專利名稱：：一種宮頸癌相關(guān)位點檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及疾病相關(guān)位點檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，涉及宮頸癌相關(guān)位點檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是指一種宮頸癌相關(guān)位點檢測方法。
背景技術(shù)：
：宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位，僅在乳腺癌之后。據(jù)世界范圍內(nèi)統(tǒng)計，每年大約有50萬左右的宮頸癌新發(fā)病例，占所有癌癥新發(fā)病例的5%，其中80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家。我國地域廣闊、人口眾多，每年新發(fā)病例約13.15萬，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的28.8%。近幾年來宮頸癌的年輕患者開始增加，在我國也出現(xiàn)了宮頸癌的年輕病例逐年增加的趨勢。宮頸癌的易患因素很多，主要有病毒感染、多性伴侶、早婚多育、年齡、宮頸病史、肥胖、包皮垢、吸煙、藥物史及遺傳，其中，據(jù)統(tǒng)計，在感染人類乳頭瘤病毒者中，有家族史者較其他人患癌幾率可以增加10倍。到目前為止的研究表明，至少有多個基因的變異與宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān)。因此，為了更早地預(yù)防宮頸癌的發(fā)生，需要在宮頸癌發(fā)生前就提前通過基因檢測準(zhǔn)確篩查出高風(fēng)險人群，并對這一人群進(jìn)行有針對性的健康管理，才能做到真正的早預(yù)防，再結(jié)合其它手段定期檢測，真正實現(xiàn)宮頸癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療，以達(dá)到提前進(jìn)行個性化預(yù)防的目的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種宮頸癌相關(guān)位點檢測方法，該檢測方法設(shè)計巧妙、操作簡單、檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為是否進(jìn)一步采取有針對性的健康管理以及后續(xù)的檢測手段提供參考依據(jù)。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下該宮頸癌相關(guān)位點檢測方法，其特點是，包括步驟a.提取來自人的樣本的基因組DNA;b.根據(jù)至少2個宮頸癌相關(guān)基因的每一個分別設(shè)計一對T叫man探針對和一對引物對，所述T叫man探針對的5'端和3'端分別標(biāo)記熒光報告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，分別對所述基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；c.根據(jù)熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果來判斷所述宮頸癌相關(guān)基因是否發(fā)生突變。較佳的，所述宮頸癌相關(guān)基因的數(shù)目是4個。較佳的，所述宮頸癌相關(guān)基因是FAS基因、MTHFR基因、XRCC1基因和FASL基因。更佳的，所述Taqman探針對和所述引物對用于檢測FAS基因的rs1800682位點，MTHFR基因的rsl801133位點，XRCCl基因的rsl7435395位點，F(xiàn)ASL基因的rs763110位點。較佳的，所述Taqman探針對是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標(biāo)記FAM標(biāo)記和TET標(biāo)記，3'端均標(biāo)記TAMRA標(biāo)記，所述引物對是SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。較佳的，所述Taqman探針對是SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標(biāo)記FAM標(biāo)記和HEX標(biāo)記，3'端均標(biāo)記TAMRA標(biāo)記，所述引物對是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的核苷酸序列。較佳的，所述Taqman探針對是SEQIDN0:9和SEQIDNO:IO所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標(biāo)記FAM標(biāo)記和TET標(biāo)記，3'端均標(biāo)記TAMRA標(biāo)記，所述引物對是SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示的核苷酸序列。較佳的，所述Taqman探針對是SEQIDNO:13和SEQIDN0:14所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標(biāo)記FAM標(biāo)記和TET標(biāo)記，3'端均標(biāo)記TAMRA標(biāo)記，所述引物對是SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示的核苷酸序列。本發(fā)明的創(chuàng)新點在于幾個宮頸癌有關(guān)的侯檢位點的整合，通過選取多個宮頸癌的侯檢位點，根據(jù)FAS基因、MTHFR基因、XRCCl基因和FASL基因設(shè)計特異性引物和Taqman探針對來自人的樣本的基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)產(chǎn)生的熒光的量和熒光的種類可以知道侯檢位點的基因型，設(shè)計巧妙、操作簡單、檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，將基因體檢的結(jié)果作為宮頸癌健康管理的主線，監(jiān)控疾病的發(fā)生發(fā)展。