一種基于solid測序技術的基因snp位點檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程領域，尤其涉及一種基于SOLID測序的SNP位點檢測方法。其具體步驟如下：（1）通過SOLID測序獲得待測基因樣本的顏色序列；（2）預備參考序的顏色序列；（3）制備顏色編碼參考序的索引表以備快速定位樣本序；（4）將SOLID測序樣本序和顏色編碼參考序進行比對，找出樣本序在參考序中的最佳匹配位置；比對樣本序與參考序，獲取顏色編碼匹配信息；（5）根據(jù)顏色編碼的匹配信息，分析SOLID樣本序與顏色編碼的參考序的堿基匹配信息，確定不確定變異點；（6）統(tǒng)計獲得的不確定變異點，去除噪聲和測序錯誤導致的不確定變異點，從而獲得樣本SNP位點。采用本發(fā)明的SNP檢測方法，既保持了SOLID數(shù)據(jù)在比對過程中定位準確度高的特性，又提高了分析SNP方法的準確度。
【專利說明】—種基于SOLID測序技術的基因SNP位點檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領域，尤其涉及SNP位點的檢測方法。
【背景技術】
[0002]單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP),即指由于單個核苷酸堿基的改變而導致的核酸序列的多態(tài)性。在不同個體的同一條染色體或同一位點的核苷酸序列中，絕大多數(shù)核苷酸序列一致而只有一個堿基不同的現(xiàn)象，就是SNP。由于SNP在人類基因組中數(shù)量較多，發(fā)生頻率較高，因此被認為是繼微衛(wèi)星之后的新一代遺傳學標記，在醫(yī)學遺傳學、藥物遺傳學、疾病遺傳學、疾病診斷學、以及人類進化等研究領域都有很高的研究價值和應用前景。
[0003]SOLiD全稱為supported oligo ligation detetion,它的獨特之處在于以四色熒光標記寡核苷酸的連續(xù)連接合成為基礎，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應，可對單拷貝DNA片段進行大規(guī)模擴增和高通量并行測序。其無以倫比的準確性、系統(tǒng)可靠性和可擴展性更讓它從其他新一代測序平臺中脫穎而出。SOLiD流程獲得的嚴密的DNA片段范圍，使研究人員可以鑒別出很寬范圍內的插入和缺失片段，結構重排也能很容易鑒別出來。這個平臺的超高通量使研究人員可輕而易舉地獲得高度基因組覆蓋率的數(shù)據(jù)，精確鑒定個體基因組中存在的數(shù)百萬個單堿基多態(tài)性SNP，揭示大量此前未知、具有潛在醫(yī)學價值的遺傳變異，從而促進我們對正常/疾病狀態(tài)下DNA結構變異的了解，以及在更高的分辨率下對結構變異進行深入分析，解釋個體之間的易感性差異和對疾病治療應答的差異，最終實現(xiàn)個性化醫(yī)療。
[0004]隨著SOLiD測序技術的發(fā)展，相應的SNP檢測方法也有了很好的發(fā)展，然而，由于新測序技術產生的測序片段與以往相比有顯著的差異，目前基于SOLiD測序技術的SNP檢測方法經(jīng)常產生大量的假陽性SNP位點，因此現(xiàn)有的SNP檢測方法難以滿足高通量測序技術的要求 。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種基于SOLiD測序的SNP檢測方法，旨在解決現(xiàn)有的SNP位點檢測方法難以滿足高通量測序技術的要求并且產生大量假陽性SNP位點的技術問題。
[0006]為解決上述技術問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種基于SOLiD測序的SNP位點檢測方法，具體步驟如下:
(1)通過SOLiD測序獲得待測基因樣本的顏色序列；
(2)預備參考序的顏色序列，按照“雙堿基編碼矩陣”，將堿基參考序編碼為顏色編碼
序;
(3)制備顏色編碼參考序的索引表以備快速定位樣本序；
(4)將SOLID測序樣本序和顏色編碼參考序進行比對，找出樣本序在參考序中的最佳匹配位置；比對樣本序與參考序，獲取顏色編碼匹配信息；(5)根據(jù)顏色編碼的匹配信息，分析SOLiD樣本序與顏色編碼的參考序的堿基匹配信息，確定不確定變異點；
(6)統(tǒng)計獲得的不確定變異點，去除噪聲和測序錯誤導致的不確定變異點，從而獲得樣本SNP位點。
[0007]在本發(fā)明的一個實施方案中,在步驟(3)中，所述索引表采用bowtie變換來預制顏色編碼參考序的bowtie索引表，或采用hash表預制顏色編碼參考序的索引表。
[0008]在本發(fā)明的另一個實施方案中，在步驟(5 )中，為避免所述分析SOLiD樣本序與顏色編碼的參考序的堿基匹配信息中出現(xiàn)的堿基轉換錯誤，采用如下方法降低由測序錯誤引起的堿基轉換錯誤(流程圖見附圖2):
