專利名稱：：鼻咽癌遺傳檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本實(shí)用新型屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種鼻咽癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)基因位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，是通過利用熒光定量PCR，檢測(cè)被檢者基因組DNA樣本中的兩個(gè)鼻咽癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)基因SNP位點(diǎn)基因型的試劑盒。
背景技術(shù)：
：鼻咽癌是人體鼻咽腔粘膜上皮和腺體上皮組織，在各種化學(xué)性、物理性和生物性致癌因素的作用下，或機(jī)體自身存在遺傳易感性的情況下，鼻咽腔組織發(fā)生過度增生及異常變化，所形成生長(zhǎng)能力很強(qiáng)、能無限制的繁殖和分裂的惡性腫瘤，該腫瘤可分泌溶解組織的物質(zhì)侵犯和溶解正常組織、甚至能壓迫鄰近器官組織。鼻咽癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，惡性變比率高，自然生存時(shí)間平均為18.7個(gè)月，起病隱蔽，早期常無明顯癥狀，一般情況下常見鼻塞、涕血或回縮性血涕、耳鳴及頭痛等，晚期常有頸淋巴結(jié)腫大及臟器轉(zhuǎn)移。國(guó)內(nèi)外大量關(guān)聯(lián)研究及流行病學(xué)研究表明，鼻咽癌與遺傳因素關(guān)系非常密切，在南方鼻咽癌高發(fā)地區(qū)可見該疾病有家族聚集趨勢(shì)，目前該疾病的遺傳易感性研究主要集中于種群特異性基因和常見的解毒酶基因。通過基因檢測(cè)可以確定遺傳高風(fēng)險(xiǎn)人群，并可相應(yīng)制定有針對(duì)性的預(yù)防和治療策略，對(duì)降低鼻咽癌的發(fā)病和死亡都具有重要作用。國(guó)內(nèi)外大量的關(guān)聯(lián)研究表明，鼻咽癌的發(fā)病與細(xì)胞色素P4502E1基因(CYP2E1)上的RsaI位點(diǎn)和X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因l(XRCC1)上的Arg399Gln位點(diǎn)這兩個(gè)SNP位點(diǎn)基因型有很密切的關(guān)系。細(xì)胞色素P4502E1基因(CYP2E1)是細(xì)胞色素P450超基因家族成員，定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微粒體，在全身各組織器官都有表達(dá)，其中肝表達(dá)量最多，在鼻咽組織也有表達(dá)。由于CYP2E1是亞硝胺類代謝的主要酶類，該基因的變異會(huì)直接影響亞硝胺的生物活化，而亞硝胺的活性代謝物具有氧化損傷DNA進(jìn)而導(dǎo)致癌癥的作用，因此CYP2E1基因多態(tài)性與各種癌癥的發(fā)生有關(guān)，其中包括肝癌、鼻咽癌、肺癌、食管癌等。CYP2El基因RsaI酶切位點(diǎn)是5'UTR端上的一個(gè)C/T多態(tài)位點(diǎn)，cl、c2是該位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因，后者可增加該基因的轉(zhuǎn)錄效率，提高酶活性。該多態(tài)位點(diǎn)的基因型有clcl、clc2、c2c2，研究顯示，當(dāng)個(gè)體攜帶c2c2基因型時(shí)，CYP2E1的誘導(dǎo)活性顯著增強(qiáng)，即誘導(dǎo)產(chǎn)生的CYP2E1水平上升，因此亞硝胺轉(zhuǎn)化先成的致癌物質(zhì)的量也大大增加，使得鼻咽上皮細(xì)胞易發(fā)生癌變，增加了鼻咽癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1(XRCC1)第一個(gè)分離到的影響細(xì)胞對(duì)電離輻射敏感性的哺乳動(dòng)物基因，廣泛參與DNA損傷的修復(fù)。XRCC1在機(jī)體內(nèi)各個(gè)組織中的表達(dá)量均不高，在大腸中的表達(dá)相對(duì)較高。目前，在XRCC1基因中共發(fā)現(xiàn)3個(gè)單核苷酸多態(tài)(SNP)，三者都位于外顯子中，氨基酸序列的改變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，從而影響XRCC1蛋白與其他酶的結(jié)合能力，最終影響機(jī)體修復(fù)損傷DNA的能力。若DNA損傷修復(fù)能力發(fā)生下調(diào)，則易發(fā)生體細(xì)胞癌變，各種癌癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)因此上升。