專利名稱：：通過基于磷酸抑制和超聲處理樣品的方式分離粘附于固體樣品微生物的方法通錄于鰍抑制械聲處理#^口的方式分離粘附于固體#^微生物的方法鉢領(lǐng)域本發(fā)明公開了一種^^基于高摩爾狄的緩沖液(0.5M以上)和超聲技術(shù)來分離存在于固^fW^中的生物群落的觸物的方法。背景狄固體樣品中微生物的分析與多種生物技術(shù)的領(lǐng)域高度相關(guān)，如生物浸礦(Biomining)、生物^f務(wù)復(fù)(Bioremediation)領(lǐng)域，"^而言無i^l^H^野生的或引入的生物群落的特征，都涉^Jt^定樣品。這種固^#品可以是例如礦源、S^為^r礦(oreconcentrates)、新礦、黃45^戶、黃銅礦、藍(lán)銅礦(coveline)、尾礦、浸出尾礦、脈石、和通常的金屬的和一Mr屬種；等等。生物浸礦是具有巨大商業(yè)利益的^^領(lǐng)域。生物浸礦可以定義為^^]g物;^r石中重新獲4Hr屬。最傳統(tǒng)的^J^t物浸出(bioleaching)，它B物浸礦不^(RA這一個(gè)單獨(dú)的步驟，它還是對所包含^生物的監(jiān)控^f預(yù)，因?yàn)檫@些才i^il合的并持續(xù)j^。^tbi涉;s^it:的工藝^t方法學(xué)的開發(fā)的實(shí)驗(yàn)室水平的^9f究。為了有效的;^生物浸出，便于控制，甚至是干預(yù)實(shí)^Lh述操怍的微生物群落。通過應(yīng)用一些可能W"存在于礦藏中微生物的扭術(shù)來實(shí)祐J^i控制，通常，行。迅些孑壞經(jīng)仗卞卞與當(dāng)這些^^應(yīng)用到復(fù)合的Jf^^口時(shí)，獲得的,艮差，因?yàn)榇嬖诘牡V石物理干駄其氧化一麻贈(zèng)能夠破壞該,斤需要的生物材料。例如，廣^I于檢測和鑒別微生物的一種^t^l^^Sl^^技術(shù)，PCR。這項(xiàng)^^只需要有少量完整的核苷^^子的存在就可以啟動(dòng)反應(yīng)。M需要的量少，但是對提取自固##本中的#^進(jìn)行成功的PCR擴(kuò)增^M:非常困難的。這種情況的J^是因?yàn)楫?dāng)^^1直接的雜方法時(shí)，細(xì)胞與M接觸時(shí)錄，所iii^f為礦源時(shí)，外溶解到溶液中的核苷^t具有很強(qiáng)的破沐性。即使^^J具有較少破壞性的礦物M，例如i^LiU^p、物，^M攤l^fii^^在pcr中的作為才莫板的核香酸(Milleretal，A卯l.Environ.Microbiol.Vol65:4715-4724，1999;Zhouetal，A卯l.Environ.Microbiol.Vol62:316-322,1996).第^從T源中獲得核酸的分子生物學(xué)方法A^離存在于固^#本中的細(xì)Jte著石i^些細(xì)l^純化核酸。盡管這種方法的優(yōu)勢明顯，因?yàn)樗鼘⒑怂釓钠茐男缘沫h(huán)境中分離出來，但只有相對較少的出版物中使用該方法，并且，其不能保證徹底的獲得最初存在于樣本中的細(xì)胞。在;M頁域內(nèi)一直期望能夠彬'J一種將存在于固##本中的M物提取出來的方法，無論是將其用于需粉離的孩^1物存活的孩仏物學(xué)技術(shù)中，i^l^)于純^^5些分離自礦藏中的孩&物核酸的^"生物才棘中。本發(fā)明解決了這個(gè)技術(shù)問題，發(fā)明了一種方法，其^^1高狄的鹽和金屬AU廣藏中分離其上附著的孩性物群落，^f^)高摩爾M的磷酸緩沖^超聲技術(shù)，獲#^和存活的(viable)微生物。所述微生物可用于傳統(tǒng)的微生物學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)中。