專利名稱：氨基酸診斷/測定試劑(盒)及氨基酸的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨基酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定氨基酸濃度
的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨基酸含量的測定在醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中都是比較重要的測定項(xiàng)目。 現(xiàn)有的測定方法有色譜法、電化學(xué)法、儀器分析法(氨基酸分析儀)、分光光度計(jì)等方法，這 些方法或是操作方法較為繁雜、特異性差、或儀器設(shè)備成本較高等缺點(diǎn)。 氨基酸不是單純的一種物質(zhì)，用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸(儀器價 格昂貴，不能普遍使用)，對于醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中來說，多數(shù)情況下，都是很 多種氨基酸同時存在，所以需要測定總的氨基酸含量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只 能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。 大量食肉或饑餓時尿中氨基酸氮增加，孕婦及新生兒尿液氨基酸氮也增加。氨基 酸代謝異常，造成某些氨基酸在體內(nèi)積累過多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎縮、肝功能 衰竭、Reye綜合征、或某些因素造成蛋白質(zhì)分解加速的疾病，遺傳性疾病所導(dǎo)致的代謝異常 均可使尿中氨基酸氮增加。 酶法測定血、尿、體液、食品、土壤、工業(yè)產(chǎn)品中氨基酸氮含量具有特異性高、方法 簡便、成本低的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化，得以測定氨基酸濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實(shí) 現(xiàn)該方法的氨基酸診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或 半、全自動生化分析儀上進(jìn)行氨基酸濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到 切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明氨基酸濃度測定方法如下 氨基酸+水+氧氨某酸氧化酶氧化酸+氨+過氧化氫 過氧化氫+ 二氧化碳+乙酰輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+ 輔酶A+氧 9輔酶A+雙氫紅曲霉L+8 二氧化碳+11輔酶+ S-腺苷-同型半胱氨酸+6水洛伐他汀九酮合成酶 8蘋果酰-輔酶A+乙酰_輔酶A+l 1還原型輔酶+S-腺苷-蛋氨酸這種方法應(yīng)用氨基酸氧化酶(amino-acid oxidase ;EC 1. 4. 3. 2 ;EC 1.4.3.3)
酶(偶)聯(lián)丙酮酸氧化酶(Pyruvate Oxidase ;EC 1. 2. 3. 6)、洛伐他汀九酮合成酶
(lovastatin nonaketide synthase EC 2.3.1.161)酶促反應(yīng)比色終點(diǎn)法。氨基酸氧化酶酶解氨基酸反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸氧化酶、洛伐他汀九酮合成酶的作 用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)， 從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過測量340nm處吸光度上升的 程度，可以測算氨基酸的濃度大小。 實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單 劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明氨基酸診斷/測定試劑(盒)較為理想緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑500,1/L輔酶3mmol/L氨基酸氧化酶10000U/L丙酮酸氧化酶12000U/L洛伐他汀九酮合成酶12000U/L碳酸氫鈉9mmol/L乙酰輔酶A6mmol/L雙氫紅曲霉L6mmol/Ls-腺苷-同型半胱氨酸6mmol/L本發(fā)明的氨基酸診斷/領(lǐng);u定試劑(盒)可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、洛伐他汀九酮合成酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、雙氫紅曲霉L、 S-腺苷-同型半胱氨酸。
試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、雙氫紅曲霉L、 S-腺
苷-同型半胱氨酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、洛伐他汀九酮合成酶。
輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、洛伐他汀九酮合成酶、碳酸氫鈉(二氧化 碳)、乙酰輔酶A、雙氫紅曲霉L、S_腺苷_同型半胱氨酸在試劑1或試劑2中的位置可以不 限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、雙氫紅曲霉L、 S-腺
苷-同型半胱氨酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、洛伐他汀九酮合成酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶。
輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、洛伐他汀九酮合成酶、碳酸氫鈉(二氧化 碳)、乙酰輔酶A、雙氫紅曲霉L、 S-腺苷_同型半胱氨酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位 置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定氨基酸濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一本實(shí)施例的氨基酸診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷- 鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑500,1/L輔酶3mmol/L氨基酸氧化酶10000U/L丙酮酸氧化酶12000U/L洛伐他汀九酮合成酶12000U/L碳酸氫鈉9mmol/L乙酰輔酶A6mmol/L雙氫紅曲霉L6mmol/Ls-腺苷-同型半胱氨酸6mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0. l，測
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向
