專利名稱：：血清微小核糖核酸試劑盒及其在乙肝早期診斷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及血清/血漿微小核糖核酸在乙型肝炎的診斷、預(yù)測、療效評價、藥物活性成分的篩選、藥效評價等方面的應(yīng)用。二
背景技術(shù)：
：乙肝病毒(H印atitisBvirus:HBV)是全世界最常見的致病微生物之一。據(jù)統(tǒng)計，目前全世界約有4億乙型肝炎病毒(HBV)攜帶者。慢性乙型肝炎可能導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥(如肝硬化和肝癌)，統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，全世界約80%的原發(fā)性肝癌與乙型肝炎病毒感染有關(guān)。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國約有1.3億人長期攜帶乙肝病毒。專家推算，我國現(xiàn)有慢性乙肝病人約2000多萬，每年約有28萬人死于與乙肝病毒感染相關(guān)的肝硬化或肝癌。目前對乙型肝炎進(jìn)行臨床診斷的傳統(tǒng)生物化學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)方法主要包括反向被動血凝、酶聯(lián)免疫吸附試驗、基因診斷等，這些方法還比較繁瑣和粗糙，在靈敏度、特異性、效率性、普及性、樣品準(zhǔn)備和保存方面都會存在各種缺陷或不足。由于乙肝病毒感染尚無理想的早期診斷方法，因此開發(fā)有效的乙肝檢測方法是當(dāng)務(wù)之急，這樣才能實現(xiàn)乙肝患者的早診斷、早治療。微小核糖核酸，英文名為microRNA，是一類長約19至23個核苷酸的非編碼單鏈小核糖核酸分子。它們在進(jìn)化上高度保守，并與動物的許多正常生理活動，如生物個體發(fā)育、組織分化、細(xì)胞調(diào)亡以及能量代謝等密切相關(guān)，同時也與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展存在著緊密的聯(lián)系。最近的研究發(fā)現(xiàn)慢性淋巴細(xì)胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中的幾種微小核糖核酸的表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào)；分析比較人肺癌、乳腺癌組織中的微小核糖核酸表達(dá)時，發(fā)現(xiàn)有若干組織特異性微小核糖核酸的表達(dá)水平相對于正常組織發(fā)生了變化。也有研究證明微小核糖核酸影響了心肌肥厚、心衰、動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展，并且與II型糖尿病等代謝性疾病有密切關(guān)聯(lián)。這些實驗結(jié)果提示微小核糖核酸表達(dá)及特異性變化與疾病發(fā)生和發(fā)展之間存在著必然聯(lián)系。由于微小核糖核酸在基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控中起著超乎想象的重要作用，因此它與疾病存在以下的關(guān)聯(lián)性首先，微小核糖核酸的變化可能是病因，這是因為疾病的抑制因子以及促進(jìn)因子都可能是微小核糖核酸的靶位點，當(dāng)微小核糖核酸本身先發(fā)生了紊亂表達(dá)，比如本來抑制疾病促進(jìn)因子的微小核糖核酸表達(dá)量降低了，或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表達(dá)量升高了，其最終結(jié)果都會導(dǎo)致下游一系列基因表達(dá)的變化以及某些通路的整體紊亂，進(jìn)而誘發(fā)疾病發(fā)生；其次，微小核糖核酸的變化也可能是疾病的結(jié)果，這是因為當(dāng)疾病(如癌癥)發(fā)生時，會導(dǎo)致染色體片段的丟失、基因的突變或者染色體片段的劇烈擴(kuò)增，若微小核糖核酸正好位于這一變化區(qū)段內(nèi)，那么其表達(dá)量將發(fā)生極其顯著的變化。因此，理論上微小核糖核酸分子完全可以作為一類新的疾病標(biāo)志物，它的特異性變化必然與疾病產(chǎn)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)。