專利名稱：一種產(chǎn)油酵母菌株及其制備生物油脂的方法
一種產(chǎn)油酵母菌株及其制備生物油脂的方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種產(chǎn)油酵母菌株及其制備生
物油脂的方法，涉及菌種為7Wc/20spora"cMta"ew附CXl，保藏號(hào)為CGMCC No. 2527。
背景技術(shù)：
隨著石油資源的日益緊缺、石油價(jià)格的不斷上漲、油品供需矛盾的曰漸 顯現(xiàn)及環(huán)境污染問題的更加突出，多渠道開發(fā)可再生油脂資源成為必然。生 物柴油具有能量密度高、含硫量低、燃燒充分、潤(rùn)滑性好等優(yōu)良性能，還具
有可再生、易生物降解、儲(chǔ)運(yùn)安全、抗爆性能好等特點(diǎn)，可作為優(yōu)質(zhì)的石化 柴油代用品。
制備生物柴油的原料現(xiàn)在主要是以植物油脂為主，原料成本占總生產(chǎn)成 本的70% 85%。成本問題顯然成為限制生物柴油廣泛使用的最主要問題。 只有降低成本，生物柴油才具廣闊的商業(yè)化應(yīng)用前景。根據(jù)國(guó)外經(jīng)驗(yàn)，發(fā)展 油料作物產(chǎn)業(yè)似乎可以為生物柴油提供原料。然而，我國(guó)現(xiàn)有耕地資源貧乏， 可用來發(fā)展能源作物的耕地十分有限，依靠種植油料作物為生物柴油提供油 源不符合我國(guó)國(guó)情。而在適宜條件下，某些微生物產(chǎn)生并貯存的油脂占其生 物總量的20%以上，具有這樣表型的菌株稱為產(chǎn)油微生物。已知細(xì)菌、酵母、 霉菌、藻類中都有能生產(chǎn)油脂的菌株，但以酵母菌和霉菌為主。微生物油脂 又稱單細(xì)胞油脂，是指由微生物在一定條件下產(chǎn)生并儲(chǔ)存在菌體內(nèi)的甘油脂，其脂肪酸組成與一般的植物油脂相似，仍以C16， C18系脂肪酸，如棕櫚酸、 硬脂酸、油酸和亞油酸等飽和和不飽和的脂肪酸為主。可以作為植物油的替 代品成為制備生物柴油的原料。
生物質(zhì)纖維原料是地球上最豐富的可再生資源，廣泛存在于農(nóng)副產(chǎn)業(yè)及 林產(chǎn)業(yè)的木質(zhì)廢棄物，以及以農(nóng)產(chǎn)品、林產(chǎn)品為原料的工業(yè)(如造紙業(yè))廢棄物 中，是巨大的再生資源。生物質(zhì)原料一般由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等組 成，通過工業(yè)微生物技術(shù)轉(zhuǎn)化和利用以木質(zhì)纖維素為主的可再生資源制備液 體能源產(chǎn)品一生物柴油，已成為社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的迫切要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種產(chǎn)油酵母菌株及其制 備生物油脂的方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的-本發(fā)明的產(chǎn)油酵母菌株的誘變篩選方法簡(jiǎn)述如下
本發(fā)明提供一種皮狀絲孢酵母7Wc/zo5pora" CX1,為華東理工
大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物質(zhì)能源研究中心以7hW20^WO" CGMCC 2.1374為出發(fā)菌株經(jīng)Co60誘變后，以乙酸鈉為抗性篩選標(biāo) 志連續(xù)培養(yǎng)得到，于2008年5月28日被中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中心(CGMCC)登記保藏，編號(hào)為CGMCCNo.2527。
所述的皮狀絲孢酵母有以下微生物學(xué)特征
1.形態(tài)學(xué)上特征為
(1) 細(xì)胞形態(tài)，呈圓形，橢圓形或者柱形；
(2) 大小為3 6x4 10nm;(3) 菌體內(nèi)部含有非常清楚的脂質(zhì)體，呈透明狀，內(nèi)部包含油脂，易被 蘇丹黑染色；
