專利名稱：：基因擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是關(guān)于一種能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的表達(dá)載體(expressionvector),其包括有一欲表達(dá)的基因、一核錨定(nuclearanchoring)元件、及至少一反向重復(fù)(invertedrepeat,IR)元件。本發(fā)明另關(guān)于一種藉由將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染(transfect)于諸如人類等哺乳類細(xì)胞以加強(qiáng)基因表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
：即有基因表達(dá)方法是于原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)人類重組蛋白質(zhì)。大多數(shù)的人類重組蛋白質(zhì)需要進(jìn)行轉(zhuǎn)譯后或轉(zhuǎn)譯時(shí)修飾作用(post-and/orperi-translationalmodifications),諸如糖基化作用(glycosilation)、g-羧化作用(g-carboxylation)或g-羥化作用(g-hydroxylation)。因此，一個(gè)關(guān)于原核表達(dá)系統(tǒng)的已知問題是原核表達(dá)系統(tǒng)無法實(shí)行哺乳類表達(dá)系統(tǒng)所提供的轉(zhuǎn)譯后或轉(zhuǎn)譯時(shí)修飾作用。于是在原核表達(dá)系統(tǒng)中，將無法正常地表達(dá)需要進(jìn)行轉(zhuǎn)譯后或轉(zhuǎn)譯時(shí)修飾作用才能發(fā)揮正常功能的蛋白質(zhì)。另一被廣泛用以表達(dá)所述人類重組蛋白的既有方法是采用一哺乳類表達(dá)系統(tǒng)。哺乳類表達(dá)系統(tǒng)使用哺乳類細(xì)胞以利用其實(shí)行轉(zhuǎn)譯后或轉(zhuǎn)譯時(shí)修飾作用的能力。尤其是中國倉鼠卵巢(Chinesehamsterovary,CHO)細(xì)胞己經(jīng)常規(guī)化地被用以表達(dá)生物醫(yī)藥蛋白以供治療與診斷。于哺乳類細(xì)胞中加強(qiáng)基因表達(dá)的既有方法包括有一以提高選擇劑(selectionagent)濃度來進(jìn)行逐步選擇的步驟。這種于哺乳類細(xì)胞中加強(qiáng)基因表達(dá)的既有方法的一實(shí)施例是采用中國倉鼠卵巢細(xì)胞并以甲氨喋呤(methotrexate,MTX，或稱"滅殺除癌錠")逐步地選擇二氫葉酸還原酶(Dihydrofolatereductase,DHFR)基因?？蓞㈤哋masa，2002,J.Biosci.Bioeng.94:600-605。然而，前述逐步選擇的方式既繁瑣又耗時(shí)。其過程需經(jīng)數(shù)月才能達(dá)到讓細(xì)胞內(nèi)基因大量表達(dá)的目的，更何況在非人類的哺乳類細(xì)胞中的轉(zhuǎn)譯后修飾與人類細(xì)胞所實(shí)行的不盡相同。且這種具有基因擴(kuò)增(geneamplification)的既有加強(qiáng)基因表達(dá)方法，并未被廣泛地用于人類細(xì)胞中以生產(chǎn)生物醫(yī)藥蛋白以供治療與診斷。一般而言，在人類細(xì)胞中產(chǎn)出的人類蛋白質(zhì)應(yīng)比以其它非人類系統(tǒng)所生的更具優(yōu)勢(shì)。研究者己觀察到一種錯(cuò)配修復(fù)(mismatchrepair,MMR)系統(tǒng)，其于人類細(xì)胞中強(qiáng)效地壓抑基因擴(kuò)增?？蓞⒄誏inetal.，2001，NucleicAcidsRes29,3304-3310;Chenetal"2001,ProcNatlAcadSciUSA98，13802-13807。因此藉由基因擴(kuò)增而加強(qiáng)的基因表達(dá)在錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)正常(MMR-normal/MMR-proficient，或記為MMR+)細(xì)胞中亦受壓抑。HCT116細(xì)胞是導(dǎo)因于hMLHl基因突變的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺陷(MMR-deficient，或記為MMR-)細(xì)胞。已知HCT116細(xì)胞能夠藉由基因擴(kuò)增加強(qiáng)基因表達(dá)。相對(duì)之下，HCT116+Ch3簾由引入含有野生型hMLHl基因的第3對(duì)染色體于其中而具備正常錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng))則壓抑藉由基因擴(kuò)增而加強(qiáng)的抗藥基因表達(dá)。
發(fā)明內(nèi)容為克服前述在哺乳類細(xì)胞中(尤其是人類細(xì)胞中)既有基因表達(dá)方法與既有加強(qiáng)基因表達(dá)方法的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠去除或改善前述問題的方法。為達(dá)到前述目的，本發(fā)明所采用的一種技術(shù)手段是提供一種表達(dá)載體(expressionvector),其包括有至少一基因、一核牽苗定(nuclearanchoring)元件以及至少一反向重復(fù)元件(invertedrepeat,IR)，其中該反向重復(fù)元件具有二側(cè)面核酸序列(lateralnucleicacidsequences),各側(cè)面核酸序列互補(bǔ)(complementary)于另一側(cè)面核酸序列。又，所述表達(dá)載體是一位于所述哺乳類細(xì)胞內(nèi)的游離型載體(印isomalvector)且是得用以轉(zhuǎn)染一哺乳類細(xì)胞的表達(dá)載體。較佳的是，所述反向重復(fù)元件進(jìn)一步包括有一中介序列(centmlsequence^其位于所述二側(cè)面核酸序列之間，且相異于所述二側(cè)面核酸序列之中的任一側(cè)面核酸序列。又，較佳的是，所述表達(dá)載體是如pGT02-GFP包括有一反向重復(fù)元件；更佳的是，所述表達(dá)載體是如pGT03-GFP或pGT04-ID包括有二反向重復(fù)元件。在所述包括有二反向重復(fù)元件的情況下，所述二反向重復(fù)元件可為彼此相同者或彼此相異。所述表達(dá)載體的基因可為一編碼一蛋白質(zhì)的基因或一可被轉(zhuǎn)錄(transcribe)為一非編碼RNA(non-codingRNA)的基因。由前述基因所編碼的蛋白質(zhì)可為但不限于信號(hào)肽(signalpeptide)、生長因子(growthfactor)、激素(hormone)、細(xì)胞介素(cytokine)、趨化因子(chemokine)、神經(jīng)肽(neuropeptide)、抗原(antigen)、抗體(antibody)、酶(enzyme，酵素)、凝血因子(clottingfactor)、抗血管生成因子(anti-angiogenicfactor)、促血管生成因子(pro-angiogenicfactor)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transportprotein)、受體(receptor)、酉己體(ligand)、調(diào)控蛋白(regulatoryprotein)、結(jié)構(gòu)蛋白(structuralprotein)、報(bào)告蛋白(reporterprotein)、轉(zhuǎn)錄因子(tmnscriptionfactor)、核糖酶(ribozyme)、融合蛋白(fiisionprotein)或耐藥蛋白(drug-resistanceprotein,抗藥蛋白)。