專利名稱：Egfr基因突變位點的檢測探針、液相芯片及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及EGFR基因突變位點的檢測探針、液相芯片及其檢測方法。

背景技術(shù)：
表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一種廣泛分布于人體各組織細胞膜上的多功能糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，為ErbB家族的四個成員之一，因此又名HER1或ErbB1。EGFR被配體激活后啟動胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，經(jīng)過細胞質(zhì)中銜接蛋白、酶的級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子激活基因的轉(zhuǎn)錄，指導(dǎo)細胞遷移、黏附、增殖、分化和凋亡。研究表明，在許多實體腫瘤中存在EGFR的高表達或異常表達，為以EGFR為靶向的腫瘤治療和針對EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)干預(yù)治療提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。因此，以表皮生長因子受體(EGFR)為治療靶標的分子靶向治療成為國內(nèi)外腫瘤界關(guān)注的焦點。其中，EGFR受體酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼(Genfitinib，Irressa)和厄洛替尼(Erlotinib，特羅凱，Tarceva)已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于治療晚期非小細胞肺癌(NSCLC)。我國在2005年2月也批準了吉非替尼進入臨床。這些藥物用于其他腫瘤(如乳腺癌、結(jié)腸癌和胃癌等)的治療，目前也已經(jīng)進入臨床試驗階段。
吉非替尼，厄洛替尼是一種口服的小分子EGFR拮抗劑，可與ATP競爭結(jié)合EGFR酪氨酸激酶區(qū)的ATP結(jié)合袋從而抑制EGFR的活性，已應(yīng)用于晚期和不適宜傳統(tǒng)化療方案的非小細胞肺癌患者的臨床治療，是目前對于部分NSCLC患者治療最有效的藥物。然而，患者對這種分子靶向藥物的反應(yīng)性與個體的遺傳背景相關(guān)。2004年6月，美國哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員Lynch等和Paez等率先報道，肺癌細胞中EGFR酪氨酸激酶編碼區(qū)基因突變是靶向治療藥物奏效的一個必要前提條件。研究結(jié)果顯示，對EGFR酪氨酸激酶基因編碼區(qū)突變型腫瘤，吉非替尼的有效率高達80％以上，而對無突變的野生型腫瘤上述藥物基本無效。這一最新研究結(jié)果發(fā)表后受到了各國學(xué)者的高度重視，并在不足一年的時間內(nèi)相繼被美國、日本、韓國和我國(包括臺灣)學(xué)者的研究所證實(Pao W等，2004；Han SW等，2005；Mitsudomi T等，2005；Huang SF等，2004；Mu XL等，2005)。因此，在進行吉非替尼，厄羅替尼等藥物治療前，檢測患者是否存在相關(guān)的EGFR功能性突變，可準確預(yù)測分子靶向藥物治療的有效性，便于臨床準確用藥，顯著提高藥物療效，使病人最大限度地受益，同時可以避免不合理用藥所造成的病人醫(yī)療費用增加和社會醫(yī)療資源浪費，減少不必要治療的時效損失以及經(jīng)濟損失。
目前，EGFR(酪氨酸激酶區(qū))基因突變的檢測標準是組織DNA樣本的直接測序。該方法由Lynch等和Pacz等率先報道，優(yōu)點是可以確切了解EGFR基因突變的范圍和類型，并且基因突變與吉非替尼臨床療效的關(guān)系已得到肯定。然而，基因測序作為臨床常規(guī)診斷方法也存在不少障礙，有待排除。首先，微量組織標本的檢測困難。組織DNA經(jīng)PCR擴增后進行基因測序，DNA需要量至少在100ng以上。目前檢測EGFR基因突變的標本主要取自術(shù)后的組織樣本，然而70％—80％的癌癥患者在確診時已難以進行根治性手術(shù)切除，無法獲得組織標本進行EGFR基因突變測定。晚期癌癥病人唯一能夠獲得組織的途徑是穿刺活檢。但腫瘤穿刺活檢組織的樣本很小。通常僅含數(shù)萬個細胞。因而微量組織標本的EGFR基因檢測相當困難。這類標本的EGFR基因檢測國內(nèi)還沒有成功的報道。其次，腫瘤穿刺活檢手術(shù)僅適用部分病人，標本采集的難度較大。晚期腫瘤多處于破裂出血的高危狀態(tài)，穿刺活檢作為一種損傷性手術(shù)存在一定的醫(yī)療風(fēng)險。并且相當一部分病人由于病灶所處的特殊解剖部位(如腦轉(zhuǎn)移、病灶鄰近心臟及大血管等)而不適宜進行這種手術(shù)。導(dǎo)致不能提供腫瘤組織進行基因診斷。最后，該方法對技術(shù)的要求高、結(jié)果判讀耗時費力。基因測序雖然是最直觀、準確的檢測方法，可以明確診斷突變的范圍及其類型。但其檢測周期長，從收到待檢樣品到順利完成檢測發(fā)出報告，需要連續(xù)的15—21小時。如以正常工作時間進行檢測，實際至少需要3個工作日才能發(fā)出檢測結(jié)果報告，因此，難以滿足指導(dǎo)臨床用藥時效性的要求。同時，由于95％以上的突變屬于雜合性突變(即同時存在野生型和突變型擴增產(chǎn)物)，準確診斷突變類型難度較大，尤其是外顯子19的基因突變譜比較復(fù)雜，不少標本需要通過基因克隆后才能確定其突變類型。因而該方法僅適合少數(shù)技術(shù)裝備精良的實驗室開展，國內(nèi)現(xiàn)有的研究都是依托重點大學(xué)及科研機構(gòu)(如中科院和協(xié)和醫(yī)科大學(xué))完成的，各級醫(yī)院很少能獨立開展這項診斷。
