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肺癌遺傳檢測試劑盒的制作方法

文檔序號:569204閱讀:230來源:國知局
專利名稱:肺癌遺傳檢測試劑盒的制作方法
技術領域
本實用新型屬生物技術領域,具體涉及一種肺癌遺傳風險基因位點檢測試劑盒,是通過利用熒光定量 PCR,檢測基因組DNA樣本中的六個肺癌遺傳風險基因SNP位點基因型的試劑盒。
背景技術
肺癌是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤,由于絕大多數(shù)肺癌起源于支氣管粘膜上皮,也稱支氣管肺癌。肺 癌發(fā)病早期癥狀缺乏特征性且較復雜,只有少部分患者會有癥狀。這與腫瘤生長的位置有關,如果長在支 氣管內(nèi),會阻塞氣體的出入,并刺激支氣管壁,而造成咳嗽,有時會咳出帶血絲的痰。如果長在肺的其它 部位,只有靠X線檢查才能發(fā)現(xiàn)。因為肺部是人體進行氣體交換的重要部位,血流充足,血液循環(huán)快,淋 巴腺多,所以肺癌特別容易轉(zhuǎn)移,當發(fā)現(xiàn)時往往病情難以控制。如果病人出現(xiàn)胸痛、胸悶或關節(jié)痛等癥狀 時,說明已經(jīng)進入肺癌中晚期,甚至癌細胞已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。
肺癌的形成與遺傳、環(huán)境、行為生活方式因素的共同作用密不可分。雖然遺傳因素不可改變,但及早 檢測出是否存在患肺癌的遺傳風險,可以在未發(fā)生癥狀之前通過定期的身體檢査盡早發(fā)現(xiàn)和盡早治療;還 可以通過控制飲食、改善生活習慣等干預手段,彌補遺傳風險。這對于肺癌的防治具有十分重大的意義。
研究表明,肺癌的發(fā)病與細胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)上的Ile462Val位點、Mspl位點、細胞 色素P450 2D6基因(CYP2D6)上的C188T位點、X射線交錯互補修復基因1 (XRCC1)上的Arg399Gln位 點、基質(zhì)金屬蛋白酶1基因(MMP1)上的1G/2G位點、5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)上的C677T 位點這六個SNP位點基因型有很密切的關系。
大量研究顯示,CYP1A1基因與環(huán)境因素的交互作用會影響各種癌癥的發(fā)病風險。CTP1A1作為重要解 毒酶在肺組織中有大量表達,由于吸煙等外界環(huán)境因素刺激下表達量增大,而煙草中所含的多環(huán)芳烴類物 質(zhì)經(jīng)CYP1A1代謝成各種高活性的致癌物質(zhì),若下游的II相代謝酶的活性不足,會使得致癌物質(zhì)在肺中蓄 積,易導致肺癌的發(fā)生。因此,CYP1A1基因多態(tài)性導致的酶活性異常增強會顯著提高前致癌物的激活效率, 是肺癌發(fā)病的重要風險因素。1le462Val是位于該基因第7號外顯子處的A/G多態(tài)位點,引起第462號密 碼子編碼的lie變?yōu)閂al,由于該多態(tài)位點位于CYP1A1的血紅素結合區(qū),因此影響了血紅素與編碼蛋白的 結合,具有提高酶活性的作用。該多態(tài)位點有三種基因型11e/Ile、 Ile/Val和Val/Val,當個體攜帶 11e/Val和Val/Val基因型時,CYP1A1的酶活性顯著增強,對多環(huán)芳烴類物質(zhì)的激活作用增強,因此轉(zhuǎn)化 生成的高活性致癌物質(zhì)增多,提高了肺組織細胞癌變風險,引起肺癌的發(fā)病風險升高。M印I酶切多態(tài)是 CYP1A1另一個最常見的多態(tài)位點之一,位于3'端非編碼區(qū)多聚腺嘌昤下游264bp處,為T/C置換(T3801C)。 該多態(tài)常見的等位基因為ml、 m2, m2 (C等位基因)可被限制性核酸內(nèi)切酶M印I識別,而ml (T等位基 因)則不能識別。三種基因型為ml/ml(TT)、 ml/m2(TC)、 m2/m2(CC),當個體攜帶m2/m2基因型時,CYP1A1 的誘導活性增強,即容易受到環(huán)境致癌物的影響,從而誘導產(chǎn)生更多的CYP1A1,引起致癌物質(zhì)的活化加速, 若其它解毒酶不能及時將該類物質(zhì)代謝排出,則會造成DNA損傷和細胞畸變,增加患癌癥的風險。
