專利名稱：：帕金森病早期診斷標(biāo)志物的制作方法帕金森病早期診斷標(biāo)志物
背景技術(shù)：
：本發(fā)明總體而言涉及分子生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域以及帕金森病(Parkinson'sDisease,PD)的診斷、預(yù)后或預(yù)防性/治療性治療。帕金森病是一種進(jìn)行性的神經(jīng)退行性疾病，其特征為黑質(zhì)中多巴胺神經(jīng)元缺失和存活神經(jīng)元中存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物(路易體，Lewybodies)。帕金森病的經(jīng)典臨床特征包括進(jìn)行性震顫、強(qiáng)直和運(yùn)動(dòng)l變。然而，在其早期階段，由于缺乏臨床癥狀和可信的生物標(biāo)志物使得PD#^被診斷。另外，PD可能被誤診為其它一些疾病，包括，但不僅限于，例如特發(fā)性震顫和多系統(tǒng)萎縮等，這進(jìn)一步干擾了任何潛在診斷。PD診斷可以基于神經(jīng)表現(xiàn)，這些只在大腦脆弱區(qū)域內(nèi)實(shí)體細(xì)胞損失之后才顯現(xiàn)出來(lái)。發(fā)明概要本發(fā)明總體而言涉及樣品的分析測(cè)試以及用于PD診斷、預(yù)后或者預(yù)防性/治療性治療的生物標(biāo)志物說(shuō)明的各個(gè)方面。其中一個(gè)方面，本文提供了一種診斷或監(jiān)測(cè)帕金森病的方法，其包括(a)確定在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)取自受試者的樣品中5wflW或i^W的表達(dá)水平，和(b)將樣品中5w"http://或的表達(dá)水平和參考水平相比較，其中樣品中^Wfl//或尸ei^表達(dá)水平和參考水平的差異指示出受試者患有帕金森病或其分級(jí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述參考水平是指未患帕金森病的受試者對(duì)照群體中或的表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述參考水平是指未患帕金森病的個(gè)體中或i^r的表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述參考水平是指受試者之前的5maW或/Vi^的表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述參考水平是指受試者在接受治療方案之前5附"W或尸eW的表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品為血液樣品。在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，所述樣品包含外周白細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量表達(dá)水平的步驟是通過(guò)定量PCR實(shí)施。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量表達(dá)水平的步驟是通過(guò)northern印跡或點(diǎn)印跡實(shí)施。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定表達(dá)水平的步驟包括將或iVW的mRNA的量相對(duì)于管家基因mRNA的量進(jìn)行歸一化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述管家基因選自hCDK4、p-肌動(dòng)蛋白、3-磷酸甘油醛脫氬酶和18SrRNAB在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)包括至少一個(gè)處于晝夜循環(huán)中夜間部分的時(shí)間點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)包括選自約23:00至約9:00之間的至少一個(gè)時(shí)間點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)自選自下列的時(shí)間段20:00到22:00，23:00到1:00,5:00到7:00,以及8:00到10:00。在一個(gè)舉例性實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)選自約21:00、約00:00、約06:00和約09:00。在一個(gè)實(shí)施方案中，比較i/imW或表達(dá)水平與參考水平的步驟是通過(guò)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)來(lái)實(shí)施的。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者5w"http://或表達(dá)水平與參考水平的差異與受試者帕金森病分級(jí)正相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，帕金森病分級(jí)是通過(guò)Hoehn&Yahr分級(jí)系統(tǒng)測(cè)定的。在一個(gè)實(shí)施方案中，確定受試者是否患有帕金森病或其分級(jí)的步驟是對(duì)Hoehn&Yahr分級(jí)系統(tǒng)所確定的分級(jí)和受試者必/MflW或Pw/表達(dá)水平與參考水平的差異之間進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，帕金森病的分^it過(guò)UPDRS量表進(jìn)fr^價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方案中，相比于參考水平，受試者丑mflW表達(dá)水平在選自約21:00、約00:00和約06:00的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)處降^f氐指示出受試者患有帕金森病或其分級(jí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，相比于參考水平，受試者/>7表達(dá)水平在約00:00、約06:00或同時(shí)在約00:00和約06:00時(shí)升高指示出受試者患有帕金森病或其分級(jí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，相比于參考水平，受試者表達(dá)水平在21:00時(shí)降低指示出受試者患有帕金森病或其分級(jí)。在一些示例性實(shí)施方案中，所述方法另外包括通過(guò)測(cè)量來(lái)源于受試者取自至少兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的樣品中和/或5附flW的表達(dá)水平以及比較至少兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間和/或5maW的表達(dá)水平來(lái)確定受試者中和/或5附flW表ii^式的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者在約21:00和約00:00時(shí)表達(dá)水平比約06:00和09:00時(shí)低的表i^漠式指示出受試者患有帕金森病。在一些示例性實(shí)施方案中，本方法還包括4^據(jù)受試者所患帕金森病以及其分m擇治療方案的步驟。在一些示例性實(shí)施方案中，本方法還包括在治療方案施用給受試者之后測(cè)量丑附fl/2或/Vr2表達(dá)水平的步驟。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本文提供了一種篩選可用于治療帕金森病的化合物的方法，其包括(a)對(duì)施用了測(cè)試化合物的受試者的樣品中必/im//或的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)量；(b)將5wflW或i^f/的表達(dá)水平和參考水平相比較；和(c)確定所述測(cè)試化合物的效力，其中5w"W或iVW的表達(dá)水平相比于參考水平的差異指示出所述測(cè)試化合物可用于治療受試者的帕金森病。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述參考水平是接受所述測(cè)試化合物之前受試者的A/waW或iVW表達(dá)水平。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本文提供了一種診斷或監(jiān)測(cè)受試者帕金森病的試劑盒，它包含(a)—種或多種用于測(cè)量受試者樣品中5附iiW或/V"表達(dá)水平的檢測(cè)試劑；(b)至少一例來(lái)自未患帕金森病的受試者對(duì)照,的對(duì)照樣品；和(c)一種或多種檢測(cè)試劑的使用說(shuō)明。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種檢測(cè)試劑包括用于必附flWmRNA的RT-PCR的引物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種檢測(cè)試劑包括用于/VWmRNA的RT-PCR的引物。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本文提供了一種或多種測(cè)量受試者樣品中丑wa/7或表達(dá)水平的檢測(cè)試劑用于制備診斷或監(jiān)測(cè)帕金森病的藥劑中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了一種或多種測(cè)量受試者樣品中5附fl//或表達(dá)水平的檢測(cè)試劑用于制備診斷或監(jiān)測(cè)帕金森病的藥劑中的用途，其中(a)所述一種或多種測(cè)量受試者樣品中或戶w7表達(dá)水平的檢測(cè)試劑確定在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)取自受試者的樣品中5附"W或的表達(dá)水平；和(b)將所述樣品中5w"W或表達(dá)水平和5附flW或戶erJ表達(dá)的參考水平進(jìn)行比較；其中所述樣品中丑w"http://或表達(dá)水平和參考水平的差異指示出受試者患有帕金森病或其分級(jí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述參考水平是指未患帕金森病的受試者對(duì)照群體中5挑flW或i^r7的表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述參考水平是指未患帕金森病的個(gè)體中或i^r的表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述參考水平是指受試者之前的或iVW的表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述參考水平是指受試者在接受治療方案之前或/VW的表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品為血液樣品。在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，所述樣品包含外周白細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用定量PCR確定所述表達(dá)水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用northern印跡或點(diǎn)印跡確定所述表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)水平的確定包括將"挑fl/7或PeW的mRNA的量相對(duì)于管家基因mRNA的量進(jìn)行歸一化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述管家基周選自hCDK4、p-肌動(dòng)蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶和18SrRNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)包括至少一個(gè)處于晝夜循環(huán)中夜間部分的時(shí)間點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)包括至少一個(gè)處于約23:00至約9:00的時(shí)間點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)自選自下列的時(shí)間段20:00到22:00，23:00到1:00,5:00到7:00,以及8:00到10:00。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)選自約21:00、約00:00、約06:00和約09:00。