所述蛋白質(zhì)可為天然蛋白質(zhì)(proteinofnaturalorigin)或經(jīng)人工修飾(artificiallymodified)的蛋白質(zhì)，例如作為報(bào)告蛋白的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)。所述非編碼RNA可為但不限于tRNA、rRNA、反義RNA(antisenseRNA)、微脂A(micro-脂A)或雙鏈RNA(doublestrandedRNA)。較佳的是，所述哺乳類細(xì)胞是一人類細(xì)胞，且可為一錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺陷(mismatchrepair-deficient,MMR-)細(xì)胞或一錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)正常(mismatchrepair-proficient,MMR+)細(xì)胞。所述錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺陷細(xì)胞可為但不限于一HCT116(hMLHl-)細(xì)胞或一DLD-l(hMSH6-)細(xì)胞。所述錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)正常細(xì)胞可為但不限于一HCT116+ch3細(xì)胞或一HCT116+hMLHl細(xì)胞。較佳的是，所述核錨定元件(nuclear-anchoringelement)包括有一編碼EB病毒(Epstein-BarrVirus,EBV)核蛋白EBNA-1的EB病毒基因以及一EB病毒復(fù)帝幅點(diǎn)(originofreplication)oriP。又，所述表達(dá)載體是得用以于哺乳類細(xì)胞中加強(qiáng)所述基因的表達(dá)的表達(dá)載體。本發(fā)明所采用的另一技術(shù)手段是提供一種構(gòu)成(organizedas)反向二聚體(inverteddimer，ID)的表達(dá)載體，其包括有一具有二長序列(longsequence)的環(huán)形核酸分子(circularnucleicacidmolecule),所述二長序列是被二反向重復(fù)元件所分隔；其中，所述二長序列彼此互補(bǔ)，且各長序列包括有至少一基因以及一核錨定元件；又，所述各反向重復(fù)元件具有二側(cè)面核酸序列，各側(cè)面核酸序列互補(bǔ)于另一側(cè)面核酸序列，所述二反向重復(fù)元件彼此相同或相異，而所述表達(dá)載體是得用以轉(zhuǎn)染一哺乳類細(xì)胞的表達(dá)載體；且所述表達(dá)載體是一位于所述哺乳類細(xì)胞內(nèi)的游離型載體。此外本發(fā)明另采用的又一技術(shù)手段是提供一種于一哺乳類細(xì)胞中表達(dá)一基因的方法，該方法包括有以本發(fā)明所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染所述哺乳類細(xì)胞以制成一轉(zhuǎn)染細(xì)胞(transfectedcell);培養(yǎng)(culturing)所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞以令該轉(zhuǎn)染細(xì)胞制造所述基因所編碼的蛋白質(zhì)；以及獲取所述蛋白質(zhì)等步驟。所述表達(dá)載體可以采用電穿孔法(electr叩oration)送入所述哺孔類細(xì)胞。為更進(jìn)一步描述本發(fā)明的標(biāo)的、改善及創(chuàng)新技術(shù)將配合附圖詳述于后。圖1A是關(guān)于本發(fā)明的表達(dá)載體pGT01-GFP的圖譜(map)。圖IB是關(guān)于本發(fā)明的表達(dá)載體pGT02-GFP的圖譜。圖1C是關(guān)于本發(fā)明的表達(dá)載體pGT03-GFP的圖譜。圖2是由圖1C所示表達(dá)載體pGT03-GFP制作(generating)表達(dá)載體pGT04/ID的流程圖。圖3A是以pGT03-GFP或pGT04/ID轉(zhuǎn)染的DLD-l(hMSH6-)細(xì)胞，且該轉(zhuǎn)染細(xì)胞是施以400昭/ml或1000叱/ml的潮霉素B(hygromycinB)處理。圖3B是以pGT02-GFP、pGT03-GFP或pGT04/ID轉(zhuǎn)染的HCT116(hMLHl-)細(xì)胞或HCT116+hMLHl細(xì)胞，且該轉(zhuǎn)染細(xì)胞是施以1000嗎/ml的潮霉素B處理。圖3C是呈現(xiàn)圖3A轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活群落(cokmy)數(shù)量的柱狀圖。圖3D是呈現(xiàn)圖3B中pGT03-GFP或pGT04/ID轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活群落數(shù)量的柱狀圖。圖4A是細(xì)胞數(shù)對(duì)綠色熒光強(qiáng)度(intensity)的圖表，其中所示的是以pGT04/ID轉(zhuǎn)染并施以50昭/ml、400嗎/ml或1000jig/ml潮霉素B處理的DLD-l(hMSH6-)細(xì)胞。圖4B是圖4A所示細(xì)胞的免疫印跡法(Westem-blotting，西方點(diǎn)墨法)分析圖；其以未受轉(zhuǎn)染的DLD-1細(xì)胞作為陰性對(duì)照組(negativecontrol)。又，關(guān)于其于細(xì)胞萃取物的凝膠中施用抗肌動(dòng)蛋白的單株抗體以作為蛋白質(zhì)加載量(loadinglevd)的對(duì)照組(control)則未示于本圖。具體實(shí)施方式定義用語「表達(dá)載體(expressionvector)」于此定義為一載體，尤為一游離型載體(episomalvector);其中所謂載體者，一般為一質(zhì)粒(plasmid，質(zhì)體)，其是用以被引入(introduce)—靶細(xì)胞(targetcell,標(biāo)的細(xì)胞)并于該靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一特定基因。所述表達(dá)載體可被用以制造大量的mRNA。當(dāng)所述表達(dá)載體位于所述靶細(xì)胞內(nèi)時(shí)，可藉由細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄(transcription)及轉(zhuǎn)譯(translation)機(jī)制而制造一由所述特定基因所編碼的蛋白質(zhì)。所述質(zhì)粒是具高效啟動(dòng)子(promoter)以制造大量的mRNA。一游離型載體則得被用以于其宿主細(xì)胞(hostcell)中自主地(autonomously)自我復(fù)制(self-replicating)。用語「基因(gene)」于此定義為一組核酸(nudeicacid)片段(segments)，其包括有為藉由轉(zhuǎn)錄過程(transcriptionprocess)調(diào)控并制造一功能性RNA產(chǎn)品所需的信息(information)。