專利名稱：一種復(fù)合蛋白起泡劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種復(fù)合蛋白起泡劑的制備方法，涉及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能性 質(zhì)的改造，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大豆蛋白、小麥面筋蛋白和大米蛋白是食品加工工業(yè)中常用的原料，資源 豐富，品質(zhì)優(yōu)良，價(jià)格低廉，膽固醇較低，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，但目前國內(nèi)， 此類蛋白的應(yīng)用都是集中在附加值相對比較低的場合，而附加值略高的食品蛋 白類配料功能產(chǎn)品較少，分析造成這種局面的主要原因是此類蛋白盡管價(jià)格便 宜，也具有一定的功能性質(zhì)，但是各種性質(zhì)例如乳化性、膠凝性、起泡性等與 動(dòng)物源蛋白如酪蛋白、肌纖維蛋白、蛋清蛋白等天然優(yōu)良性能的蛋白質(zhì)相比， 仍然有相當(dāng)大的差距，導(dǎo)致其在現(xiàn)代食品加工中的應(yīng)用受到一定限制。
大豆分離蛋白、小麥面筋蛋白和大米蛋白與蛋清蛋白相比具有較差的起泡 性，在起泡性能方面的應(yīng)用也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及蛋清蛋白。蛋清蛋白作為起泡性能最佳 的蛋白起泡劑在蛋糕等焙烤類食品中的應(yīng)用相當(dāng)普遍。但是，蛋清蛋白中含有 較多的膽固醇，并且蛋清蛋白價(jià)格遠(yuǎn)高于一般的谷物蛋白，因此改善大豆、小 麥和大米等谷物蛋白的起泡性與泡沫穩(wěn)定性具有重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義。
對于大豆蛋白、小麥蛋白等谷物蛋白的結(jié)構(gòu)改造以及進(jìn)一步提高功能性質(zhì) 的研究一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前谷物蛋白質(zhì)的改性方法主要有物理改性、 化學(xué)改性、酶法改性以及生物工程改性。酶法改性技術(shù)是利用蛋白酶內(nèi)切作用 及外切作用將蛋白分子切割成較小分子，使其蛋白功能特性有所改變。同物理、 化學(xué)改性相比，酶法改性由于具有反應(yīng)條件相對溫和、反應(yīng)進(jìn)程及結(jié)果可控等 多方面的優(yōu)點(diǎn)而愈加受到重視。目前，許多研究者使用單一或復(fù)合蛋白酶對蛋
白進(jìn)行水解，以期改善蛋白的起泡性，如專利CN101011101A (改善蛋白質(zhì)的起 泡性的方法)采用米曲蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶組成的復(fù)合酶水解大豆 蛋白，起泡性比未處理前提高了 83.3%。專利CN1944662A (—種應(yīng)用于啤酒的 泡沬活性蛋白的制備與應(yīng)用方法)采用蛋白酶水解大豆蛋白、小麥蛋白、大米 蛋白和乳清蛋白，并經(jīng)過超濾方法獲得起泡性較好的蛋白組合物。但前人研究 表明，酶法水解雖然可使得蛋白質(zhì)構(gòu)象展開，顯著提高蛋白的起泡能力，但同 時(shí)也會(huì)降低其泡沫穩(wěn)定性。 一般來說，提高起泡特性既要提高其起泡能力又要 提高其泡沫穩(wěn)定性，而對于蛋白質(zhì)來說，提高其泡沫穩(wěn)定性更有意義。有報(bào)道 表明采用谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(TGase)進(jìn)行交聯(lián)，可以顯著提高蛋白質(zhì)的泡沬穩(wěn)定性。
另外，許多研究也表明，疏水性與蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)有顯著聯(lián)系，由于蛋白質(zhì) 具有四級結(jié)構(gòu)，其具有疏水性的殘基原則上處于分子內(nèi)部，但并不是絕對的， 嚴(yán)格地說，整個(gè)蛋白質(zhì)分子由里到外，疏水性殘基是逐漸減少的。而肽段具有 更少的氨基酸序列，限制了蛋白質(zhì)分子的折疊，使得更多的具有疏水性的氨基 酸殘基暴露在外，增大了表面疏水性。表面疏水性與表面張力、乳化性、起泡 性都有密切的關(guān)系，而且高的表面疏水性可以使得粘度升高分散性變好，而這 些都是好的起泡性的適應(yīng)條件，因此，表面疏水性對于提高蛋白的起泡性和乳 化性有很重要的意義。