當(dāng)超聲技術(shù)應(yīng)用于浸^^沖液中的固>^#本時(shí)，已^JL^某些控制條件下，上清中含有4^的活的敗物，因此可以直接用于孩速物學(xué)技術(shù)，或更^f^l]于^^生物學(xué)才棘，因?yàn)楹怂峥梢匀菀椎?gt;^^1些全#^物中提取出來。我們發(fā)^Lt^^中沒有^^r研究能夠通it^聲^^成功的分離存在于固^#本中的#^物，并且特別當(dāng)這些固體是含有對M物和分離的DM均具有破沐性的試劑的礦源時(shí)。有一些研究關(guān)于這項(xiàng)^l^用于分離存在于i^iU;C^物中做物，即^^在》br源^x更5脈"的a下，沒有獲得非常妤的結(jié)果。例如，Picard等(A卯l.EnviroiLMicrobiol.Vol58:2717-2722，1992)描述了超聲^M^作為最有效的方法分離與土壤粘附的細(xì)胞，但是其缺點(diǎn)在于釆用該超聲才1^處理分離自i^L的細(xì)^導(dǎo)致產(chǎn)生DM小片艮我們;NKt這些片段化的DNA是在沒有^m沖液的情況下城超聲^Ht的結(jié)果，^it種糾下細(xì)胞不僅被秋出來，而JL^L破壞。^^本發(fā)明的方法就不會(huì)jgjt這種情況，分離自固*品的細(xì);!&###完^^存活，并且，如果要純4誠酸，可以在與從常規(guī)實(shí)驗(yàn)室培絲獲得的相同糾下獲得。另一個(gè)出版物中在土壤中使用超聲技術(shù)的方法是Buesing和Gessner(Aquat.Microb.Ecol.Vol27:29-36，2002)描述的。四個(gè)步J^f^J了不同的儀器用于秋與環(huán)嫂J5E^物^M目結(jié)合的細(xì)菌，該文章對這兩個(gè)步l^ii行t嫩。"W^儀器是具有強(qiáng)度80W的棒W1聲器；具有強(qiáng)度95W的溶液型超聲器；Ultra-Turrax⑧組織均漿器和Stomacher80@實(shí)驗(yàn)室用的混合器。在每種情況下對樣品處理0.5到20分紳。已經(jīng)發(fā)KL^有效的;A^^物中a細(xì)菌的方法是使用Sto咖cher80,而iWM^R器的提取糾非?？量蹋@絲致明顯的細(xì)JMC壞。Buesing的結(jié)果對超聲方法來說并不是有利的。而且，因?yàn)橐証^的鹽^r屬處理5f^陣品，而且由于其i殳計(jì)Stomacher80Wf磨系^ti要適合于小顆iWo。。或糊，該系^t礦源樣品的有效性是有4H義的。礦源樣品中通常含有;U1寸顆粒(直徑2-5cm)并富含鹽和礦物。同時(shí)<^1本專利中的高摩爾就的磷酸緩沖^^聲技術(shù)，當(dāng)對具有不同顆狄寸和艦的鹽和礦物不同來源的礦源進(jìn)行處理3^皮證明是有#方便的，并且因?yàn)槿绱?，表?UI]于解決對來自礦源細(xì)胞的提取問題的有效可選擇方法。另一方面,Craig等(JournalofAppliedMicrobiology,Vol83:557-565，2002)蕭了用于分離來自海岸^^物的細(xì)菌的多種^t^。AX攪拌；溶^^聲，700W，35kHz6到10^4中，然后棒超聲，100W，20kHz15秒到1*，進(jìn)行t嫩。1克^^浙的#/口與9ml的蛋白胨水(含有0.1%的蛋白胨)混^*￡行不同的處理。結(jié)^示^^聲對從含有高^L的沙石的沉積物提取細(xì)菌更有效，^t含有污泥，粘土和有M的沉農(nóng)浙中提取細(xì)菌的效率較低。^il些;^P、物的氣昏類型中，最有效的方法^AX撒泮，本發(fā)明中開展的方法不同與Craig描述的^T一個(gè)方法，因?yàn)楸綹發(fā)明的方法使用了高摩爾狄的^^緩沖液，其可以保證大多數(shù)細(xì)J!