為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 實(shí)施例二 本實(shí)施例的氨基酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
碳酸氫鈉 9mmol/L
乙酰輔酶A 6mmol/L
雙氫紅曲霉L 6mmol/L
S-腺苷-同型半胱氨酸 6mmol/L
試劑2
6[OO71]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 氨基酸氧化酶 10000U/L 丙酮酸氧化酶 12000U/L 洛伐他汀九酮合成酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0. 1，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為
2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 實(shí)施例三
本實(shí)施例的氨基酸診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶


















乙酰輔酶A 雙氫紅曲霉L
s-腺苷-同型半胱氨酸
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸氧化酶
洛伐他汀九酮合成酶
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
100,1/L 50mmol/L 3mmol/L 9mmol/L 6mmol/L 6mmol/L 6mmol/L
100,1/L 500,1/L 12000U/L 12000U/L
100,1/L 500,1/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定氨基酸濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間io分鐘，起
始吸光度《0. 1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑2、試 劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右， 檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá)到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0007 ;吸光度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上 升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)40mmol/L ;試劑測試的不準(zhǔn)確 度，其相對偏差不超過±5% ;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達(dá)0. 004±0. 002AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本 發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種酶比色法及酶聯(lián)法的氨基酸的濃度測定方法，其方法如下氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨+過氧化氫過氧化氫+二氧化碳+乙酰輔酶A 丙酮酸氧化酶丙酮酸+ 輔酶A+氧9輔酶A+雙氫紅曲霉L+8二氧化碳+11輔酶+S-腺苷-同型半胱氨酸+6水洛伐他汀九酮合成酶8蘋果酰-輔酶A+乙酰-輔酶A+11還原型輔酶+S-腺苷-蛋氨酸將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出氨基酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種氨基酸診斷緩沖液穩(wěn)定劑輔酶J定試劑(盒)，主要成分包括20-1—1——500,1/L-4000mmol/L-6mmol/L丙酮酸氧化酶洛伐他汀九酮合成酶-50mmol/L乙酰輔酶A 1-50mmol/L雙氫紅曲霉L 1-50mmol/LS-腺苷_同型半胱氨酸1——50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、洛伐他汀九酮合成酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、雙氫紅曲霉L、 S-腺苷-同型半胱氨酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、洛伐他汀九酮合成酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、雙氫紅曲霉L、S-腺苷-同型半胱氨酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、雙氫紅曲霉L、 S-腺苷-同型半胱氨酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、洛伐他汀九酮合成酶組成。輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、洛伐他汀九酮合成酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、雙氫紅曲霉L、S-腺苷-同型半胱氨酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、洛伐他汀九酮合成酶、碳酸氫鈉(二氧化碳h乙酰輔酶A,雙氫紅曲霉US-腺苷-同型半胱氨酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、雙氫紅曲霉L、 S-腺苷-同型半胱氨酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、洛伐他汀九酮合成酶組成；試劑 3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶組成。輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、洛伐他汀九 酮合成酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、雙氫紅曲霉L、 S-腺苷-同型半胱氨酸在試 劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(A,niaSulfate)、甘油 (Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一 種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨基酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定氨基酸濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、雙氫紅曲霉L、S-腺苷-同型半胱氨酸、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、洛伐他汀九酮合成酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
文檔編號C12Q1/26GK101750315SQ200810235650
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司