同時微小核糖核酸還可以作為潛在的藥物作用靶點，通過抑制疾病過程中上調(diào)的微小核糖核酸和過表達(dá)下調(diào)的微小核糖核酸，將有可能極大地緩解疾病的發(fā)生和發(fā)展。本發(fā)明人巳經(jīng)開展了以微小核糖核酸作為疾病標(biāo)志物的相關(guān)領(lǐng)域的研究，例如我們發(fā)現(xiàn)大部分的血清微小核糖核酸來自于血清中的細(xì)胞微粒子(micr叩articles)。血清中的細(xì)胞膜微粒子來自人體不同的細(xì)胞(不僅是血細(xì)胞)且包含和特定細(xì)胞/組織相關(guān)的微小核糖核酸，檢測血清中細(xì)胞膜微粒子內(nèi)微小核糖核酸的變化就可以得到整個機(jī)體的病變情況；更重要的是細(xì)胞微粒子帶有源頭細(xì)胞表面特有的受體蛋白或膜脂結(jié)構(gòu)，與對應(yīng)的靶細(xì)胞有高親和性，因而可以選擇性地遞送微小核糖核酸到靶細(xì)胞/組織，從而大大提高微小核糖核酸調(diào)控細(xì)胞功能的作用。顯然，由于細(xì)胞微粒子(或類似微粒子的膜脂囊泡結(jié)構(gòu))本身具有和特定組織及細(xì)胞結(jié)合的特異性，其所載微小核糖核酸也呈現(xiàn)較強(qiáng)的靶向性、穩(wěn)定性及高效率，它在疾病的診斷及治療方面有重大應(yīng)用前景。另外我們還選取乙型肝炎作為研究對象，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在正常人、乙型肝炎攜帶者、乙型肝炎病人之間，一些微小核糖核酸分子都存在著特異性變化，并據(jù)此通過測定微小核糖核酸的特異性變化已經(jīng)建立起一種更敏感、更精確的早期確診、治療乙型肝炎的方法。三
發(fā)明內(nèi)容目前，對乙型肝炎的診斷僅僅局限于血清/血漿中的各種生化指標(biāo)，還沒有關(guān)于血清/血槳微小核糖核酸用于乙型肝炎診斷與治療方面的任何報道?；谖⑿『颂呛怂岬倪@一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人將研究目光鎖定在血清/血漿微小核糖核酸在乙型肝炎診斷與治療方面的重大應(yīng)用前景。本發(fā)明人通過分離和研究正常人、乙肝攜帶者和乙肝患者血清中的微小核糖核酸，尋找一類可用于乙型肝炎治療的靶向高效率的微小核糖核酸。我們采用了兩種試驗手段一是分別取40ral若千正常人、乙肝攜帶者、乙肝病人的血清，提取總RNA進(jìn)行Solexa測序。二是分別將各個正常人、乙肝攜帶者和乙肝患者的血清除蛋白，上清進(jìn)行定量PCR檢測。由于微小核糖核酸分子是一類新型疾病標(biāo)志物，因此希望通過對血清/血槳微小核糖核酸是否存在，個體之間的差別及其與乙肝的相關(guān)性的研究，建立一種利用血清/血漿中穩(wěn)定存在的微小核糖核酸及其特異性變化來進(jìn)行乙型肝炎的早期診斷，病程監(jiān)控，并發(fā)癥發(fā)生的預(yù)測，藥效判定，用藥指南，個體化治療，中藥有效成份篩選，種群分類等研究的新技術(shù)。本發(fā)明需要解決的問題包括(l)分析鑒定正常人、乙肝攜帶者、乙肝患者血清/血漿中微小核糖核酸分子分布及其特異性；(2)研究乙肝的發(fā)病過程中血清/血漿微小核糖核酸的特異性變化；(3)將篩選到的在乙肝患者、乙肝攜帶者及正常生理狀態(tài)下差異表達(dá)程度大的一類血清/血漿微小核糖核酸分子用于血清/血漿微小核糖核酸檢測技術(shù)的研制，來制備應(yīng)用于乙肝診斷的生物芯片或診斷試劑盒。(4)在體外將特定的微小核糖核酸傳遞到特定細(xì)胞/組織，從而達(dá)到組織功能改善或疾病治療的效果。本發(fā)明提供一種具有較高靶向性、靈敏性、穩(wěn)定性及高效率并在乙型肝炎的診斷和治療方面具有重大應(yīng)用前景的微小核糖核酸。其研究的技術(shù)方案主要包括以下幾個部分l,Solexa測序(1)收集血清/血漿樣本收集正常人、乙肝攜帶者、乙肝患者血清若干份，從每份正常人血清中取出一部分混成40ml的混合血清用于總RNA的提取。乙肝攜帶者和乙肝患者也是如此。(2)通過Trizol試劑提取血清/血漿總RNA:a每lml血清加入lml的Trizol(solexa需要約40ml的血清)，用手震蕩混勻；b相分離15-3(TC孵化勻漿物5分鐘，致使核蛋白復(fù)合體充分解離，lml/200ul氯仿，蓋緊蓋子，用力震蕩15秒，15-3(TC孵化2-3分鐘，2-8。