在一個(gè)實(shí)施方案中，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較5w"/7或表達(dá)水平和參考水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者5wfl//或iVW的表達(dá)水平和參考水平之間的差異與受試者帕金森病的分級(jí)正相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，帕金森病分級(jí)是通過(guò)11061111&Yahr分級(jí)系統(tǒng)測(cè)定的。在一個(gè)實(shí)施方案中，確定受試者是否患有帕金森病或其分級(jí)的步驟是對(duì)Hoehn&Yahr分級(jí)系統(tǒng)所確定的分級(jí)和受試者或i^r/表達(dá)水平與參考水平的差異之間進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，帕金森病的分級(jí)通過(guò)UPDRS量表進(jìn)行評(píng)價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方案中，與參考水平相比受試者5ifmW表達(dá)水平在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)處降低指示出受試者患有帕金森病或其分級(jí)，所述時(shí)間點(diǎn)選自約21:00、約00:00、約06:00。在一個(gè)實(shí)施方案中，與參考水平相比受試者/^W表達(dá)水平在約00:00、約06:00或者約00:00和約06:00同時(shí)升高指示出受試者患有帕金森病或其分級(jí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，與參考水平相比受試者iVH的表達(dá)水平在21:00下降指示出受試者患有帕金森病或其分級(jí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中一種或多種測(cè)量受試者樣品中丑/iiflW或表達(dá)水平的檢測(cè)試劑還可用于確定受試者中尸^/或丑iwfl/7的表達(dá)模式，所述確定是通過(guò)測(cè)量來(lái)源于受試者取自至少兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品中Pw7或丑w^/的表達(dá)水平以及比較所述至少兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的/^f7或必wfl/7表達(dá)水平來(lái)進(jìn)行的。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者中在約21:00和約00:00時(shí)的表達(dá)水平比約06:00和約09:00時(shí)低的i^r表達(dá)模式指示出受試者患有帕金森病。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中還根據(jù)受試者患有帕金森病或其分級(jí)選擇治療方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中另外在受試者接受治療方案之后測(cè)量丑/MflW或7VW表達(dá)水平。上述概務(wù)仗為說(shuō)明性而并不意為任何形式的限制。除上述的示例性方面、實(shí)施方案以及特征之外，另外的示例性方面、實(shí)施方案以及特征通過(guò)參考附圖以及以下發(fā)明詳述進(jìn)行說(shuō)明。發(fā)明詳述在下面的詳細(xì)說(shuō)明中，參考作為說(shuō)明書(shū)一部分的附圖。在附圖中，除非文中另外指出，相似的符號(hào)通常表示相似的成員。在詳細(xì)i兌明、附圖以及權(quán)利要求中描述的示例性實(shí)施方案不意味著限制。在不脫離本文主題的精神和范圍的前提下，也可使用其它一些實(shí)施例以及做出一些其它的改變。本文中提及時(shí)間時(shí)采用24小時(shí)制。24小時(shí)制是慣用的計(jì)時(shí)方式，其中一天從午夜開(kāi)始至午夜結(jié)束，其被劃分為24個(gè)小時(shí)，以數(shù)字0到23表示oI定義單位、前綴以及符號(hào)都以其公認(rèn)的SI制表示。除非另外說(shuō)明，核酸從左至右以5'端至3'端的方向書(shū)寫(xiě)；^J^酸序列從左至右以從Jl^端至g端的方向書(shū)寫(xiě)。本文中用通常所知的三字母代碼或者采用IUPAC-IUBMB10命名委員會(huì)推薦的單字母代碼表示氨基酸。類似的，核苷酸可以用普遍接受的單字母編碼表示。在隨后的說(shuō)明中，頻繁使用很多術(shù)語(yǔ)。通過(guò)參考說(shuō)明書(shū)整體更完整地定義下列術(shù)語(yǔ)。除非有明確相反的說(shuō)明，單詞"包含"及其變化形式如"有"和/或"包括"將被理解為例如包含權(quán)利要求中所述的信息，但并不排除未明確說(shuō)明的信息。除非明確說(shuō)明是單數(shù),本文提及的名詞均表示"一個(gè)(種)或多個(gè)(種)"。如本文中所使用的，當(dāng)提到數(shù)值時(shí)，除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"約"表示所舉數(shù)值的正負(fù)10%,如本文中所使用的，對(duì)受試者或患者"施用，，試劑或藥物包括將化合物通過(guò)任意途徑芽1入或iH^受試者體內(nèi)以實(shí)施其預(yù)期功能?？梢酝ㄟ^(guò)任何合適途徑進(jìn)行施用，包括口服、鼻內(nèi)、胃腸外(靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、J^內(nèi)或皮下)、直腸或局部。施用包括自我施用和他人施用。另外還要認(rèn)識(shí)到，各種所提到的治療或預(yù)防醫(yī)學(xué)狀況的模式都意味著"基本上"，其包含全部但也包含少于全部的治療或預(yù)防，其中得到一些生物或者藥物相關(guān)的結(jié)果，包括生活質(zhì)量的改善。術(shù)語(yǔ)"評(píng)估"和"評(píng)價(jià)"可互換地用于指代任何形式的測(cè)量，包括確定特性、特點(diǎn)或特征是否存在。術(shù)語(yǔ)"確定"，"測(cè)量"，"評(píng)估"和"測(cè)定"可互換地使用，其包括定量和定性的確定。評(píng)估可以是相對(duì)的或絕對(duì)的。"評(píng)價(jià)其存在"包括確定存在事物的量，也包括確定事物是否存在。如本文中所使用的，本發(fā)明背景中術(shù)語(yǔ)"生物標(biāo)志物"指信使RNA，與取自對(duì)照受試者或?qū)φ帐茉囌呷后w的相當(dāng)樣品相比，該信使RNA差異存在于取自帕金森病患者的樣品中。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"對(duì)照群體"是指陰性診斷或未檢測(cè)到帕金森病的個(gè)體，例如，正?；蚪】档氖茉囌摺Ｈ绫疚闹兴褂玫?，短語(yǔ)"水平差異"是指取自帕金森病患者身上的樣品中存在的生物標(biāo)志物與對(duì)照相比在數(shù)量上的差異。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物標(biāo)志物可以是信4吏RNA，與參考水平相比，它以升高的或降低的量存在于帕金森病患者的樣品中。在一個(gè)實(shí)施方案中，"水平差異"可以是統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。例如，如果生物標(biāo)志物的測(cè)量水平落在任何對(duì)照或參考群組平均值約1.0標(biāo)準(zhǔn)偏差、約1.5標(biāo)準(zhǔn)偏差、約2.0標(biāo)準(zhǔn)偏差或約2,5標(biāo)準(zhǔn)偏差之外，其差異可以是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。如本文中所使用的，"晝夜循環(huán)"是指一天24小時(shí)的循環(huán)，其被劃分為夜間和白天兩段。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)測(cè)試化合物的"有效量"是指足以達(dá)到所需治療和/或預(yù)防效果的量，例如，達(dá)到預(yù)防或減輕與所治療疾病(即帕金森病)相關(guān)癥狀的劑量。施用給受試者的化合物量取決于疾病的類型和嚴(yán)重程度以及個(gè)體特性，如，基本健康狀況、年齡、性別、體重和藥物耐受性。它還取決于疾病的程度、嚴(yán)重性和分級(jí)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)這些或其他因素決定合適的劑量。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"群體"可以是任何至少兩個(gè)個(gè)體的組。群體可以包括，但不僅限于，對(duì)照群體、患者^(guò)、參考群體、幹本組、家族群體、臨M體和同性別群體等。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"參考水平"是指用于比較的目的生物標(biāo)志物的量或濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述參考水平可以是至少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，其表現(xiàn)為取自健康受試者對(duì)照群體的樣品中至少一種生物標(biāo)志物的平均水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述參考水平可以^Il相同受試者之前的(即在當(dāng)前測(cè)定之前)至少一種生物標(biāo)志物表達(dá)水平。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，所述參考水平可以是受試者在接受治療方案之前至少一種生物標(biāo)志物的水平。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"樣品"可以包括，但不僅限于，身體組織或體液，如血液(或血液的一部分如血漿或血清)、淋巴液、粘液、眼淚、唾液、膽嚢液、尿液、精液、糞便、脊髓液(CSF)、腹水或全血，以及包括來(lái)自身體組織的活檢樣品。樣品可以來(lái)自任何受試者，如具有或懷疑有患帕金森病潛在風(fēng)險(xiǎn)的受試者/患者。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"篩選"意味著確定測(cè)試化合物是否具有預(yù)防或減緩(減輕)本文所述的目標(biāo)病理狀況(即帕金森病)的能力和特性。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"受試者"是指哺乳動(dòng)物，如人類，但也可以是其它動(dòng)物，如家養(yǎng)動(dòng)物(如狗、貓等)，家畜(如牛、羊、豬、馬等)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物(如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。術(shù)語(yǔ)"患者"是指那些患有或懷疑患有帕金森病的"受試者"。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"治療"或"療法"是指治療性處理和預(yù)防性或防治性措施，其目的是為預(yù)防、減緩或減輕目標(biāo)病理狀況或疾病。如果，在接受治療量的根據(jù)本發(fā)明方法的測(cè)試化合物后，受試者表現(xiàn)出一種或幾種PD跡象或癥狀可觀察的和/或可測(cè)量的減少或消失或者在Hoehn&Yahr和/或UPDRS分級(jí)類別上有所改善，那么患者的帕金森病特征的疾病就被成功"治療"。II發(fā)明概述本文公開(kāi)了檢測(cè)受試者是否患有帕金森病(PD)的方法，其(至少部分地)基于本發(fā)明對(duì)樣品的測(cè)試方法的結(jié)果。本文還公開(kāi)了監(jiān)測(cè)被診斷為帕金森病的受試者iOl狀況的方法，其至少部分基于對(duì)樣品的測(cè)試結(jié)果。本文公開(kāi)的測(cè)試樣品以下列物質(zhì)為代表，但不僅限于此，例如血液(或血液的一部分如血漿或血清)、淋巴液、粘液、眼淚、唾液、膽囊液、尿液、精液、糞便、脊髄液(CSF)、腹水或全血，以及身體組織的活檢樣本。本公開(kāi)涉及診斷、監(jiān)測(cè)和治療PD的方法，等等。本發(fā)明一般性提供了對(duì)測(cè)試樣品中iVW和5/MflW基因表達(dá)的檢測(cè)、測(cè)量和比較。因此，涉及測(cè)試樣品中信使RNA的收集、制備、分離、鑒定、定性和豐度比較的各個(gè)方面。本發(fā)明還涉及包含/VW和信使RNA的樣品的檢測(cè)和/或監(jiān)測(cè)，所述信使RNA可單獨(dú)或組合用于確定是否患有帕金森病或其itA狀態(tài)。另一方面包括根據(jù)受試者是否患有帕金森病及其程度來(lái)選擇治療方案。因此，本發(fā)明還涉及選擇和檢測(cè)藥劑(如藥物、化合物)對(duì)尸^/和/或fiwm〃基因表達(dá)影響，其在下文有詳細(xì)描述。本發(fā)明的另一方面涉及用于檢測(cè)和監(jiān)測(cè)帕金森病的診斷試劑盒，其在下文有詳細(xì)描述。