XRCC1基因Arg399Gln位點(diǎn)是該基因第10號(hào)外顯子上的一個(gè)G/A多態(tài)位點(diǎn)，引起XRCC1基因編碼蛋白的第399個(gè)氨基酸由Arg變?yōu)镚ln,該氨基酸處于BRCTI區(qū)域。A、G是該位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因，前者會(huì)增強(qiáng)XRCC1蛋白與DNA-致癌物加合物的結(jié)合能力。該位點(diǎn)有三種基因型，分別為M(Gln/Gln)、AG(Gln/Arg)、GG(Arg/Arg),國(guó)外關(guān)聯(lián)研究顯示，當(dāng)個(gè)體攜帶M基因型時(shí)，XRCC1基因BRCTI功能域的空間構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致XRCC1蛋白不能正常結(jié)合于DNA受損處，而影響PARP1的活性，最終使得堿基切除修復(fù)能力被削弱，DNA損傷增多，體細(xì)胞癌變?cè)龆?，各種腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)升高。鼻咽組織是與環(huán)境致癌物接觸較多的部位，容易發(fā)生DNA損傷和體細(xì)胞突變，若堿基切除修復(fù)能力下調(diào)，則鼻咽癌的患病風(fēng)險(xiǎn)會(huì)升高。熒光定量PCR是近幾年來興起的生物學(xué)技術(shù)，具有準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，已廣泛用于基因表達(dá)研究、SNP位點(diǎn)分析等諸多領(lǐng)域，該方法采用完全閉管檢測(cè)，省去了對(duì)PCR產(chǎn)物后處理，避免了交叉污染，結(jié)果判斷有計(jì)算機(jī)完成，簡(jiǎn)化了操作步驟，并增加了結(jié)果的可靠性。是一種簡(jiǎn)便快速檢測(cè)SNP位點(diǎn)基因型的方法。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型針的目的是提供一種采用熒光定量PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)鼻咽癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)基因SNP位點(diǎn)的試劑盒。該試劑盒由包裝盒體、襯墊、裝有檢測(cè)兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管、裝有陽性對(duì)照品的一個(gè)試管、裝有陰性對(duì)照品的一個(gè)試管組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液、陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品。其中熒光定量PCK反應(yīng)液的成分主要包含PCR緩沖液、MgCh、dNTPs、SNP位點(diǎn)檢測(cè)用上游引物、SNP位點(diǎn)檢測(cè)用下游引物、SNP位點(diǎn)基因型一熒光探針、SNP位點(diǎn)基因型二熒光探針、T叫DNA聚合酶。其中，細(xì)胞色素P4502E1基因(CYP2E1)上的KsaI位點(diǎn)檢測(cè)引物和探針為上游引物序列5'-TTAGAAGGTGACAGTGACCA-3'下游引物序列5'-TCTCAACCCTACTCACTCA-3'基因型一熒光探針序列5'-FAM-TCTTCAGCcGGAT-TAMRA-3'基因型二熒光探針J^列5'-VIC-CTTCAGCtGGATC-TAMRA-3'X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因l(XRCC1)上的Arg399Gln位點(diǎn)檢測(cè)引物和探針為上游引物序列5'-TAACTGGCATCTTCACTTCT-3'下游引物序列5'-TCCAGATTCCTGGCATTGC_3'基因型一熒光探針序列5'-FAM-TGCCCTCCCaGAG-TAMKA-3'基因型二熒光探針序列5'-VIC-GCCCTCCCgGAG-TAMRA-3'對(duì)照品分為陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，陰性對(duì)照品為無菌雙蒸水樣品，陽性對(duì)照品為口腔粘膜細(xì)胞DNA樣品。本試劑盒保存于-2CTC，盡量減少反復(fù)凍融。本實(shí)用新型試劑盒使用方法每次檢測(cè)均應(yīng)設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。擴(kuò)增檢測(cè)在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，分為6個(gè)反應(yīng)管，每一個(gè)SNP位點(diǎn)檢測(cè)使用3個(gè)反應(yīng)管，其中l(wèi)個(gè)反應(yīng)管為被檢測(cè)樣品，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照各使用l個(gè)反應(yīng)管，每管中總體積10ul，其中8wlPCR反應(yīng)液，2ul檢測(cè)樣品(基因組DNA、陽性對(duì)照或陰性對(duì)照)。