因此，EGFR基因突變的檢測要成為一項臨床常規(guī)診斷技術(shù)，迫切需要解決二個關(guān)鍵問題①需要尋找合適的腫瘤組織替代材料(surrogate source)，可以使晚期癌癥病人不必從腫瘤組織中獲取材料也能進EGFR基因診斷。②有必要研制開發(fā)特異性好、敏感性高、簡便易行的檢測新技術(shù)，使各級醫(yī)院都有條件開展這一基因診斷項目。
因此，建立一種采樣方便、病人痛苦小、特異性好、靈敏度高、準確快速、簡便易行且無需組織標本的EGFR基因突變診斷方法是NSCLC患者應(yīng)用EGFR TKIs治療需要解決的重要問題。
腫瘤病人的體液(血漿、血清或胸水等)中存在大量游離的核酸(DNA或RNA)，其含量約為健康人的10倍以上。這類游離核酸主要來自癌細胞凋亡壞死，其遺傳特性與腫瘤基因組DNA相同。因而血清游離核酸可用于癌基因突變檢測。但游離核酸可能僅有非常小量的突變基因，而含有大量的野生型基因，混雜的大量野生型基因會阻礙突變基因的檢出，因此需要一種高敏感性和特異性的突變體檢測方法來評估EGFR基因突變。
根據(jù)目前的文獻報道，EGFR與藥物療效相關(guān)的基因突變的發(fā)生頻率在亞洲約為30％-50％，主要集中在19外顯子的堿基缺失突變(△E746-750A，包括兩種常見類型，見下表)以及21外顯子的點突變(L858R)。在我國，19外顯子的堿基缺失突變約占突變總數(shù)的54.5％，21外顯子的點突變約占40.3％，其他外顯子的突變僅占5.2％。為此，本發(fā)明選擇突變率最高的19外顯子和21外顯子進行檢測。



發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供用于EGFR基因突變檢測的探針序列。
實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下 用于EGFR基因突變檢測的探針包括有 選自于SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3任一種的、針對Exon19外顯子的野生型探針，以及選自于SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6任一種的、針對Exon19外顯子的del E746-A750(1)突變型探針，和/或選自于SEQ ID NO.29～SEQ ID NO.31任一種的、針對Exon19外顯子的突變型del E746-A750(2)探針；和/或 選自于SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9任一種的針對Exon21外顯子的野生型探針，和選自于SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12任一種的針對Exon21外顯子的突變型探針。
本發(fā)明的另一目的是提供EGFR基因突變檢測的液相芯片。該液相芯片可用于檢測EGFR基因19和21外顯子上的相關(guān)突變，從而可用于預(yù)測吉非替尼，厄羅替尼等藥物治療療效。
實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下 一種EGFR基因突變檢測的液相芯片，主要包括有包被有堿基序列選自于SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.3任一種的、針對Exon19外顯子野生型的氨基修飾探針的微球，以及包被有堿基序列選自于SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6任一種的、針對Exon19外顯子delE746-A750(1)突變型的氨基修飾探針的微球，和/或包被有堿基序列選自于SEQ ID NO.29～SEQ ID NO.31任一種的、針對Exon19外顯子del E746-A750(2)突變型的氨基修飾探針的微球；和/或 包被有堿基序列選自于SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9任一種的針對Exon21外顯子野生型的氨基修飾探針的微球，和包被有堿基序列選自于SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12任一種的針對Exon21外顯子突變型的氨基修飾探針的微球，上述每種探針的堿基序列與氨基之間連接有間隔臂，上述每種微球具有不同顏色編碼； 以及用于擴增出具有19外顯子和/或21外顯子突變位點的目標序列的引物，且該目標序列的末端具有生物素標記。
以上所述間隔臂為用于將特異性的探針與微球表面間隔開來或是將特異性探針置于親水性環(huán)境中的序列。通過在探針序列與氨基之間設(shè)置適當長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。常見的間隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n間隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干擾，還可以用poly(TTG)作為間隔臂。本發(fā)明間隔臂優(yōu)選為5—30個T，更優(yōu)選為10個T。