本發(fā)明的實(shí)施過(guò)程中，用到了許多分子生物學(xué)、蛋白生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)以及微生物學(xué)中的常規(guī)技術(shù)。這些公知技術(shù)分別在下列文獻(xiàn)中有解釋例如CwreW/11Mo/ecw/flf及V/f^，Vols.I畫(huà)III，Ausubel，Ed.(1997);SambrookCfl/"C7<m//ig..JZfl6ora似fjAfawna/，SecondEd.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989);2X/V^C7o/"g..J戶ra"/cfl/々戶flcA，Vols.IandII，Glover，Ed.(1985);O/i^owMc/roftV/eiSy/i幼ew、Gait,Ed.(1984);7Vwc/e/c爿"VZHames&Higgins，Eds.(1985);7hi"5r/7)7ftVwia/ififrraws/flrio，Hames&Higgins,Eds.(1984);j/ii'畫(huà)/CW/CWfM^，F(xiàn)reshney，Ed.(1986);/附附^/CW/s做rf(IRLPress,1986);Perbal，j/Vwft'ca/(7"!V/etoA/o/eoi/"/*C7wi/"g;theseries,Me仇E/^/wo/"(AcademicPress,Inc.,1984);Thwi^/^*Actors1/orMld附附fl/Zflw0//s，Miller&Calos，Eds.(ColdSpringHarborLaboratory,NY，1987);和她仇五"^wo/"Vols.154and155,Wu&Grossman,andWu,Eds.。檢測(cè)和測(cè)量信使RNA基因表達(dá)產(chǎn)物水平(即基因轉(zhuǎn)錄水平)的方法是本領(lǐng)域^^p的，其包括mRNA的檢測(cè)方法，如RT-PCR和印跡技術(shù)。III診斷和監(jiān)測(cè)PD的方法一方面，本文提供了診斷、監(jiān)測(cè)PD和篩選治療PD的化合物的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括測(cè)量受試者血液樣品中分子時(shí)鐘基因表達(dá)。在白天或夜間特定時(shí)間時(shí)鐘基因的表達(dá)水平提供了有關(guān)受試者是否患有帕金森病或其分級(jí)的信息。在一些實(shí)施方案中，時(shí)鐘基因在特定時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)可用于確定受試者是否患有帕金森病或其分級(jí)，在其它一些實(shí)施方案中，在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表i^漠式可用于確定受試者是否患有帕金森病或其分級(jí)。A.PD晝夜節(jié)律的分子特征帕金森病患者經(jīng)常會(huì)經(jīng)受各種各樣受晝夜節(jié)律控制的生理性改變。Bruguerolle"C7/"iVe歸pto附腳/25:194-201(2002)。例如，帕金森病患者的血壓缺少了其正常的晝夜節(jié)律從而導(dǎo)致了一天內(nèi)血壓的顯著變化。另外，他們的交感神經(jīng)早間J^值和心率晝夜調(diào)節(jié)喪失。最后，帕金森病患者具有更高的皮質(zhì)醇合成速率，伴隨著變得平緩的每日皮質(zhì)醇分泌曲線。大多數(shù)帕金森病患者還患有睡眠紊亂、體溫顯著降低、次級(jí)異常癥狀波動(dòng)(secondabnormalmotorfluctuation)和時(shí)間依賴的多巴胺刺^L^應(yīng)，Camara"/"CA腦C細(xì)/22(5):917-924(2005);Monge"a/"C7/"iVe歸/^fl簡(jiǎn)flco/27:116-118(2004),PeW和5wflW基因的表達(dá)遵循身體的晝夜節(jié)律。戶eW、5mflW和其它基因(如CtodUOj基因、其它iVf基因、D"基因和i^v-er6a)構(gòu)成包括身體分子時(shí)鐘的自調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。RutterW"/.,Jwm/及ev及Vc/^w71:307-331(2002);HonmaCfl/"7Vfl似"419:841-844(2002);Lowrey&fl/"j/i/i"及ev34:533-563(2000)。時(shí)鐘基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的正負(fù)調(diào)節(jié)構(gòu)成了一個(gè)互聯(lián)的反饋回路，該回糾區(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)生物鐘的自維持振蕩。具體的，CLOCK和BMAL1蛋白形成了誘導(dǎo)i^nV^基因i^、iVr2和尸er3以及隱花色素基因Oj7和Oj2的表達(dá)的二聚體。由PER和CRY蛋白形成的二聚體接著以負(fù)調(diào)節(jié)方式作用，其通過(guò)轉(zhuǎn)位回細(xì)胞核和抑制CLOCK/BMAL1二聚體的活性來(lái)完成反饋回路。其他次級(jí)調(diào)節(jié)過(guò)程對(duì)核心時(shí)鐘機(jī)制的精細(xì)調(diào)節(jié)也有貢獻(xiàn)。LiuWfl/.，Oiw/iW/o/7^/24(5):793-820(2007)。所得的分子時(shí)鐘具有全身性，并被廣泛研究，例如，在下丘腦腹側(cè)的視交叉上核(suprachiasmicnucleus)以及外周組織中。R印pert&Weaver,及ev63:647-676(2001);Fukuhara&Tosini,F訓(xùn)f8:642-651(2003)。時(shí)鐘系統(tǒng)因此包括一個(gè)復(fù)雜的分級(jí)結(jié)構(gòu)，其中視交叉上核的時(shí)鐘基因振蕩傳遍整個(gè)大腦并通過(guò)神經(jīng)及體液系統(tǒng)到達(dá)外周組織。Albrecht&Eichele,Cwir0//"G^iWDev13:271-277(2003)。在分子時(shí)鐘基因中，i^7表現(xiàn)出強(qiáng)有力的振蕩，而丑wa/7是時(shí)鐘的中心調(diào)控子。Ko&Takahashi，丑"wAfo/15:R271-277(2006);Dardente&Cermakian,CAf謝淑iiif24:195-213(2007)。和J5細(xì)W的表達(dá)在健康受試者的全血細(xì)胞中振蕩，從而建立了尸eW和W/wflW表達(dá)的參考水平。BoivinWfl/"丑/oM102:4143-4145(2003);Takimoto"W.，/及"w/CV附/;289(5):R1273-1279(2005);FukuyaW丑/oc/re附5/c^/^s及esCV附附ww354(4):924隱8(2007);JamesWfl/.，C^fwiMiV/7^24(6):1009-34(2007)。在年輕人的外周血單個(gè)核細(xì)胞以及多形核細(xì)胞中i^/表ii^現(xiàn)出相似的24小時(shí)模式，表a月在不同血細(xì)胞類型中存在相似的時(shí)鐘基因活性。KusanagiCiVe"nwc/￡M365(2):124-7(2004)。特別地，i^W在血液、口腔粘膜、皮膚和骨髓CD34+祖細(xì)胞中的表i^Jt常在早間達(dá)到峰值，而在白細(xì)胞中5wflW表達(dá)的峰值則在一天的晚些時(shí)候或夜間出現(xiàn)，在口腔粘膜細(xì)胞和皮膚細(xì)胞中在傍晚稍晚些時(shí)候或夜間出現(xiàn)。B.i^W和丑/Mfl/表達(dá)的測(cè)量i^W或5附flW的表達(dá)可以在下列樣品中測(cè)量，其包括但不僅限于，例如，全血、部分血液成分或其它身體組織。因此，在本方法的一個(gè)實(shí)施方案中，或的表達(dá)水平在血液樣品中測(cè)定，在另一個(gè)實(shí)施方案中，或的表達(dá)水平在外周白細(xì)胞中測(cè)定?？梢酝ㄟ^(guò)確定樣品中存在的或的信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄物的量來(lái)測(cè)量i^J和5附flW的表達(dá)水平。大多數(shù)基因，包括AW和Wiiia/7,攜帶有細(xì)胞合成特定蛋白質(zhì)分子的信息?；虮磉_(dá)是指基因信息轉(zhuǎn)化成細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能和行為的多步過(guò)程。該過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯，借助轉(zhuǎn)錄基因信息被拷貝到mRNA分子中，借助翻譯mRNA分子編碼的信息被用來(lái)合成蛋白質(zhì)分子。mRNA和蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)都可具有多種作用。因此，轉(zhuǎn)錄自一個(gè)特定基因的mRNA分子數(shù)與基因表i^目關(guān)。mRNA的分子數(shù)可以通過(guò)幾種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的成熟方法進(jìn)行定量。第一步可以包括用公知的常規(guī)方法，如苯酚/氯仿提取后2-丙醇沉淀法，制名"洋品的總RNA。另外，許多釆用固相離心柱的商品試劑盒的方法也是可用的。在一些實(shí)驗(yàn)方案中，在樣品中加入一些特殊的酶來(lái)除去基因組DNA污染。RNA分離完成之后，有幾種技術(shù)可以用來(lái)測(cè)定制備的總RNA中的特定目標(biāo)mRNA的量。例如，印跡和擴(kuò)增方法都適用于通過(guò)mRNA的定量來(lái)測(cè)量基因的表達(dá)水平。總的來(lái)說(shuō)，這些技術(shù)測(cè)定了與轉(zhuǎn)錄自特定基因的mRNA分子數(shù)成比例的信號(hào)。使用寡核苷酸探針的印跡以及使用寡核苷酸引物的PCR是兩種mRNA定量的方法。其它一些可以被采用的高通量測(cè)定方法有基因表達(dá)系列分才斤(serailanalysisofgeneexpression,SAGE)、微陣列法以;5L^達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetag,EST)分析。在所公開(kāi)方法的一個(gè)實(shí)施方案中，尸^和的表達(dá)水平通過(guò)印跡方法，如northern印跡測(cè)定。如本文中所用的，"northern印跡"意為包含所有基本的RNA檢測(cè)方法(包括點(diǎn)印跡和狹縫印跡)在內(nèi)的各種變化。在典型的印跡方法中，總RNA被分離并通常是根據(jù)尺寸不同采用電泳法分離。電泳包括將分離后的樣品置于^的孔中，其中^可以是變性的或非變性的聚丙烯酰胺或瓊脂糖亂&。對(duì):^加以直流或脈沖電流，樣品中的各組分根據(jù)分子大小、構(gòu)象、電荷和/或物理性質(zhì)的組合進(jìn)行分離。隨后，凝膠上的RNA被轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)移方法是本領(lǐng)域公知的，其包括但不僅限于，通過(guò)毛細(xì)管作用、吸取和通過(guò)加載電場(chǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)移。在轉(zhuǎn)移和固定在濾紙或膜上之后，采用標(biāo)記的序列特異的探針通過(guò)序列特異雜交對(duì)特定基因的mRNA進(jìn)行定量。該探針將與固定在膜上的RNA結(jié)合，并通過(guò)各種顯影方法(如放射性標(biāo)記、熒光、化學(xué)發(fā)光、比色)以確定特定RNA的量。樣品中存在的mRNA分子數(shù)以結(jié)合在目標(biāo)mRNA上標(biāo)記過(guò)的探針量所產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)表示。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)定量PCR測(cè)量戶eW和/或5w"W的表達(dá)水平。定量PCR方法由標(biāo)準(zhǔn)PCR變化而來(lái)，其是分子生物學(xué)中廣泛應(yīng)用的通過(guò)體外酶復(fù)制擴(kuò)增一段DNA或RNA的技術(shù)。PCR需要熱穩(wěn)定的聚合酶(如Taq聚合酶)，特異性針對(duì)目標(biāo)DNA或RNA序列擴(kuò)增的被稱作寡核苷酸引物的短DNA分子，四種單獨(dú)的DNA核苷酸單體以及合適的緩沖液。這些組分均有市售的。在將這些反應(yīng)組分與樣品混合后，反應(yīng)釆用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室儀器進(jìn)行熱循環(huán)，使得目標(biāo)DNA或RNA序列進(jìn)行指數(shù)式鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和擴(kuò)增。