(4) 菌落為白色，呈奶酪狀，光滑； 2.該菌株的生理生化特征為
(1) 本菌株可以利用經(jīng)過稀硫酸或蒸汽膨爆預(yù)處理后再酶解的木質(zhì)纖維 素水解液生長(zhǎng)；
(2) 培養(yǎng)時(shí)間3 6天；
(3) 對(duì)氧氣的需求好氣；
(4) 具有較強(qiáng)的乙酸抗性，其中乙酸鈉的抗性濃度為0.9% 1.2%;
(5) 可以利用的碳源葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖中的 一種或幾種；
(6) 生長(zhǎng)pH范圍5.0 6.0;
(7) 生長(zhǎng)最適宜溫度28 30°C;
(8) 生成生物油脂主要成份C16， C18系飽和和不飽和脂肪酸，為棕
櫚酸，硬脂酸，油酸，亞麻酸，棕櫚油酸中的一種或幾種。
本酵母菌是7Hc/2o^ora" cwto"wm CGMCC 2.1374的突變株；與原始酵母 相比，本酵母菌可以在含有較高濃度的乙酸鈉水解液中生長(zhǎng)，而原始菌株不 生長(zhǎng)；并且在蒸汽膨爆預(yù)處理的酶水解液中，較之原始菌株在油脂產(chǎn)量方面 有很大的提高。
本發(fā)明的7Wc/zos/7oraw CX1，可以利用木質(zhì)纖維素水解液生產(chǎn)
生物油脂，主要包括以下步驟
(1)稀酸預(yù)處理液或蒸汽膨爆預(yù)處理酶水解液的制備-利用農(nóng)作物秸稈，經(jīng)過稀硫酸或蒸汽膨爆預(yù)處理，獲得的預(yù)處理后的秸稈經(jīng)過纖維素酶的酶水解生成水解液，經(jīng)過堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH, pH為5.0 6.0; 所述的農(nóng)作物秸稈選自玉米秸桿，汽爆玉米秸桿，小麥秸稈或者稻子秸
稈中的一種，優(yōu)選玉米秸桿；
所述的稀硫酸預(yù)處理?xiàng)l件是在140 25(TC下，預(yù)處理0.5 60分鐘；
所述的蒸汽膨爆預(yù)處理是由吉林燃料乙醇有限公司完成；
所述的酶選自Spezyme CP，纖維素酒精酶Accellerase或者Novozyme 188
中的一種或幾種；Spezyme CP購(gòu)買于美國(guó)杰能科有限公司，纖維素酒精酶
Accellerase購(gòu)買于無錫杰能科有限公司，Novozyme 188購(gòu)買于美國(guó)Sigma公
司；
所述的堿性物質(zhì)為Ca(OH)2溶液或者NaOH溶液中的一種；優(yōu)選為 Ca(OH)2溶液；
(2) 7Wc/zosporaw cwtowe^w CXI禾中子培養(yǎng)
從平板上選取一環(huán)菌落接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成如下
培養(yǎng)基組份質(zhì)量百分比為，葡萄糖2% 5%，酵母粉0.05% 0.1%， (NH4)2S04 0.10/o 5%， KH2P04 0.05% 5%; MgS04.7H20 0.01% 1%; pH 5.8 6.0，搖瓶裝液量10 30%，培養(yǎng)溫度為28 30°C，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 200 轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間為20 28小時(shí)；
(3) 7h'c/705/ oraw cwtowewm CXI搖瓶發(fā)酵
在步驟(1)的預(yù)處理液或酶水解液中添加無機(jī)鹽，水解液組份由高效液 相色譜測(cè)得，其組份為各種糖和有機(jī)物；接種量為2 10%，培養(yǎng)時(shí)間為96 120小時(shí)，其他發(fā)酵條件與種子培養(yǎng)相同；培養(yǎng)結(jié)束離心收集細(xì)胞，破壁提取 生物油脂；
所述的無機(jī)鹽，組份質(zhì)量百分比為，(NH4)2S04 0.1% 5%， KH2P040.05% 5%， MgS04.7H20 0.01% 1%;