具有間隔臂的氨基修飾探針的組成 SEQ ID NO. 5’NH2-TTTTTTTTTTcaaggaattaagagaagcaacat3’ 1 5’NH2-TTTTTTTTTTaaggaattaagagaagcaac3’ 2 5’NH2-TTTTTTTTTTgttgcttctcttaattcctt3’ 3 5’NH2-TTTTTTTTTTgtcgctatcaaaacatctccg3’4 5’NH2-TTTTTTTTTTtcgctatcaaaacatctccg3’ 5 5’NH2-TTTTTTTTTTcggagatgttttgatagcga3’ 6 5’NH2-TTTTTTTTTTagattttgggcTggccaaact3’7 5’NH2-TTTTTTTTTTgattttgggcTggccaaact3’ 8 5’NH2-TTTTTTTTTTagtttggccAgcccaaaatc3’ 9 5’NH2-TTTTTTTTTTtttgggcGggccaaactctg3’ 10 5’NH2-TTTTTTTTTTgattttgggcGggccaaact3’ 11 5’NH2-TTTTTTTTTTagtttggccCgcccaaaatc3’ 12 5’NH2-TTTTTTTTTT ccgtcgctatcaagacatctc3’ 29 5’NH2-TTTTTTTTTT cgtcgctatcaagacatct3’ 30 5’NH2-TTTTTTTTTT gagatgtcttgatagcgacgg3’ 31。
優(yōu)選地，用于擴增出具有19外顯子突變位點的目標序列的引物包括有SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.15引物序列，所述引物中至少有一條帶有末端的生物素標記；和/或用于擴增出具有21外顯子突變位點的目標序列的SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.18引物，所述引物中至少有一條帶有末端的生物素標記。
本發(fā)明的另一目的還在于提供一種EGFR基因突變的檢測方法，該方法快速、準確、操作簡便，可同時并行檢測多個突變位點，待測樣本可以是組織樣本，還可以是血清，血漿或者胸腔積液。
一種使用上述EGFR基因突變檢測的液相芯片EGFR基因突變的檢測方法，包括以下步驟 (1)提取待檢測樣本中的DNA后，以用于擴增出具有19外顯子和/或21外顯子突變位點的目標序列的引物進行第一輪PCR擴增； (2)酶切富集第一輪PCR擴增產(chǎn)物； (3)以酶切產(chǎn)物為模板進行第二輪PCR擴增； (4)第二輪PCR擴增產(chǎn)物與上述包被有探針序列的微球進行雜交； (5)雜交反應(yīng)后加入鏈霉親和素-藻紅蛋白進行反應(yīng)，然后通過Luminex儀器檢測信號。
優(yōu)選地，進行第一輪PCR擴增用的引物對為SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和/或SEQID NO.16、SEQ ID NO.17。
進行第二輪PCR擴增用的引物對SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15和/或SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.17。
優(yōu)選地，雜交的溫度為55—60℃。
優(yōu)選地，每種包被有探針的微球的制備方法包括步驟如下 (1)取微球母液，渦旋，充分混勻成微球懸液； (2)取出8μl微球母液，共含0.8×105—1.2×105個微球至0.5ml離心管中； (3)15,000rpm離心10min，小心棄去上清液； (4)加入10μl偶聯(lián)液(pH4.5)，渦旋使之充分混勻； (5)加入2pmol/μl探針工作液2μl； (6)加入2.5μl 10mg/ml的EDC工作液，25℃孵育30min；重復(fù)該步驟一次； (7)加入0.2ml洗滌液，渦旋使之充分混勻，12,000g離心5min，小心棄去上清液；重復(fù)該步驟一次； (8)加入500μlTE溶液，渦旋使之充分混勻； (9)12,000g離心5min，小心棄去上清液； (10)加入17μlTE溶液，渦旋使之充分混勻，微球濃度應(yīng)約為5×103個/μl； (11)取2μl，用水稀釋50倍，計數(shù)，儲存于2-8℃。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于 (1)采用本發(fā)明提供的EGFR基因突變檢測液相芯片，可同時對EGFR基因突變相對頻率較高的位點進行檢測，可以對19外顯子和21外顯子各單獨進行檢測，也可以兩者同時檢測，檢測時的反應(yīng)條件均一，檢測結(jié)果特異性好，靈敏度高，檢測準確度達90％以上。
(2)本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，因而避免了復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準確率。
(3)本發(fā)明所提供的檢測方法所需要的時間遠遠低于常用的測序技術(shù)，特別符合臨床需要。
(4)本發(fā)明采用酶切富集的方法進行目標序列的PCR擴增進而用于檢測，避免了產(chǎn)物中大量野生型序列對檢測結(jié)果所造成的干擾。
(5)本發(fā)明所提供的檢測方法不僅能檢測腫瘤組織樣本中的EGFR基因突變，同時也能檢測腫瘤病人體液中的EGFR基因突變，從而具有采樣方便、病人痛苦小、能夠動態(tài)監(jiān)測的優(yōu)勢。

具體實施例方式 以聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，以熒光檢測儀作為檢測平臺，對核酸分子進行高通量的多指標并行檢測。在微球的制造過程中，摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑，從而形成多至100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價結(jié)合了針對不同待檢測物的核酸分子作為探針分子，報告分子以生物素標記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、報告分子、熒光標記物就形成完整的微球檢測體系用于Luminex系統(tǒng)的讀取。Luminex閱讀系統(tǒng)分別激發(fā)紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測，其中紅色激光檢測微球表面紅色分類熒光的強度，并根據(jù)微球中不同色彩而編號分類，從而確定反應(yīng)的類型；綠色激光檢測樣本中熒光標記物的熒光強度，再通過機器與計算機自動統(tǒng)計分析激光所檢測到微球種類、數(shù)量，從而判定待測樣本多種目標測試物各自的濃度。