反應(yīng)條件為50'C、2分鐘，95°C、IO分鐘，再進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95'C、30秒，6(TC、1分鐘。反應(yīng)完成后在熒光定量PCR儀上進(jìn)行終點(diǎn)熒光讀取，根據(jù)得到的二維熒光圖和實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線讀取被檢測(cè)樣品的SNP位點(diǎn)基因型。本實(shí)用新型提供的該試劑盒主要用于檢測(cè)被檢測(cè)者對(duì)于鼻咽癌的遺傳得病風(fēng)險(xiǎn)和患病機(jī)理，從而指導(dǎo)被檢測(cè)者選擇正確的生活飲食習(xí)慣避免疾病的發(fā)生，對(duì)于已患病者可指導(dǎo)醫(yī)師針對(duì)其患病機(jī)理選擇正確的臨床治療方案，有利于患者進(jìn)行個(gè)體化治療。本實(shí)用新型的特點(diǎn)是該試劑盒運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)鼻咽癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)基因SNP位點(diǎn)基因型的目的，相對(duì)于現(xiàn)有的熒光定量PCR試劑盒只檢測(cè)一個(gè)SNP位點(diǎn)，本實(shí)用新型試劑盒將與同一疾病相關(guān)的兩個(gè)SNP位點(diǎn)檢測(cè)整合在一個(gè)試劑盒內(nèi)，使用更方便而且成本更低，對(duì)鼻咽癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)的結(jié)果分析也更便捷。圖1為本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為細(xì)胞色素P4502E1基因(CYP2E1)上的RsaI位點(diǎn)被檢測(cè)樣品的二維熒光圖。圖3為X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1(XRCC1)上的Arg399Gln位點(diǎn)被檢測(cè)樣品的二維熒光圖。圖4為所有位點(diǎn)被檢測(cè)樣品的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線。具體實(shí)施方式本實(shí)用新型結(jié)合附圖和具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說明目的，而不用于限制本實(shí)用新型范圍。實(shí)施例1參見圖l，本實(shí)用新型試劑盒由包裝盒體1、襯墊2、裝有檢測(cè)兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管3、裝有陽性對(duì)照品的一個(gè)試管4、裝有陰性對(duì)照品的一個(gè)試管5組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液3、陽性對(duì)照品4和陰性對(duì)照品5。其中熒光定量PCR反應(yīng)液的成分主要包含PCR緩沖液、MgCh、dNTPs、SNP位點(diǎn)檢測(cè)用上游引物、SNP位點(diǎn)檢測(cè)用下游引物、SNP位點(diǎn)基因型一熒光探針、SNP位點(diǎn)基因型二熒光探針、TaqDNA聚合酶。本試劑盒保存于-2CTC，盡量減少反復(fù)凍融。實(shí)施例2熒光定量PCR法同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)鼻咽癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)基因SNP位點(diǎn)基因型1.材料血樣總DNA提取試劑盒購于美國(guó)Qiagen公司，TaqDNA聚合酶、dNTPs等PCR相關(guān)試劑購于美國(guó)Promega公司，7900型熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。2.引物及探針設(shè)計(jì)與合成分別針對(duì)兩個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物和探針，根據(jù)引物和探針的設(shè)計(jì)原則以及基因組DNA序列情況，從中選擇最佳組合。引物和探針均由上海基康生物技術(shù)有限公司合成。