專利名稱：單胺氧化酶診斷試劑(盒)及單胺氧化酶活性濃度測定方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種單胺氧化酶診斷試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定單胺氧化酶
活性濃度的方法，屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，測定單胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有熒光法、免疫抑制法和化學分光光度法。熒光法是以e-苯乙胺作為底物來檢測單胺氧化酶，其依據(jù)是e-苯乙胺在10 lOOmg時反應速度最大，高于芐胺和5-羥色胺的反應速度。免疫學方法則利用單胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發(fā)生反應，測定反應后形成的單胺氧化酶同工酶，目前應用較多的單克隆抗體有MA0-A3C9、MA0-A4F10、MA0-A7B10、MA0-A7E10和MA0-B1C2等。
相對而言，化學分光光度法應有更為普遍。可以用單胺氧化酶催化胺類釋放出的過氧化氫(H202)去氧化10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪(MCDP)等發(fā)色劑進行測定，也可以應用芐胺(Benzylamine)、對苯甲胺-l3-偶氮萘酚、丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine) 、 |3 -苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyr咖ine，又稱"3-對羥基苯乙胺，，，3-pa:rahdroxyphenylethyl咖ine) 、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine)等作為反應底物來測定單胺氧化酶的活性。其中，應用苯甲胺類型底物測得的單胺氧化酶的活性比其它底物高，而用丁基胺、戊基胺、P-苯乙基胺作底物測得的活性約為3-對羥基苯乙胺作底物的30%。目前，單胺氧化酶測定多用芐胺和對苯甲胺-e-偶氮萘酚作為底物。芐胺法的原理是芐胺在單胺氧化酶的作用下生成芐醛，然后在強堿性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應，生成醛苯腙，這在生化儀上測定較困難；對苯甲胺-P _偶氮萘酚方法則需要用環(huán)乙烷提取，限制了該方法的實用性，且不能應用全自動生化儀分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出 一 種利用酶倍增法(EnzymaticDoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(CoupleReaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定單胺氧化酶活性濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的單胺氧化酶診斷試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行單胺氧化酶活性濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發(fā)明單胺氧化酶活性濃度測定方法如下 胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應醛類產(chǎn)物+氨+過氧化氫
氨+ (吲哚-3-基)丙酮酸+還原型輔酶色氨酸脫氡酶色氨酸+
水+輔酶
過氧化氫+還原型輔酶NADH過氧化物酶輔酶+2水 這種方法應用單胺氧化酶(Monoamine Oxidase ;EC 1. 4. 3. 4 ;EC 1. 4. 3. 6)酶(偶)聯(lián)色氨酸脫氫酶(Tryptophan dehydrogenase ;EC 1. 4. 1. 19) 、NADH過氧化物酶(NADHperoxidase ;EC 1. 11. 1. 1 ;EC 1. 11. 1. 2)酶促反應連續(xù)監(jiān)測法。單胺氧化酶酶解胺類化合物反應產(chǎn)生氨及過氧化氫，再分別通過(偶)聯(lián)合色氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶的作用，最終二次將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算單胺氧化酶的活性濃度大小。 實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明單胺氧化酶診斷/測定試劑較為理想
緩沖液 lOOmmol/L穩(wěn)定劑 500mmol/L還原型輔酶 0. 25mmol/L
色氨酸脫氫酶 10000U/LNADH過氧化物酶 10000U/L胺類化合物 12mmol/L(口引哚_3-基)丙酮酸 15mmol/L
本發(fā)明測定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當中，所述"胺類化合物"優(yōu)選以下物質(zhì)之一芐胺、對苯甲胺-e-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、e-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者這七種物質(zhì)的衍生物，但選擇范圍不受這些列舉所限制。
本發(fā)明的單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、胺類化合物、(吲基)丙酮酸。
試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、色氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、胺類化合物、(吲哚_3_基)丙酮酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定單胺氧化酶活性濃度的方法，其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一 本實施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L 色氨酸脫氫酶 10000U/L
NADH過氧化物酶 10000U/L
節(jié)胺 12mmol/L
(卩引哚-3-基)丙酮酸 15mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復溶后使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值-4180。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。實施例二本實施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑l三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑50mmol/L還原型輔酶0. 25,1/L芐胺12mmol/L(吲哚-3-基)丙酮酸15mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑500,1/L色氨酸脫氫酶10000U/LNADH過氧化物酶10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為
2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，
理論K值-2170。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
實施例三
本實施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 芐胺
(吲哚-3-基)丙酮酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
NADH過氧化物酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑















100,1/L 50mmol/L 0. 25,1/L 12mmol/L
15mmol/L
100,1/L 500,1/L 10000U/L
100,1/L 500,1/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定單胺氧化酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間
10分鐘，起始吸光度1. 8±0. 7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品 與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時 間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值-2170。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
申請人:經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.001 ;吸光度時間反應曲線應呈直 線下降；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達600U/L ;試劑測試的不準確度，其相對偏 差不超過±3% ;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑的靈敏度可 達0. 0005±0. 0003 AA/min/U/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈 敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應用。
權(quán)利要求
一種利用酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶活性濃度測定方法，其方法如下胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應醛類產(chǎn)物+氨+過氧化氫氨+(吲哚-3-基)丙酮酸+還原型輔酶色氨酸脫氫酶色氨酸+水+輔酶過氧化氫+還原型輔酶NADH過氧化物酶輔酶+2水將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出單胺氧化酶的活性濃度大小結(jié)果。
2. —種單胺氧化酶診斷試劑(盒)，主要成分包括緩沖液 20-500mmol/L穩(wěn)定劑 1-4000mmol/L還原型輔酶 0. 1-0. 35mmol/L色氨酸脫氫酶 1000——80000U/LNADH過氧化物酶1000——80000U/L胺類化合物 1——50mmol/L(吲哚-3-基)丙酮酸 1——50mmol/L本發(fā)明測定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當中，所述"胺類化合物"優(yōu)選以下物質(zhì)之一芐胺、對苯甲胺-e-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、e-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者這七種物質(zhì)的衍生物，但選擇范圍不受這些列舉所限制。試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、胺類化合物、(吲哚_3-基)丙酮酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、胺類化合物、(吲哚_3-基)丙酮酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、(吲哚_3-基)丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶組成。還原型輔酶、色氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、胺類化合物、(吲哚-3-基)丙酮酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、胺類化合物、(吲哚_3-基)丙酮酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、(吲哚_3-基)丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、NADH過氧化物酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸脫氫酶組成。還原型輔酶、色氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、胺類化合物、(吲哚-3-基)丙酮酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶診斷試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定單胺氧化酶活性濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、胺類化合物、(吲哚-3-基)丙酮酸、色氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
文檔編號C12Q1/26GK101750310SQ20081023564
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司