溶液配方 偶聯(lián)液(pH4.5)0.1mol/L MES(Sigma M-2933) 洗滌液0.2ml/LTween-20(Sigma P-9416)，1g/L SDS(SigmaL-4390) TE(pH8.0)(儲存液)10mmol/L Tris(Sigma337501)，1mmol/L EDTA(Sigma E-5134)2×Tm雜交緩沖液 過濾后貯存于4℃ 1×Tm雜交緩沖液 過濾后貯存于4℃。
實施例1 EGFR基因突變檢測的液相芯片的制備 一、探針序列設(shè)計及微球包被 針對EGFR基因19、21外顯子的野生型與突變型序列，設(shè)計特異的寡核苷酸探針。探針的5’端為一個氨基基團，接著是一個10個T的間隔臂。探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。探針分別與不同顏色編碼的微球(購自Luminex公司)通過共價結(jié)合偶聯(lián)在一起(包被過程)。探針序列如下表所示

每種微球包被的具體步驟如下 (1)將探針干粉10,000rpm離心1min； (2)用ddH2O溶解至0.1mM(0.1nmol/μl，約70μl)； (3)短時離心將溶液聚在管底； (4)分裝為10μl和2μl，儲存于-20℃； (5)取微球母液，渦旋，充分混勻成微球懸液； (6)分別取出1×105微球(共8μl母液)至0.5ml離心管中； (7)15,000rpm離心10min，小心棄去上清液； (8)加入10μl偶聯(lián)液(pH4.5)，渦旋使之充分混勻； (9)取2μl探針母液，用偶聯(lián)液(pH4.5)稀釋至2pmol/μl； (10)往裝有微球的離心管中加入相對應(yīng)的2pmol/μl探針工作液2μl； (11)用ddH2O配制EDC工作液(10mg/ml)； (12)每個反應(yīng)管各加入2.5μl EDC工作液，把剩余的EDC工作液丟棄； (13)25℃孵育30min； (14)每個反應(yīng)管再各加入2.5μl EDC工作液； (15)25℃孵育30min； (16)加入0.2ml洗滌液，渦旋使之充分混勻； (17)12,000g離心5min，小心棄去上清液； (18)重復(fù)步驟(16)、(17)一次； (19)加入500μlTE溶液(pH8.0)，渦旋使之充分混勻； (20)12,000g離心5min，小心棄去上清液； (21)加入17μl TE溶液(pH8.0)，渦旋使之充分混勻。(微球濃度應(yīng)約為5×103個/μl)； (22)取2μl，用水稀釋50倍，計數(shù)； (23)儲存于2-8℃。
二、微球包被效果的檢測 19外顯子與21外顯子分別設(shè)置6組實驗。以19外顯子為例，微球包被效果檢測第一組反應(yīng)體系中含野生型探針包被的微球與相應(yīng)的包被效果檢測用的生物素標記的反向互補序列即E19w-P+E19w-b；第二組反應(yīng)體系中含野生型探針包被的微球，突變型探針包被的微球及生物素標記的野生型探針的反向互補序列即E19w-P+E19m-P+E19w-b；第三組反應(yīng)體系中含突變型探針包被的微球與生物素標記的野生型探針的反向互補序列即E19w-P+E19m-b；第四組反應(yīng)體系中含突變型探針包被的微球與生物素標記的突變型探針的反向互補序列即E19m-P+E19m-b；第五組反應(yīng)體系中含突變型探針包被的微球，野生型探針包被的微球及生物素標記的突變型探針的反向互補序列即E19w-P+E19m-P+E19m-b；第六組反應(yīng)體系中含突變型探針包被的微球與生物素標記的野生型探針的反向互補序列即E19m-P+E19w-b。21外顯子的微球包被效果檢測實驗設(shè)計同19外顯子。具體操作流程如下 (1)將微球管渦旋，使微球充分混勻； (2)用1.5×Tm雜交液將微球稀釋至75個/μl(每反應(yīng)需微球工作液33μl)； (3)將微球工作液渦旋使之充分混勻； (4)每孔加入33μl微球工作液； (5)用TE(pH8.0)將包被效果檢測用的生物素標記的探針反向互補序列(即E19w-b，E19m-b，E21w-b，E21m-b)稀釋至25fmol/17μl； (6)背景孔加入17μl TE(pH8.0)； (7)其他每孔分別加入17μl包被效果檢測用的生物素標記的探針反向互補序列(即E19w-b，E19m-b，E21w-b，E21m-b)工作液(溶于TE溶液)； (8)輕輕混勻； (9)蓋上反應(yīng)板(管蓋)防止蒸發(fā)； (10)設(shè)置PCR儀程序95℃3min；60℃雜交孵育15min； (11)用1×Tm雜交液配制SA-PE至10ug/ml； (12)每孔加入25μl SA-PE，輕輕混勻； (13)60℃雜交孵育5min； (14)將Luminex儀器設(shè)置到雜交溫度，讀數(shù)。
微球包被效果檢測結(jié)果如下 實驗結(jié)果表明，本發(fā)明所設(shè)計的19外顯子野生型探針，19外顯子突變型探針，21外顯子野生型探針，21外顯子突變型探針均能很好地識別相應(yīng)的互補序列，雜交后的熒光值均在2500以上。同時，19外顯子野生型探針與19外顯子突變型探針之間不存在交叉反應(yīng)；21外顯子野生型探針與21外顯子突變型探針之間存在部分交叉反應(yīng)，但交叉反應(yīng)率在10％以內(nèi)，基本上不影響檢測結(jié)果。