^皮提取出來，當(dāng)然tbAX,更有效。正如你所看到的，迄今為JB^殳有介紹過^1的從含有高^1的鹽和金屬的固M品中分離g物的方法。本發(fā)明將要解決這一^L^問題，證明4捐超聲技術(shù)可以將存在與固>*^中的觸物分離出來。發(fā)明簡述本發(fā)明^iHf了一種用于分離存在于固*品中的te物群落的M物的方法，并且，一旦分離出這些孩&物，在做物學(xué)^^中^J^它們，或從它們中提取核酸DM和RNA用于H生物學(xué)4支術(shù)。這種固*品可以是例如礦源其含有例如，精礦、新礦、黃鐵礦、黃銅礦、藍(lán)4^A>CT、浸出4/戶、樂^S、和^t礦中的金屬'I^M^r屬'斷類；等等。該方法可以應(yīng)用于^f可固^M^粒尺寸，^f戶石樣品的情況下，無論是>^^廣藏、碎石、渣滓(ground)或粉末中獲得。它可以同樣的應(yīng)用到未經(jīng)生物學(xué)處理的固^W品上或經(jīng)ii^養(yǎng)的樣品中，以增加其生物數(shù)量。該方法主要包括w曼i錄高摩爾、;;iyL的基于磷,緩沖液中的固^#品進(jìn)行超聲處理，目的是獲^"有4^te物的上清，其可以用于孩姓物學(xué)或襯生物學(xué)技術(shù)。本發(fā)明的超聲緩沖液包括^^緩沖液、乙醇和聚山梨酯20或80表面活性劑(吐溫20⑧或吐溫80⑧)。該緩沖^E含有非^iJ^成分，例如^IU匕劑、'^it:壓調(diào)節(jié)劑、^剖、巖酶(Uthicenzyme)、溶劑和鹽。固體#^^^聲緩沖液的';^^物，超聲處理15到300秒，尤其;lj^聲水浴中，特別是60到150秒，優(yōu)選90秒。功率為20到200瓦，特別是80到150瓦，更特別是IOO瓦，而誠率在10到lOOKHz的范圍內(nèi)，特別是25到75KHz，更特別的是42KHz。一^SJ^行了超聲處理，通過傳統(tǒng)的細(xì)胞分離方法可以從固糾品中分離出感^的生物材料。在其中獲得的細(xì)Jlfe^存活的，因此它們可以應(yīng)用在任何的微生物學(xué)或^"生物學(xué)方法中。附圖簡述圖i顯示:n^i超聲處ig^o、i、7和ii天時(shí)的#^和對照中的存在于培;^中的細(xì)胞的數(shù)量(^a微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù))。在沒有進(jìn)行，的培養(yǎng)^Ji沒有M^到細(xì)胞的生長，而在^^M明的方法用"經(jīng)M的礦石1"和"經(jīng)接種的礦石2"處理過的樣品中觀瘵到明顯的細(xì)胞生長，在"Wenelen培養(yǎng)物"和"^^聲的Wenelen"陽性對照中觀肩:到相似的情況。結(jié)論^^I本發(fā)明的方法從固僻游品中提WJ細(xì)Jf&^存活的。圖2顯示了應(yīng)用本發(fā)明的方法的#^和陽'!^照的核酸的^^凝歐，其中所述#^口"經(jīng)糾的礦石1"=1"經(jīng)糾的礦石2"=2，并且陽'ltxt照"Wenelen培養(yǎng)物"=2和"經(jīng)超聲的Wenelei^5"。4種樣品財(cái)相同的條帶，最上面的一條對應(yīng)于基因組DNA而下面的兩條"對應(yīng)于核^^RNA。結(jié)論通it^發(fā)明的方法從固M品種中提取出的細(xì)Jffe^有新陳代謝的活性，通i^目應(yīng)于核糖體RM(23S和16SrRNA)條帶的存在證明^^"上必奮性。圖3顯示了用溴化乙咬染色的0.9%瓊脂糖皿，顯示在沙道1和2中，其中的^f對應(yīng)于^^I本發(fā)明的方法從固gP中提取出的總DNA，該方法使用了擴(kuò)展的超聲緩沖液，除了含有^i^成分(高摩爾狄的^^緩沖液、乙醇和非離子表面活性劑)夕卜還含有其它非J^成^^'J如巖酶、@_鈉、DMS0、EDTA和甘油。