如果是宮頸癌遺傳風(fēng)險度高的人群，建議減少一切宮頸癌的外在致病因素，并每半年進(jìn)行一次檢查，做到早預(yù)防，早發(fā)現(xiàn)，早治療，延緩甚至避免疾病的發(fā)生。具體實施例方式為更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實施例作進(jìn)一步說明。1.基因組DNA提取1.l試劑和儀器1.1.1試劑和耗材基因組DNA抽提試劑盒(TIANampBLOODDNAkit,DP318-03;TIANampMicro微量樣品基因組DNA提取試劑盒，DP316;TIANamp口腔拭子基因組DNA提取試劑盒，DP322-03)含細(xì)胞裂解液CL;緩沖液GA;緩沖液GS;緩沖液GB;緩沖液GD;漂洗液PW;洗脫緩沖液TB;CarrierRNA;RNase-freeddH20;蛋白酶K(20mg/ml);吸附柱；收集管(2ML);1.5ML無菌收集管；無水乙醇。1.1.2儀器DENVILLE260離心機(jī)，XW-80A旋渦混合器，H.H.S指針式電熱恒溫水浴鍋。1.2提取步驟從全血中提取基因組DNA1.2.1取200iil的抗凝全血至1.5ml的E卯endorf管中，如果樣本的量少于200iil，則加入緩沖液GS補(bǔ)充至200ia。如果樣本量多于200iil，需要用細(xì)胞裂解液CL處理，具體步驟如下在樣品中加入1-2.5倍體積的細(xì)胞裂解液CL，顛倒混勻，10，OOOrpm離心1分鐘，吸取上清，留下細(xì)胞核沉淀(如果裂解不徹底，可重復(fù)以上步驟一次)，向離心收集到的細(xì)胞核沉淀中加200iU緩沖液GS，振蕩至徹底混勻。1.2.2加入20iil的蛋白酶K溶液，混勻，再加入200y1的緩沖液GB，立刻充分顛倒混勻。56t:水浴樣本10分鐘，水浴過程中請每隔3分鐘上下輕柔顛倒混勻樣本，溶液應(yīng)變清亮。(如溶液未徹底變清亮，可延長裂解時間至溶液變清亮為止)。1.2.3加入200y1無水乙醇，充分顛倒混勻，這時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。41.2.4將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。1.2.5向吸附柱中加入500ill緩沖液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，000rpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。1.2.6向吸附柱中加入700ill漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，000rpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。1.2.7向吸附柱中加入500iil漂洗液PW，12，000rpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液。1.2.8將吸附柱放回收集管中，12，OOOrpm(13，400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。1.2.9將吸附柱轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50-200ii1洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5分鐘，12，OOOrpm(13，400Xg)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。注意洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50iU，體積過小影響回收效率。為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12，OOOrpm(13，400Xg)離心2分鐘。洗脫液的pH對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)(可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍)，pH值低于7.0會降低洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在_20°C，以防DNA降解。2.Taqman探針法檢測侯檢位點2.1實驗試劑及儀器2.1.1實驗試劑熒光定量試劑:ABITaqMan2XPCRMastermix(P/N:4326614，Lot:G15502)。普通PCR試劑寶生物工程(大連)有限公司的ExTaqDNA聚合酶(P/N:DRR100B，Lot:CKA1801A)。2.1.2實驗儀器ABI9700型PCR儀和ABI7900HT型熒光定量PCR儀。2.1.3檢測位點探針及引物表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2.2.3根據(jù)反應(yīng)過程中釋放的熒光的量和熒光的種類來判斷對應(yīng)候選位點的基因型。3.結(jié)果分析根據(jù)最終終點讀板結(jié)果分型圖進(jìn)行分析，結(jié)果如下反應(yīng)1:用于檢測FAS基因的rsl800682位點，該候檢位點在人群中有三種基因型TT，CT和CC，其中攜帶TT基因型為正常人群，攜帶CT和CC基因型的人群較攜帶TT基因型的人群有較高的風(fēng)險罹患宮頸癌，患病風(fēng)險幾率大小CC型〉CT型〉TT型，分型圖分析結(jié)果表明rsl800682位點為CT，非正常基因型；反應(yīng)2:用于檢測MTHFR基因的rsl801133位點，該候檢位點在人群中有三種基因型CC，CT和TT，其中攜帶CC基因型為正常人群，攜帶CT和TT基因型的人群較攜帶CC基因型的人群有較高的風(fēng)險罹患宮頸癌，患病風(fēng)險幾率大小TT型>CT型>CC型，分型圖分析結(jié)果表明rsl801133位點為TT，非正?；蛐?