C(4'C)10000rcf(132,000rpm)離心15分鐘，離心后混合物分為三層下層苯酚氯仿相、中間相、無色的上層水相一含RNA,RNA完全溶解于上層水相，上層水相占總體積的60%;c多歩酚-氯仿抽提去掉多余蛋白1/3體積苯酚(除DNA蛋白)震蕩，10000g離心5分鐘，轉(zhuǎn)移上清；1/6體積苯酚+1/6體積氯仿震蕩，10000g離心5分鐘，轉(zhuǎn)移上清；1/3體積氯仿震蕩，10000g離心5分鐘，轉(zhuǎn)移上清，除掉多余的酚；dRNA沉淀將上層水相轉(zhuǎn)移，按每lmlTrizol/500ul異丙醇的量加入異丙醇(一般過量的異丙醇，可以加到離心管的容量范圍)，冰浴或者4。C放置1小時，2-8°C(4°C)10000rcf離心1小時，則RNA粗提物將沉降在官底，將異丙醇用槍吸掉；注意異丙醇加過量(25ml+15ml沉淀在光下可見，薄膜狀)e用lml的Trizol溶解沉淀(此時可以更加清晰地看到沉淀，為露珠狀)吹打直到沉淀溶解，冰上靜置一會，轉(zhuǎn)移至EP管中；f重復(fù)2-3步，如果蛋白雜質(zhì)少，可以省略掉步驟3;gRNA沉淀將上層水相轉(zhuǎn)移，按每lmlTrizol/500ul異丙醇的量加入異丙醇，在15-30'C孵化(冰浴)10分鐘，在2-8°C(4°C)10000rcf(132，000rpm)離心10分鐘則RNA粗提物將沉降在管底;h沖洗RNA:倒掉上清，用75%的乙醇沖洗沉淀一次，用量為lmlTrizol/lml乙醇，用震蕩器重懸乳白色沉淀，沉淀從管底脫落漂浮起來，在在2-8。C(4°C)10000rcf(132，OOOrpm)離心5分鐘;i溶解RNA:用槍吸掉上清，略離心一下，將上清徹底吸干凈，晾干5分鐘(透明或半透明的狀態(tài))，切勿使RNA完全干燥，否則RNA很難溶解。溶解后(20ul左右)于一70。C保存；j測量濃度。(3)進(jìn)行PAGE電泳回收17-27ntRNA分子；(4)將adaptorprime酶聯(lián)在小RNA分子的3'與5'端；(5)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后并進(jìn)行測序；(6)數(shù)據(jù)分析與處理。根據(jù)上述方法所檢測到的存在差異表達(dá)的正常人、乙肝攜帶者、乙肝患者血清/血漿中的微小核糖核酸包括let-7c、miR-1、miR-10a、miR-122、miR-125b、miR-128a、miR-128b、miR-150、miR-197、miR-221、miR-222、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-27b、miR-30a、miR-342-3p、miR-361_5p、miR-423-5p、miR-532-5p、miR-574-3p、miR-629、miR-92a、miR-92b、miR-99a、miR-139-5p、miR-193a-5p、miR-193b、miR_365、miR-375、miR-455-3p、miR-483-3p、miR-483-5p、miR-486-3p、miR-885-5p、miR-99b、let-7f、let-7g、let-7i、miR-101、miR-103、miR-106a、miR-106b、miR-107、miR-126、miR—130a、miR—130b、miR—142—3p、miR-142—5p、miR-144、miR-146a、miR—146b—5p、miR-148b、miR-151-5p、miR-15a、miR-16、miR-17、miR-182、miR_183、miR_185、miR-186、miR-18a、miR—191、miR-19b、miR-20a、miR-20b、miR-21、miR—210、miR—26a、miR-26b、miR-29c、miR-30e、miR-340、miR-362-5p、miR-363、miR-374a、miR-378、miR—424、miR-451、miR-454、miR—532_5p、miR_652、miR_660、miR-7、miR-923、miR_93、miR-96、miR-98。