提取自固^#品的總DM的相同^f顯示在沙道3和4中，這歡使用的^L^發(fā)明的方法，但是使用的^^緩沖液僅含有3種1^成分。DNA提取的總J^殳有明顯的差別。發(fā)明詳述超聲技術(shù)是^^聲^^I于不同目的的應(yīng)用。它通常用于^絲中的顆粒，其使得溶液中的特定物質(zhì)分解加速，尤其是在物理^f亍不通時(shí)其非常有用，如在用于核磁M(腿)的試管的情形下。它也用于為化學(xué)AJI提供能量。超聲的傳統(tǒng)生物學(xué)應(yīng)用破壞了多種生物材料例如細(xì)胞和嚢泡，并且^ll失活。^M1于^^生物學(xué)材料，例如粘附到^H^上的做物iUai只。有兩種典型的方法進(jìn)"ff^聲，^^超聲7jC^其中通it7JO^聲波能量^^化n^到樣品，或^^超聲棒其中^A^樣品中的金^^產(chǎn)生聲波能量。^r這些技術(shù)可以應(yīng)用到本發(fā)明中。當(dāng)4M超聲棒時(shí)，聲能的功率和頻率必須降低，相反應(yīng)用超聲溶液時(shí)，樣品必須有*的保護(hù)以消除產(chǎn)生的熱量，從而避免由于高^^孩ii物產(chǎn)生的損傷。在7JC^超聲下，聲波的能量通it7JC來雜，因此，可以使用較高的功率^M率而不^"存在的微生物帶iM員傷。本發(fā)明的方法用于分離粘附到含有高M(jìn)L的鹽和金屬的固體樣品上的g物群落，獲#^部的、存活的微生物，這樣就可用于常皿生物學(xué)和^生物學(xué)狄了。能夠應(yīng)用本發(fā)明的方法的含有高M(jìn)的鹽和金屬的固,品，可以是與銅礦藏有關(guān)的礦源或與已發(fā)現(xiàn)其他商業(yè)剛興趣的金屬的礦絲關(guān)，例:黃鐵礦、黃銅礦、藍(lán)銅礦、尾礦，脈石，和非金屬種類。該方法可以應(yīng)用到任何大小的固體樣品粒，在礦源的情況下，只要從礦中獲得，那怕是礦、碎石、渣滓或粉末?？梢酝瑫r(shí)應(yīng)用到生物學(xué)未處理過的固M品或經(jīng)ii^養(yǎng)的樣品，以增加其中的生物量。在第一階段中，獲取其中存^^分離微生物的固,品。合適的#^量是1到50g，特別是5到20g，艦10g。將獲取的樣品;^J^被的^I試管中，如50mLFalcon試管向固體樣品中加發(fā)明所述一定^P、的超聲緩沖液(與固##品的僻浙相等)。超聲緩沖液包舍.基于^^的緩沖液.乙醇.非離子表面活性劑^^緩沖液的pH值在4到9的范圍內(nèi)，雖然在任阿的pH范圍能夠到勤目同的^，鑒于本發(fā)明的重點(diǎn)在于高的^Wf爾M而不是緩沖液的pH值。磷酸緩沖液的摩爾^l可以^it0.5M，^i^0.8M到2M之間，最她lM。乙醇使用的是5%到20%重量/重量賦的無水乙醇(下i^斤有的重量/重量百分比簡單的表示為T),艦的^1:8%到12%^間，最艦10%。其中的非離子表面活性劑她聚山梨酯酯20或80表面活性劑(-W顯20或^^顯80@)，加入的狄范圍是0.Ol到O.5%，她0.02到0.1%,最艦0.05%。方便時(shí)，本發(fā)明的超聲緩沖液具有其它雜沖液帶來有科性質(zhì)的非基本化^^。緩沖液可以含有巖酶，其能夠幫助^A物膜(biofilm)和襯粘附的細(xì)胞，使得它們?nèi)菀譤U'j上清中。溶菌酶、喊，例:fo^S!A、B、C、Y;氨UfeSl、胰島素、胰凝#源白酶、胃液素等，B酶的例子。巖酶的^ML^0.1到1mg/mL，M的，濃^^b范圍為0.3到0.8mg/mL，更優(yōu)選0.5mg/mL。