引物的設(shè)計與標記 針對EGFR基因19與21外顯子的基因序列，分別設(shè)計如下引物 引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。其中，Exon19-S1與Exon19-As1用于19外顯子的第一輪PCR擴增，生物素標記Exon19-S1與Exon19-As2用于19外顯子的第二輪PCR擴增；Exon21-S1與Exon21-As1用于21外顯子的第一輪PCR擴增，Exon21-As1與生物素標記的Exon21-S2用于21外顯子的第二輪PCR擴增。
制備得到的EGFR基因突變檢測的液相芯片包括有 包被有SEQ ID NO.3的、針對Exon19外顯子的野生型氨基修飾探針的微球、包被有SEQID NO.6的、針對Exon19外顯子的del E746-A750(1)突變型氨基修飾探針的微球、包被有SEQID NO.31的、針對Exon19外顯子的del E746-A750(2)突變型氨基修飾探針的微球、包被有于SEQ ID NO.9的針對Exon21外顯子的野生型氨基修飾探針的微球、和包被有SEQ ID NO.12的針對Exon21外顯子的突變型氨基修飾探針的微球，上述每種微球具有不同顏色編碼；以及 SEQ ID NO.13—15和SEQ ID NO.16—18的引物序列，其中SEQ ID NO.13與SEQ IDNO.18堿基序列的5’端分別加上生物素標記。
實施例2 運用實施例1中的EGFR基因突變檢測的液相芯片對非小細胞肺癌血清樣本的檢測 一、待測樣本的準備(血漿、血清和胸水上清游離核酸的提取) 參照AxyPrep全血基因組小量提取試劑盒說明，詳細步驟如下 (1)取患者抗凝靜脈血或胸腔積液約2.5ml，3000rpm離心15分鐘，取300μl上清加到一個1.5ml干凈無菌的離心管中； (2)向離心管中加入500μl AP1緩沖液，渦旋振蕩充分混勻； (3)加入100μl AP2緩沖液，渦旋振蕩充分混勻； (4)室溫下12,000rpm離心10分鐘； (5)小心吸取上清加入放在2ml收集管上的吸附柱AxyPrep中，蓋上蓋子，以6,000rpm離心1分鐘； (6)倒掉廢液收集管中的廢液，用800μl緩沖液W1洗滌1次，以6,000rpm離心1分鐘； (7)倒掉廢液收集管中的廢液，加入800μl緩沖液W2，以12,000rpm離心1分鐘；倒掉廢液收集管中的廢液，加入500μl緩沖液W2，以12,000rpm離心1分鐘，棄掉廢液； (8)將吸附柱AxyPrep放回空收集管中，12,000rpm離心1分鐘； (9)將吸附柱AxyPrep置于一干凈無菌的1.5ml離心管中，加入40μl TE緩沖液，室溫下放置1分鐘，12,000rpm離心1分鐘洗脫DNA，電泳檢測，-20℃保存。
二、待測樣品的PCR擴增與酶切富集 (1)樣本DNA的PCR擴增與酶切富集 外顯子19突變型的酶切富集PCR擴增如下 1.第一輪PCR擴增 PCR反應(yīng)體系
PCR反應(yīng)條件 步驟 溫度 時間 循環(huán)次數(shù) 預(yù)變性 95℃ 5min 1 變性 95℃ 30sec 復(fù)性 60℃ 30sec 30 延伸 72℃ 45sec 最后延伸 72℃ 10min 1 2.PCR產(chǎn)物Mse I酶切 反應(yīng)體系如下 10×Mse I Buffer1μl PCR產(chǎn)物 3μl 100×BSA0.1μl Mse I 0.5μl(50U/μl) 加入滅菌雙蒸水至10μl 37℃溫育2小時，65℃20分鐘滅活酶。
3.第二輪PCR擴增 PCR反應(yīng)體系
PCR反應(yīng)條件 步驟 溫度 時間 循環(huán)次數(shù) 預(yù)變性 95℃ 5min 1 變性 95℃ 30sec 復(fù)性 60℃ 30sec30 延伸 72℃ 45sec 最后延伸 72℃ 10min1 外顯子21突變型的酶切富集PCR擴增如下 1.第一輪PCR擴增 PCR反應(yīng)體系
PCR反應(yīng)條件 步驟 溫度 時間 循環(huán)次數(shù) 預(yù)變性95℃ 5min 1 變性 95℃ 30sec 復(fù)性 60℃ 30sec 30 延伸 72℃ 45sec 最后延伸 72℃ 10min 1 2.PCR產(chǎn)物Msc I酶切 反應(yīng)體系如下 10×Msc I Buffer1μl PCR產(chǎn)物 3μl Msc I 0.5μl(10U/μl) 加無酶水至 10μl 37℃溫育2小時，65℃ 20分鐘滅活酶。
3.第二輪PCR擴增 PCR反應(yīng)體系
PCR反應(yīng)條件 步驟 溫度時間 循環(huán)次數(shù) 預(yù)變性95℃5min 1 變性 95℃30sec 復(fù)性 60℃30sec30 延伸 72℃45sec 最后延伸 72℃10min1 或者進行EGFR基因19，21外顯子突變型與野生型序列的同步擴增(多重PCR擴增) 1.19外顯子，21外顯子第一輪PCR擴增以及酶切與上述相同，不同的是第二輪PCR擴增采取同步擴增的方法。
2.第二輪PCR擴增(19，21外顯子野生型序列與突變型序列同時擴增) PCR反應(yīng)體系
PCR反應(yīng)條件 步驟 溫度 時間 循環(huán)次數(shù) 預(yù)變性 95℃ 5min 1 變性 95℃ 30sec 復(fù)性 60℃ 30sec30 延伸 72℃ 45sec 最后延伸 72℃ 10min1 三、雜交與上機檢測 (1)將包被有19外顯子野生型探針(E19w-P)，19外顯子del E746-A750(1)突變型探針(E19m-P)，19外顯子del E746-A750(2)突變型探針(E19m-P11)，21外顯子野生型探針(E21w-P)，21外顯子突變型探針(E21m-P)，陰性對照探針(N-P)的微球分別vortex 30s，超聲處理30s； (2)用1.5×Tm雜交液配制含有包被有探針的混合微球工作液，使溶液中每種微球濃度為75個/μl； (3)將混合微球工作液vortex 30s，超聲處理30s； (4)每孔加入對應(yīng)的33μl混合微球工作液，使反應(yīng)體系中最終含有每種微球各約2500個； (5)背景孔加入17μl TE(pH8.0)；其他每孔分別加入每個樣本的19外顯子及21外顯子的第二輪PCR產(chǎn)物各2-17μl，補加TE至17μl；輕輕混勻；蓋上反應(yīng)板(管蓋)防止蒸發(fā)； (6)設(shè)置PCR儀程序95℃5min；60℃雜交孵育15min； (7)用1×Tm雜交液配制SA-PE至2ug/ml(75μl/孔)； (8)將反應(yīng)管(板)12,000g離心5min，小心棄去上清液?；蛘咿D(zhuǎn)移至濾板中，抽濾除去液體； (9)每孔加入75μl SA-PE(鏈親和素藻紅蛋白)工作液(含150ng的SA-PE)，輕輕混勻； (10)馬上置于雜交溫度(60℃)，孵育5min； (11)將Luminex儀器設(shè)置到雜交溫度，讀數(shù)。