關(guān)于大豆蛋白、小麥蛋白、大米蛋白和乳清蛋白起泡性質(zhì)的改良，前人大
部分研究集中在只使用蛋白酶水解或只使用TGase交聯(lián)，起泡能力和泡沫穩(wěn)定 性并沒有同時(shí)得到明顯的改善。因此，通過控制疏水性對于蛋白起泡性的影響， 先將蛋白質(zhì)水解，水解液根據(jù)分子量和疏水性分級分離，再采用TGase對不同 疏水性肽段進(jìn)行交聯(lián)，制備復(fù)合蛋白起泡劑，以實(shí)現(xiàn)更加有目的性地對蛋白質(zhì) 進(jìn)行改性，大幅度提高蛋白質(zhì)的起泡性和泡沬穩(wěn)定性，為谷物蛋白的結(jié)構(gòu)與功 能性質(zhì)改造方法提供新思路，拓寬其在現(xiàn)代食品加工中的應(yīng)用。目前還尚未有 將大豆蛋白、小麥蛋白、大米蛋白等混合蛋白水解物按照疏水性分級和進(jìn)行 TGase交聯(lián)制備復(fù)合起泡劑產(chǎn)品的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提出一種復(fù)合蛋白起泡劑的制備方法。以大豆分離蛋 白、小麥面筋蛋白、大米蛋白以及乳清蛋白為原料，采用酶法水解各類蛋白， 并通過超濾方法，從各類蛋白混合水解液中獲得10kDa以上分子量的蛋白肽段， 經(jīng)疏水性分離分級后，不同疏水性肽段再經(jīng)酶法交聯(lián)，得到高起泡性和泡沫穩(wěn) 定性的復(fù)合蛋白起泡劑產(chǎn)品，提高谷物類蛋白產(chǎn)品的附加值，以拓寬其在現(xiàn)代 食品加工中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種復(fù)合蛋白起泡劑的制備方法，以大豆分離蛋白、 小麥面筋蛋白、大米蛋白及乳清蛋白為原料，先用堿性蛋白酶Alcalase將各類 蛋白分別水解，然后通過超濾方法從各類蛋白混合水解液中獲得10kDa以上分 子量的蛋白肽段，經(jīng)疏水性分級分離后，再通過谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(TGase)對不 同疏水性肽段進(jìn)行交聯(lián)重組，交聯(lián)后的產(chǎn)物經(jīng)濃縮、冷凍干燥，得到復(fù)合蛋白 起泡劑產(chǎn)品，步驟為-(1)蛋白質(zhì)的水解
將大豆分離蛋白、小麥面筋蛋白、大米蛋白及乳清蛋白的蛋白質(zhì)分別進(jìn)行 水解各類蛋白加水?dāng)嚢枞芙?，配?0g/L的蛋白溶液，用lmol/L NaOH溶液 調(diào)整pH值至8.0，溫度保持55'C，加入溶液體積量0.2%的堿性蛋白酶Alcalase 進(jìn)行水解反應(yīng)，期間維持蛋白溶液pH值8.0，當(dāng)?shù)鞍姿舛冗_(dá)到3%時(shí)終止反應(yīng)，
水解液在沸水浴中加熱15 min滅酶，經(jīng)5000 r/min離心20 min后收集上清液；
(2) 蛋白水解液的超濾
將大豆分離蛋白、小麥面筋蛋白、大米蛋白及乳清蛋白的水解液按體積比3 :3:3:1混合，使用截留分子量為10kDa的聚砜超濾膜將混合蛋白水解液進(jìn)行 超濾，收集截留部分，獲得分子量大于10kDa的混合蛋白水解肽液；
(3) 分子量大于lOkDa的混合蛋白水解液的疏水性分級 使用超純水將C18柱浸潤充滿，將分子量大于10kDa的混合蛋白水解肽液
上柱進(jìn)行分離，肽液每次上樣200mL，待肽液充滿C18柱之后，使用600mL超 純水清洗，流速2mL/min，收集流出液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即得親水性肽段；再用600mL 甲醇清洗，流速2mL/min，收集流出液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即得疏水性肽段；
(4) 不同疏水性肽段的酶法交聯(lián) 將分級得到的疏水性肽段和親水性肽段按重量比1 : 1混合作為酶反應(yīng)底
物，底物多肽含量為50g/L，往底物溶液中加入3 5g/L的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行 交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)溫度為40 45。C、 pH6.0-6.5，反應(yīng)2 4h后，放置80。C水浴中 保溫30min滅酶，然后在25'C水浴中冷卻，交聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥后 得到復(fù)合蛋白起泡劑產(chǎn)品，測得產(chǎn)品的起泡能力比蛋清蛋白提高了 10% 30%。