其它非J4^成分是鹽，其能夠增加緩沖液的摩爾濃度，例如醋酸鈉、醋酸鐘、檸^i^鈉或鉀、^酸鈉或鉀，作為例子。鹽的摩爾濃度可以是20到200mM，優(yōu)選的M是50到150niM，更M為100mM。滲i^調(diào)節(jié)劑例如蔗糖、海藻糖、甘棘、bethaine、甘^j^等，也可以<^1。緩沖^￡可以含有^^化劑例如DMS0(二甲JJL^)，其濃度可以是1到10%,特別是5%;^^劑例如EDTA(乙二胺四乙酸)，EGTA(乙二醇四乙酸)其摩爾M范圍是10到100mM，艦50mM。方便時(shí)，緩沖液也可以含有"^由作為增稠劑，其i^;l到10。/。，特別是5%。緩沖液中含有還原劑的話^(f，其可以選自P-5tt乙醇、DTT或谷胱甘肽。在M的例子中，超聲緩沖液包括基于^^l的緩沖液.乙醇.聚山梨酯20或80表面活性劑(吐溫20@或吐溫80).巖酶扁EDTA.浙由固^*口^1聲緩沖液的:^^超聲處理15到300秒，^i^^聲7JC^中，特別;^^聲處理60到150秒，更特別的超聲處理90秒。在50到200瓦，特別是80到150瓦的功率，更特別是100瓦的功率，并JU5率從10到100KHz，特別是從25到75KHz，更特別是42KHz。在這個(gè)階^^占附在固體樣品上的樹生物變得+^，懸浮^^聲M中。為了從固^^。中分離出含有M物的上清，M域內(nèi)^^r已知的用于分離細(xì)胞的方法^r以《^j。在一，選的方面，超聲的^JI試管可以進(jìn)行冷凍離心，"iato^#，利于傾析。離心應(yīng)當(dāng)itJL,以使固*品^^定而生物材料留在懸浮液中。離心可以在500到3，000g進(jìn)行15到10分鐘。特別的，離心在l，000g時(shí)進(jìn)行2分鐘。離心^，獲得了含有秋細(xì)胞的上清。為了從懸浮液中^M^t的細(xì)胞與其它成分分開，可以對獲取的上清進(jìn)行離心。離心應(yīng)當(dāng)^j^i樣的條降下進(jìn)行，以使細(xì)胞留在i5^內(nèi)而^^小的成^^如多糖有機(jī)殘留物、蛋白、脂類或簡單的鹽，留在上清中，其lt^L丟棄。離心^中進(jìn)行將;l^^更的，可以避免生物材料的降解。在優(yōu)選的情況下，可以在41C冷凍離心41C下^^過4，000g離心5^4中。獲得的沉淀可以^^理任河細(xì)J^一樣^Mh理，It^的處理m^于使用的孩&物學(xué)或襯生物學(xué)技術(shù)。例如，可以將獲得的^定重新懸浮以用于培#的樹體，或用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，或可以^^;WJ域內(nèi)的常^i^M)于分離核酸，并將這些核妙用到PCIU^、DM或RM朝剛、FISH、測序等?？捎糜谥匦聭腋〕恋硪蕴酠酸的緩沖液有STTtampon(TRIS10mMpH8.0;EDTA20mM;SDS2%;h±i§L201%;TRITONX1001%;Biotechniques27，p1140—pll45;1999)補(bǔ)充了Proteinaze-K和3MpH5.2的醋酸鈉。一種m的獲得核酸的方法是s^氯仿-異戊sf^取，其對于^M頁域?qū)＜沂鞘熘?。也可以通過核酸l^:^iM^取。實(shí)St^發(fā)明的實(shí)施例如下。實(shí)施例1兩個(gè)4-g的礦石#^0"^#在40mL的Wenelen菌林的培養(yǎng)物中，BioSigma(DSM16786)的特征，生"JL^9KFe"培養(yǎng)基(10%p/vM)并孵育24小時(shí)。然后去除多余的培養(yǎng)基，這樣留下的礦石^j顯的，并粘附有細(xì)胞。