四、檢測結(jié)果與數(shù)據(jù)分析 反應(yīng)后產(chǎn)物通過Luminex系列分析儀器檢測，檢測結(jié)果如表1所示。19外顯子野生型與突變型(缺失)探針不存在交叉反應(yīng)，因此以突變型熒光值(兩種突變型熒光值較高者)除以陰性對照熒光值(即M/N)>25作為陽性判定值(cut-off值)。當19外顯子檢測結(jié)果M/N>25時，則判定該樣本為存在19外顯子的缺失，否則判定該樣本為19外顯子野生型。21外顯子野生型探針與突變型探針存在交叉反應(yīng)(交叉反應(yīng)率在10％以內(nèi))，因此，以(突變型熒光值-陰性對照熒光值)/(野生型熒光值-陰性對照熒光值)即((M-N)/(W-N))>2作為陽性判定值(cut-off值)。當21外顯子檢測結(jié)果((M-N)/(W-N))>2時，判定該樣本存在21外顯子的L858R點突變，否則判定該樣本為21外顯子野生型。
根據(jù)這一判定標準，本實施例所檢測的10份樣本中，3例存在19外顯子的缺失(3號，5號，7號樣本)，2例存在21外顯子的點突變(2號，10號樣本)。檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳再進行銀染的結(jié)果作比較，計算吻合率。19外顯子的檢測吻合率達到100％，21外顯子的檢測吻合率亦達到90％。整體吻合率為95％。因此，使用本發(fā)明所提供的EGFR基因突變檢測液相芯片及其檢測方法可以準確檢測EGFR基因19外顯子的缺失突變及21外顯子的點突變，準確率高達95％，為評估吉非替尼，厄羅替尼等靶向藥物治療的有效性，便于臨床準確用藥，避免不必要治療的時效損失以及經(jīng)濟損失提供了重要的檢測手段。
表1 血清樣本的檢測結(jié)果 表2 血清樣本EGFR突變類型分析結(jié)果 實施例3 運用實施例1中的EGFR基因突變檢測的液相芯片對肺癌組織樣本的檢測 取上述實施例2所用的1-10號病人的肺癌組織樣本進行檢測，具體過程如下 一、待測樣本的準備 肺癌組織樣本中DNA的提取取肺癌術(shù)后或活檢的組織標本5-50mg，研磨后，用pH7.4的PBS溶液洗滌2次；洗滌后的組織標本重懸于1ml的消化液(50mmol/L Tris，1mmo/LNa2EDTA，0.5％ Tween-20，200ug/ml的蛋白酶K 200，pH8.5)，55℃水浴消化1小時，99℃水浴15min滅活蛋白酶K；12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；取上清，通過酚-氯仿-異戊醇法抽提，乙醇沉淀法獲得用于PCR反應(yīng)的DNA樣品。也可通過微量離心柱法提取DNA； 二、待測樣品的PCR擴增與酶切富集 具體方法同實施例2。
三、雜交與上機檢測 具體方法同實施例2進行檢測。
四、檢測結(jié)果與數(shù)據(jù)分析 反應(yīng)后產(chǎn)物通過Luminex系列分析儀器檢測，檢測結(jié)果如表3，表4所示。判定標準同實施例2所述。實驗結(jié)果顯示，肺癌組織樣本檢測的分析結(jié)果與用血清樣本進行檢測分析的結(jié)果一致，即10例樣本中存在3例19外顯子的缺失突變(3號，5號，7號樣本)，存在2例21外顯子的點突變(2號，10號樣本)。說明本發(fā)明所提供的用血清游離核酸進行EGFR基因突變檢測的方法是可行的，也說明本發(fā)明所提供的方法是穩(wěn)定可靠的。
表3 肺癌組織樣本的檢測結(jié)果 表4 肺癌組織樣本EGFR突變類型分析結(jié)果 實施例4 一、制備EGFR基因突變檢測的液相芯片 按照實施例1的方法將探針包被微球 一、EGFR突變檢測其他備選探針設(shè)計及微球包被 針對EGFR基因19、21外顯子的野生型與突變型序列，設(shè)計兩組寡核苷酸探針(E19w-P1，E19m-P1，E19m-P13，E21w-P1，E21m-P1以及E19w-P2，E19m-P2，E19m-P12，E21w-P2，E21m-P2)。探針的5’端為一個氨基基團，接著是一個10個T的間隔臂。探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。探針分別與不同顏色編碼的微球(購自Luminex公司)通過共價結(jié)合偶聯(lián)在一起(包被過程)，同實施例1所述。探針序列如下表所示
本實施例的EGFR基因突變檢測的液相芯片包括有 包被有SEQ ID NO.2的、針對Exon19外顯子的野生型氨基修飾探針的微球、包被有SEQID NO.5的、針對Exon19外顯子del E746-A750(1)的突變型氨基修飾探針的微球、包被有SEQ ID NO.30的、針對Exon19外顯子del E746-A750(2)的突變型氨基修飾探針的微球、包被有于SEQ ID NO.8的針對Exon21外顯子的野生型氨基修飾探針的微球、和包被有SEQ IDNO.11的針對Exon21外顯子的突變型氨基修飾探針的微球，上述每種微球具有不同顏色編碼；以及 SEQ ID NO.13—15和SEQ ID NO.16—18的引物序列，其中SEQ ID NO.15與SEQ IDNO.17堿基序列的5’端分別加上生物素標記。
二、將本實施例的EGFR基因突變檢測的液相芯片用于肺癌血清樣本的檢測 運用E19w-P1，E19m-P1，E19m-P13，E21w-P1，E21m-P1探針包被的微球?qū)Ψ切〖毎伟┭鍢颖镜臋z測。