所述的真空濃縮處理是45~50°C的真空濃縮，所述的冷凍干燥處理是在-50 -55'C溫度下的冷凍干燥。
水解用的堿性蛋白酶Alcalase的酶活單位為400000u/mL，交聯(lián)所用的谷氨 酰胺轉(zhuǎn)移酶的酶活單位為100u/g。
蛋白質(zhì)的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的測定是按如下方法進(jìn)行將IO g/L的蛋 白溶液lOOmL置于500mL量筒(口徑6cm，高為20cm)中，使用高速乳化均 質(zhì)機(jī)以17500r/min的轉(zhuǎn)速均質(zhì)40s，連續(xù)3次共計(jì)2min，記錄均質(zhì)后液面高度 并計(jì)算溶液體積為Vo(mL)，靜置30min后記錄液面高度并計(jì)算溶液體積為V3()min (mL)。蛋白的起泡能力(FC)和泡沫穩(wěn)定性的計(jì)算公式分別為<formula>formula see original document page 5</formula>
100 Ko-100 本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種復(fù)合蛋白起泡劑的制備方法。通過
對各類谷物蛋白進(jìn)行酶法改性，大幅度提高了蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，為 谷物蛋白的結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)改造方法提供了新思路，提高了低值植物蛋白產(chǎn)品 的附加值，拓寬了谷物蛋白在現(xiàn)代食品加工中的應(yīng)用，具有很好的市場前景和
經(jīng)濟(jì)效顯o
本發(fā)明制備的復(fù)合蛋白起泡劑，起泡能力和泡沫穩(wěn)定性遠(yuǎn)好于蛋清蛋白， 而且比蛋清蛋白具有價(jià)格優(yōu)勢，可以替代蛋清蛋白廣泛應(yīng)用于食品加工中，并 且大豆蛋白、小麥蛋白、大米蛋白及乳清蛋白改性組成的復(fù)合蛋白起泡劑天然、
營養(yǎng)，食用安全性好。
本發(fā)明方法可以適用于其它一些植物蛋白的結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的改造，這對 于高效利用植物蛋白資源生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品和促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展都具有積極和 重要的現(xiàn)實(shí)意義。
具體實(shí)施例方式
對照實(shí)施例
準(zhǔn)確稱取蛋清蛋白lg，加水?dāng)嚢枞芙?，配?% (W/V)的蛋白溶液，經(jīng)測
試，蛋清蛋白的起泡能力為240%，泡沫穩(wěn)定性為95%。 實(shí)施例1
準(zhǔn)確稱取大豆分離蛋白50g，加水?dāng)嚢枞芙?，配?0g/L的蛋白溶液，用 lmol/LNaOH溶液調(diào)整pH值至8.0，溫度保持在55'C，加入溶液體積量0.2%的 堿性蛋白酶Alcalase進(jìn)行水解反應(yīng)，期間維持蛋白溶液pH值8.0，當(dāng)?shù)鞍姿?度達(dá)到3%時(shí)，終止反應(yīng)，水解液在沸水浴中加熱15 min滅酶，經(jīng)5000 r/min 離心20min后收集上清液。小麥面筋蛋白、大米蛋白及乳清蛋白的水解操作步 驟同大豆分離蛋白。
將大豆分離蛋白、小麥面筋蛋白、大米蛋白及乳清蛋白的水解液按3 : 3 : 3 :1 (v/v/v/v)混合，使用截留分子量為lOkDa的聚砜超濾膜將混合蛋白水解液 進(jìn)行超濾，收集截留部分，獲得分子量大于10kDa的蛋白肽段。
使用超純水將實(shí)驗(yàn)室自組裝的C18柱浸潤充滿，將分子量大于10kDa的混 合蛋白水解肽液上C18柱進(jìn)行疏水性分離，肽液上樣量為200mL，待肽液充滿 C18柱之后，使用600mL超純水清洗，流速2mL/min，收集流出液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即 得親水性肽段，超純水清洗過后使用600mL甲醇清洗，流速2mL/min，收集流 出液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即得疏水性肽段。