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR，有可能將一個(gè)或幾個(gè)拷貝的DNA片段進(jìn)行幾個(gè)數(shù)量級(jí)的擴(kuò)增，產(chǎn)生百萬(wàn)計(jì)或更多拷貝的DNA片段。然而，可以對(duì)PCR進(jìn)行大量修改以進(jìn)行一系列的基因操作或提供定量特定種類RNA的方法。在定量PCR中，^Jl所得產(chǎn)物的量與樣品中特定RNA的量成正比。為了對(duì)特定的信使RNA分子進(jìn)行定量，使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成樣品中mRNA的互補(bǔ)DNA(cDNA)拷貝。|51#，使用PCR擴(kuò)增cDNA拷貝以確定樣品中最初的mRNA分子數(shù)?？梢允褂枚喾N信號(hào)進(jìn)行定量，其包括但不僅限于熒光、溴化乙錠染色和化學(xué)發(fā)光法。在一些定量PCR方法中，使用另外的熒光標(biāo)記探針進(jìn)行mRNA的定量?？梢杂脕?lái)定量i^nf的引物實(shí)例有正向引物SEQIDNO:1和反向引物SEQIDNO:2，Boivindfl/，5/^^/102:4143-4145(2003);可以用來(lái)定量5附"W的引物實(shí)例有正向引物SEQIDNO:3和反向引物SEQIDNO:4，Chen"f尸W/"^i^58:1180-1184(2005)。采用合適的方法，探針SEQIDNO:5可以用來(lái)檢測(cè)/VrJ而SEQIDNO:6可以用來(lái)檢測(cè)丑附fl//。BoivinWfl/"說(shuō)卯d102:4143-4145(2003);ChenW"/.，/^AWri^s58:1180-1184(2005)。這些探針通常在其一端具有熒光標(biāo)簽而另一端具有淬滅劑染料。例如，這些探針可以在5'端具有熒光標(biāo)簽例如6-羧基熒光素(縮寫(xiě)為FAM)，而在3'端具有淬滅劑染料如四甲基羅丹明(縮寫(xiě)為TANMRA)。采用這類引物的一種方法被稱作"Taqman"法。Heide,/.，Gemwie及es6:986~994(1996)。其它適當(dāng)?shù)暮蚖附flW基因特異性的引物和探針也可以在其它一些檢測(cè)方法中使用。一方面，測(cè)量/^rJ或表達(dá)水平包括將/VW或的量相對(duì)于"管家"基因mRNA的量進(jìn)行歸一化。細(xì)胞或樣品中mRNA的總量變化會(huì)影響到該樣品中具體的目標(biāo)mRNA的量。例如，樣品中總RNA的分離和回收效率的變化以及樣品中總RNA非特異性降解會(huì)影響到特定目標(biāo)mRNA的定量。為了解決此問(wèn)題，采用表達(dá)水平相對(duì)恒定的特定基因作為內(nèi)參對(duì)不同樣品和制備物中目標(biāo)mRNA定量ii行歸一化。涉及總體的和/或重要的細(xì)胞維持活動(dòng)的管家基因被用作此目的。這些活動(dòng)的例子有胞內(nèi)運(yùn)輸、總體代謝和蛋白質(zhì)合成。一些涉及這些過(guò)程的并被本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍用于歸一化的管家基因包括但不僅限于編碼hCDK4、p-肌動(dòng)蛋白、3-磷酸甘油搭脫氫酶和18S核糖體RNA的基因。使用上述方法對(duì)這些管家基因進(jìn)行定量。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)定量PCR測(cè)定18S核糖體RNA基因表達(dá)，其使用正向引物SEQIDNO:7和反向引物SEQIDNO:8，以及探針SEQIDNO:9。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)確定樣品中生物標(biāo)志物多肽的量來(lái)測(cè)量一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。可通過(guò)抗體檢測(cè)多肽，所述抗體是具有可檢測(cè)標(biāo)記的，或可以l^被標(biāo)記的?？梢圆捎枚喾N形式來(lái)確定樣品是否包含與給定抗體結(jié)合的目標(biāo)蛋白。可用于檢測(cè)生物標(biāo)志物的免疫檢測(cè)方法包括但不僅限于例如點(diǎn)印跡、western印跡、蛋白芯片、免疫沉淀(IP)、竟?fàn)幮院头蔷範(fàn)幮缘鞍捉Y(jié)合測(cè)定、酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)和其他一些常規(guī)使用并在科技文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)中廣泛描述的方法以及許多商業(yè)應(yīng)用的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以輕易調(diào)整已知的蛋白/抗刷會(huì)測(cè)方法以用于確定樣品中是否包含生物標(biāo)志物和樣品中該特定多肽表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)濃度或變體形式。可以釆用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)分離來(lái)自受試者的蛋白。所采用的蛋白分離方法包括但不僅限于，如Harlow&Lane，J/i說(shuō)wf/wJZfl6omto^jMflAiMtt/(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1988)中所述?？贵w可以用于下列方法以檢測(cè)表達(dá)的生物標(biāo)志物，所述方法包括但不僅限于如，western印跡或ELISA。在這些應(yīng)用中，可以將抗體或蛋白固定在固體支持物上。支持物或栽體包括任何能與抗原或抗體結(jié)合的支持物。/>知的支持物或載體包括但不僅限于例如，玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然的或<務(wù)飾的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長(zhǎng)巖和磁石。在一個(gè)實(shí)施方案中，western印跡可用于檢測(cè)生物標(biāo)志物。如本文所使用的，"western印跡"旨在包括基本蛋白檢測(cè)方法的所有變化。本領(lǐng)域中western印跡技術(shù)已非常成熟，其通常包括在變性或非變性條件下通過(guò)PAGE基于質(zhì)量進(jìn)行蛋白分離，及l(fā)^的檢測(cè)步驟。免疫熒光和酶免疫檢測(cè)(EIA)技術(shù)都已非常成熟。但是，也可使用其它的一些才艮告分子，其包括但不僅限于例如，放射性同位素、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光分子。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，如何改變所述過(guò)程使^it合所需的要求是顯而易見(jiàn)的。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，IP測(cè)定可以用于生物標(biāo)志物檢測(cè)。如本文所使用的，"免疫沉淀"或"IP"旨在包括基本蛋白檢測(cè)方法的所有變化。免疫沉淀技術(shù)已非常成熟，其通常包括采用特異或非特異的抗體4吏樣品中蛋白沉淀。f^可以通過(guò)SDS-PAGE分離沉淀的蛋白，接著是檢測(cè)步驟。但是，也可使用其它的報(bào)告分子，其包括但不僅限于例如，放射性同位素，化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光分子。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，如何改變所述過(guò)程使^it合所需應(yīng)用是顯而易見(jiàn)的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，存在4艮多變化的ELISA法和/或夾心ELISA法可用于本發(fā)明的方法和測(cè)定。如本文所使用的，"ELISA"旨在包括基本免疫吸附測(cè)定的所有變化。如本文所使用的，"夾心測(cè)定"旨在包括基本的雙位點(diǎn)免疫吸附結(jié)合技術(shù)的所有變化。在本領(lǐng)域中免疫熒光和EIA技術(shù)都已非常成熟。然而，也可使用其它的報(bào)告分子，其包括但不僅限于例如，放射性同位素、化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光分子。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，如何改變所述過(guò)程4吏之適合所需應(yīng)用是顯而易見(jiàn)的。B.iVW和5wfl//表達(dá)水平和參考水平的比較在另外一方面，本文提供了受試者樣品中P^和/或5附flW表達(dá)水平19與參考水平的比較。這些基因即為生物標(biāo)志物，也就是，與受試者相關(guān)的生物化學(xué)特征與方面，其可用來(lái)測(cè)量疾病J^A或衰退和/或治療效果。當(dāng)與參考水平相比較時(shí)，本文所述的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平可以與受試者發(fā)病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。因此，生物標(biāo)志物可以作為受試者患病或健康狀態(tài)的指示。帕金森病患者的i^7和/或5wmW表達(dá)特征鐠為確定患者中PD狀態(tài)提供了診斷工具。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者樣品中iVW和/或與參考水平相近的表達(dá)指示出受試者未患帕金森病。在另一實(shí)施方案中，受試者的樣品中i^W和/或5附flW的表達(dá)與參考水平的差異指示出受試者患有帕金森病或其嚴(yán)重程度。而在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)不同時(shí)間的和/或的表達(dá)與參考水平的比較來(lái)監(jiān)測(cè)帕金森病的iCA或衰退。可以釆用統(tǒng)計(jì)方法來(lái)設(shè)置閾值以確定何時(shí)可認(rèn)為受試者表達(dá)水平與參考水平有差異或相似。另外，統(tǒng)計(jì)方法可以用于確定患者所，見(jiàn)察到的基因表達(dá)水平和參考水平的差異或相似的有效性。有用的統(tǒng)計(jì)分析方法在L.D.Fisher&GlvanBelle,丑iVs她'幼'wJAfe幼0flto/(^)7幼e份a/幼5We"c^s(Wiley-lnterscience，NY，1993)中有描述。例如，置信度("/;")可以通過(guò)未成對(duì)雙側(cè)t檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算，如果p值小于或等于0.05,則認(rèn)為組間具有顯著性差異。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者7^^或必/^//表達(dá)水平與參考水平的比^A通過(guò)被稱作Man-WhitneyU檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)施的。II.治療方案和有效化合物篩選方法的選擇本文所述的方法可以用于帕金森病的預(yù)后、診斷、分級(jí)、治療以及選擇和/或篩選測(cè)試化合物。在一些實(shí)施方案中，這些方法可以用于監(jiān)測(cè)帕金森病的逸艮，選擇有效的特定治療，和/或篩選對(duì)帕金森病的治療和/或預(yù)防可能有治療或預(yù)防效果的化合物。因此，本文所描述的方法可以用于確定在采用特定治療方案和/或化合物后帕金森病是否存在。所述方法還可通過(guò)檢測(cè)生物標(biāo)志物監(jiān)測(cè)帕金森病治療或提前確定多種治療和/或化合物是否有效。由此，一些實(shí)施方案提供了用于確定受試者是否有帕金森病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、選擇臨床實(shí)驗(yàn)的受試者、檢測(cè)臨床效果和劃分受試者的預(yù)后或預(yù)測(cè)測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定可以以預(yù)后或預(yù)測(cè)為目的用于確定受試者是否具有發(fā)生帕金森病的風(fēng)險(xiǎn)，以及隨后任選地在受試者發(fā)病之前對(duì)其實(shí)施預(yù)防性治療。此外，本文所述的預(yù)后測(cè)定可以用于確定受試者是否可作為臨床試驗(yàn)的可能候選，其中可以確定所施用的帕金森病治療是否有效。例如，這些方法可用于確定受試者是否可以用影響時(shí)鐘基因(例如但不僅限于iVW和5mfl/7)晝夜節(jié)律表達(dá)的化合物來(lái)有效治療帕金森病。因此，本發(fā)明提供了用于確定受試者是否可以用針對(duì)PD的化合物有效治療的方法，其中獲得測(cè)試樣品并將本文所述的生物標(biāo)志物與參考水平相比較(例如，其中受試者iVW或5wfl〃表達(dá)水平的升高或降低是施用所述化合物預(yù)防和/或治療帕金森病的診斷依據(jù))。