2.Real-timePCR方法(1)提取受試者的血清/血漿總RNA，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品；或者收集受試者的血清/血漿樣本，以血清/血漿作為緩沖液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來制備cDNA樣品；(2)用微小核糖核酸設(shè)計引物；(3)加入熒光探針進(jìn)行PCR反應(yīng)；(4)檢測并比較正常人、乙肝攜帶者、乙肝患者血清/血漿樣本中微小核糖核酸的量的變化。根據(jù)solexa結(jié)果我們選擇了正常人與乙肝攜帶者和乙肝患者之間具有較大差異的let-7c、miR—10a、miR-122、miR-125b、miR-150、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-342-3p、let-7f、miR-423_5p、miR-574_3p、miR-92a、miR-99a、miR-139-5p、miR-375、miR-483-5p、miR-885-5p、miR-101、miR-106b、miR-16、miR-185、miR-451用Real-timePCR方法所檢測到的乙肝攜帶者與正常人血清/血漿中存在差異表達(dá)的微小核糖核酸包括let-7c、miR-10a、miR_122、miR-125b、miR_150、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-342-3p、miR-423-5p、miR-92a、miR-99a、miR-139-5p、miR-375、miR-483-5p、miR-885-5p，乙肝患者與正常人血清/血漿中存在差異表達(dá)的微小核糖核酸包括let-7c、miR-10a、miR-122、miR-125b、miR-150、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-342_3p、miR-423-5p、miR-92a、miR-99a、miR-139-5p、miR-375、miR-483-5p、miR-885_5p，乙肝攜帶者與乙肝患者血清/血槳中存在差異表達(dá)的微小核糖核酸包括let-7c、miR-423-5p、miR-139_5p。3.本發(fā)明還提供一種用于評價受試者是正常人、乙肝攜帶者還是乙肝患者的試劑盒，所述試劑盒可以包含正常人、乙肝攜帶者、乙肝患者血清/血漿中存在差異表達(dá)的全部成熟體微小核糖核酸的引物，具體包括let-7c、miR-10a、miR_122、miR-125b、miR-150、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-342-3p、miR-423-5p、miR-92a、miR-99a、miR-139-5p、miR-375、miR-483_5p和miR-885_5p的引物。具體而言，上述組合、方法、試劑盒中，用于診斷和/或鑒別受試者的生理和/或病理狀態(tài)、用于篩選待測物的預(yù)防和/或治療乙型肝炎的活性、評價對受試者進(jìn)行治療的有效性、對受試者發(fā)生并發(fā)癥進(jìn)行預(yù)測。目前對乙型肝炎進(jìn)行臨床診斷的傳統(tǒng)生物化學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)方法主要包括反向被動血凝、酶聯(lián)免疫吸附試驗、基因診斷等，這些方法還比較繁瑣和粗糙，在靈敏度、特異性、效率性、普及性、樣品準(zhǔn)備和保存方面都會存在各種缺陷或不足。傳統(tǒng)的乙肝治療方法主要包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎保肝、抗纖維化和對癥治療等，其中抗病毒治療是關(guān)鍵，主要包括干擾素治療、核苷類似物治療、免疫調(diào)節(jié)治療和其他抗病毒藥物和中藥治療。但因為乙肝病毒具有個體特異性，這些傳統(tǒng)的治療方法都存在一定的副作用、造成機(jī)體的耐藥性且療效均比較低。血清/血漿微小核糖核酸檢測技術(shù)，基于血清/血漿微小核糖核酸的生物芯片和診斷試劑盒巧妙地將血清/血漿微小核糖核酸的獨特性質(zhì)和常規(guī)分子生物學(xué)檢測技術(shù)結(jié)合為一體，它們可以快速地高通量地分析乙肝攜帶者或病人血清/血漿中微小核糖核酸的組成，臨床適用性極強(qiáng)。由于器官組織的生理狀態(tài)變化會引起血清/血漿微小核糖核酸組成的改變，因此血清/血漿微小核糖核酸可以作為"疾病指紋"，用于乙型肝炎的早期診斷。