,CYP2D6基因上存在著多個多態(tài)位點,多態(tài)位點的分布具有種群特異性。通常,根據(jù)CYP2D6代謝能 力不同,可分為四個亞型,分別為超強代謝型(UM)、強代謝型(EM)、中間代謝型(HEM)和弱代謝型(PM), 其中弱代謝型在歐美白種人中較為常見,而強代謝型則在亞洲人中較為常見。CYP2D6酶活性增強使機體對 環(huán)境致癌物敏感度增強,與肺癌的易感性上升有關。C188T位點為CYP2D6基因第1號外顯子處的一個C/T 多態(tài),該多態(tài)造成表達的蛋白第34位的脯氨酸變成絲氨酸(Pro34Ser),導致生成酶的活性下降。該位點 有三種基因型,分別為CC、 CT、 TT,當個體攜帶CT和CC基因型時,相對TT基因型,CYP2D6的酶活性增 強,對香煙中的前致癌物的激活作用增強,因此轉(zhuǎn)化生成的高活性致癌物質(zhì)增多,提高了肺組織細胞癌變 風險,引起肺癌發(fā)病風險的升高。
目前,在XRCC1基因中共發(fā)現(xiàn)3個單核苷酸多態(tài)(SNP),分別是Argl94Trp、 Arg280His和Arg399Gln。 三者都位于外顯子中,氨基酸序列的改變會導致蛋白質(zhì)高級結構的改變,從而影響XRCC1蛋白與其它酶的 結合能力,最終影響機體修復損傷DNA的能力。若DNA損傷修復能力發(fā)生下調(diào),則易發(fā)生體細胞癌變,各種癌癥的發(fā)病風險因此上升。目前的研究證實,XRCC1基因多態(tài)性與腫瘤的發(fā)生密切相關。Arg399Gln位 點是該基因第10號外顯子上的一個G/A多態(tài)位點,弓|起XRCC1基因編碼蛋白的第399個氨基酸由Arg變 為Gln,該氨基酸處于BRCT I區(qū)域。A、 G是該位點的兩個等位基因,前者會增強XRCC1蛋白與DNA-致癌 物加合物的結合能力。該位點有三種基因型Gln/Gln (AA) 、 Gln/Arg (AG) 、 Arg/Arg (GG),當攜帶AA 基因型時,XRCC1基因BRCT I功能域的空間構象發(fā)生改變,導致XRCC1蛋白不能正常結合于DNA受損處, 而影響PARP1的活性,最終使得堿基切除修復能力被削弱,DNA損傷增多,體細胞癌變增多,各種腫瘤的 患病風險升高。肺是與環(huán)境致癌物接觸較多的部位,容易發(fā)生DNA損傷和體細胞突變,若堿基切除修復能 力下調(diào),則肺癌的患病風險會升高。
有研究顯示,MMP1增加腫瘤的遺傳易感性可能主要是通過細胞微環(huán)境的改變以此來影響細胞的轉(zhuǎn)化與 腫瘤的發(fā)生。例如,MMPs可降解胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBPs),從而釋放出胰島素樣生長因子 (IGFs),而IGFs可強烈地促進細胞增殖并抑制細胞凋亡;此外,MMPs還可能釋放出轉(zhuǎn)化生長因子-a (TGF-a)的細胞膜結合前體,而TGF-a是另一種重要的與細胞轉(zhuǎn)化和癌癥發(fā)生有關的生長因子。MMPs還可以 通過降解細胞表面的黏附分子,繼而改變細胞周期調(diào)控,通過影響細胞黏附來促進基因組的不穩(wěn)定性,干 擾細胞的信號傳導并促使細胞逃避免疫監(jiān)視。肺是人體血氧交換的重要場所,其中血管及淋巴管較為密集, 營養(yǎng)物質(zhì)供應充分,易發(fā)生腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移,因此參與細胞活動性調(diào)控的MMP1可能為肺癌形成及惡化的 重要影響因素。1G/2G是MMP1基因啟動子上游-1607bp處的一個堿基插入多態(tài),與該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關。 