所述的糖選自葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖或者甘露糖中的一種或 幾種；所述的糖優(yōu)選為葡萄糖；
所述的有機(jī)物選自有機(jī)酸，呋喃化合物或者苯酚化合物中的一種； 所述的有機(jī)酸選自乙酸、甲酸、乙酰丙酸或者乳酸中的一種，優(yōu)選為乙
酸；
所述的呋喃化合物選自糠醛或者5-羥甲基糠醛中的一種，優(yōu)選為糠醛； 所述的苯酚化合物選自香草醛、丁香醛或者4-羥甲基苯甲醛中的一種， 優(yōu)選為4-羥甲基苯甲醛。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果是
制備生物柴油的原料現(xiàn)在主要是以植物油脂為主，原料成本占總生產(chǎn)成 本的70% 85%。成本問題現(xiàn)在顯然^K為限制生物柴油廣泛使用的最主要問 題。在使用產(chǎn)油微生物生產(chǎn)的油脂代替植物有作為生產(chǎn)生物柴油的原料以后， 成本問題依然存在。如若使菌體生長(zhǎng)良好，就要在培養(yǎng)基中加入大量的營(yíng)養(yǎng) 物質(zhì)，如葡萄糖，木糖，蛋白胨和酵母粉等等物質(zhì)，這無疑也為產(chǎn)業(yè)化增加 了成本的問題。而木質(zhì)纖維素作為一種大量存在的農(nóng)業(yè)廢棄物，就可以解決 這一問題。在將其用酸或酶解后，就可以產(chǎn)生大量的可被微生物利用的糖。 但是這一過程中，也會(huì)產(chǎn)生很多的抑制物。抑制物的存在對(duì)菌體的生長(zhǎng)是極 為不利的，在濃度很高的情況下甚至可以完全抑制菌體的生長(zhǎng)。本發(fā)明的目 的就是要通過誘變的方法使原本在水解液中不能生長(zhǎng)代的菌株可以生長(zhǎng)，并 且再不添加酵母粉和蛋白胨這一類物質(zhì)的前提下使菌株可以代謝生產(chǎn)生物油 脂并且具有較高的含油量，而生成的油脂組成與植物油類似，可以作為生產(chǎn) 生物柴油的原料，與現(xiàn)在的其他工藝(在合成培養(yǎng)集中還需要添加大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)才能獲得較高的油脂產(chǎn)量)相比較大大降低了生物柴油的生產(chǎn)成本， 為產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
以下提供本發(fā)明一種產(chǎn)油酵母菌株及其制備生物油脂的方法的具體實(shí)施 方式。
實(shí)施例1
一種利用產(chǎn)油酵母菌株制備生物油脂的方法
發(fā)酵生成生物油脂的培養(yǎng)基為經(jīng)過稀酸預(yù)處理的預(yù)處理液，組份如下(高
效液相色譜測(cè)得)葡萄糖3.79g/1,木糖2L27g/1，乙酸3.98g/1，糠醛1.14g/l， 羥甲基糠醛0.45g/1。 pH5.0， 115。C滅菌20分鐘。滅菌后加入無機(jī)鹽，組份按 質(zhì)量百分比為(NH4)2S04 0.1% 1%， KH2P04 0.09 0.12%; MgS04'7H20 0.04% 0.06%。
從平板上挑取一環(huán)菌落接入種子培養(yǎng)基，30°C， 180RPM，培養(yǎng)18 24 小時(shí)，以10%的接種量接入上述硫酸的預(yù)處理液。培養(yǎng)時(shí)間為4天。每隔24 小時(shí)取樣分析，葡萄糖在48小時(shí)代謝完畢，乙酸在72小時(shí)代謝完畢，發(fā)酵 終止時(shí)木糖僅剩余1.199g/L。最終生成的油脂量為1.96g/L。
與沒有經(jīng)過誘變的原始皮狀絲孢酵母(7Wc/20s; oraw cwto"eww CGMCC 2.1374)作對(duì)照，發(fā)酵條件全部相同，菌株表現(xiàn)為不生長(zhǎng)；可見誘變?nèi)〉昧吮?較積極的結(jié)果，所得菌株抗性較強(qiáng)。
實(shí)施例2一種利用產(chǎn)油酵母菌株制備生物油脂的方法 發(fā)酵生成生物油脂的培養(yǎng)基為蒸汽膨爆預(yù)處理后的酶水解液。所用的酶