藉此，所述RNA即可被直接使用(例如tRNA、rRNA、snRNAs及其它如SRPRNA等非編碼RNA(non-codingRNA)、反義RNA(anti-senseRNA)或微RNA(micro-RNA))，抑或是用以引導(dǎo)(direct)蛋白質(zhì)的合成。在「一基因編碼一蛋白質(zhì)」或「一蛋白質(zhì)為一基因所編碼」等語句中，其義為所述基因是被轉(zhuǎn)錄為一mRNA，而該mRNA進(jìn)而被轉(zhuǎn)譯為一蛋白質(zhì)，且可能進(jìn)一步包括有哺乳類細(xì)胞的轉(zhuǎn)譯后及/或轉(zhuǎn)譯時(shí)修飾作用(post-and/orperi-translationalmodifications)?？赏ㄟ^所述表達(dá)載體所提《共的一種加強(qiáng)復(fù)制系統(tǒng)(enhancedreplicationsystem)于哺乳類細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)可為但不限于信號(hào)肽、生長因子、激素、細(xì)胞介素、趨化因子、神經(jīng)肽、抗原、抗體、酶、凝血因子、抗血管生成因子、促血管生成因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、受體、配體、調(diào)控蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、報(bào)告蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、核糖酶、融合蛋白或耐藥蛋白。又所述蛋白質(zhì)可為天然蛋白質(zhì)或經(jīng)人工修飾的蛋白質(zhì)。用語「報(bào)告基因(reportergene)」于此定義為一基因，其結(jié)合于另一在細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)、動(dòng)物或植物中欲使用的基因(anothergeneofinterest)。某些基因之所以被選為報(bào)告基因是因其易于檢測(cè)，或可用作選別標(biāo)志(selectablemarker)。報(bào)告基因主要被用以判斷所述欲使用基因是否已進(jìn)入細(xì)胞或是否己表達(dá)于細(xì)胞或有機(jī)體群落(organismpopulation)中。常用的報(bào)告基因包括有但不限于編碼水母綠色熒光蛋白(GFP)而能夠使細(xì)胞在紫外光下發(fā)出熒光者、編碼熒光素酶(ludferase)而能夠催化熒光素(luciferin)發(fā)光者、編碼p—半乳糖苷酶((3-galactosidase)以讓宿主細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色的lacZ基因、以及可對(duì)于氯霉素產(chǎn)生抗性的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloramphenicolacetyltransferase,CAT)基因。為報(bào)告基因所編碼的蛋白質(zhì)被稱為「報(bào)告蛋白J。用語「反向重復(fù)(invertedrepeat,IR)元件」于此定義為一核酸分子，其包括有二側(cè)面核酸序列(lateralnucleicacidsequences),且可進(jìn)一步包括有一中介序歹ij(centralsequence)。各側(cè)面核酸序列互補(bǔ)(complementary)于另一側(cè)面核酸序列。所述二側(cè)面核酸序列可形成為回文(palindrome)結(jié)構(gòu)。所述中介序列是一異于所述二側(cè)面核酸序列的短核酸序列，其插置于所述二側(cè)面核酸序列之間，從而破壞所述二側(cè)面核酸序列所形成的回文結(jié)構(gòu)。例如設(shè)一核酸具有「5'-taatccggatttccggatta-3'」的序列，其中相當(dāng)于二側(cè)面核酸序列的即分別為「5'-taatccgga-3'」與「5'陽tccggatta-3'」，而相當(dāng)于中介序列的則為「5'-tt-3'」。為數(shù)眾多的反向重復(fù)元件散見于人類基因體的不同部位。關(guān)于這些位于人類基因體的反向重復(fù)元件的信息是公眾可得而知的。例如波士頓大學(xué)(BostonUniversity)維護(hù)一反向重復(fù)數(shù)據(jù)庫(InvertedRepeatsDatabase,IRDB)并對(duì)外公開，其不僅提供關(guān)于基因體DNA中反向重復(fù)元件的信息，更包括有多種分析用工具。可參照網(wǎng)站..「https:〃tandem.bu.edu/cgi-bin/irdb/irdb.exe」，現(xiàn)提供反向重復(fù)搜尋算法(InvertedRepeatsFinderalgorithm)、査詢及篩選特定重復(fù)(repeat)元件的功能、基于序列相似度(similarity)的重復(fù)叢集運(yùn)算法(repeatclusteringalgorithms)、PCR弓|物(PCRprimer)選用功能、以及數(shù)種格式的數(shù)據(jù)下載功能。此外，前述反向重復(fù)數(shù)據(jù)庫可作為一集中式的研究平臺(tái)(centralizedresearchworkbench),其提供了供儲(chǔ)存分析結(jié)果的空間，且可在多數(shù)使用者之間共同分享數(shù)據(jù)與分析。又所述的反向重復(fù)元件可見于Lyu、Lin及Liu等人的著作(Lyuetal.，1999，J.Mol,Bio1.，285:1485-1501);且反向重復(fù)元件亦可人為設(shè)計(jì)。用語「反向二聚體(inverteddimer，ID)」于此定義為一具有二長序列(longsequence)的環(huán)形核酸分子(circularnucleicacidmolecule),所述二長序列被二反向重復(fù)元件所分隔；其中，所述二長序列彼此互補(bǔ)，且各長序列包括有至少一基因以及一核錨定元件。所述反向二聚體可自一包括有二終端(terminal)反向重復(fù)元件的直鏈形DNA(linearDNA)底物(substrate)制成。理論上，所述具有二終端反向重復(fù)元件的直鏈形DNA底物是藉由細(xì)胞中的外切核酸酶(exonuclease)或螺旋酶/核酸酶(helicase/nuclease)的作用轉(zhuǎn)變?yōu)橐粏♀彔畹腄NA中間產(chǎn)物(intermediate)。藉由螺旋酶/核酸酶的特異性可產(chǎn)出二種類的環(huán)狀反向二聚體。就第一種類而言，一針對(duì)雙鏈進(jìn)行5'端至3'端(5'—3')或3'端至5'端(3'—5')的外切核酸酶可以所述二終端反向重復(fù)元件在相對(duì)鏈的DNA上外露為突出的單鏈DNA。在所述反向重復(fù)元件處所形成終端發(fā)夾圈將令所述DNA轉(zhuǎn)變成一個(gè)具有終端圈(terminalloops)的啞鈴狀中間產(chǎn)物。后續(xù)的DNA復(fù)制過程則將所述椏鈴狀中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成環(huán)形反向二聚體。就第二種類而言，與所述相同或相異的外切核酸酶/螺旋酶可將所述直鏈形DNA底物轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂淒NA?？