細(xì)胞色素P4502E1基因(CYP2E1)上的RsaI位點(diǎn)檢測(cè)引物和探針為上游引物序列5'-TTAGAAGGTGACAGTGACCA-3'下游引物序列5'-TCTCAACCCTACTCACTCA-3'基因型一熒光探針序列5'-FAM-TCTTCAGCcGGAT-TAMRA-3'基因型二熒光探針序列5'-VIC-CTTCAGCtGGATC-T細(xì)RA-3'X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因l(XRCC1)上的Arg399Gln位點(diǎn)檢測(cè)引物和探針為上游引物序列5'-TAACTGGCATCTTCACTTCT-3'下游引物序列5'-TCCAGATTCCTGGCATTGC-3'基因型一熒光探針序列5'-FAM-TGCCCTCCCaGAG-TAMRA-3'基因型二熒光探針序列5'-VIC-GCCCTCCCgGAG-TAMRA-3'3.樣本檢測(cè)選取30例血液樣本，其中已確診患上鼻咽癌的為11例。樣本用血樣總DNA提取試劑盒提取總DNA。每一例檢測(cè)為6個(gè)反應(yīng)管，每管中總體積10ul，其中8ulPCR反應(yīng)液，每一個(gè)SNP位點(diǎn)檢測(cè)使用3個(gè)反應(yīng)管，1個(gè)反應(yīng)管中加入2u1被檢測(cè)DNA，另外2個(gè)反應(yīng)管中加入2u1陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，在ABI7900熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為50。C、2分鐘，95°C、IO分鐘，再進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95°C、30秒，60°C、l分鐘。反應(yīng)完成后在熒光定量PCR儀上進(jìn)行終點(diǎn)熒光讀取。4.結(jié)果被檢測(cè)樣本的細(xì)胞色素P4502E1基因(CYP2E1)上的RsaI位點(diǎn)的二維熒光圖參見圖2，X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因l(XRCC1)上的Arg399Gln位點(diǎn)的二維熒光圖參見圖3,所有位點(diǎn)實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線參見圖4。30例被測(cè)樣本的兩個(gè)SNP位點(diǎn)基因型統(tǒng)計(jì)結(jié)果參見表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1.一種鼻咽癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)基因位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，其特征是由包裝盒體(1)、襯墊(2)、裝有檢測(cè)兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管(3)、裝有陽性對(duì)照品的一個(gè)試管(4)、裝有陰性對(duì)照品的一個(gè)試管(5)組成，襯墊(2)上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液(3)、陽性對(duì)照品(4)和陰性對(duì)照品(5)。專利摘要本實(shí)用新型提供了一種鼻咽癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)基因位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，由包裝盒體1、襯墊2、裝有檢測(cè)兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管3、裝有陽性對(duì)照品的一個(gè)試管4、裝有陰性對(duì)照品的一個(gè)試管5組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液3、陽性對(duì)照品4和陰性對(duì)照品5。本實(shí)用新型試劑盒運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)鼻咽癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)基因SNP位點(diǎn)基因型的目的，相對(duì)于現(xiàn)有的熒光定量PCR試劑盒只檢測(cè)一個(gè)SNP位點(diǎn)，本實(shí)用新型試劑盒將與同一疾病相關(guān)的兩個(gè)SNP位點(diǎn)檢測(cè)整合在一個(gè)試劑盒內(nèi)，使用更方便而且成本更低，對(duì)鼻咽癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)的結(jié)果分析也更便捷。文檔編號(hào)C12Q1/68GK201390748SQ2008201569公開日2010年1月27日申請(qǐng)日期2008年12月12日優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日發(fā)明者賀憲民申請(qǐng)人:上海榮健生物技術(shù)有限公司