每個(gè)礦石樣品以這種方狄理，；^A到50mL的Falcon試管中，加入與樣^JM^p湘同的超聲緩沖液^p、基于^^液的緩沖液pH5.0..................1M聚山梨酯20表面活性劑(20)..............0.05%乙醇........................................10%.巖酶.........................................0.5mg/mL醋酸鈉pH5.2...............................100mM'DMSO......................................5%*EDTA.......................................50mM.賴.......................................5%礦石^^沖液的^^^^聲》:fc^谷中以100瓦的功率和42KHz固定的頻率妙90秒。與礦石粘附的te物^i^t一階段被樹出來，并留^^聲絲的懸浮液中。A^試管以l，000g在4X:冷凍離心機(jī)中離心2分鐘，離心之后，獲取含有M物的上清；丟棄舍有礦石的小塊。上清以9，000g在4iC冷凍離心機(jī)中離心5分鐘，本夂離心中，細(xì)胞保留在^定中，雞更小的#^成^^如膜或鹽類留在上清中，！^被去除。將提取細(xì)胞的^定重新懸浮在沒有核麟的lmL水中，然后才科己為"經(jīng)接種的礦石1"和"經(jīng)糾的礦石2"。從每個(gè)懸浮樣品中取出0.5mL，并糾到5mL的9KFe2+培養(yǎng)基。將另外的0.5mL直接用于提取核酸，使用KiuChoongSyn等，1999描述的方法提;^酸。為了^HWit^發(fā)明的方法獲得的細(xì)胞的存活性，將培養(yǎng)基中的樣品培育11天，在此期間監(jiān)領(lǐng)'傳在于培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)目，如圖1所示。除了4^發(fā)明方法的樣品，培養(yǎng)^t對照-Wenelen培絲M長的Wenelen培絲中取出0.5mL并糾到5mL的9KFe2+培養(yǎng)^Ji。另取出0.5mL用于提絲酸。-^l聲的Wenelen:M長的Wenelen培絲中取出40mL，然后在與含有礦石的試管同樣的*下超聲處理，換句"^i兌，添加來自相同發(fā)明的超聲緩沖液，在超聲7jc浴中以100W的功率和42KHz固定的頻率超聲處理90秒。隨后在的冷凍離心機(jī)中以9，000g離心5分鐘，獲取的^i定重新懸浮于1mL的iL^^^7K中。從該懸浮液中取出0.5mL糾到5mL的9KFe2+培養(yǎng)^iJi,另取0.5mL用于進(jìn)4沐酸提取。-ib^種的培養(yǎng)基將0.5mL的ib^^l^水加入到5mL的9KFe2+培養(yǎng)基中。將兩個(gè)樣品，"經(jīng)糾的礦石l"和"經(jīng)糾的礦石2"和三個(gè)對照，"Wenelen培養(yǎng)基"，"經(jīng)超聲的Wenelen"和"^L^種的培養(yǎng)基"，;M在6孔的無菌板上，在^^f的情況下，301C,培養(yǎng)11天。在第0、1、7和11天時(shí)從每個(gè)孔中取出20ji1的樣品，以通itjt^微鏡下M^^十?dāng)?shù)細(xì)胞。圖1顯示了在經(jīng)處S^在所示天數(shù)時(shí)樣品和對照的相對顯微鏡計(jì)數(shù)。在沒有，的培養(yǎng)基中沒有M^到細(xì)胞的生長，而^^明的方法處理過的#^"經(jīng)，的礦石1"和"經(jīng)接種的礦石2"中有明顯的細(xì)胞生長，在陽'1^照，enelen培養(yǎng)基"和"經(jīng)超聲處理的Wenelen"中觀察到了相似的結(jié)果。