將分級得到的疏水性肽段和親水性肽段按1 : 1 (w/w)混合作為酶反應(yīng)底 物，底物多肽含量為50g/L，往底物溶液中加入3g/L的TGase進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)， 反應(yīng)溫度為4(TC、 pH6.0，反應(yīng)2h后，放置80'C水浴中保溫30min滅酶，然后 在25'C水浴中冷卻，交聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)45 5(TC真空濃縮、在-50 -55"溫度下冷凍干 燥后得到復(fù)合蛋白起泡劑產(chǎn)品，測得交聯(lián)后產(chǎn)物的起泡能力為265%，泡沫穩(wěn)定 性為91%，起泡能力比蛋清蛋白提高了 10%。
實(shí)施例2
按實(shí)施例1的操作步驟制備得到分級的疏水性肽段和親水性肽段。 將分級得到的疏水性肽段和親水性肽段按1 : 1 (w/w)混合作為酶反應(yīng)底 物，底物多肽含量為50g/L，往底物溶液中加入4g/L的TGase進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)， 反應(yīng)溫度為4(TC、 pH6.5，反應(yīng)3h后，放置8(TC水浴中保溫30min滅酶，然后 在25'C水浴中冷卻，交聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)45 5(TC真空濃縮、在-50 -55°。溫度下冷凍干
燥后得到復(fù)合蛋白起泡劑產(chǎn)品，測得交聯(lián)后產(chǎn)物的起泡能力為284%，泡沫穩(wěn)定 性為96%，起泡能力比蛋清蛋白提高了 18%。 實(shí)施例3
按實(shí)施例1的操作步驟制備得到分級的疏水性肽段和親水性肽段。 將分級得到的疏水性肽段和親水性肽段按1 : 1 (w/w)混合作為酶反應(yīng)底 物，底物多肽含量為50g/L，往底物溶液中加入4g/L的TGase進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)， 反應(yīng)溫度為45'C、 pH6.5，反應(yīng)3.5h后，放置8(TC水浴中保溫30min滅酶，然 后在25'C水浴中冷卻，交聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)45 50'C真空濃縮、在-50~-55匸溫度下冷凍 干燥后得到復(fù)合蛋白起泡劑產(chǎn)品，測得交聯(lián)后產(chǎn)物的起泡能力為293%，泡沫穩(wěn) 定性為97%，起泡能力比蛋清蛋白提高了 22 %。 實(shí)施例4
按實(shí)施例1的操作步驟制備得到分級的疏水性肽段和親水性肽段。 將分級得到的疏水性肽段和親水性肽段按1 : 1 (w/w)混合作為酶反應(yīng)底 物，底物多肽含量為50g/L，往底物溶液中加入5g/L的TGase進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)， 反應(yīng)溫度為45'C、 pH6.0，反應(yīng)4h后，放置8(TC水浴中保溫30min滅酶，然后 在25。C水浴中冷卻，交聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)45 5(TC真空濃縮、在-50 -55°。溫度下冷凍干 燥后得到復(fù)合蛋白起泡劑產(chǎn)品，測得交聯(lián)后產(chǎn)物的起泡能力為312%，泡沫穩(wěn)定 性為99%，起泡能力比蛋清蛋白提高了30%。 實(shí)施例5
按實(shí)施例1的操作步驟制備得到分級的疏水性肽段和親水性肽段。 將分級得到的疏水性肽段和親水性肽段按1 : 1 (w/w)混合作為酶反應(yīng)底 物，底物多肽含量為50g/L，往底物溶液中加入5g/L的TGase進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)， 反應(yīng)溫度為40'C、 pH6.5，反應(yīng)3h后，放置8(TC水浴中保溫30min滅酶，然后 在25。C水浴中冷卻，交聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)45 5(TC真空濃縮、在-50~-55°0溫度下冷凍干 燥后得到復(fù)合蛋白起泡劑產(chǎn)品，測得交聯(lián)后產(chǎn)物的起泡能力為303%，泡沬穩(wěn)定 性為98%，起泡能力比蛋清蛋白提高了26%。
權(quán)利要求