為Accellerase;其中纖維素酶活是67.8FPU，纖維二糖酶活為152IU。水解液 組份的組分如下(高效液相色譜測(cè)得)葡萄糖40g/L，木糖9.5g/L,乙酸0.32g/L， 糠醛，羥甲基糠醛含量極少起作用可以忽略不計(jì)，pH6.0， 115。C滅菌20分鐘。 從平板上選取一環(huán)菌落接入種子培養(yǎng)基，30°C， 180RPM，培養(yǎng)24小時(shí)， 以10%的接種量接入上述酶水解液。培養(yǎng)時(shí)間為3天。最終生成的油脂量為 3.61g/L，含油率達(dá)到42.17%，油脂系數(shù)(油脂系數(shù)是指生成的油脂量除以消 耗的葡萄糖再乘以100)為10。
實(shí)施例3
一種利用產(chǎn)油酵母菌株制備生物油脂的方法
發(fā)酵生成生物油脂的培養(yǎng)基為蒸汽膨爆預(yù)處理后經(jīng)過酶水解得到的水解 液。所用的酶為Accellerase;其中纖維素酶活是67.8FPU，纖維二糖酶活為 152IU。水解液組份的組份如下(高效液相色譜測(cè)得)葡萄糖40g/L，木糖9.5g/L， 乙酸0.32g/L，糠醛，羥甲基糠醛含量極少起作用可以忽略不計(jì)，pH6.0， 115°C 滅菌20分鐘。
從平板上選取一環(huán)菌落接入種子培養(yǎng)基，30°C， 180RPM,培養(yǎng)24小時(shí)， 以10%的接種量接入上述酶水解液。培養(yǎng)3天后收獲細(xì)胞，再將這些細(xì)胞全 部重新放入上述條件的水解液中去， 一共進(jìn)行3輪發(fā)酵總計(jì)9天時(shí)間。最終 生成的油脂量為9.2g/L，含油率達(dá)到42.31%,油脂系數(shù)為8.9。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾， 這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種產(chǎn)油酵母菌株，其特征在于，產(chǎn)油酵母菌為皮狀絲孢酵母Trichosporon cutaneum CX1，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)登記保藏；保藏日期為2008年5月28日；編號(hào)為CGMCC No.2527。
2. —種應(yīng)用權(quán)利要求l,所述的產(chǎn)油酵母菌株制備生物油脂中的方法，其 特征在于，具體步驟為，(1) 稀酸預(yù)處理液或蒸汽膨爆預(yù)處理酶水解液的制備 利用農(nóng)作物秸稈，經(jīng)過稀硫酸或蒸汽膨爆預(yù)處理，獲得的預(yù)處理后的秸稈經(jīng)過纖維素酶的酶水解生成水解液，經(jīng)過堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH， pH為5.0 6.0;所述的農(nóng)作物秸稈選自玉米秸桿，汽爆玉米秸桿，小麥秸稈或者稻子秸 稈中的一種；所述的稀硫酸預(yù)處理?xiàng)l件是在140 25(TC下，預(yù)處理0.5 60分鐘； 所述的堿性物質(zhì)為Ca(OH)2溶液或者NaOH溶液中的一種；(2) Jh'c/ osporaw cwtowew附CX1禾中子培養(yǎng) 從平板上選取一環(huán)菌落接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成如下-培養(yǎng)基組份質(zhì)量百分比為，葡萄糖2% 5%，酵母粉0.05% 0.1%，(NH4)2S04 0.1% 5%， KH2P04 0.05% 5o/o; MgS04.7H20 0.01% 1%; pH 5.8 6.0，搖瓶裝液量10 30%，培養(yǎng)溫度為28 30°C，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 200 轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間為20 28小時(shí)；(3) 7WcZ/aspora" cw加ewm