這證明了使用本發(fā)明的方法從固^W品中提取中的細(xì)l&i存活的。正如指出的那#[錢KiuChoongSyn等，1999描述的方法提械酸，使用來自"經(jīng)糾的礦石l"、"經(jīng)接種的礦石2"、，enelen培養(yǎng)基"和"經(jīng)超聲處理的Wenelen"的辨品各5mL。圖2中的:^顯示了提取的核亂可以觀幕到4個(gè)^^存^f目同的^f,其中^h面的^f對應(yīng)于基因組DNA，下面的兩條^^對應(yīng)于核糖體RNA。核^:^f的存在;l^-HM^I本發(fā)明方法從固^T口中提取的細(xì)胞活的并具有新陳代躺活性的另一個(gè)清楚的鄉(xiāng)。實(shí)施例2;為了評^f錢含有簡單組分(與擴(kuò)展的組^目對)的高摩爾^t^于磷酸緩沖液(超聲抑制)從固^。中分離te物方法的有效性，進(jìn)^下的步驟;.將40g相同的均質(zhì)礦物#^口分^目等的4份，^^中加入10mL相等體積的高摩爾M的基i^W的抑制物。.在,A中(圖3中的1和2的副本(r印lica))^JI擴(kuò)充的組^的超聲緩沖船且分基于^^t的緩沖液pH5.0.....................1M聚山梨酯20表面活性劑(g20)................0.05%'。帛..........................................10%.巖酶.........................................0.5mg/mL醋酸鈉pH5.2.....................................100mM.畫........................................5%EDTA..............................................50nM.賴..........................................外在情形B下(3和4的副本)使用簡化的組合物的超聲緩沖、泉基于^^的緩沖液pH5.0.....................1M.聚山梨酯20表面活性劑(pi^顯20)...............0.05%'。醇.........................................10%.將A和B礦石與緩沖液的';a^^^聲7K^中以ioo瓦的功率和固體的頻率42KHz超聲90秒。.將四^h^聲試管在4X:的冷凍離心機(jī)中以1,000g離心2分鐘。離心之后，回收含有微生物的上清；丟棄含有礦石的沉淀。將在41C的冷凍離心機(jī)中以9，000g對上清離心5分沖。^Eil樣離心條件下細(xì)胞留在^it內(nèi)，樣品中其它較小的成分，例如膜或鹽，留在了上清中，將絲除。.將提取的細(xì)J!fe^定重新懸浮在不含核^l的1mL水中。從該#^中取出0.5mL，才MHKiuChoongSyn等人，1999描述的方法進(jìn)械酸的提取。圖3顯示了經(jīng)過0.9。/。溴化乙錄色的瓊脂糖m，表明^^1擴(kuò)展的或簡單的超聲緩沖^i行DNA提^j殳有明顯的差別。而且，當(dāng)^JJNanoDropND1000分ibt^計(jì)定i^取自4個(gè)副本的DNA時(shí)，如表1所示，經(jīng)ii^目同類型超聲器處理的1和2之間的^t別比經(jīng)it^同類型超聲緩沖狄理的1和3之間的差別要大。',A(1和2)中DNA的平均狄，555.95ng/nl，非常接近于',B(3和4)中DM的平均狄，522.98ng/nl。因此，可以得出兩種組^是等效的緩沖液，只有^t處理樣品U雜時(shí)才建i^p入一些或4^可選的緩沖成分(EDTA或EGTA、甘油、巖酶、鹽例如醋酸鈉、醋酸鉀、檸^^鈉或鉀、琥珀酸鐘或鈉、滲i^a調(diào)節(jié)劑、DMSO和/或還原劑)。