選擇實施例2中所用的1-5共五份非小細胞肺癌血清樣本進行檢測。待測樣本的準備，待測樣本的PCR擴增與酶切富集，雜交與上機檢測的實驗步驟同實施例2所述。實驗結(jié)果如下所示 表5 血清樣本的檢測結(jié)果 表6 血清樣本EGFR突變類型分析結(jié)果 實驗結(jié)果表明，探針E19w-P1，E19m-P1，E19m-P13，E21w-P1，E21m-P1同樣可用于對臨床樣本EGFR的突變檢測，分析結(jié)果與用探針(E19w-P，E19m-P，E19m-P11，E21w-P，E21m-P)檢測的結(jié)果一致。
實施例5 一、制備EGFR基因突變檢測的液相芯片 制備方法同實施例1。
本實施例的EGFR基因突變檢測的液相芯片包括有 包被有SEQ ID NO.1的、針對Exon19外顯子的野生型氨基修飾探針的微球、包被有SEQID NO.4的、針對Exon19del E746-A750(1)的突變型氨基修飾探針的微球、包被有SEQ IDNO.29的、針對Exon19外顯子del E746-A750(2)的突變型氨基修飾探針的微球、包被有于SEQ ID NO.7的針對Exon21外顯子的野生型氨基修飾探針的微球、和包被有SEQ ID NO.10的針對Exon21外顯子的突變型氨基修飾探針的微球，上述每種微球具有不同顏色編碼；以及 SEQ ID NO.13—15和SEQ ID NO.16—18的引物序列，其中SEQ ID NO.15與SEQ IDNO.17堿基序列的5’端分別加上生物素標記。
二、將本實施例的EGFR基因突變檢測的液相芯片用于肺癌血清樣本的檢測 運用E19w-P2，E19m-P2，E19mP12，E21w-P2，E21m-P2探針包被的微球?qū)Ψ切〖毎伟┭鍢颖镜臋z測 同樣選擇1-5共五個非小細胞肺癌血清樣本進行檢測。待測樣本的準備，待測樣本的PCR擴增與酶切富集，雜交與上機檢測的實驗步驟同實施例2所述。實驗結(jié)果如下所示 表7 血清樣本的檢測結(jié)果 表8 血清樣本EGFR突變類型分析結(jié)果 實驗結(jié)果表明，探針E19w-P2，E19m-P2，E19m-P12，E21w-P2，E21m-P2也可用于對臨床樣本EGFR的突變檢測，分析結(jié)果與探針(E19w-P，E19m-P，E19m-P11，E21w-P，E21m-P)檢測的結(jié)果一致。
序列表
<110>廣州益善生物技術(shù)有限公司
<120>EGFR基因突變位點的檢測探針、液相芯片及其檢測方法
<160>34
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>23
212>DNA
<213>人工序列
<400>1
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
<210>13
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
<210>15
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
<210>18
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
<210>19
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
<210>30
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
<210>31
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3權(quán)利要求
1.用于EGFR基因突變檢測的探針序列，其特征在于包括有
選自于SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3任一種的、針對Exon19外顯子的野生型探針，以及選自于SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6任一種的、針對Exon19外顯子的del E746-A750(1)突變型探針，和/或選自于SEQ ID NO.29～SEQ ID NO.31任一種的、針對Exon19外顯子的del E746-A750(2)突變型探針；和/或
選自于SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9任一種的、針對Exon21外顯子的野生型探針，和選自于SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12任一種的、針對Exon21外顯子的突變型探針。
2.用于EGFR基因突變檢測的液相芯片，其特征在于主要包括有
A.包被有探針的微球包被有堿基序列選自于SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3任一種的、針對Exon19外顯子野生型的氨基修飾探針的微球，以及包被有堿基序列選自于SEQ IDNO.4～SEQ ID NO.6任一種的、針對Exon19外顯子del E746-A750(1)突變型的氨基修飾探針的微球，和/或包被有堿基序列選自于SEQ ID NO.29～SEQ ID NO.31任一種的、針對Exon19外顯子del E746-A750(2)突變型的氨基修飾探針的微球；和/或
包被有堿基序列選自于SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9任一種的針對Exon21外顯子野生型的氨基修飾探針的微球，和包被有堿基序列選自于SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12任一種的針對Exon21外顯子突變型的氨基修飾探針的微球，上述每種探針的堿基序列與氨基之間連接有間隔臂，上述每種微球具有不同顏色編碼；以及