血清/血漿微小核糖核酸檢測技術(shù)的優(yōu)越性(1)血清/血漿微小核糖核酸作為新型的疾病標(biāo)志物，具有檢出譜系廣、靈敏度高、檢測成本低、取材方便、樣本易存放(血清/血漿-2(TC存放即可)等優(yōu)點，該方法可廣泛用于乙肝普査等相關(guān)工作，成為早期診斷乙肝的有效手段。(2)血清/血漿微小核糖核酸作為新的疾病標(biāo)記物將改進(jìn)單一的標(biāo)記物所難以克服的個體差異所帶來的低特異性和低靈敏度，顯著提高乙肝的臨床檢出率和實現(xiàn)乙肝的早期診療。(3)血清/血漿微小核糖核酸檢測技術(shù)的優(yōu)勢在于其檢測的是一系列疾病相關(guān)標(biāo)記物，因而能夠克服病人個體之間的差異(即年齡、性別、種族、飲食和環(huán)境等)，而這正是單一疾病標(biāo)記物所無法逾越的一個主要問題。四具體實施例方式實施例1正常人、乙肝攜帶者、乙肝患者血清/血漿中微小核糖核酸的Solexa測序，具體步驟為(1)收集血清/血漿樣本收集正常人、乙肝攜帶者、乙肝患者血清若干份，從每份正常人血清中取出一部分混成40ml的混合血清用于總RNA的提取。乙肝攜帶者和乙肝患者也是如此。(2)通過Trizol試劑提取血清/血漿總RNA:a每lml血清加入lml的Trizol(solexa需要約40ml的血清)，用手震蕩混勻；b相分離15-3(TC孵化勻漿物5分鐘，致使核蛋白復(fù)合體充分解離，lml/200ul氯仿，蓋緊蓋子，用力震蕩15秒，15-3(TC孵化2-3分鐘，2-8°C(4°C)10000rcf(132,000rpm)離心15分鐘，離心后混合物分為三層下層苯酚氯仿相、中間相、無色的上層水相一含RNA，RNA完全溶解于上層水相，上層水相占總體積的60%;c多步酚-氯仿抽提去掉多余蛋白1/3體積苯酚(除DNA蛋白)震蕩，10000g離心5分鐘，轉(zhuǎn)移上清；1/6體積苯酚+1/6體積氯仿震蕩，10000g離心5分鐘，轉(zhuǎn)移上清；1/3體積氯仿震蕩，10000g離心5分鐘，轉(zhuǎn)移上清，除掉多余的酚；dRNA沉淀將上層水相轉(zhuǎn)移，按每lmlTrizol/500ul異丙醇的量加入異丙醇(一般過量的異丙醇，可以加到離心管的容量范圍)，冰浴或者4。C放置l小時，2-8'C(4'C)10000rcf離心1小時，則RNA粗提物將沉降在官底，將異丙醇用槍吸掉；注意異丙醇加過量(25ml+15ml沉淀在光下可見，薄膜狀)e用lml的Trizol溶解沉淀(此時可以更加清晰地看到沉淀，為露珠狀)吹打直到沉淀溶解，冰上靜置一會，轉(zhuǎn)移至EP管中；f重復(fù)2-3步，如果蛋白雜質(zhì)少，可以省略掉步驟3;gRNA沉淀將上層水相轉(zhuǎn)移，按每lmlTrizol/500ul異丙醇的量加入異丙醇，在15-30。C孵化(冰浴)10分鐘，在2-8°C(4°C)10000rcf(132,000rpm)離心10分鐘則RNA粗提物將沉降在管底；h沖洗RNA:倒掉上清，用75%的乙醇沖洗沉淀一次，用量為lmlTrizol/lml乙醇，用震蕩器重懸乳白色沉淀，沉淀從管底脫落漂浮起來，在在2-8。C(4°C)10000rcf(132,000rpm)離心5分鐘;i溶解RNA:用槍吸掉上清，略離心一下，將上清徹底吸干凈，晾干5分鐘(透明或半透明的狀態(tài))，切勿使RNA完全干燥，否則RNA很難溶解。溶解后(20ul左右)于一70'C保存；(3)進(jìn)行PAGE電泳回收17-27ntRNA分子；(4)將adaptorprime酶聯(lián)在小RNA分子的3'與5'端；(5)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后并進(jìn)行測序；(6)數(shù)據(jù)分析與處理具體實驗結(jié)果見下表，其中的數(shù)值表示microRNA的相對拷貝數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例2正常人、乙肝攜帶者、乙肝患者血清/血漿中部分存在差異表達(dá)的微小核糖核酸的real-timePCR實驗定量PCR的實驗步驟如下(1)提取受試者的血清/血漿總RNA，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品；或者收集受試者的血清/血漿樣本，以血清/血漿作為緩沖液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來制備cDNA樣品；(2)用微小核糖核酸設(shè)計引物；(3)加入熒光探針進(jìn)行PCR反應(yīng)；(4)檢測并比較正常人、乙肝攜帶者、乙肝患者血清/血漿樣本中微小核糖核酸的量的變化。