因此，可以在臨床試驗(yàn)前根據(jù)本文所述的診斷測(cè)定結(jié)果對(duì)受試者進(jìn)行分類。對(duì)此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供的化合物可用于篩選其中有效治療帕金森病的，其中受試者分類可以在得到治療/臨床試驗(yàn)結(jié)果后重新評(píng)估。帕金森病患者通常經(jīng)受著多種睡眠紊亂，導(dǎo)致了夜間睡眠異常。因此，一方面，本方法包括測(cè)量在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)處尸eW和/或5/iwiW的表達(dá)水平，所述時(shí)間點(diǎn)包括至少一個(gè)處于晝夜循環(huán)中夜間部分的時(shí)間點(diǎn)。如上所討論的，帕金森病患者晝夜節(jié)律發(fā)生改變，可以通過(guò)監(jiān)測(cè)和/或5附flW表a測(cè)這些改變。實(shí)施例1報(bào)道了帕金森病患者和健康對(duì)照中這兩個(gè)基因的夜間表達(dá)水平。在帕金森病患者和健康對(duì)照中，/^/的表M21:00到06:00整個(gè)夜間一直增加。但是，盡管帕金森病患者的戶eW表達(dá)水平在09:00繼續(xù)增加，而健康對(duì)照的表達(dá)水平在此時(shí)間點(diǎn)時(shí)下降。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，iVW的表ii^式可以作為受試者患有帕金森病或其分級(jí)的指示，相比健康對(duì)照在所a&漠式中i^W的表ii^09:00時(shí)增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)樣品取自約23:00到約09:00。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)選自20:00到22:00、23:00到01:00、05:00到07:00和08:00到10:00。在另外一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)選自約21:00、約00:00、約06:00以及約09:00。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處的或5mflW表達(dá)可用于確定受試者是否患有帕金森病或其分級(jí)。觀察到特定時(shí)間點(diǎn)的和表^健康受試者和帕金森病患者之間是不同的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在以下至少一個(gè)時(shí)間受試者5wflW的表達(dá)水平相對(duì)于參考水平下降可以指示出受試者患有帕金森病或其分級(jí)，所述時(shí)間為約21:00、約00:00或約06:00。另外，可以通過(guò)在兩個(gè)或更多時(shí)間點(diǎn)測(cè)量戶eW或5waW的表達(dá)水平以及比較測(cè)量結(jié)果來(lái)確定尸eW或5附flW的表i^漠式。已在帕金森病患者中觀察到這些時(shí)鐘基因表i^式相對(duì)于健康對(duì)照受試者的差異。在一個(gè)實(shí)施方案中，在約21:00和約00:00時(shí)比約06:00和約09:00時(shí)務(wù)f氐的/VW表ii^式指示出受試者患有帕金森病。在所述方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，在約21:00和約09:00時(shí)比約00:00和約06:00時(shí)要高的iVW表ii^式指示出受試者未患帕金森病。為了推導(dǎo)對(duì)治療的臨床響應(yīng)與特定生物標(biāo)志物水平之間的相關(guān)性，需要獲取接受治療的受試者幹沐(即臨^#^)的臨床響應(yīng)教:據(jù)。可以通過(guò)對(duì)臨床試驗(yàn)結(jié)果的回顧性分析得到這些臨床數(shù)據(jù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)設(shè)計(jì)并實(shí)施一個(gè)或多個(gè)新的臨床試驗(yàn)得到所述臨床數(shù)據(jù)。臨M體數(shù)據(jù)分析可用于定義標(biāo)準(zhǔn)參考幹沐，接著可用于以參與臨床試驗(yàn)和選擇治療方案為目的將受試者分類。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)臨M體中的受試者針對(duì)帕金森病的存在進(jìn)行分級(jí)。對(duì)潛在受試者的分級(jí)包括但不僅限于例如Hoehn&Yahr分級(jí)法或UPDRS得分分析并隨后確定臨^M^中生物標(biāo)志物水平相對(duì)于對(duì)照群體升高或降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)受試者中一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志物(例如，iVW或5/ifflW的表達(dá))的測(cè)量水平和標(biāo)準(zhǔn)參考群體中所觀察的相同生物標(biāo)志物水平的相似性，可以將其劃分或分配為特定的組或類。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將感興趣的治療方案施加于實(shí)驗(yàn)群體中每個(gè)受試者，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量每個(gè)受試者對(duì)治療的反應(yīng)(即治療的效力)。在許多情況下，預(yù)期試驗(yàn)群體會(huì)表現(xiàn)出一系列的響應(yīng)，研究人員將選擇由多種響應(yīng)組成的響應(yīng)者分組的數(shù)目(例如高、中、低)。另外，對(duì)生物標(biāo)志物(如i^rJ或5附fl/7)的表達(dá)水平進(jìn)行定量，這可以在治療前和/或后實(shí)施。接下來(lái)對(duì)這些結(jié)果進(jìn)行分析以確定是否組之間觀察到的任何臨床響應(yīng)(即療效)改變是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。可用的統(tǒng)計(jì)分析方法在Fisher&vanBdle,歷os她'幼'csvJAfe幼o(hù)rf^^v幼e份"欣5Wewces(Wiley畫(huà)lnterscience，NY，1993)中有描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以建立數(shù)學(xué)模型以預(yù)測(cè)作為上述分析中生物標(biāo)志物表達(dá)水平函數(shù)的臨床響應(yīng)或帕金森病分級(jí)。臨床響應(yīng)和生物標(biāo)志物表達(dá)水平之間相關(guān)性的鑒定可以作為設(shè)計(jì)診斷方法的基礎(chǔ)，所述診斷方法用以確定受試者是否對(duì)治療有響應(yīng)，或者以較低水平響應(yīng)由此可能需要更多的治療(例如更大劑量的化合物、藥物或治療)。所述診斷方法可以采取幾種以下數(shù)種形式之一，例如但不僅限于，如印跡方法、定量PCR、微陣列實(shí)驗(yàn)、SAGE分析或EST分析。唯一的要求是診斷測(cè)試結(jié)果和潛在的帕金森病之間具有相關(guān)性。在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷方法釆用TaqmanPCR來(lái)確定如上所述的iVW和/或的表達(dá)水平和表ii^式。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志物的表達(dá)水平相關(guān)于帕金森病分級(jí)?？梢酝ㄟ^(guò)基于Hoehn&Yahr量表對(duì)患者進(jìn)行分類實(shí)施帕金森病的進(jìn)行性監(jiān)測(cè)，所述量表將其分為五個(gè)不同的分級(jí)。每個(gè)分級(jí)描述了與帕金森病相關(guān)的癥狀和臨M現(xiàn)。所述分級(jí)由以下組成(l)只有身體一側(cè)有癥狀；(2)身體兩側(cè)都有癥狀但平衡能力沒(méi)有被破壞；(3)輕度至中度的平衡能力破壞但患者身體獨(dú)立；(4)患者嚴(yán)重殘疾，但患者仍可以在無(wú)幫助情況下行走或站立；(5)患者在無(wú)幫助情況下只能坐在輪椅上或臥床。參見(jiàn)Hoehn&Yahr，7V^w/<^.17:427-442(1967)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，帕金森病綜合評(píng)分量表(UPDRS)可以根據(jù)臨M現(xiàn)將患者劃分為四個(gè)不同分級(jí)，以用于監(jiān)測(cè)帕金森病的;SOL每個(gè)分級(jí)用5分制評(píng)分，其對(duì)帕金森病的臨M現(xiàn)排序。組成每個(gè)分級(jí)的癥狀涉及(l)精神狀態(tài)、行為和情緒方面，其中對(duì)智力損傷、思維混亂、動(dòng)*主動(dòng)性和抑郁進(jìn)M價(jià)；(2)日常生活行為方面，其中對(duì)語(yǔ)言、流涎、吞咽、書(shū)寫(xiě)、切割食物、穿衣、衛(wèi)生、在床上翻身、摔倒、靜止、行走、震顫和感覺(jué)疾病進(jìn)#^價(jià)；(3)運(yùn)動(dòng)檢查方面，其中對(duì)語(yǔ)言、面部表情、靜止時(shí)震顫、行動(dòng)震顫、強(qiáng)直、手指拍打、手部移動(dòng)、手部翻轉(zhuǎn)、腿部靈活性、從椅子中站起、姿勢(shì)、步態(tài)、姿勢(shì)穩(wěn)定性和身體運(yùn)動(dòng)i^進(jìn)行評(píng)價(jià)；(4)治療并發(fā)癥方面，其中對(duì)運(yùn)動(dòng)功能障礙持續(xù)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)功能障礙程度、運(yùn)動(dòng)功能障礙的疼痛、凌晨肌張力障礙、關(guān)-可預(yù)測(cè)(offs-predictable)、關(guān)-不可預(yù)測(cè)(offs-unpredictable)、關(guān)-突然(offs-sudden)、關(guān)-長(zhǎng)期(offs-duration)、厭食、惡心、嘔吐、睡眠障礙以及有癥狀的姿勢(shì)性低血壓進(jìn)^if價(jià)。參見(jiàn)RascolW/，359:1589-1598(2002)。睡眠紊亂在帕金森病患者中有許多才艮道，Young"fl/.，Sleep25:573-577(2002)。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)(PSQI)對(duì)帕金森病患者睡眠質(zhì)量進(jìn)行分級(jí)。PSQI評(píng)價(jià)一個(gè)月時(shí)間間隔的睡眠質(zhì)量，它基于十九個(gè)單項(xiàng)，得到七個(gè)部分的評(píng)分主觀睡眠質(zhì)量、入睡潛伏期、睡眠時(shí)間、習(xí)慣睡眠效率、睡眠障礙、睡眠藥物的4吏用以及日間功能障礙。BuysseWfl/"iVcAiWo;i^s28:193-213(1989)。因此，所公開(kāi)生物標(biāo)志物的表達(dá)水平可與Hoehn&Yahr和/或UPDRS分^目關(guān)，或者與PSQI相關(guān)，以用于帕金森病的預(yù)后、診斷、治療選擇、監(jiān)測(cè)和/或治療化合物的篩選。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法可以用于表征兩個(gè)變量之間的相關(guān)性程度，例如，帕金森病嚴(yán)重程度或睡眠質(zhì)量與戶^/或5附flW表達(dá)之間?？偟膩?lái)說(shuō)，相關(guān)性是指兩個(gè)獨(dú)立變量之間的偏離，可以計(jì)算得到幾個(gè)衡量相關(guān)性程度的系數(shù)。盡管可以在不同的情況下使用許多不同系數(shù)，最著名的Pearson積矩相關(guān)系ltA通過(guò)兩個(gè)變量的協(xié)方差除以它們的標(biāo)準(zhǔn)偏差的乘積得到的。在本方法的一個(gè)實(shí)施方案中，確定受試者是否患有帕金森病或其分級(jí)的步驟是通過(guò)對(duì)Hoehn&Yahr分級(jí)系統(tǒng)所確定分級(jí)和受試者或5w"W的表達(dá)水平與參考水平相比的差異之間實(shí)施pearson相關(guān)性分析得到的。在一個(gè)實(shí)施方案中，以這些測(cè)定和指示因素為指導(dǎo)，感興趣的治療性或預(yù)防性治療可以選自蛋白質(zhì)、多肽、肽、核酸、病毒、病毒樣核酸、M酸類似物、經(jīng)修飾氨基酸、經(jīng)修飾氨基酸類似物、類固醇、蛋白多糖、脂類和碳水化合物，或其組合(例如包含蛋白質(zhì)和DNA組分的治療或者一對(duì)或一組治療，其中一個(gè)或多個(gè)成分將其它成分轉(zhuǎn)化為活性形式，例如通過(guò)催化)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療性或預(yù)防性治療可包括核酸，其包括但不限于例如，寡核普酸或經(jīng)修飾寡核苷酸、反義l^核苷酸或經(jīng)^務(wù)飾反義寡核苷酸、核酸適體(aptamer)、cDNA、基因組DNA、人工或天然染色體(例如，酵母人工染^體)或其一部分、RNA(包括siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、ncRNA、rRNA)或核酶；肽核酸(peptidenuleicacid,PNA)或鎖核酸(lockednucleicacid,LNA);病毒或病毒樣顆粒；核苷酸或核糖核苷酸或其合成類似物，它們可以是經(jīng)修飾的或未經(jīng)修飾的。