刹捎脝我煌馇泻怂崦富蚵菔┟缸砸欢诉M(jìn)行處理。反向重復(fù)元件藉單鏈DNA黏合(annealing)將形成具有終端圈的啞鈴狀DNA。后續(xù)的DNA復(fù)制過程則將所述啞鈴狀DNA轉(zhuǎn)變成環(huán)形反向二聚體。請(qǐng)參閱參考文獻(xiàn)所載Linetal.，2001，NucleicAcidsRes.29:3529-3538。用語「核錨定元件(nuclearanchoringelement)」于此定義為一核酸分子的核酸序列，其被保持(retain)在一細(xì)胞的細(xì)胞核中，尤其是在一人類細(xì)胞的細(xì)胞核中。此核酸分子，作為一具有所述核錨定元件的載體，是錨定于核仁(nucleus)的細(xì)胞核基質(zhì)(rmclearmatrix)中。核錨定元件的例示包括有但不限于一編碼EBV核蛋白的EBV基因(例如核抗原-l(nuclearantigen-l)[EBNA-l])及一EBV復(fù)制起點(diǎn)(例如EBV復(fù)制子(replicon)的oriP復(fù)制起點(diǎn))、一乳多泡病毒(papovavirus)復(fù)制起點(diǎn)及一乳多泡病毒大T抗原(largeTantigen)、或一多瘤病毒(polyomavirus,Py)的復(fù)制起點(diǎn)(PyOri)及大T(largeT，LT)抗原的基因(PyLT)，請(qǐng)參閱HeffemanandDennis,1991，NucleicAcidsRes.19:85-92。較受偏好的核錨定元件是前述EBV基因及EBV復(fù)制起點(diǎn)。所述EBV基因及EBV復(fù)制起點(diǎn)的錨定效果是導(dǎo)因于oriP序列的高親和性(high-affinity)基質(zhì)附著(matrixattachment)(Jankelevichetal.，1992，EMBOJ.，11，1165-1176;Mattiaetal.,1999，Virology262,9-17)以及oriP與復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合蛋白(originbindingprotein)EBNA-1之間的交互作用(interaction)(LuptonandLevine，1985，Mol.CellBiol.5，2533-2542;Polvino-BodnarandSchaffer，1992，Virology187,591-603;Yatesetal.,1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81,3806-3810)。在本發(fā)明中，構(gòu)建了包括有至少一反向重復(fù)元件或形成為反向二聚體的表達(dá)載體。這些載體可被選擇以有效地提升基因表達(dá)。當(dāng)用以表達(dá)一對(duì)抗選擇劑的抗性基因(resistancegene)時(shí)，可以在單一步驟中采用高濃度的選擇劑來選擇細(xì)胞。即使在錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)正常人類細(xì)胞之中，亦能夠迅速而有效地獲取由前述表達(dá)載體所表達(dá)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法是用以在細(xì)胞中生產(chǎn)至少一蛋白質(zhì)并包括有下列步驟(a)準(zhǔn)備一表達(dá)載體，其包括有至少一核錨定元件、至少一基因、以及至少一反向重復(fù)元件；(b)轉(zhuǎn)染所述表達(dá)載體于一哺乳類細(xì)胞以獲取一轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(c)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞以讓該轉(zhuǎn)染細(xì)胞制造一為所述基因所編碼的蛋白質(zhì)；以及(d)獲取所述蛋白質(zhì)。所述用以表達(dá)所述表達(dá)載體的基因的哺乳類細(xì)胞較佳是但不限于中國倉鼠卵巢細(xì)胞、人類胚胎腎臟細(xì)胞(HEK293)細(xì)胞、hMLHl-A的人類大腸腫瘤(HCT116)細(xì)胞、引入第3對(duì)染色體的HCT116細(xì)胞(HCT116+ch3cell)、引入hMLHl基因的HCT116細(xì)胞(HCT116+hMLHlcell)、人類結(jié)腸癌(DLD-1(hMSH6-))細(xì)胞。以下的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是用以描述本發(fā)明而非意圖限定本發(fā)明的范圍。對(duì)所屬領(lǐng)域中具有通常知識(shí)的技術(shù)人員而言，可實(shí)行的合理變化調(diào)整將不逸脫本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l構(gòu)建(Constmction)并轉(zhuǎn)染表達(dá)載體如圖1A所示，一商業(yè)上可購得的pEGFP-Nl質(zhì)粒(Clontech，CA)、一源于商業(yè)上可購得pDR2質(zhì)粒(Clontech，CA)且基于EB病毒的p220.2質(zhì)粒、以及一商業(yè)上可購得的pMAMneo質(zhì)粒(Clontech,CA)是被用以構(gòu)筑一pGT01-GFP質(zhì)粒。所述pEGFP-Nl質(zhì)粒具有多個(gè)克隆位點(diǎn)(cloningsites),包括有一BglII、一BamHI、以及一Xhol限制酶切位點(diǎn)(restrictionsites)。所述pEGFP-Nl質(zhì)粒是先以BglII限制酶與BamHI限制酶處理，以自所述多個(gè)克隆位點(diǎn)之中排除所述Xhol限制酶切位點(diǎn)，并獲取一直鏈形pEGFP-NlDNA。在經(jīng)過瓊脂凝膠(agarosegel)純化后，再讓所述直鏈形pEGFP-NlDNA進(jìn)行自我連接(self-ligation)，且以EcoRI限制酶的截切(digest)確認(rèn)Xhol限制酶切位點(diǎn)已遭排除，進(jìn)而獲取一無Xhol限制酶切位點(diǎn)的pEGFP-Nl質(zhì)粒。藉由以AflII與ApaLI限制酶截切所述無Xhol限制酶切位點(diǎn)的pEGFP-Nl質(zhì)粒，可獲取一增強(qiáng)型綠色熒光基因(EGFPgene)以及一驅(qū)動(dòng)(driving)所述增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)啟動(dòng)子。其中，所述增強(qiáng)型綠色熒光基因具有一編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白編碼序列(codingsequence)。如圖1A、圖1B及圖1C所示，一pGT01-GFP質(zhì)粒具有一核錨定元件、一潮霉素B(hygromycinB)抗性基因、一安比西林(ampicillin，氨芐青霉素)抗性基因、一HindIII限制酶切位點(diǎn)、一AflII限制酶切位點(diǎn)、一PvuII限制酶切位點(diǎn)、一XhoI限制酶切位點(diǎn)、以及一BamHI限制酶切位點(diǎn)。所述增強(qiáng)型綠色熒光基因是作為一基因被插入在所述BamHI限制酶切位點(diǎn)。其核錨定元件包括有一編碼EBV核蛋白EBNA-1的EBV基因以及一EBV的oriP復(fù)制起點(diǎn)。所述pEGFP-Nl質(zhì)粒是主要源自于所述p220.2質(zhì)粒、以及所述pMAMneo質(zhì)粒的BamHI-HindIII片段。