定量PCR實驗用的染料是EvaGreen，儀器使用的是ABIPrism7500熒光定量PCR儀，反應(yīng)條件為95X:、5分鐘進(jìn)行1個循環(huán)一95°C、15秒，60°C、1分鐘進(jìn)行40個循環(huán)。將正常人、攜帶者、乙肝病人血清/血漿樣本與正常人血清/血漿樣本用酚和氯仿除蛋白后直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，通過定量PCR反應(yīng)比較其中所含微小核糖核酸的量。我們根據(jù)solexa結(jié)果選取let-7c、miR-10a、miR-122、niR-125b、miR-150、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-342-3p、let-7f、miR-423-5p、miR-574-3p、miR-92a、miR-99a、miR-139-5p、miR-375、miR-483-5p、miR-885-5p、miR-101、miR-106b、miR-16、miR-185、miR-451進(jìn)行實驗，實驗結(jié)果見下表1，2:表1攜帶者與正常人的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>正常人平均值的計算方法為首先每個樣品求2—"'wnaX100000，所得的值求平均值，然后每個樣品的2—eti"iRNAX100000除以平均值，所得的值再求平均值，因此都為1。攜帶者平均值的計算方法為首先求每個樣品的2—"，miRNA，求得的值除以正常人2—"^miRNAX100000的平均值，然后再算平均值?；颊咂骄档挠嬎惴椒槭紫惹竺總€樣品的2—"患者週，求得的值除以正常人2-"正常^腿><100000的平均值，然后再算平均值。從表中我們看出與Solexa結(jié)果相符的microRNA是let-7c、miR-10a、miR-122、miR-125b、miR-150、miR—223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR—342-3p、miR-423-5p、miR-92a、miR-99a、miR-139-5p、miR-375、miR-483-5p和miR-885-5p，其中，攜帶者和患者之間存在差異的為let-7c、miR-423-5p和miR-139-5p。實施例3用于乙肝診斷與預(yù)測的微小核糖核酸試劑盒的制作微小核糖核酸試劑盒的制作工藝和操作流程是基于solexa測序技術(shù)、Realtime-PCR技術(shù)和生物芯片技術(shù)。首先通過測序的方法或PCR方法確定正常人血清/血漿中的微小核糖核酸。然后通過定量PCR技術(shù)和生物芯片技術(shù)篩選乙肝攜帶者、乙肝患者與正常人表達(dá)量差異程度大的一類血清/血漿微小核糖核酸，作為預(yù)測是否發(fā)生疾病以及診斷病變程度的指標(biāo)。最后篩選出的對應(yīng)乙肝攜帶者和乙肝患者的血清/血漿微小核糖核酸的數(shù)量控制在十幾條，這是在芯片探針庫的基礎(chǔ)上做出的最優(yōu)化的精簡。此試劑盒包括一批血清/血漿微小核糖核酸引物，Taq酶、dNTP等試劑，其中微小核糖核酸的引物包括let-7c、miR-10a、miR_122、miR-125b、miR_150、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-342-3p、miR-423_5p、miR-92a、miR-99a、miR-139_5p、miR-375、miR-483-5p和miR-885-5p的引物。此試劑盒的價值在于只需要血清/血漿而不需要其它組織樣品，通過最精簡的探針庫檢測微小核糖核酸的變化趨勢，再通過該變化趨勢預(yù)測乙肝發(fā)生的可能性或診斷乙肝的病理階段。因此此試劑盒投入生產(chǎn)實踐，可在乙肝診斷、治療、療效評價、預(yù)后中應(yīng)用。權(quán)利要求1.