，95°C、 IO分鐘，再進(jìn)行60個循環(huán)的95 °C、 30秒，60'C、 l分鐘。反應(yīng)完成后在熒光定量PCR儀上進(jìn)行終點熒光讀取。
4. 結(jié)果
被檢測樣本的雄激素受體基因(AR)上的Stu I位點的二維熒光圖參見圖2,細(xì)胞色素P450 17A1基 因(CYP17A1)上的MspAl I位點的二維熒光圖參見圖3，鈣粘蛋白E基因(CDH1)上的A-160C位點的二 維熒光圖參見圖4，所有位點實時擴增曲線參見圖5。
30例被測樣本的三個SNP位點基因型統(tǒng)計結(jié)果參見表1。
SNP位點 高風(fēng)險基因型l 高風(fēng)險基因型l 無風(fēng)險基因型l 無風(fēng)險基因型2
表1 SNP位點基因型統(tǒng)計結(jié)果
Stu I位點 MspAl I位點 A-160C位點
AA 20例 CC 15例 AA 10例
AC 12例
AG 8例 TC 12例 CC 8例
GG 2例 TT 3例
權(quán)利要求1.一種前列腺癌遺傳風(fēng)險基因位點檢測試劑盒，其特征是由包裝盒體(1)、襯墊(2)、裝有檢測三個SNP位點的熒光定量PCR反應(yīng)液的三個試管(3)、裝有陽性對照品的一個試管(4)、裝有陰性對照品的一個試管(5)組成，襯墊(2)上設(shè)有容器孔，分別放置三管熒光定量PCR反應(yīng)液(3)、陽性對照品(4)和陰性對照品(5)。
專利摘要本實用新型提供了一種前列腺癌遺傳風(fēng)險基因位點檢測試劑盒，由包裝盒體1、襯墊2、裝有檢測三個SNP位點的熒光定量PCR反應(yīng)液的三個試管3、裝有陽性對照品的一個試管4、裝有陰性對照品的一個試管5組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分別放置三管熒光定量PCR反應(yīng)液3、陽性對照品4和陰性對照品5。本實用新型試劑盒運用熒光定量PCR技術(shù)實現(xiàn)了同時檢測三個前列腺癌遺傳風(fēng)險基因SNP位點基因型的目的，相對于現(xiàn)有的熒光定量PCR試劑盒只檢測一個SNP位點，本實用新型試劑盒將與同一疾病相關(guān)的三個SNP位點檢測整合在一個試劑盒內(nèi)，使用更方便而且成本更低，對前列腺癌遺傳風(fēng)險的結(jié)果分析也更便捷。
文檔編號C12Q1/68GK201390751SQ2008201569
公開日2010年1月27日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司