一HPH片段是一反向重復(fù)元件，且包括有位于二端的二H片段(segment)與位于中間之一P片段。所述HPH片段是取自一pHPH質(zhì)粒。所述pHPH質(zhì)粒是自pBR322質(zhì)粒所制成(BiandLiu，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93,819-823)。所述HPH片段作為一HPH/tet片匣(cassette)存在于所述pHPH質(zhì)粒上，其是一基因開關(guān)(geneticswitch),藉由所述P段落的指向(orientation)來調(diào)控具有功能的(fimctional)四環(huán)霉素(tetracycline)基因轉(zhuǎn)錄(transcription)。削短的(shortened)所述HPH片段可藉由Nrul限制酶截切而自一pHPH質(zhì)粒(Linetal.，1997，NucleicAcidsRes.25，3009-3016)取得。一pGT02-GFP質(zhì)粒是藉由克隆(cloning)所述HPH片段至平滑的(bhmted)BamHI限制酶切位點(diǎn)作為第一反向重復(fù)元件，并藉由克隆一增強(qiáng)型綠色熒光基因至AflII限制酶切位點(diǎn)而制成。一pGT03-GFP質(zhì)粒是更進(jìn)一步克隆所述HPH片段至所述pGT02-GFP質(zhì)粒的PvuII限制酶切位點(diǎn)作為第二反向重復(fù)元件，且令所述第二反向重復(fù)元件的P片段與所述第一反向重復(fù)元件的P片段具有相反的指向。藉由限制酶截切的方式可以決定所述第一反向重復(fù)元件P片段與所述第二反向重復(fù)元件P片段間相對(duì)指向的關(guān)系。請(qǐng)配合參照?qǐng)D2，所述pGT03-GFP質(zhì)粒是以Xho1限制酶截切，并經(jīng)過凝膠純化(gel-purification)以獲取一直鏈形pGT03-GFPDNA。所述直鏈形pGT03-GFPDNA具有二端，所述第一反向重復(fù)元件與所述第二反向重復(fù)元件是分別位于所述二端。所述直鏈形pGT03-GFPDNA被變性(denatured)以獲取一變性的(denatured)DNA溶液，溶液內(nèi)含單鏈(singlestranded)直鏈形pGT03-GFPDNA。可采用相當(dāng)于所述DNA溶液容積(avolume)且最后濃度為O.lN氫氧化鈉(NaOH)溶液對(duì)前述雙鏈直鏈形pGT03-GFPDNA進(jìn)行堿性變性。等容積(anequalvolume)的0.1N鹽酸(HC1)溶液與十分之一容積的1M三羥甲基胺基甲垸(tris(hydroxymethyl)aminomethane，簡(jiǎn)稱Tris)緩沖液(pH7.8)被加入前述DNA溶液進(jìn)行中和并停止(quench)變性。被中和的DNA溶液暫時(shí)置于攝氏37度10分鐘后再移至冰上，以讓第一反向重復(fù)元件各H片段是相互黏合，并讓第二反向重復(fù)元件各H片段亦相互黏合。于所述單鏈直鏈形pGT03-GFPDNA二端形成類發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin-likestructure)，以獲取一自我黏合(self-annealing)的單鏈直鏈形pGT03-GFPDNA。如圖2所示，在所述自我黏合的單鏈直鏈形pGT03-GFPDNA的二端之間形成一間隙(gap)?？刹捎肈NA聚合酶(DNApolymerase)與連接酶(ligase)處理所述自我黏合的單鏈直鏈形pGT03-GFPDNA以封閉所述間隙并獲取一啞鈴形狀的自我黏合的單鏈直鏈形pGT03-GFPDNA(Linetal.,1997，NucleicAcidsRes.25，3009-3016;Linetal.，2001，NucleicAcidsRes.29:3529-3538)。所述啞鈴形狀的自我黏合的單鏈直鏈形pGT03-GFPDNA是被引入至一DH5a(RecA-)大腸桿菌(E.coli)之中，以進(jìn)行DNA復(fù)制(DNAreplication)并自所述啞鈴形狀的自我黏合的單鏈直鏈形pGT03-GFPDNA產(chǎn)生一雙鏈DNA質(zhì)粒(請(qǐng)參照?qǐng)D2)。所述雙鏈DNA質(zhì)粒是以Hindlll限制酶與NotI限制酶截切并進(jìn)行選擇以獲取一pGT04/ED反向二聚體。被構(gòu)建的pGT01-GFP質(zhì)粒、pGT02-GFP質(zhì)粒、pGT03-GFP質(zhì)粒、以及pGT04/ID反向二聚體，是作為表達(dá)載體，藉由電穿孔(electroporation)以轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。所述電穿孔可采用諸如商業(yè)上可得的Nuleofectorsystem(Amaxa，Germany),依據(jù)其制造者提供的指引實(shí)行。轉(zhuǎn)染細(xì)胞(transfectedcell)經(jīng)24至48小時(shí)培養(yǎng)后，加入50嗎/ml的潮霉素B以選擇穩(wěn)定的克隆(clone，殖系)。本發(fā)明的主要目的在于加強(qiáng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因表達(dá)。為此，所述可在人類細(xì)胞中復(fù)制的表達(dá)載體被設(shè)計(jì)為包括有核錨定元件，以便渡過長時(shí)間的培養(yǎng)期間。在本實(shí)施例中，所述核錨定元件包括有編碼EBV核蛋白EBNA-1的EBV基因以及EBV的oriP復(fù)制起點(diǎn)。一包括有編碼EBV核蛋白EBNA-1的EBV基因以及EBV的oriP復(fù)制起點(diǎn)的載體，或一包括有編碼EBV核蛋白EBNA-1的EBV基因以及EBV的oriP復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體皆可被稱為EBV載體。一EBV載體藉由包括有oriP序列的高親和性基質(zhì)附著區(qū)域錨定于細(xì)胞核基質(zhì)(Jankelevichetal"1992，EMBOJ.，11，1165-1176;Mattiaetal.,1999,Virology,262,9-17)。此外，oriP與復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合蛋白EBNA-1之間的交互作用對(duì)于EBV載體在靈長類細(xì)胞中的復(fù)制、分離(segregation)、以及保留(retention)而言是必要的(LuptonandLevine,1985,Mol.CellBiol,5,2533-2542;Polvino-BodnarandSchaffer，1992,Virology187,591-603;Yatesetal.，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，3806-3810)。請(qǐng)?jiān)賲㈤唸D1A、圖IB及圖1C，所述包括有EBV元件與至少一反向重復(fù)元件的表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)，是為了確認(rèn)是否可以藉由至少一反向重復(fù)元件所調(diào)控(mediate)的DNA結(jié)構(gòu)(DNArearrangement)進(jìn)而藉由被增加的藥物選擇與被增加的基因復(fù)本(copy沐加強(qiáng)基因表達(dá)。