；反應(yīng)3:用于檢測XRCC1基因的rsl7435395位點，該候檢位點在人群中有三種基因型GG，AG和AA，其中攜帶GG和GA基因型為正常人群，攜帶AA基因型的人群較攜帶GG和GA基因型的人群有較高的風(fēng)險罹患宮頸癌，患病風(fēng)險幾率大小AA型>AG型和GG型，分型圖分析結(jié)果表明rsl7435395位點為GG，正常基因型；反應(yīng)4:用于檢測FASL基因的rs763110位點，該候檢位點在人群中有三種基因型TT，CT和CC，其中攜帶TT基因型為正常人群，攜帶CT和CC基因型的人群較攜帶TT基因型的人群有較高的風(fēng)險罹患宮頸癌，患病風(fēng)險幾率大小CC型〉CT型〉TT型，分型圖分析結(jié)果表明rs763110位點為CT，非正常基因型；根據(jù)上述檢測結(jié)果，可以判斷上述受檢的FAS基因、MTHFR基因、FASL基因異常，僅XRCC1基因正常，受檢者較正常人患宮頸癌的幾率要高不少，其患宮頸癌的遺傳傾向?qū)儆谥卸蕊L(fēng)險人群，需要進(jìn)行專門的針對性的健康管理，但是是否已經(jīng)患有宮頸癌，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的檢查，因為其與多種因素有關(guān)。如果其中沒有基因異常，則基本無需進(jìn)行專門的針對性的健康管理，但是如果其中更多個基因異常，那么就更需要進(jìn)行進(jìn)一步的宮頸癌檢查以確定是否已經(jīng)患有宮頸癌，并進(jìn)行專門的針對性的健康管理。綜上所述，本發(fā)明的宮頸癌相關(guān)位點檢測方法設(shè)計巧妙、操作簡單、檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為是否進(jìn)一步采取有針對性的健康管理以及后續(xù)的檢測手段提供參考依據(jù)。需要說明的是，在本發(fā)明中提及的所有文獻(xiàn)在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，以上所述的是本發(fā)明的具體實施例及所運用的技術(shù)原理，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改而不背離本發(fā)明的精神與范圍，這些等價形式同樣落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。序列表〈110〉上海基康生物技術(shù)有限公司〈120〉一種宮頸癌相關(guān)位點檢測方法〈160>16〈210>1〈211>26〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1).(26)〈223〉根據(jù)人FAS基因序列設(shè)計的Taqman探針〈400>1tgtccattccagaaacgtctgtgagc26〈210>2〈211>27〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1).(27)〈223〉根據(jù)人FAS基因序列設(shè)計的Taqman探針〈400〉2actgtccattccaggaacgtctgtgag27〈210>3〈211>19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1).(19)〈223〉根據(jù)人FAS基因序列設(shè)計的上游引物〈400〉3gccctatggcgcaacatct19〈210>4〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1).(21)〈223〉根據(jù)人FAS基因序列設(shè)計的下游引物〈400〉4tgactgggctgtccatgttgt21<210>5〈211>22:0109]〈212>DNA:0110]〈213>人工序列:0川]〈220>:0112]〈221>misc_feature:0113]〈222>(1)...(22):0114]〈223〉根據(jù)人MTHFR基因序列設(shè)計的Taqman探針:0115]<400>5:0116]gtctgcgggagccgatttcatc22:0117]〈210>6:0118]〈211>24:0119]〈212>DNA:0120]〈213>人工序列:0121]〈220〉:0122]〈221>misc_feature:0123]〈222>(1)..(24):0124]〈223〉根據(jù)人MTHFR基因序列設(shè)計的Taqman探針:0125]〈400>6:0126]tgtctgcgggagtcgatttcatca24:0127]〈210>7:0128]〈211>21:0129]〈212>DNA:0130]〈213>人工序列:0131]〈220〉:0132]〈221>misc_feature:0133]〈222〉(1).(21):0134]〈223〉根據(jù)人MTHFR基因序列設(shè)計的上游引物:0135]〈400>7:0136]ggctgacctgaagcacttgaa21:0137]〈210>8:0138]〈211>17:0139]〈212>DNA:0140]〈213>人工序列:0141]〈220〉:0142]<221>misc—feature:0143]〈222>(1)...(17)〈223〉根據(jù)人MTHFR基因序列設(shè)計的下游引物〈400>8tgcccatgtcggtgcat17〈210〉99<211〉23〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(1).(23)〈223〉根據(jù)人XRCCl基因序列設(shè)計的Taqman探針〈400〉9ctgccctcccagaggtaaggcct23<210〉10〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(1).(21)〈223〉根據(jù)人XRCCl基因序列設(shè)計的Taqman探針〈400〉10ctgccctcccggaggtaaggc21〈210>11〈211>21<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈22l>misc_feature〈222〉(1).(21)〈223〉根據(jù)人XRCCl基因序列設(shè)計的上游引物〈400〉11aaggagtgggtgctggactgt21〈210>12<211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(1)..(21)〈223〉根據(jù)人XRCCl基因序列設(shè)計的下游引物〈400>12tctgactcccctccagattcc0187]〈210>130188]〈211>190189]〈212>DNA0190]〈213〉人工序列0191]〈220〉0192]〈221〉misc—feature0193]〈222〉(1).(19)0194]〈223>根據(jù)人FASL基因序列設(shè)計的T叫man探針0195]〈400>130196]朋cattgtga肌tec;aaag0197]〈210〉140198]〈211>140199]〈212>DNA0200]〈213〉人工序列0201]〈220〉:0202]〈221>misc_feature:0203]〈222〉(1).