所述治療還可以是M酸或其類似物，其可以是經(jīng)修飾的或未經(jīng)修飾的或非肽類(如膽固醇)激素；蛋白多糖；脂類；或碳水化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，還可以使用小分子，其包括無(wú)機(jī)和有機(jī)物質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述小分子是藥物活性劑?？捎玫乃幬锘钚詣┓N類包括但不僅限于例如，抗生素、抗炎藥物、血管生成或血管活性劑、生長(zhǎng)因子和化療劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，感興趣的治療性或預(yù)防性治療可選自包含PD藥物的組，所述PD藥物包括但不僅限于例如，左旋多巴、COMT抑制劑、恩他卡朋、托卡朋、多巴胺激動(dòng)劑、溴隱亭、普拉克索、羅匹尼羅、阿樸嗎啡金剛烷胺、抗M、甲磺酸節(jié)托品、丙環(huán)啶、比哌立登、和/或司立吉林。在另一個(gè)實(shí)施方案中，感興趣的治療性或預(yù)防性治療實(shí)際上可以是手術(shù)，其過(guò)程可以任選地選自蒼白球切開(kāi)術(shù)、丘腦切開(kāi)術(shù)、丘腦刺激、神經(jīng)組織移植和/或深度腦刺激(de印brainstimulation,DBS)。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定來(lái)源于受試者的測(cè)試樣品中i^W或在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)處的表達(dá)水平，并將其與來(lái)源于受試者的測(cè)試樣品在后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)處生物標(biāo)志物的水平相比較。來(lái)源于受試者的測(cè)試樣品在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)處生物標(biāo)志物的表達(dá)水平可以與來(lái)源于受試者的測(cè)試樣品在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)處的生物標(biāo)志物的水平相比較，其中生物標(biāo)志物在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)和第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)處表達(dá)水平的差異指示出需要帕金森病治療的受試者?；蛘?，生物標(biāo)志物在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)和第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)處表達(dá)水平的差異指示出對(duì)帕金森病治療有反應(yīng)的受試者。受試者中生物標(biāo)志物的水平可以進(jìn)一步與Hoehn&Yahr和/或UPDRS分級(jí)或與PSQI相關(guān)聯(lián)?？赡苄枰M(jìn)一步的測(cè)試以做出陽(yáng)性診斷。本文還包括監(jiān)測(cè)患者帕金森病逸艮的方法，其是出于選擇治療方案和/或篩選有用化合物的目的，其中測(cè)定來(lái)源于受試者的測(cè)試樣品中生物標(biāo)志物在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平(例如，i>^7或5附"W表達(dá)的升高或降低)，并將其與來(lái)源于受試者的測(cè)試樣品中生物標(biāo)志物在后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)處的水平相比較。來(lái)源于受試者的測(cè)試樣品中生物標(biāo)志物在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)處的表達(dá)水平可以與來(lái)源于受試者的測(cè)試樣品中生物標(biāo)志物在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)處的水平相比較，其中生物標(biāo)志物在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)和第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)處的表達(dá)水平的改善(即，向與參考水平更相似的水平變化)指示出有效的帕金森病治療或化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以輕易的理解用于選擇治療方案和/或篩選有用化合物的方法。有多種方法可被用于上述帕金森病的診斷性或預(yù)后性評(píng)價(jià)，包括尸er/或和本文所述的所有生物標(biāo)志物，以及受試者是否易患這些疾病的鑒別/治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)測(cè)量不同對(duì)照群組的表達(dá)水平確定iVW或表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。接著將參考水平與本文所述的給定受試者的生物標(biāo)志物的測(cè)量水平相比較。根據(jù)測(cè)量水平與給定組對(duì)照水平相比的相似度，可以將受試者劃分或分配為特定的組。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，做出這種測(cè)定具有某種程度上的不確定性。因此，對(duì)照組表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)偏差可以用于做出概率性判定，本文的方法在寬范圍的基于概率的基因型或表型組判定中都適用。因此，例如，但不僅限于，在一個(gè)實(shí)施方案中，如果生物標(biāo)志物的測(cè)量水平落入任意對(duì)照組平均值的2.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差以內(nèi)，則受試者可以被分配到該組中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如果生物標(biāo)志物的測(cè)量水平落入任意對(duì)照組平均值的2.0個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差以內(nèi)，則受試者可以被分配到該組中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如果生物標(biāo)志物的測(cè)量水平落入任意對(duì)照組平均值的1.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差以內(nèi)，則受試者可以被分配到該組中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如果生物標(biāo)志物的測(cè)量水平落入任意對(duì)照組平均值的l.O個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差以內(nèi)，則受試者可以被分配到該組中。因此，該過(guò)程允許在多種概率度下做出判定，將特定受試者分配至應(yīng)該處于的組內(nèi)，并且這種分配接著會(huì)將風(fēng)險(xiǎn)分類確定至個(gè)體應(yīng)該處于的^i置。IV.PD診斷試劑盒在另一方面，本文提供可用于確定受試者中PD預(yù)后、診斷或監(jiān)測(cè)受試者中PD的檢測(cè)試劑盒。該試劑盒還可用于劃分選來(lái)進(jìn)行臨床試驗(yàn)的受試者。具體而言，本發(fā)明包括用于測(cè)量樣品中一個(gè)或多個(gè)時(shí)鐘基因表達(dá)的試劑盒。例如，該試劑盒可以包含一個(gè)能夠檢測(cè)樣品中時(shí)鐘基因表達(dá)的標(biāo)記的化合物或試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)使用預(yù)先包裝的包含實(shí)施本發(fā)明任意方法所需試刑的診斷試劑盒實(shí)施本文所述的方法。例如，這類試劑盒可包含用于測(cè)量樣品中尸eW和/或5wflW水平的檢測(cè)試劑。在這類試劑盒的一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)試劑是用于RT-PCR檢測(cè)尸eW或5附fl/7的mRNA所需的PCR引物和熒光標(biāo)記探針?？梢暂p易的合成PCR引物并在多種制劑中穩(wěn)定M4艮長(zhǎng)一段時(shí)間，特別是以凍干或其他干燥方式下得到的粉末形式。在這種形式下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使其輕易地復(fù)原。打算使用該試劑盒的耗品。該試劑盒還可包含本發(fā)明方法中有用的酶和緩沖液。該試劑盒可以包含試劑4吏用和結(jié)果分析的使用說(shuō)明。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所提供的試劑盒包含至少一個(gè)用作對(duì)照的樣品，其包裝在一個(gè)或多個(gè)小瓶中。該試劑盒的每個(gè)組分可以裝在單獨(dú)的容器中，所有的容器可以裝在單個(gè)包裝中，并附以分析試劑盒測(cè)定結(jié)果的說(shuō)明。實(shí)施例通過(guò)下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本文，但并不以任何方式構(gòu)成限制。在下文描述本節(jié)出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)的方法。方法愛(ài)試者。在征得同意后，招募了十七位神經(jīng)學(xué)家認(rèn)為的帕金森病患者。運(yùn)動(dòng)障礙專家確認(rèn)了對(duì)所有患者的初發(fā)性帕金森病的臨床診斷。病情嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)采用帕金森病綜合評(píng)分量表(UPDRS)和Hoehn&Yahr分級(jí)系統(tǒng)。參見(jiàn)及e"",Deve/o/;艦/^/"戶fl,A:/"so"，s"/s^"5^.MacMillanHealthCareInformation,FlorhamPark,NJ;1987:153-163;Hoehn&Yahr，7Ve"ra/<^v17:427-442(1967)。睡眠質(zhì)量通過(guò)匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)(PSQI)確定。Buysse,""/，i^yc/^Wij及m28:193-213(1989)。從當(dāng)?shù)厣鐓^(qū)招募了十六位性別年齡匹配的健康的非帕金森病對(duì)照。帕金森病患者的平均年齡為62.2±2.8歲，健^照的為57.8±1.1歲。在研究期間，所有的受試者一日三餐常規(guī)飲食，飲食時(shí)間平均分別在07:00到08:00之間，11:30到12:30之間，和19:00左右進(jìn)行。被研究的受試者通常在22:00左右睡覺(jué)，約06:30起床。他們?cè)趯?shí)驗(yàn)前一周以及實(shí)驗(yàn)期間不飲酒或咖啡因。血液樣品分別在十二個(gè)小時(shí)周期內(nèi)的21:00、00:00、06:00和09:00時(shí)采集。所有受試者繼續(xù)其日常生活，除了在睡眠障礙實(shí)驗(yàn)室過(guò)27夜睡眠以進(jìn)行血液取樣。實(shí)驗(yàn)室照明在睡眠期間維持在低于10lux的水平，室溫整夜維持在23±1°C。J&淡^冷勿應(yīng)W浙務(wù)。在肘前靜脈血管內(nèi)插入內(nèi)置導(dǎo)管十二小時(shí)，將血液樣品在每個(gè)設(shè)定時(shí)間時(shí)收集到PAX基因血液RNA試管中(Qiagen，Alameda，CA)。^RA^新務(wù)、逆脊求;^,)^PO根據(jù)PAX基因血液RNA試劑盒的說(shuō)明手冊(cè)分離樣品中的總RNA，接著進(jìn)行RQ1無(wú)RNA酶的DNA酶I(Promega，SanLuisObispo，CA)處理以除去可能的基因組DNA污染。通過(guò)SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，Carlsbad,CA)合成cDNA。