所述編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白且受巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的增強(qiáng)型綠色熒光基因是作為基因被克隆進(jìn)入所述各表達(dá)載體中。請(qǐng)配合參閱圖2，所述pGT04/ID反向二聚體是藉由反向重復(fù)元件調(diào)控的方式自所述pGT03-GFP質(zhì)粒制得。齊備細(xì)胞(準(zhǔn)備細(xì)胞)HCT116(hMLHW-之人類大腸腫瘤)細(xì)胞是來自Dr.C.R.Boland(UCSDCA)(Koietal.,1994,CancerRes.54,4308-4312;ATCC#CCL-247)。pC9MLHWT質(zhì)粒包含有由巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子所控制野生型(wild-type)hMLHl互補(bǔ)DNA(complementDNA，cDNA)，其藉電穿孔轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞以回復(fù)錯(cuò)配修復(fù)功能。所述pC9MLHWT質(zhì)粒是來自Dr.B.Vogelstein(Linetal.，NucleicAcidsRes.29，3304-3310)。其表達(dá)hMLHl蛋白的G418抗性克隆(G418-resistantclone)被稱為HCT116+hMLHl。HCT116+hMLHl細(xì)胞是于含有100嗎/mlG418的環(huán)境下培養(yǎng)。另一人類結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-l(hMSH6-)(ATCC^CCL-221)是來自Dr.ThomasA.Kunkel(NIEHS，NC)。DLD-1細(xì)胞是于添加10。/。胎牛血清(fetalbovineserum)的完整RPMI培養(yǎng)基(completeRPMImedium)中培養(yǎng)。實(shí)施例3富集測(cè)定在進(jìn)行藥物選擇(drugsdection)的24小時(shí)前，約lxl(/的未匯合細(xì)胞被殖于(seed)含有完整RPMI-1640培養(yǎng)基或添加10。/o胎牛血清(可自Gibco商業(yè)獲得)DMEM培養(yǎng)基的100x20mm培養(yǎng)皿(culturedish)中。隨著培養(yǎng)基營養(yǎng)消耗以及細(xì)胞廢棄物(cellwaste)的累積，經(jīng)過一定的期間即以新鮮的培養(yǎng)基更新老化的(aged)培養(yǎng)基。在更新培養(yǎng)基后，在各盤(plate)中加入指定濃度的潮霉素B。所述培養(yǎng)皿是培養(yǎng)于攝氏37度并添加5°/。二氧化碳的培養(yǎng)器(incubator)中。隨著潮霉素B所帶來的細(xì)胞毒性，在處理2至4日后，重新補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基予細(xì)胞。存活的群落(cokmy)在10至14日后觀察其生長狀態(tài)。將細(xì)胞殖于培養(yǎng)皿中的生長效率(platingeffidency)的測(cè)量方法是藉由將500細(xì)胞殖入100x20mm培養(yǎng)皿中，待其生長10日后再計(jì)算其群落數(shù)目。實(shí)施例4(1)測(cè)量綠色熒光蛋白生產(chǎn)量以PBS清洗細(xì)胞、并進(jìn)行胰蛋白酶處理使細(xì)胞懸浮于PBS。接著使用一熒光激發(fā)細(xì)胞分選器(FACSVantagecellsorter)(BectonDickinson,MountainView,CA)以激發(fā)波長(excitationwavelength)480nm及放射波長(emissionwavelength)525nm測(cè)定綠色熒光蛋白的綠色熒光。(2)加強(qiáng)重組基因表達(dá)作為人類結(jié)腸癌細(xì)胞的DLD-1細(xì)胞、HCT116細(xì)胞、以及HCTl16+hMLHl細(xì)胞是轉(zhuǎn)染所述各種表達(dá)載體并以50嗎/ml潮霉素B選擇穩(wěn)定克隆。于各穩(wěn)定克隆均培養(yǎng)了多個(gè)穩(wěn)定克隆細(xì)胞。各種人類結(jié)腸癌細(xì)胞采lxl0H定克隆細(xì)胞殖于培養(yǎng)皿并于包括有400(ig/ml或1000嗎/ml潮霉素B的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。如圖3A、圖3B、圖3C及圖3D所示，在1000嗎/ml潮霉素B的選擇條件下，轉(zhuǎn)染pGT04/ID反向二聚體的結(jié)腸癌細(xì)胞克隆DLD-l(MMR-)細(xì)胞與HCT116(MMR-)細(xì)胞比其它具有至少一反向重復(fù)元件的細(xì)胞具高于50倍的群落數(shù)目。請(qǐng)配合參閱圖4A，在400嗎/ml或1000昭/ml潮霉素B的選擇條件下，以流動(dòng)式細(xì)胞測(cè)量術(shù)(flowcytometiy)測(cè)得增加的綠色熒光蛋白產(chǎn)出量(yield)。實(shí)施例5蛋白質(zhì)印跡法一蛋白酶抑制劑混合物(cocktailofproteaseinhibitors)對(duì)于諸如絲氨酸(serine)、半胱氨酸(cysteine)及天冬氨酸蛋白酶(asparticproteases)與氨肽酶(aminopeptidases)等具有廣泛的特異性(specificity)。一蛋白酶抑制劑混合物可包括有4-(2-氨乙基)氟化苯磺酰(4-(2-aminoethyl)benzenesulfonylfluoride,AEBSF)、胃蛋白酶抑制劑(pepstatinA)、絲氨酸蛋白酶抑制劑(E-64)、氨肽酶抑制劑(bestatin)、亮抑酶肽(leupeptin)、以及抑胰肽酶(aprotinin)。一蛋白酶抑制劑混合物可不含金屬螯合物(metalchelator),亦得以自商業(yè)公司獲得。細(xì)胞萃取物(cellextracts)是在含有蛋白酶抑制劑混合物的溶解緩沖液(lysisbuffer)(含50mMHEPESpH7.6、0.5%SDS、1%脫氧膽酸鈉(sodiumdeoxycholate)、以及5mMEDTA)(Sigma)中制備而成。部分蛋白質(zhì)樣本是于12%SDS-PAGE瓊膠上分離，并以電轉(zhuǎn)漬(electroblot)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride)膜(Amersham)上。蛋白質(zhì)印跡法是采用一GFP抗體(ChemiconInternational)及一肌動(dòng)蛋白(actin)抗體(1-19;SantaCruzBiotechnology)進(jìn)行。接合有辣根過氧化酶(horseradishperoxidase)的二次抗體(Secondaryantibodies)(Sigma)與加強(qiáng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定系統(tǒng)(enhancedchemiluminescence)(ECL;Amersham)則被用以進(jìn)行偵測(cè)。如圖4B所示，在50昭/ml、400pg/ml或1000昭/ml潮霉素B的條件下培養(yǎng)的細(xì)胞以蛋白質(zhì)印跡法觀察到增加的綠色熒光蛋白產(chǎn)出量。