當樣本序在位置P出現(xiàn)顏色編碼與參考序顏色不一致時，連續(xù)檢查其后的三個顏色編碼是否出現(xiàn)與參考序的不匹配，若三個連續(xù)編碼范圍之內出現(xiàn)不匹配的情況則繼續(xù)向后檢查，直至在位置P+n，p+n+1, p+n+2出現(xiàn)三個與參考序完全一致的顏色編碼，將樣本序在位置P至位置P+n之間的顏色編碼{cl，c2…cn}作為局部顏色編碼序列，從參考序中取出位置P的堿基b,根據(jù)轉換矩陣將{cl，c2…cn}轉換為堿基序{bl，b2…bn},與參考序位置P至p+n的堿基序{rl, r2…rn }比較,進而得出堿基匹配信息；若樣本序在p+n處的堿基bn與對應的參考序堿基rn不一致,將P至p+n標注為不確定變異點。所述三個編碼范圍之內出現(xiàn)不一致的情況為三個連續(xù)顏色編碼中任一編碼出現(xiàn)與參考序顏色編碼不一致即認定三個編碼范圍之內出現(xiàn)不匹配的情況。
[0009]SOLiD測序完成后，獲得了由顏色編碼組成的SOLiD原始序列。理論上來說，按照“顏色轉換矩陣”(表1)，只要知道所測DNA序列中任何一個位置的堿基類型，就可以將SOLiD原始顏色序列“解碼”成堿基序列。但由于雙堿基編碼規(guī)則中雙堿基與顏色信息的兼并特性(一種顏色對應4種堿基對)，前面堿基的顏色編碼直接影響緊跟其后堿基的解碼，所以一個錯誤顏色編碼就會引起“連鎖解碼錯誤”。
[0010]SOLID樣本序文件以0，1，2，3代表藍，綠，黃，紅四種顏色編碼，已知某顏色編碼序列為0102定位在參考序位置P處，假設參考序在位置P的堿基為A,轉換后得出0102對應的堿基序列為ACCT，即為樣本在P至p+4區(qū)域的堿基序。
[0011]表1:顏色轉換矩陣
【權利要求】
1.一種基于SOLiD測序的SNP位點檢測方法，其特征在于，具體步驟如下: (1)通過SOLiD測序獲得待測基因樣本的顏色序列； (2)預備參考序的顏色序列，按照“雙堿基編碼矩陣”，將堿基參考序編碼為顏色編碼序; (3)制備顏色編碼參考序的索引表以備快速定位樣本序； (4)將SOLID測序樣本序和顏色編碼參考序進行比對，找出樣本序在參考序中的最佳匹配位置；比對樣本序與參考序，獲取顏色編碼匹配信息； (5)根據(jù)顏色編碼的匹配信息，分析SOLiD樣本序與顏色編碼的參考序的堿基匹配信息，確定不確定變異點； (6)統(tǒng)計獲得的不確定變異點，去除噪聲和測序錯誤導致的不確定變異點，從而獲得樣本SNP位點。
2.根據(jù)權利要求1所述的SNP位點檢測方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述索引表采用bowtie變換來預制顏色編碼參考序的bowtie索引表,或采用hash表預制顏色編碼參考序索引表。
3.根據(jù)權利要求1所述的SNP位點檢測方法，其特征在于，在步驟(5)中，為避免所述分析SOLiD樣本序與顏色編碼的參考序的堿基匹配信息中出現(xiàn)的堿基轉換錯誤，采用如下方法降低由測序錯誤引起的堿基轉換錯誤: 當樣本序在位置P出現(xiàn)顏色編碼與參考序顏色不一致時，連續(xù)檢查其后的三個顏色編碼是否出現(xiàn)與 參考序的不匹配，若三個連續(xù)編碼范圍之內出現(xiàn)不匹配的情況則繼續(xù)向后檢查，直至在位置P+n，P+n+1, p+n+2出現(xiàn)三個與參考序完全一致的顏色編碼，將樣本序在位置P至位置P+n之間的顏色編碼{cl，c2…cn}作為局部顏色編碼序列，從參考序中取出位置P的堿基b,根據(jù)轉換矩陣將{cl，c2…cn}轉換為堿基序{bl，b2…bn},與參考序位置P至p+n的堿基序{rl, r2…rn}比較,進而得出堿基匹配信息；若樣本序在p+n處的堿基bn與對應的參考序堿基rn不一致,將P至p+n標注為不確定變異點。
4.根據(jù)權利要求1所述的SNP位點檢測方法，其特征在于，步驟(6)中，所述去除噪聲和測序錯誤導致的不確定變異點通過分析下列指標實現(xiàn)，具體指標如下: 評估位置為P，變異堿基為X的不確定變異點為SNP位點的可信度通過以下參數(shù)進行評估: (1)Mutation Percentage,變異百分比，其公式為: k=在位置P發(fā)生變異的樣本數(shù)/覆蓋位置P的所有樣本數(shù)X 100% ； (2)Allel Percentage, Allel堿基百分比，其公式為: 1=在位置P堿基為X的樣本數(shù)/覆蓋位置P的所有樣本數(shù)X 100% ； (3)Forward Reverse Balance Score,正反向平衡分，其公式為: m=覆蓋位置P的正向樣本數(shù)/覆蓋位置P的反向樣本數(shù)X 100% ； (4)Allel Forward Reverse Balance Score, Allel 正反向平衡分，其公式為: η=在位置P堿基為X的正向樣本數(shù)/在位置P堿基為X的反向樣本數(shù)X 100%。
5.根據(jù)權利要求4所述的SNP位點檢測方法，其特征在于，當評估位置P的k值>20%,I值≥5%，m值≥20%及η值≥80%時，即認定位置為P的不確定變異點為SNP位點，當評估位置P的k值〈20%，I值<5%，m值〈20%或η值〈80%時，即認定位置為P的不確定變異點為假陽性SNP位點。
【文檔編號】C12Q1/68GK103451279SQ201310351267
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月11日 優(yōu)先權日:2013年9月11日
【發(fā)明者】鄧彥, 王月蘭, 倪受庸, 劉新華 申請人:北京華生恒業(yè)科技有限公司, 江蘇華生恒業(yè)科技有限公司