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求1.一種用于分離粘附到固體樣品上的微生物的方法，其特征在于包括下列的步驟a.提供微生物粘附到其上的固體樣品；b.向所述固體樣品中加入含有濃度超過0.5M的磷酸溶液、乙醇、和非離子表面活性劑的高摩爾濃度的基于磷酸的緩沖液，c.超聲，d.回收含有分離自固體樣品微生物的上清。2.^4t似，J^求l所述的分離粘附到固體^^上的微生物的方法，特#于高摩爾狄的基于^的緩沖液的pH錄4到9之間。3.#^^^要求1所述的分離粘附到固*品上的#^物的方法，特4iE^于所述的乙醇為^A5到20%的無水乙醇。4.##^^要求1所述的分離粘附到固#^口上的#^物的方法，特;^于所述的非離子表面活性劑選自聚山梨酯20表面活性劑或聚山梨酯80表面活性劑，并且^f吏用的艦范圍是0.01到0.5%;艦0.02到0.1%;更特別是0.05%。5.#^^']要求1所述的分離粘附到固體樣品上的微生物的方法，特4iMt于所述高摩爾^L的基于^的緩沖液^t的包括，成分，其選自EDTA或EGTA、甘油、巖酶、鹽例如醋酸鈉、醋酸鉀、檸#^鈉或鉀、*6酸鈉或鉀、滲it^調(diào)節(jié)劑、DMSO和/或ii^劑。6.才M^U'漆求l所述的分離粘附到固^fW^上的旨物的方法，特M于可以^^I超聲7lC^進(jìn)Wl聲。7.#^擬0^求6所述的分離粘附到固體#^上的微生物的方法，特M于進(jìn)^f^^處理的時(shí)間為15到300秒。8.才M^U，J^求6所述的分離粘附到固^h。上的旨物的方法，特4iE^于進(jìn)^i聲處理的時(shí)間為60到150秒。9.才E^;M'J^求6所述的分離粘附到固^^口上的旨物的方法，特4iE^于進(jìn)"ff^^處理的功率為20到200瓦。10.^4t權(quán)矛J^求6所述的分離粘附到固##^上的#^物的方法，特征在于進(jìn)^^聲處理的頻率為10到100KHz。11.才^^5U，J要求1所述的分離粘附到固^p上的做物的方法，特征在于通過離心分離含有分離自固體樣品的微生物的上清。12.才N^3U，J^求1所述的分離粘附到固^P上的做物的方法，特征在于4^te物通it^過4，ooog離心Mi^與上清中的^ia分分離，以使細(xì)胞留在^j定中。13.才M^5U，J要求1所述的分離粘附到固體樣品上的微生物的方法，特征在于分離自固##^的旨物用于#^物學(xué)或^生物學(xué)^^中。14.才M^U'J^求1所述的分離粘附到固^#品上的孩性物的方法，特征在于固耕品對應(yīng)于礦源，例如精礦、新礦、黃鐵礦、黃銅礦、藍(lán)銅礦、尾礦、浸出4y5戶、ii^5、通常的金屬和一Mr糾。全文摘要本發(fā)明提供了用于分離存在于固體樣品的微生物群落中微生物的方法。并且一旦分離出微生物，它們可以用于微生物學(xué)技術(shù)，或從它們中分離到的核酸DNA和RNA可用于進(jìn)行分子生物學(xué)技術(shù)的處理。根據(jù)本發(fā)明，用于分離粘附于固體樣品的微生物的方法包括以下的步驟提供微生物粘附到其上的固體樣品；向固體樣品中加入含有濃度超過0.5M的磷酸溶液、乙醇和非離子表面活性劑的高摩爾濃度的基于磷酸的緩沖液；超聲，回收含有分離自固體樣品微生物的上清。文檔編號C12N1/00GK101358170SQ200810214738公開日2009年2月4日申請日期2008年6月27日優(yōu)先權(quán)日2007年6月29日發(fā)明者斯圖爾澤巴赫K·N·艾赫倫費(fèi)爾德,瓦爾德坎圖斯P·A·帕拉達(dá)申請人:拜奧希格馬公司