B.引物用于擴增出具有19外顯子和/或21外顯子突變位點的目標序列的引物，且該目標序列的末端具有生物素標記。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的EGFR基因突變檢測的液相芯片，其特征是，包被探針的微球為包被有堿基序列為SEQ ID NO.3的、針對Exon19外顯子野生型的氨基修飾探針的微球，和包被有堿基序列為SEQ ID NO.6的、針對Exon19外顯子突變型的氨基修飾探針的微球，和包被有堿基序列為SEQ ID NO.31的、針對Exon19外顯子突變型的氨基修飾探針的微球；和包被有堿基序列為SEQ ID NO.9的針對Exon21外顯子野生型的氨基修飾探針的微球，和包被有堿基序列為SEQ ID NO.12、針對Exon21外顯子突變型的氨基修飾探針的微球，上述每種探針的堿基序列與氨基之間連接有間隔臂，上述每種微球具有不同顏色編碼。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于EGFR基因突變檢測的液相芯片，其特征在于所述間隔臂為5—30個T。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于EGFR基因突變檢測的液相芯片，其特征在于所述間隔臂為10個T。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項所述的用于EGFR基因突變檢測的液相芯片，其特征在于用于擴增出具有19外顯子突變位點的目標序列的SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.15引物，所述引物中至少有一條帶有末端的生物素標記；和/或用于擴增出具有21外顯子突變位點的目標序列的SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.18引物，所述引物中至少有一條帶有末端的生物素標記。
7.一種EGFR基因突變的檢測方法，其特征在于使用權(quán)利要求2所述的EGFR基因突變檢測的液相芯片，包括以下步驟
1)提取待檢測樣本中的DNA，以用于擴增出具有19外顯子和/或21外顯子突變位點的目標序列的引物進行第一輪PCR擴增；
2)酶切富集第一輪PCR擴增產(chǎn)物；
3)以酶切產(chǎn)物為模板進行第二輪PCR擴增；
4)第二輪PCR擴增產(chǎn)物與對應(yīng)的權(quán)利要求2中所述包被有探針的微球進行雜交；
5)雜交反應(yīng)后加入鏈霉親和素-藻紅蛋白進行反應(yīng)，然后檢測信號。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的EGFR基因突變的檢測方法，其特征在于步驟1)第一輪PCR擴增用的引物對為SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和/或SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17。步驟3)第二輪PCR擴增用的引物對為SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15和/或SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.17。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的EGFR基因突變的檢測方法，其特征在于步驟4)所述雜交溫度為55—60℃。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的EGFR基因突變的檢測方法，其特征在于每種所述包被有探針的微球的制備方法包括步驟如下
(1)取微球母液充分混勻成微球懸液；
(2)取出8μl微球母液，共含0.8×105—1.2×105個微球至0.5ml離心管中；
(3)15,000rpm離心10min，小心棄去上清液；
(4)加入10μl偶聯(lián)液，渦旋使之充分混勻；
(5)加入2pmol/μl探針工作液2μl；
(6)加入2.5μl10mg/ml的EDC工作液，25℃孵育30min；重復(fù)該步驟一次；
(7)加入0.2ml洗滌液，渦旋使之充分混勻，12,000g離心5min，小心棄去上清液；重復(fù)該步驟一次；
(8)加入500μlTE溶液，渦旋使之充分混勻；
(9)12,000g離心5min，小心棄去上清液；
(10)加入17μlTE溶液，渦旋使之充分混勻，微球濃度應(yīng)約為5×103個/μl；
(11)取2μl，用水稀釋50倍，計數(shù)，儲存于2-8℃。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種EGFR基因突變位點的檢測探針、液相芯片及其檢測方法，該EGFR基因突變檢測液相芯片主要包括有包被探針的微球；用于擴增出具有19外顯子和/或21外顯子的目標序列的引物。采用本發(fā)明提供的EGFR基因突變檢測液相芯片和檢測方法，可同時對EGFR基因突變相對頻率較高的位點進行檢測，可以對19外顯子和21外顯子各單獨進行檢測，也可以兩者同時檢測，檢測時的反應(yīng)條件均一，檢測結(jié)果特異性好，靈敏度高，檢測準確度達90％以上，檢測所需時間短。本發(fā)明所提供的檢測方法不僅能檢測腫瘤組織樣本中的EGFR基因突變，同時也能檢測腫瘤病人體液中的EGFR基因突變，且能夠動態(tài)監(jiān)測的優(yōu)勢。
文檔編號C12Q1/68GK101445829SQ20081018412
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月23日
發(fā)明者許嘉森, 楊惠夷, 林一群, 軍 徐 申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司