在此多態(tài)性位點中,原序列(5' -GAT-3' , 1G)插入一個G時會形成一個新的序列(5' -GGAT-3' , 2G), 這個新序列是Est轉(zhuǎn)錄因子的核心序列,已經(jīng)證明在黑素瘤細胞和正常成纖維細胞等細胞中2G純合基因 型會使MMP1的轉(zhuǎn)錄水平增高。該位點有三種基因型,分別為1G/1G、 1G/2G、 2G/2G,當個體攜帶1G/2G和 2G/2G基因型時,剛P1誘導活性增強,使得同等轉(zhuǎn)錄條件下MMP1生成量加大,引起特定組織結構趨于松 散,腫瘤細胞(如肺癌細胞)的生長環(huán)境因此改善,使其增殖迅速而且易于侵潤和轉(zhuǎn)移,最終導致肺癌發(fā) 病風險和惡化程度增加。
MTHFR是5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶的編碼基因,該酶的主要作用是在葉酸代謝通路中將5, 10-亞甲 基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸,參與甲基傳遞通路。MTHFR酶催化生成5-甲基四氫葉酸的反應是葉酸 代謝中的一個限速步驟,若MTHFR酶活性降低,則會導致葉酸代謝失衡,機體內(nèi)甲基化水平下降,各種基 因的調(diào)控以及DNA損傷修復機制受到影響,易引起癌變。由于肺部經(jīng)常與外界物質(zhì)接觸,其中有不少為環(huán) 境致癌物,容易發(fā)生DNA損傷,若無法及時進行修復,則有可能發(fā)展成為肺癌。MTHFR基因第5號外顯子 上的一個C/T多態(tài)位點(C677T)突變,導致編碼蛋白第222個氨基酸由Ala(A)變?yōu)閂al(V),使該酶的熱 穩(wěn)定性下降,酶活性也顯著降低。該多態(tài)位點的基因型有CC、 CT、 TT,其中CT、 TT被確定為肺癌的易感 基因型。在攝入的葉酸充足,能夠滿足正常的細胞增殖的基礎上,當攜帶風險基因型(TT、 CT)時,MTHFR 蛋白耐熱性降低,酶活性減弱,不利于5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸,從而降低了甲基化 供體的水平,削弱DNA損傷修復機制,最終使肺癌發(fā)生風險上升。
熒光定量PCR是近幾年來興起的生物學技術,具有準確性高、重現(xiàn)性好等特點,已廣泛用于基因表達 研究、SNP位點分析等諸多領域,該方法釆用完全閉管檢測,省去了對PCR產(chǎn)物后處理,避免了交叉污染, 結果判斷有計算機完成,簡化了操作步驟,并增加了結果的可靠性。是一種簡便快速檢測SNP位點基因型 的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本實用新型針的目的是提供一種采用熒光定量PCR技術同時檢測六個肺癌遺傳風險基因SNP位點的試 劑盒。該試劑盒由包裝盒體、襯墊、裝有檢測六個SNP位點的熒光定量PCR反應液的六個試管、裝有陽性 對照品的一個試管、裝有陰性對照品的一個試管組成,襯墊上設有容器孔,分別放置六管熒光定量PCR反 應液、陽性對照品和陰性對照品。
其中熒光定量PCR反應液的成分主要包含PCR緩沖液、MgCh、 dNTPs、 SNP位點檢測用上游引物、SNP 位點檢測用下游引物、SNP位點基因型一熒光探針、SNP位點基因型二熒光探針、T叫DNA聚合酶。
其中,細胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)上的11e462Val位點檢測引物和探針為 上游引物序列5' - AAAGCTGCGTGA -3' 下游引物序列5' - TGMGGAGAAGGTG -3' 基因型一熒光探針序列5' -FAM - ATCGgCTCCC - TAMRA -3, 基K型二熒光探針序列5' -VIC - TCGaCTCCCGC - TAMRA -3' 細胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)上的MspI位點檢測引物和探針為 上游引物序列5' - MGMCGAAGACTTCA -3' 下游引物序列5' - GGGAGGAGCTGAC -3'