結(jié)果上述實(shí)施例清楚地表示出具有核錨定元件與反向重復(fù)元件的表達(dá)載體，無論在錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺陷與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)正常細(xì)胞中都加強(qiáng)了轉(zhuǎn)染基因(transgene)的基因表達(dá)。本發(fā)明所提及的實(shí)驗(yàn)是將具有核錨定元件、一或二個(gè)反向重復(fù)元件、二抗藥基因(例如潮霉素B抗性基因與安比西林抗性基因)、以及一報(bào)告基因(例如增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至人類細(xì)胞中。如圖3A-D所示，由于更多克隆在1000潮霉素B存活，轉(zhuǎn)染細(xì)胞表示出抗藥性(drug-resistance)大幅地改善(例如對(duì)于潮霉素B抗性)。又如圖4A-B所示，由提升的熒光強(qiáng)度(intensityoffluorescence)與SDS-polyacrylamide瓊膠上較高的綠色熒光蛋白染色，可知在高濃度潮霉素B存活的克隆明顯地比低濃度潮霉素B存活的對(duì)照組克隆(其未經(jīng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染)具有較高濃度的熒光蛋白。此結(jié)果確認(rèn)了在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中基因擴(kuò)增與基因表達(dá)均受到加強(qiáng)。最為明顯的是這些改善非僅見于錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺陷細(xì)胞(其無法壓抑基因擴(kuò)增與基因表達(dá))中，在錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)正常細(xì)胞(其通常具有壓抑基因擴(kuò)增與基因表達(dá)之效果)中亦有這些改善。在本發(fā)明中構(gòu)筑的各載體中，pGT04/ID反向雙聚體作為表達(dá)載體是構(gòu)成為環(huán)狀反向二聚體(circularinverteddimer，circularID),其在宿主細(xì)胞(hostcell)中提供最高的抗藥性效果與綠色熒光蛋白濃度。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員將可以理解所使用的所述抗藥基因與綠色熒光基因可以采用編碼其它蛋白質(zhì)的基因代換，例如生長因子、激素、細(xì)胞介素、趨化因子、神經(jīng)肽、抗原、抗體、酶、凝血因子、抗血管生成因子、促血管生成因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、受體、配體、調(diào)控蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、核糖酶。雖然本發(fā)明的許多特性與優(yōu)點(diǎn)已如上記述，關(guān)于本發(fā)明詳細(xì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，上述的揭露用意在于說明本發(fā)明。對(duì)于本發(fā)明的細(xì)部可進(jìn)行修改，尤其是在本發(fā)明揭露的原則下，依照申請(qǐng)專利范圍用語最廣泛的解釋對(duì)于形狀、大小以及部件配置進(jìn)行修改。權(quán)利要求1.一種表達(dá)載體，包括有至少一基因；一核錨定元件；以及至少一反向重復(fù)元件，其具有二側(cè)面核酸序列，各側(cè)面核酸序列互補(bǔ)于另一側(cè)面核酸序列；其中，所述表達(dá)載體是得用以轉(zhuǎn)染一哺乳類細(xì)胞的表達(dá)載體；且所述表達(dá)載體是一位于所述哺乳類細(xì)胞內(nèi)的游離型載體。2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中，所述基因編碼一蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)選自由信號(hào)肽、生長因子、激素、細(xì)胞介素、趨化因子、神經(jīng)肽、抗原、抗體、酶、凝血因子、抗血管生成因子、促血管生成因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、受體、配體、調(diào)控蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、報(bào)告蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、核糖酶、融合蛋白以及耐藥蛋白所構(gòu)成的群組。3.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其中，所述蛋白質(zhì)是天然蛋白質(zhì)或經(jīng)人工修飾的蛋白質(zhì)。4.如權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其中，所述報(bào)告蛋白是增強(qiáng)型綠色熒光蛋白。5.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中，所述基因是轉(zhuǎn)錄為一RNA，該RNA選自由tRNA、rRNA、反義RNA、微RNA以及雙鏈RNA所構(gòu)成的群組。6.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中，所述哺乳類細(xì)胞是人類細(xì)胞。7.如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其中，所述人類細(xì)胞是錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺陷細(xì)胞。8.如權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體，其中，所述錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺陷細(xì)胞是HCT116(hMLHl-)細(xì)胞或DLD-l(hMSH6-)細(xì)胞。9.如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其中，所述人類細(xì)胞是錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)正常細(xì)胞。10.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中，所述核錨定元件包括有一編碼EB病毒核蛋白EBNA-1的EB病毒基因以及一EB病毒復(fù)制子oriP。11.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中，所述反向重復(fù)元件進(jìn)一步包括有一中介序列，其位于所述二側(cè)面核酸序列之間，且相異于所述二側(cè)面核酸序列之中的任一側(cè)面核酸序列。12.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中，所述至少一反向重復(fù)元件包括有一反向重復(fù)元件。13.如權(quán)利要求12所述的表達(dá)載體，該表達(dá)載體是pGT02-GFP。14.