/^r/,必/imW和18S核糖體RNA基因的表達(dá)水平通過(guò)TaqMan定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)確定。擴(kuò)增引物和探針從Sangon，Inc.(Shanghai,China)訂購(gòu)。引物和探針對(duì)設(shè)計(jì)如下對(duì)于戶er7(正向5'-TTCCTGACGGGCCGAAT-3'(SEQIDNO:1);反向5'-CGCTTGCAACGCAGCA誦3'(SEQIDNO:2);TaqMan探針5'-FAM陽(yáng)TCTACATTTCGGAGCAGGCAGCCG國(guó)Tamra-3，(SEQIDNO:5))，對(duì)于5附fl/J，(正向5'國(guó)CTCCAGCCCATTGAACATC-3'(SEQIDNO:3);反向5'隱GCCTCATCATTACTGGGACT誦3'(SEQIDNO:4);TaqMan探針5'-FAM-CTCCCCCTGATGCCTCTTCTCC-Tamra-3'(SEQIDNO:6))，以及對(duì)于18S基因，(正向5'糊TTCGGAACTGAGGCCATGAT-3'(SEQIDNO:7);反向5'-TTTCGCTCTGGTCCGTCTTG-3'(SEQIDNO:8);TaqMan探針5'-FAM-CTCTAGCGGCGCAATACGAATGC-Tamra國(guó)3'(SEQIDNO:9))。鍵#為>#。戶w7和5wflW表達(dá)定義為每個(gè)血液樣品相應(yīng)的mRNA與18S基因mRNA的比值。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。采用獨(dú)立樣品的雙側(cè)t檢驗(yàn)進(jìn)行同一時(shí)間點(diǎn)處兩組中/VW和相對(duì)豐度的比較。帕金森病患者和對(duì)照受試者中iVW和必ww/7mRNA的相對(duì)豐度也都標(biāo)準(zhǔn)化為個(gè)體平均值的百分?jǐn)?shù)并通過(guò)組結(jié)合。采用單向ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化以檢驗(yàn)12小時(shí)采樣周期內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間的差異，其可指示出時(shí)間依賴性。采用雙側(cè)Pearson's相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)i^W和丑附fl/7相對(duì)表達(dá)水平與帕金森病嚴(yán)重程度以及睡眠質(zhì)量度量的相關(guān)性。如果p^0.05，任何差異都i/w為具有統(tǒng)計(jì)顯著性，或如果0.05<p50.10，則具有邊界顯著性。實(shí)施例1在此實(shí)驗(yàn)中研究了十七位帕金森病患者(9男；8女)，以及十六位年齡匹配的對(duì)照(9男；7女)。在十二小時(shí)周期內(nèi)的21:00,00:00,06:00和09:00時(shí)從帕金森病患者和對(duì)照身上采集血樣。制備總RNA,采用上述的引物和探針通過(guò)TaqMan定量實(shí)時(shí)RT-PCR對(duì)尸w7、"m"W以及18S核糖體RNA基因定量。數(shù)據(jù)結(jié)果呈現(xiàn)在下面表l中。表i.外周白細(xì)胞中時(shí)鐘基因表達(dá)與時(shí)間的關(guān)系帕金森病患者對(duì)照基因時(shí)間N平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差N平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差/值21:001216±132161340±1250.50100:001738±238161788±2470.88406:002592±353163107±5210.41509:002999±42662198±2250,291682136±173542091±1980.74321:004349±8031610034±16310.00300:005944±10701619620±48490.00806:003732±6541612872±27680.00209:008175±147469759±23870.585詐685550±5535413685±17卯0.002將尸^和必mfl/7的平均豐度相對(duì)于18S核糖體RNA基因表達(dá)進(jìn)行歸一化。值由未成對(duì)雙側(cè)t檢^i十算得到，如果S0.05則表示組間差異顯著。在十二小時(shí)時(shí)間間隔的研究中，通過(guò)ANOVA觀察到顯著的時(shí)間依賴性。在健康對(duì)照和帕金森病患者的中觀察到的ANOVA/;值小于0.001,在帕金森病患者5附flW中觀察到的ANOVAp值小于0.001，而對(duì)29照的則小于0.017。在帕金森病患者和健康對(duì)照中，戶"2的表達(dá)在夜間從21:00到06:00—直升高。然而，盡管帕金森病患者的尸eW表達(dá)水平在09:00繼續(xù)升高，而健康對(duì)照的則在此時(shí)下降。因此，i^W和5附fl/7是帕金森病生物標(biāo)志物，測(cè)量這些生物標(biāo)志物的表達(dá)可用于診斷和監(jiān)測(cè)受試者帕金森病的方法。實(shí)施例2通過(guò)統(tǒng)計(jì)方法分析來(lái)自實(shí)施例1的數(shù)據(jù)。帕金森病患者的嚴(yán)重程度用Hoehn&Yahr分級(jí)系統(tǒng)或UPDRS量^^示。平均Hoehn&Yahr分級(jí)為2.0±0.2(范圍1到4)，平均UPDRS得分為28.3±4.5(范圍8到70)。使用統(tǒng)計(jì)分析確定i^r和5wfl/的表達(dá)(上述)和帕金森病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。#4&Hoehn&Yahr或UPDRS評(píng)分在21:00、00:00和06:00顯示的結(jié)果將帕金森病患者進(jìn)一步分組，無(wú)論帕金森病嚴(yán)重程度如何患者的5附"W表ii4fP低于對(duì)照組。09:00時(shí)，UPDRS得分小于20的帕金森病患者的丑/wfl/7豐度較低，其中在UPDRS表，20是被選為區(qū)分嚴(yán)重病例(>20)和非嚴(yán)重病例(S20)的切斷值。帕金森病患者的/VW表達(dá)水平在00:00,06:00和總體時(shí)間內(nèi)與UPDRS得分相關(guān)，丑wfl/2表達(dá)水平在06:00，09:00和總體時(shí)間內(nèi)與UPDRS得分相關(guān)。/Vi7基因表達(dá)和Hoehn&Yahr量表的帕金森病嚴(yán)重程度的相關(guān)性在00:00時(shí)和總體時(shí)間內(nèi)具有顯著性，而^w"W基因表達(dá)與之的相關(guān)性在09:00和總體時(shí)間內(nèi)具有顯著性。因此，測(cè)量i^W和等生物標(biāo)志物的表達(dá)可用于確定受試者帕金森病分級(jí)的方法。表2.外周白細(xì)胞中Bmall的表達(dá)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>在上面的表格中，將5wflW的平均豐度相對(duì)于18S核糖體RNA基因的表達(dá)進(jìn)行歸一化。疾病嚴(yán)重程度采用帕金森病綜合評(píng)分量表(UPDRS)和Hoehn&Yahr分級(jí)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。/;值通過(guò)未成對(duì)雙側(cè)t檢驗(yàn)計(jì)算得到。如果p^0.05，則組間差異認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)顯著性；如果0.05<p￡0.10，則具有邊界顯著性。實(shí)施例3在睡目M^量和5附"W表W目關(guān)性實(shí)驗(yàn)中研究了十七位帕金森病患者(9男8女)，以及十六位年齡匹配的對(duì)照(9男7女)。釆用匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)(PSQI)確定睡眠質(zhì)量，它是用來(lái)測(cè)量老年人睡眠的質(zhì)量和模式。通過(guò)對(duì)七個(gè)方面的測(cè)量來(lái)區(qū)分睡眠的"好"和"壞"一個(gè)月中的主觀睡眠質(zhì)量、入睡潛伏期、睡眠時(shí)間、習(xí)慣睡眠效率、睡眠功能障礙、睡眠藥物的使用以及日間功能障礙。帕金森病患者PSQI的平均得分為6.4±1.2(范圍1到17)，健康對(duì)照的平均得分為3.8士0.5(范圍1到10)，從而導(dǎo)致他們睡眠質(zhì)量具有邊界顯著差異(p=0.069)。帕金森病患者和健康對(duì)照的外周白細(xì)胞丑/miW表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)平均值通過(guò)睡B民質(zhì)量進(jìn)一步分組。表3.歸一化的5waW表達(dá)時(shí)間組別PSQI亞組21:00C所有(C1)c好(C2)帕金森病所有帕金森病好帕金森病壞00:00c所有(C1)c好(C2)帕金森病所有帕金森病好帕金森病壞06:00c所有(Cl)c好(C2)帕金森病所有帕金森病好帕金森病壞09:00c所有(Cl)c好(C2)帕金森病所有帕金森病好帕金森病壞N平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差p值(vsCl)p值(vsC2)1610034±1631--1210076±20820.987-174349±8030.0030.0084383±10510.0400.064104236±11970.0190.0351619620±4849--1219600±64280.998-175944±10700.0140.0594421±17140.0560.041107011±13340.0220.0791612872±2768--1212928±34880.9卯-173732±6540.0050.0053122±11120.0340.052104159±8170.0230.03669759±2387--47149±10580.424-178175±14740.5850.58075514±23670.2350.6321010038±17350.9250.336通過(guò)匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)(PSQI)測(cè)量睡眠質(zhì)量。通過(guò)未成對(duì)雙側(cè)t檢驗(yàn)計(jì)算得到/;值。則認(rèn)為對(duì)照組C1或C2間差異具有統(tǒng)計(jì)顯著性；如果0.05</^0.10，則具有邊界顯著性。在21:00,00:00，和06:00時(shí)，與所有對(duì)照和正常睡眠對(duì)照相比，觀察到正常睡眠(PSQI<5)和劣質(zhì)睡眠(PSQI^5)的帕金森病患者的WwaW表達(dá)下降。09:00時(shí)沒(méi)有觀察到顯著性差異。在任何時(shí)間點(diǎn)都^ML現(xiàn)帕金森病組內(nèi)正常和劣質(zhì)睡眠者的5挑fl/7水平有統(tǒng)計(jì)性差異(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)分析帕金森病嚴(yán)重程度或睡眠質(zhì)量與時(shí)鐘基因(/VW或AwflW)表達(dá)的相關(guān)性。帕金森病患者和對(duì)照組在單一時(shí)間點(diǎn)處的和5附"W的表i^it過(guò)UPDRS，Hoehn&Yahr評(píng)分法和PSQI評(píng)分法評(píng)價(jià)。數(shù)據(jù)在表4中顯示。表4.疾病嚴(yán)重程度或睡眠質(zhì)重和時(shí)鐘基因表達(dá)的相關(guān)性Pearson相關(guān)性組別變量l變重2戶值帕金森病UPDRS00:00處尸eW0.5930.012帕金森病UPDRS06:00處PeW0.5000.041帕金森病UPDRSPeW(全部的平均值)0.5040.039帕金森病UPDRS06:00處5附aW0.6270.007帕金森病UPDRS09:00處B/naW0.5760.015帕金森病UPDRS5maW(^P的平均值)0.5980.011帕金森病HY00:00處戶eW0.5880.013帕金森病HYPeW(4^P的平均值)0.4940.044帕金森病HY09:00的0.4840,049帕金森病PSQIHY0.7350.001帕金森病PSQIUPDRS0.7370.001帕金森病PSQI00:00處戶e/70.5400.025cPS(JI00:00處PeW0.1660.539帕金森病PSQI06:00處B鵬W0.5420.025cPS(JI06:00處5附"-0.0120.964將和i^/的表W目對(duì)于18S核糖體RNA的基因表達(dá)進(jìn)行歸一化。采用帕金森病綜合評(píng)分量表(UPDRS)或Hoehn&Yahr(HY)分級(jí)33系統(tǒng)評(píng)價(jià)疾病嚴(yán)重程度。睡眠質(zhì)量通過(guò)PSQI進(jìn)行分類。通過(guò)線性回歸分析計(jì)算R2和/;值，如果/;^0.05則具有組間顯著相關(guān)性。兩個(gè)獨(dú)立的帕金森病嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)方法(Hoehn&Yahr和UPDRS)之間有很強(qiáng)的聯(lián)系，其/1<0.001。