基因型一熒光探針序列5' - FAM - ACACTTcCTTC - TAMKA -3' 基因型二熒光探針序列5' - VIC - CACTTtCTTCA - TAMRA -3' 細胞色素P450 2D6基因(CYP2D6)上的C188T位點檢測引物和探針為-上游引物序列:5' — GCCATCGCAGAA -3' 下游引物序列5' _ ATCCATGTACCACAG -3'
基因型一熒光探針序列5' - FAM - AATtTGTGAGCMG - TAMRA -3' 基因型二熒光探針序列5' - VIC - AATcTGTGAGCM -TAMRA -3' X射線交錯互補修復基因l (XRCC1)上的Arg399Gln位點檢測引物和探針為 上游引物序列5' - TGGACAGGCGGTCC -3' 下游引物序列5' - CTGGGGTGCAGGAC -3'
基因型一熒光探針序列5' - FAM - TGGCCTCgATCAG -TAMRA -3' 基肉型二熒光探針序列5' — VIC - TGGCCTCaATCAG -TAMRA _3' 基質(zhì)金屬蛋白酶l基因(MMP1)上的1G/2G位點檢測引物和探針為 上游引物序列5' - GAGCAGAGCCTGAGTATT -3' 下游引物序列5' - TTCCTGGGGCCACAGA -3'
基因型一熒光探針序列5, _ FAM - GGGMTGgGCAGGC -TAMRA -3' 基因型二熒光探針序列5' - VIC - GGGMTGGCAGGC -TAMRA _3' 5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)上的C677T位點檢測引物和探針為 上游引物序列5' - AGAGCATCATCTGCGGCAT -3' 下游引物序列5' - GGCGGCCACTGAGGG -3' 基因型一熒光探針序列5' - FAM - ACGTCcGTGGCC -TAMRA -3' 基因型二熒光探針序列5, — VIC — ACGTCtGTGGCCT -TAMRA -3'
對照品分為陽性對照品和陰性對照品,陰性對照品為無菌雙蒸水樣品,陽性對照品為口腔粘膜細胞DNA 樣品。
本試劑盒保存于-2(TC,盡量減少反復凍融。
本實用新型試劑盒使用方法
每次檢測均應設立陽性對照和陰性對照。
擴增檢測在熒光定量PCR儀上進行,分為18個反應管,每一個SNP位點檢測使用3個反應管,其中1 個反應管為被檢測樣品,陽性對照和陰性對照各使用1個反應管,每管中總體積10ul,其中8ulPCK反 應液,2nl檢測樣品(基因組DNA、陽性對照或陰性對照)。反應條件為50'C、 2分鐘,95°C、 IO分鐘, 再進行60個循環(huán)的95'C、 30秒,60°C、 1分鐘。反應完成后在熒光定量PCR儀上進行終點熒光讀取,根 據(jù)得到的二維熒光圖和實時擴增曲線讀取被檢測樣品的SNP位點基因型。本實用新型提供的該試劑盒主要用于檢測被檢測者對于肺癌的遺傳得病風險和患病機理,從而指導被 檢測者選擇正確的生活飲食習慣避免疾病的發(fā)生,對于已患病者可指導醫(yī)師針對其患病機理選擇正確的臨 床治療方案,有利T患者進行個體化治療。本實用新型的特點是該試劑盒運用熒光定量PCR技術實現(xiàn)了同時檢測六個肺癌遺傳風險基因SNP位 點基因型的目的,相對于現(xiàn)有的熒光定量PCR試劑盒只檢測一個SNP位點,本實用新型試劑盒將與同一疾 病相關的六個SNP位點檢測整合在一個試劑盒內(nèi),使用更方便而且成本更低,對肺癌遺傳風險的結果分析 也更便捷。