1．一種復(fù)合蛋白起泡劑的制備方法，其特征是以大豆分離蛋白、小麥面筋蛋白、大米蛋白及乳清蛋白為原料，先用堿性蛋白酶Alcalase將各類蛋白分別水解，然后通過超濾方法從各類蛋白混合水解液中獲得10kDa以上分子量的蛋白肽段，經(jīng)疏水性分級分離后，再通過谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶對不同疏水性肽段進(jìn)行交聯(lián)重組，交聯(lián)后的產(chǎn)物經(jīng)濃縮、冷凍干燥得到復(fù)合蛋白起泡劑產(chǎn)品，步驟為(1)蛋白質(zhì)的水解將大豆分離蛋白、小麥面筋蛋白、大米蛋白及乳清蛋白的蛋白質(zhì)分別進(jìn)行水解各類蛋白加水?dāng)嚢枞芙?，配?0g/L的蛋白溶液，用1mol/L NaOH溶液調(diào)整pH值至8.0，溫度保持55℃，加入溶液體積量0.2％的堿性蛋白酶Alcalase進(jìn)行水解反應(yīng)，期間維持蛋白溶液pH值8.0，當(dāng)?shù)鞍姿舛冗_(dá)到3％時(shí)終止反應(yīng)，水解液在沸水浴中加熱15 min滅酶，經(jīng)5000r/min離心20 min后收集上清液；(2)蛋白水解液的超濾將大豆分離蛋白、小麥面筋蛋白、大米蛋白及乳清蛋白的水解液按體積比3:3:3:1混合，使用截留分子量為10kDa的聚砜超濾膜將混合蛋白水解液進(jìn)行超濾，收集截留部分，獲得分子量大于10kDa的混合蛋白水解肽液；(3)分子量大于10kDa的混合蛋白水解液的疏水性分級使用超純水將C18柱浸潤充滿，將分子量大于10kDa的混合蛋白水解肽液上柱進(jìn)行分離，肽液每次上樣200mL，待肽液充滿C18柱之后，使用600mL超純水清洗，流速2mL/min，收集流出液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即得親水性肽段；再用600mL甲醇清洗，流速2mL/min，收集流出液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即得疏水性肽段；(4)不同疏水性肽段的酶法交聯(lián)將分級得到的疏水性肽段和親水性肽段按重量比1:1混合作為酶反應(yīng)底物，底物多肽含量為50g/L，往底物溶液中加入3～5g/L的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)溫度為40～45℃、pH 6.0～6.5，反應(yīng)2～4h后，放置80℃水浴中保溫30min滅酶，然后在25℃水浴中冷卻，交聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥后得到復(fù)合蛋白起泡劑產(chǎn)品，測得產(chǎn)品的起泡能力比蛋清蛋白提高了10％～30％。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合蛋白起泡劑的制備方法，其特征是所述的真空 濃縮處理是45 50'C的真空濃縮，所述的冷凍干燥處理是在-50~-55"溫度下的 冷凍干燥。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合蛋白起泡劑的制備方法，其特征是水解用的堿 性蛋白酶Alcakse的酶活單位為400000u/mL，交聯(lián)所用的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的酶 活單位為100u/g。
全文摘要
一種復(fù)合蛋白起泡劑的制備方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以大豆分離蛋白、小麥面筋蛋白、大米蛋白以及乳清蛋白為原料，分別采用堿性蛋白酶Alcalase將其適度水解，水解液按一定比例混合后進(jìn)行超濾獲得10kDa以上分子量的蛋白肽段，采用疏水性分級分離后獲得不同疏水性的肽段，再通過谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(TGase)交聯(lián)將不同疏水性蛋白肽段進(jìn)行重組，交聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)濃縮、冷凍干燥，得到復(fù)合蛋白起泡劑。本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的改造，制備的產(chǎn)品起泡能力和泡沫穩(wěn)定性均好于蛋清蛋白，起泡能力比蛋清蛋白提高10％～30％。本發(fā)明將有力促進(jìn)天然食品起泡劑在食品加工中的廣泛應(yīng)用和大大提高各類低值蛋白資源的利用率和附加值，將產(chǎn)生很好的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號A23L1/03GK101361532SQ200810196568
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月11日
發(fā)明者何志勇, 瑾 劉, 唐學(xué)燕, 熊幼翎, 王林祥, 潔 陳 申請人:江南大學(xué)