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其中，所述至少一反向重復(fù)元件包括有二反向重復(fù)元件；所述二反向重復(fù)元件彼此相同或相異。15.如權(quán)利要求14所述的表達(dá)載體，該表達(dá)載體是pGT03-GFP或pGT04-ID。16.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體該表達(dá)載體是得用以于哺乳類細(xì)胞中加強(qiáng)所述基因的表達(dá)的表達(dá)載體。17.—種包括有如權(quán)利要求1所述表達(dá)載體的人類細(xì)胞。18.如權(quán)利要求17所述的人類細(xì)胞，該人類細(xì)胞是一錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺陷細(xì)胞。19.如權(quán)利要求17所述的人類細(xì)胞，該人類細(xì)胞是一錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)正常細(xì)胞。20.—種構(gòu)成反向二聚體的表達(dá)載體其包括有一具有二長序列的環(huán)形核酸分子，所述二長序列被二反向重復(fù)元件所分隔；其中，所述二長序列彼此互補(bǔ)，且各長序列包括有至少一基因以及一核錨定元件；并且，所述各反向重復(fù)元件具有二側(cè)面核酸序列，各側(cè)面核酸序列互補(bǔ)于另一側(cè)面核酸序列；所述二反向重復(fù)元件彼此相同或相異；所述表達(dá)載體是得用以轉(zhuǎn)染一哺乳類細(xì)胞的表達(dá)載體；且所述表達(dá)載體是一位于所述哺乳類細(xì)胞內(nèi)的游離型載體。21.如權(quán)利要求20所述的表達(dá)載體，其中，所述基因編碼一蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)選自由信號(hào)肽、生長因子、激素、細(xì)胞介素、趨化因子、神經(jīng)肽、抗原、抗體、酶、凝血因子、抗血管生成因子、促血管生成因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、受體、配體、調(diào)控蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、報(bào)告蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、核糖酶、融合蛋白以及耐藥蛋白所構(gòu)成的群組。22.如權(quán)利要求20所述的表達(dá)載體胞。23.如權(quán)利要求22所述的表達(dá)載體系統(tǒng)缺陷細(xì)胞。24.如權(quán)利要求22所述的表達(dá)載體系統(tǒng)正常細(xì)胞。25.—種包括有如權(quán)利要求20所述表達(dá)載體的人類細(xì)胞。26.如權(quán)利要求25所述的人類細(xì)胞，該人類細(xì)胞是一錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺陷細(xì)胞。27.如權(quán)利要求25所述的人類細(xì)胞，該人類細(xì)胞是一錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)正常細(xì)胞。28.—種于一哺乳類細(xì)胞中表達(dá)一基因的方法，該方法包括有以權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染所述哺乳類細(xì)胞以制成、一轉(zhuǎn)染細(xì)胞；培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞以令該轉(zhuǎn)染細(xì)胞制造所述基因所編碼的蛋白質(zhì)；以及獲取所述蛋白質(zhì)。29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述基因編碼一蛋白質(zhì)，該蛋，其中，所述哺乳類細(xì)胞是人類細(xì)，其中，所述人類細(xì)胞是錯(cuò)配修復(fù)，其中，所述人類細(xì)胞是錯(cuò)配修復(fù)白質(zhì)選自由信號(hào)肽、生長因子、激素、細(xì)胞介素、趨化因子、神經(jīng)肽、抗原、抗體、酶、凝血因子、抗血管生成因子、促血管生成因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、受體、配體、調(diào)控蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、報(bào)導(dǎo)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、核糖酶、融合蛋白以及耐藥蛋白所構(gòu)成的群組。30.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述基因轉(zhuǎn)錄為一RNA，該RNA選自由tRNA、rRNA、反義RNA、微RNA以及雙鏈RNA所構(gòu)成的群組。31.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述哺乳類細(xì)胞是人類細(xì)胞。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述人類細(xì)胞是錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺陷細(xì)胞。.33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺陷細(xì)胞是HCT116(hMLHl-)細(xì)胞或DLD-l(hMSH6-)細(xì)胞。34.如權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述人類細(xì)胞是錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)正常細(xì)胞。35.—種于一哺乳類細(xì)胞中表達(dá)一基因的方法，該方法包括有以權(quán)利要求20所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染所述哺乳類細(xì)胞以制成一轉(zhuǎn)染細(xì)胞；培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞以令該轉(zhuǎn)染細(xì)胞制造所述基因所編碼的蛋白質(zhì)；以及獲取所述蛋白質(zhì)。全文摘要本發(fā)明是一種能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的表達(dá)載體，其包括有一欲表達(dá)的基因、一核錨定(nuclearanchoring)元件、及至少一反向重復(fù)(invertedrepeat，IR)元件。本發(fā)明另關(guān)于一種藉由將前述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染(transfect)于諸如人類等哺乳類細(xì)胞以加強(qiáng)基因表達(dá)的方法。文檔編號(hào)C12N15/85GK101402970SQ20081021357公開日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年9月11日優(yōu)先權(quán)日2007年10月2日發(fā)明者林景太申請(qǐng)人:摩里西斯商金鈦股份有限公司