(14):0204]〈223〉根據(jù)人FASL基因序列設(shè)計的T叫man探針:0205]〈400>14:0206]3C3ttgcgaaatec:0207]<210>15:0208]〈211〉23:0209]〈212>DNA:0210]〈213〉人工序列:02"]〈220〉:0212]〈221>misc_feature:0213]〈222〉(1)...(23):0214]〈223〉根據(jù)人FASL基因序列設(shè)計的上游引物:0215]〈400>15:0216]朋ctgggc朋3c朋tg3朋3tga:0217]〈210>16<211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220>〈22l>misc—feature〈222〉(1)...(21)〈223〉根據(jù)人FASL基因序列設(shè)計的下游引物〈400>16caaaccagtggaacccacaga2權(quán)利要求一種宮頸癌相關(guān)位點檢測方法，其特征在于，包括步驟a.提取來自人的樣本的基因組DNA；b.根據(jù)至少2個宮頸癌相關(guān)基因的每一個分別設(shè)計一對Taqman探針對和一對引物對，所述Taqman探針對的5’端和3’端分別標(biāo)記熒光報告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，分別對所述基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；c.根據(jù)熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果來判斷所述宮頸癌相關(guān)基因是否發(fā)生突變。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宮頸癌相關(guān)位點檢測方法，其特征在于，所述宮頸癌相關(guān)基因的數(shù)目是4個。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的宮頸癌相關(guān)位點檢測方法，其特征在于，所述宮頸癌相關(guān)基因是FAS基因、MTHFR基因、XRCC1基因和FASL基因。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的宮頸癌相關(guān)位點檢測方法，其特征在于，所述T叫man探針對和所述引物對用于檢測FAS基因的rsl800682位點，MTHFR基因的rsl801133位點，XRCC1基因的rs17435395位點，F(xiàn)ASL基因的rs763110位點。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宮頸癌相關(guān)位點檢測方法，其特征在于，所述T叫man探針對是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標(biāo)記FAM標(biāo)記禾口TET標(biāo)記，3'端均標(biāo)記TAMRA標(biāo)記，所述引物對是SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宮頸癌相關(guān)位點檢測方法，其特征在于，所述Taqman探針對是SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標(biāo)記FAM標(biāo)記和HEX標(biāo)記，3'端均標(biāo)記TAMRA標(biāo)記，所述引物對是SEQIDNO:7禾PSEQIDNO:8所示的核苷酸序列。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宮頸癌相關(guān)位點檢測方法，其特征在于，所述Taqman探針對是SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標(biāo)記FAM標(biāo)記和TET標(biāo)記，3'端均標(biāo)記TAMRA標(biāo)記，所述引物對是SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12所示的核苷酸序列。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宮頸癌相關(guān)位點檢測方法，其特征在于，所述Taqman探針對是SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示的核苷酸序列，所述Taqman探針對的5'端分別標(biāo)記FAM標(biāo)記和TET標(biāo)記，3'端均標(biāo)記TAMRA標(biāo)記，所述引物對是SEQIDN0:15和SEQIDNO:16所示的核苷酸序列。全文摘要本發(fā)明涉及一種宮頸癌相關(guān)位點檢測方法，包括步驟提取來自人的樣本的基因組DNA；根據(jù)至少2個宮頸癌相關(guān)基因的每一個分別設(shè)計一對Taqman探針對和一對引物對，所述Taqman探針對的5’端和3’端分別標(biāo)記熒光報告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，分別對所述基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；根據(jù)熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果來判斷所述宮頸癌相關(guān)基因是否發(fā)生突變，較佳的，Taqman探針對和引物對用于檢測FAS基因的rs1800682位點，MTHFR基因的rs1801133位點，XRCC1基因的rs17435395位點，F(xiàn)ASL基因的rs763110位點，本發(fā)明設(shè)計巧妙、操作簡單、檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為是否進(jìn)一步采取有針對性的健康管理以及后續(xù)的檢測手段提供參考依據(jù)。文檔編號C12Q1/68GK101760529SQ200810208220公開日2010年6月30日申請日期2008年12月26日優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日發(fā)明者趙翊均,陳奕雄申請人:上?；瞪锛夹g(shù)有限公司