一種正常人、乙肝攜帶者、乙肝患者血清/血漿中存在差異表達(dá)的微小核糖核酸組合，其特征是該組合具體包含let-7c、miR-1、miR-10a、miR-122、miR-125b、miR-128a、miR-128b、miR-150、miR-197、miR-221、miR-222、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-27b、miR-30a、miR-342-3p、miR-361-5p、miR-423-5p、miR-532-5p、miR-574-3p、miR-629、miR-92a、miR-92b、miR-99a、miR-139-5p、miR-193a-5p、miR-193b、miR-365、miR-375、miR-455-3p、miR-483-3p、miR-483-5p、miR-486-3p、miR-885-5p、miR-99b、let-7f、let-7g、let-7i、miR-101、miR-103、miR-106a、miR-106b、miR-107、miR-126、miR-130a、miR-130b、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-144、miR-146a、miR-146b-5p、miR-148b、miR-151-5p、miR-15a、miR-16、miR-17、miR-182、miR-183、miR-185、miR-186、miR-18a、miR-191、miR-19b、miR-20a、miR-20b、miR-21、miR-210、miR-26a、miR-26b、miR-29c、miR-30e、miR-340、miR-362-5p、miR-363、miR-374a、miR-378、miR-424、miR-451、miR-454、miR-532-5p、miR-652、miR-660、miR-7、miR-923、miR-93、miR-96和miR-98。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述微小核糖核酸組合制備的試劑盒，其特征是所述試劑盒包含let-7c、miR-10a、miR-122、miR-125b、miR-150、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-27a、miR-342-3p、miR-423-5p、miR-92a、miR-99a、miH39-5p、miR-375、miR-483_5p和miR-885-5p的引物以及Taq酶和d證試劑。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微小核糖核酸試劑盒的制備方法，其特征是由以下集合步驟構(gòu)成(1)通過Solexa測序法初步確定正常人、乙肝攜帶者、乙肝患者血清/血漿中存在差異表達(dá)的微小核糖核酸；(2)根據(jù)測序的結(jié)果再進(jìn)行實時定量PCR方法進(jìn)一步確定正常人、乙肝攜帶者、乙肝患者血清/血漿中存在差異表達(dá)的微小核糖核酸；(3)根據(jù)PCR結(jié)果，最終確定可以作為區(qū)別正常人、乙肝攜帶者、乙肝患者的標(biāo)志microRNA;(4)設(shè)計試劑盒，試劑盒由標(biāo)志microRNA的引物、實時定量PCR試劑構(gòu)成。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小核糖核酸組合或權(quán)利要求2所述的微小核糖核酸組合試劑盒在乙肝診斷、治療、預(yù)后中的應(yīng)用。全文摘要血清微小核糖核酸試劑盒及其在乙型肝炎早期診斷中的應(yīng)用屬于生物技術(shù)制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明提供一種用于評價正常人、乙肝攜帶者和乙肝患者生理和/或病理狀態(tài)的微小核糖核酸的組合，所述組合包含正常人、乙肝攜帶者和乙肝患者血清/血漿中存在差異表達(dá)的全部微小核糖核酸，由此制備了一種能用于乙肝早期診斷的診斷試劑盒。所述組合、方法能夠用于乙型肝炎的早期檢測及指導(dǎo)治療，該組合、方法具有高特異性、高效性、高靈敏度、檢測成本低、取材方便、樣本易存放等優(yōu)點。文檔編號C12Q1/68GK101368213SQ20081019677公開日2009年2月18日申請日期2008年10月13日優(yōu)先權(quán)日2008年10月13日發(fā)明者楨卞,張峻峰,張辰宇,科曾,李麗民,蕊白,熹陳,陳江寧申請人:南京大學(xué)