特別是，帕金森病患者時(shí)鐘基因戶^的表達(dá)水平在00:00、06:00和整體時(shí)間時(shí)與UPDRS得分相關(guān)，丑附"/7的表達(dá)水平在06:00、09:00和整體時(shí)間時(shí)與UPDRS的得分相關(guān)。i^W時(shí)鐘基因表達(dá)與Hoehn&Yahr分級(jí)只在00:00時(shí)和整體時(shí)間時(shí)具有顯著相關(guān)性，對(duì)于5附tfW在09:00時(shí)具有顯著相關(guān)性。另外，不論采用哪種帕金森病嚴(yán)重程度的評(píng)價(jià)方法，睡眠質(zhì)量隨著帕金森病的iOl也會(huì)惡化。帕金森病患者中在00:00和06:00時(shí)，無(wú)論/^i還是5附aW的表達(dá)都與PSQI得分正相關(guān)。在對(duì)照受試者中未觀察到相關(guān)性。因此，測(cè)量戶eW々5/Wfl//等生物標(biāo)志物的表達(dá)可用于確定受試者中PD狀態(tài)的方法。等同方案本發(fā)明不僅限于本申請(qǐng)中所述的具體實(shí)施方案。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，可以進(jìn)fri午多修改和改變，而不偏離其構(gòu)思和范圍。結(jié)合上文的描述，本發(fā)明范圍內(nèi)除本文所列舉以外的功能等同的實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是很明顯的。這些修改和改變旨在與權(quán)利要求書(shū)所述等同方案的完整范圍一起落入權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不受限于具體的方法、試劑、化合物組合物或生物體系，它們當(dāng)然是可以變化的。還應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述具體的實(shí)施方案，而不旨在限制。另外，當(dāng)以馬庫(kù)什組的形式描述本發(fā)明的特征或方面時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明白，本發(fā)明還就該馬庫(kù)什組的任何個(gè)體成員或成員亞組而言進(jìn)行了描述。就像本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的那樣，對(duì)于任何及全部目的，特別是就提供書(shū)面描述而言，本文公開(kāi)的所有范圍還包括任何及全部可能的子界及其子界的組合。任何列出的范圍可以很容易地認(rèn)為是對(duì)同一范圍分成相等的至少兩部分、三部分、四部分、五部分、十部分等而進(jìn)行了描述。作為非限制性的實(shí)例，每個(gè)本文討論過(guò)的范圍可以容易地分為前三分之一、中間三分之一和后三分之一等。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)理解，詞語(yǔ)例如"多至"、"至少"、"多于"、"少于"等包括所提到的數(shù)值，并指可以如上所述分成子界的范圍。最后，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，范圍包括每個(gè)個(gè)體成員。因此，例如，含有1-3個(gè)細(xì)胞的組是指含有1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)細(xì)胞的組。類似的，含有1-5個(gè)細(xì)胞的組是指含有1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)細(xì)胞的組，依此類推。盡管本文公開(kāi)了多個(gè)方面和實(shí)施方案，但其他方面和實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)也是顯而易見(jiàn)的。本文z〉開(kāi)的多個(gè)方面和實(shí)施方案用于說(shuō)明目的而非限制，真正的范圍和構(gòu)思由以下的權(quán)利要求進(jìn)行說(shuō)明。權(quán)利要求1.一種或多種測(cè)量受試者樣品中Bmal1或Per1表達(dá)水平的檢測(cè)試劑用于制備診斷或監(jiān)測(cè)帕金森病的藥劑中的用途。2.權(quán)利要求l的用途，其中(a)所述一種或多種測(cè)量受試者樣品中5wflW或表達(dá)水平的檢測(cè)試劑確定在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)取自受試者的樣品中或戶eW的表達(dá)水平；和(b)將所述樣品中丑附"W或i^W表達(dá)水平和或/V〃表達(dá)的參考水平進(jìn)行比較；其中所述樣品中必附a/7或尸eW表達(dá)水平和參考水平的差異指示出受試者患有帕金森病或其分級(jí)。3.權(quán)利要求2的用途，其中所述參考水平是未患帕金森病的受試者對(duì)照群體中5/MflW或的表達(dá)水平。4.權(quán)利要求2的用途，其中所述參考水平是未患帕金森病個(gè)體中5wflW或i^r的表達(dá)水平。5.權(quán)利要求2的用途，其中所述參考水平是受試者之前的丑附flW或i^W的表達(dá)水平。6.權(quán)利要求2的用途，其中所述參考水平是指受試者在接受治療方案之前或i^fJ的表達(dá)水平。7.根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)的用途，其中所述樣品為血液樣P口08.根據(jù)權(quán)利要求2至7中任一項(xiàng)的用途，其中所述樣品包含外周白細(xì)胞。9.根據(jù)權(quán)利要求2至8中任一項(xiàng)的用途，其中使用定量PCR確定所述表達(dá)水平。10.根據(jù)權(quán)利要求2至8中任一項(xiàng)的用途，其中使用northern印跡或點(diǎn)印跡確定所述表達(dá)水平。11.根據(jù)權(quán)利要求2至10中任一項(xiàng)的用途，其中所述表達(dá)水平的確定包括將或iVW的mRNA的量相對(duì)于管家基因mRNA的量進(jìn)行歸一化。12.根據(jù)權(quán)利要求ll的用途，其中所述管家基因選自hCDK4、p-肌動(dòng)蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶和18SrRNA。13.根據(jù)權(quán)利要求2至12中任一項(xiàng)的用途，其中所述一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)包括至少一個(gè)處于晝夜循環(huán)中夜間部分的時(shí)間點(diǎn)。14.根據(jù)權(quán)利要求2至13中任一項(xiàng)的用途，其中所述一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)包括至少一個(gè)處于約23:00至約9:00的時(shí)間點(diǎn)。15.根據(jù)權(quán)利要求2至14中任一項(xiàng)的用途，其中所述一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)自選自下列的時(shí)間段20:00到22:00，23:00到1:00，5:00到7:00，以及8:00到10:00。16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中所述一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)選自約21:00、約00:00、約06:00和約09:00。17.根據(jù)權(quán)利要求2至16中任一項(xiàng)的用途，其中采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較丑附"W或戶^表達(dá)水平和參考水平。18.根據(jù)權(quán)利要求2至17中任一項(xiàng)的用途，其中受試者i附flW或PerJ的表達(dá)水平和參考水平之間的差異與受試者帕金森病的分級(jí)正相關(guān)。19.根據(jù)權(quán)利要求18的用途，其中通過(guò)Hoehn&Yahr分級(jí)系統(tǒng)測(cè)定帕金森病分級(jí)。20.根據(jù)權(quán)利要求19的用途，其中所述確定受試者患有帕金森病或其分級(jí)的步驟通過(guò)以下進(jìn)行進(jìn)行Hoehn&Yahr分級(jí)系統(tǒng)所確定的分級(jí)與受試者或/VW表達(dá)水平和參考水平的差異之間的Pearson相關(guān)性分析。21.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中帕金森病的分級(jí)通過(guò)UPDRS量表進(jìn)行評(píng)價(jià)。22.根據(jù)權(quán)利要求2至21中任一項(xiàng)的用途，其中與參考水平相比受試者5wmW表達(dá)水平在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)處降低指示出受試者患有帕金森病或其分級(jí)，所述時(shí)間點(diǎn)選自約21:00、約00:00、約06:00。23.根據(jù)權(quán)利要求2至21中任一項(xiàng)的用途，其中與參考水平相比受試者表達(dá)水平在約00:00、約06:00或者約00:00和約06:00同時(shí)升高指示出受試者患有帕金森病或其分級(jí)。24.根據(jù)權(quán)利要求2至21中任一項(xiàng)的用途，其中與參考水平相比受試者PeW的表達(dá)水平在21:00下降指示出受試者患有帕金森病或其分級(jí)。25.權(quán)利要求2至21中任一項(xiàng)的用途，其中一種或多種測(cè)量受試者樣品中5附flW或表達(dá)水平的檢測(cè)試劑還可用于確定受試者中iVW或的表達(dá)模式，所述確定是通過(guò)測(cè)量來(lái)源于受試者取自至少兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品中戶e〃或5附fl/J的表達(dá)水平以及比較所述至少兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的或5iwa〃表達(dá)水平來(lái)進(jìn)行的。26.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中受試者中在約21:00和約00:00時(shí)的表達(dá)水平比約06:00和約09:00時(shí)低的表達(dá)模式指示出受試者患有帕金森病。27.根據(jù)權(quán)利要求2至26中任一項(xiàng)的用途，其中還才艮據(jù)受試者患有帕金森病或其分級(jí)選擇治療方案。28.根據(jù)權(quán)利要求27的用途，其中另外在受試者接受治療方案之后測(cè)量"附flW或表達(dá)水平。29.—種篩選可用于帕金森病治療的化合物的方法，其包括(a)測(cè)量來(lái)自施用了測(cè)試化合物的受試者的樣品中5挑flW或7Vr的表達(dá)水平；(b)將5附flW或戶wJ的表達(dá)水平和參考水平進(jìn)行比較；和(C)確定測(cè)試化合物的效力，其中5附flW或iV〃的表達(dá)水平與參考水平的差異指示出所述測(cè)試化合物可用于治療受試者帕金森病。30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述參考水平是受試者在接受測(cè)試化合物之前5附flW或的表達(dá)水平。31.—種診斷或監(jiān)測(cè)受試者帕金森病的試劑盒，其包含(a)—種或多種用于測(cè)量受試者樣品中5wfl/7或戶w7表達(dá)水平的檢測(cè)試劑；(b)至少一例來(lái)自未患帕金森病的受試者對(duì)照群體的對(duì)照樣品；和(c)一種或多種檢測(cè)試劑的使用說(shuō)明。32.權(quán)利要求31的試劑盒，其中所述一種或多種檢測(cè)試劑包括用于5附tfWmRNA的RT-PCR引物。33.權(quán)利要求31的試劑盒，其中所述一種或多種檢測(cè)試劑包括用于mRNA的RT-PCR引物。全文摘要本文描述了一種檢測(cè)帕金森病(PD)發(fā)病的方法以及對(duì)用于檢測(cè)其發(fā)病的生物標(biāo)志物的鑒定。本發(fā)明涉及對(duì)包含Per1和Bmal1信使RNA之樣品的檢測(cè)和/或監(jiān)測(cè)，所述信使RNA可單獨(dú)或組合用以確定帕金森病或其任意發(fā)展?fàn)顟B(tài)是否存在。例如，檢測(cè)外周白細(xì)胞中Per1和Bmal1信使RNA為帕金森病診斷和監(jiān)測(cè)提供了一種有用的工具。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101659991SQ20081021483公開(kāi)日2010年3月3日申請(qǐng)日期2008年8月29日優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日發(fā)明者蔡彥寧,彪陳申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院