圖1為本實用新型的結構示意圖。圖2為細胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)上的11e462Val位點被檢測樣品的二維熒光圖。 圖3為細胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)上的Msp I位點被檢測樣品的二維熒光圖。 圖4為細胞色素P450 2D6基因(CYP2D6)上的C188T位點被檢測樣品的二維熒光圖。 圖5為X射線交錯互補修復基因1 (XRCC1)上的Arg399Gln位點被檢測樣品的二維熒光圖。 圖6為基質(zhì)金屬蛋白酶1基因(MMP1)上的1G/2G位點被檢測樣品的二維熒光圖。 圖7為5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)上的C677T位點被檢測樣品的—維熒光圖。 圖8為所有位點被檢測樣品的實時擴增曲線。
具體實施方式
本實用新型結合附圖和具體實施例作進一步說明。應該理解,這些實施例僅用于說明目的,而不用于 限制本實用新型范圍。實施例l參見圖1,本實用新型試劑盒由包裝盒體1、襯墊2、裝有檢測六個SNP位點的熒光定量PCR反應液的 六個試管3、裝有陽性對照品的一個試管4、裝有陰性對照品的一個試管5組成,襯墊上設有容器孔,分 別放置六管熒光定量PCR反應液3、陽性對照品4和陰性對照品5。其中熒光定量PCR反應液的成分主要包含PCK緩沖液、MgCl2、 dNTPs、 SNP位點檢測用上游引物、SNP 位點檢測用下游引物、SNP位點基因型一熒光探針、SNP位點基因型二熒光探針、Taq DNA聚合酶。本試劑盒保存于-2(TC,盡量減少反復凍融。實施例2熒光定量PCR法同時檢測六個肺癌遺傳風險基因SNP位點基因型1. 材料血樣總DNA提取試劑盒購于美國Qiagen公司,Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR相關試劑購于美國Promega 公司,7900型熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。2. 引物及探針設計與合成分別針對六個SNP位點設計熒光定量PCR引物和探針,根據(jù)引物和探針的設計原則以及基因組DNA序 列情況,從中選擇最佳組合。引物和探針均由上?;瞪锛夹g有限公司合成。 細胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)上的11e462Val位點檢測引物和探針為 上游引物序列5, - AMGCTGCGTGA -3' 下游引物序列5, - TGAAGGAGAAGGTG -3' 基因型一熒光探針序列5, -FAM - ATCGgCTCCC - TAMRA -3'基因型二熒光探針序列5' -VIC - TCGaCTCCCGC - TAMRA -3, 細胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)上的MspI位點檢測引物和探針為 上游引物序列5, - MGMCGMGACTTCA -3' 下游引物序列5, - GGGAGGAGCTGAC -3'基因型一熒光探針序列5' - FAM - ACACTTcCTTC -TAMRA -3' 基因型二熒光探針序列5' - VIC - CACTTtCTTCA -TAMRA -3' 細胞色素P450 2D6基因(CYP2D6)上的C188T位點檢測引物和探針為 上游引物序列5' - GCCATCGCAGAA -3' 下游引物序列5, - ATCCATGTACCACAG _3'基因型一熒光探針序列5' - FAM - AATtTGTGAGCMG - TAMRA _3, 基因型二熒光探針序列5, - VIC - AATcTGTGAGCM -TAMRA _3, X射線交錯互補修復基因l (XRCC1)上的Arg399Gln位點檢測引物和探針為 上游引物序列5' - TGGACAGGCGGTCC -3' 下游引物序列5' - CTGGGGTGCAGGAC -3'基因型一熒光探針序列5, - FAM - TGGCCTCgATCAG - TAMRA -3' 基因型二熒光探針序列5' - VIC - TGGCCTCaATCAG - TAMRA -3' 基質(zhì)金屬蛋白酶l基因(MMP1)上的1G/2G位點檢測引物和探針為 上游引物序列5' - GAGCAGAGCCTGAGTATT -3' 下游引物序列5' - TTCCTGGGGCCACAGA -3'基因型一熒光探針序列5' - FAM - GGGAATGgGCAGGC -TAMRA -3'基因型二熒光探針序列5' — VIC - GGGMTGGCAGGC -TAMRA -3'5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)上的C677T位點檢測引物和探針為:上游引物序列5' - AGAGCATCATCTGCGGCAT -3'下游引物序列5' - GGCGGCCACTGAGGG -3'基因型一熒光探針序列5' - FAM - ACGTCcGTGGCC -TAMRA -3'基因型二熒光探針序列5, — VIC — ACGTCtGTGGCCT -TAMRA -3'3. 樣本檢測選取30例血液樣本,其中已確診患上肺癌的為24例。樣本用血樣總DNA提取試劑盒提取總DNA。每 一例檢測為18個反應管,每管中總體積10ul,其中8ul PCR反應液,每一個SNP位點檢測使用3個反 應管,1個反應管中加入2y 1被檢測DNA,另外2個反應管中加入2u 1陽性對照和陰性對照,在ABI7900 熒光定量PCR儀上進行擴增。反應條件為5(TC、 2分鐘,95'C、 IO分鐘,再進行60個循環(huán)的95°C、 30秒, 60°C、 l分鐘。反應完成后在熒光定量PCR儀上進行終點熒光讀取。4. 結果被檢測樣本的細胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)上的11e462Val位點的二維熒光圖參見圖2,細胞色 素P450 1A1基因(CYP1A1)上的Msp I位點的二維熒光圖參見圖3,細胞色素P450 2D6基因(CYP2D6) 上的C188T位點二維熒光圖參見圖4, X射線交錯互補修復基因l (XRCC1)上的Arg399Gln位點二維熒光 圖參見圖5,基質(zhì)金屬蛋白酶l基因(MMP1)上的1G/2G位點二維熒光圖參見圖6, 5, 10-亞甲基四氫葉酸 還原酶基因(MTHFR)上的C677T位點二維熒光圖參見圖7,所有位點的實時擴增曲線參見圖8。30例被測樣本的六個SNP位點基因型統(tǒng)計結果參見表1。7表1 SNP位點基因型統(tǒng)計結果SNP位點高風險基因型1高風險基因型2無風險基因型1無風險基因型211e462Val位點AA 13例AG 12例GG 5例_Msp I位點CC 24例—CT 5例TT 1例C188T位點CC 10例CT 16例TT 4例—Arg399Gln位點AA 16例-GA 10例GG 4例1G/2G位點2G/2G 7例1G/2G 19例1G/1G 4例-C677T位點TT 10例CT 16例CC 4例一
權利要求1.一種肺癌遺傳風險基因位點檢測試劑盒,其特征是由包裝盒體(1)、襯墊(2)、裝有檢測六個SNP位點的熒光定量PCR反應液的六個試管(3)、裝有陽性對照品的一個試管(4)、裝有陰性對照品的一個試管(5)組成,襯墊(2)上設有容器孔,分別放置六管熒光定量PCR反應液(3)、陽性對照品(4)和陰性對照品(5)。
專利摘要本實用新型提供了一種肺癌遺傳風險基因位點檢測試劑盒,由包裝盒體1、襯墊2、裝有檢測六個SNP位點的熒光定量PCR反應液的六個試管3、裝有陽性對照品的一個試管4、裝有陰性對照品的一個試管5組成,襯墊上設有容器孔,分別放置六管熒光定量PCR反應液3、陽性對照品4和陰性對照品5。本實用新型試劑盒運用熒光定量PCR技術實現(xiàn)了同時檢測六個肺癌遺傳風險基因SNP位點基因型的目的,相對于現(xiàn)有的熒光定量PCR試劑盒只檢測一個SNP位點,本實用新型試劑盒將與同一疾病相關的六個SNP位點檢測整合在一個試劑盒內(nèi),使用更方便而且成本更低,對肺癌遺傳風險的結果分析也更便捷。
文檔編號C12Q1/68GK201390752SQ20082015697
公開日2010年1月27日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權日2008年12月12日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司
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