CX1搖瓶發(fā)酵-在步驟(1)的預(yù)處理液或酶水解液中添加無機(jī)鹽，水解液組分為各種糖 和有機(jī)物；接種量為2 10%，培養(yǎng)時(shí)間為96 120小時(shí)，其他發(fā)酵條件與種 子培養(yǎng)相同；培養(yǎng)結(jié)束離心收集細(xì)胞，破壁提取生物油脂；所述的酶選自Spezyme CP, 纖維素酒精酶Accellerase或者Novozyme 188中的一種或幾種;所述的無機(jī)鹽，組份質(zhì)量百分比為，(NH4)2S04 0.1% 5%， KH2P04 0.05% 5%; MgS04.7H20 0.01% 1%;所述的糖選自葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖或者甘露糖中的一種或 幾種；所述的有機(jī)物選自有機(jī)酸，呋喃化合物或者苯酚化合物中的一種； 所述的有機(jī)酸選自乙酸、甲酸、乙酰丙酸或者乳酸中的一種； 所述的呋喃化合物選自糠醛或者5-羥甲基糠醛中的一種； 所述的苯酚化合物選自香草醛、丁香醛或者4-羥甲基苯甲酸中的一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種產(chǎn)油酵母菌株制備生物油脂的方法，其特 征在于，在所述的步驟(1)中，所述的農(nóng)作物秸稈優(yōu)選玉米秸桿。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種產(chǎn)油酵母菌株制備生物油脂的方法，其特 征在于，在所述的步驟(1)中，所述的堿性物質(zhì)優(yōu)選為Ca(OH)2溶液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種產(chǎn)油酵母菌株制備生物油脂的方法，其特 征在于，在所述的步驟(3)中，所述的糖優(yōu)選為葡萄糖。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種產(chǎn)油酵母菌株制備生物油脂的方法，其特 征在于，在所述的步驟(3)中，所述的有機(jī)酸優(yōu)選為乙酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種產(chǎn)油酵母菌株制備生物油脂的方法，其特 征在于，在所述的步驟(3)中，所述的呋喃化合物優(yōu)選為糠醛。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種產(chǎn)油酵母菌株制備生物油脂的方法，其特 征在于，在所述的步驟(3)中，所述的苯酚化合物優(yōu)選為4-羥甲基苯甲醛。
全文摘要
本發(fā)明是一種產(chǎn)油酵母菌株及其制備生物油脂的方法；所述的產(chǎn)油酵母菌株為皮狀絲孢酵母Trichosporon cutaneum CX1，保藏號(hào)為CGMCC No.2527；產(chǎn)油酵母菌株生產(chǎn)生物油脂的方法農(nóng)作物秸稈經(jīng)過預(yù)處理和水解后生成秸稈的水解液；在該水解液中添加基本無機(jī)鹽組分，產(chǎn)油酵母菌就可以利用水解液中的糖和其它有機(jī)物生長(zhǎng)和代謝生成油脂；生成的油脂貯藏在細(xì)胞內(nèi)，之后將細(xì)胞內(nèi)的油脂提取得到生物油脂。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)生成的油脂組成與植物油類似，可以作為生產(chǎn)生物柴油的原料，與現(xiàn)在的其他工藝相比較極大地?cái)U(kuò)展了生物柴油的油脂原料來源，并顯著降低了生物柴油原料油脂的成本。
文檔編號(hào)C12N1/16GK101434912SQ20081020449
公開日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日
發(fā)明者曦 陳, 杰 鮑 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué) 被以下專利引用 (2),