專利名稱：一種基于核酸適體和pcr擴(kuò)增來檢測(cè)目標(biāo)分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用核酸分子識(shí)別和結(jié)合樣品中的目標(biāo)分子，利用PCR方法擴(kuò)增來定量和
檢測(cè)目標(biāo)分子的方法。
背景技術(shù)：
核酸適體(aptamer)指的是經(jīng)體外篩選技術(shù)(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment, SELEX)篩選出的能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的寡聚 核苷酸片段，對(duì)可結(jié)合的配體有嚴(yán)格的識(shí)別能力和高度的親和力。自1990年Tuerk等 首次利用SELEX技術(shù)成功篩選到噬菌體T4DNA聚合酶的RNA型適體以來，截止到 2004年6月8日，據(jù)Aptamer Database網(wǎng)站報(bào)道，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室通過該技術(shù)已成功篩選 出了 2882種核酸適體，許多申請(qǐng)專利保護(hù)的適體序列還未計(jì)其中。核酸適體作為一種 新型的分子識(shí)別工具，與傳統(tǒng)的抗體相比不僅具有高度的親和力與特異性，還具有易合 成、易修飾、半衰期較長、不易變性、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，并且避免了傳統(tǒng)蛋白質(zhì)檢測(cè)方 法中操作復(fù)雜、常需對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記、不易保持活性等缺點(diǎn)，有效地提高了蛋白質(zhì)檢 測(cè)的效率與靈敏度。在基礎(chǔ)研究、臨床診斷、藥物研制和目標(biāo)蛋白的定量檢測(cè)方面得以 廣泛應(yīng)用。
目前，結(jié)合核酸適體對(duì)蛋白質(zhì)和小分子的檢測(cè)方法有分子熒光、電化學(xué)、化學(xué)發(fā)光 等手段，具有較高的靈敏度。這些方法的檢測(cè)限一般在10—6—10—'2mol/L，但是對(duì)于更高 靈敏度的檢測(cè)要求則難以做到，或者結(jié)果重現(xiàn)性差，難以在實(shí)際應(yīng)用。
PCR技術(shù)自1985年問世以來，已成為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)，也是現(xiàn)代分子生物學(xué)研 究中不可缺少的手段，是一種極為敏感的放大系統(tǒng)。但是PCR只能對(duì)DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增 和檢測(cè)，限制了它對(duì)蛋白質(zhì)和小分子的檢測(cè)。
1992年Sano等人將免疫測(cè)定技術(shù)與PCR結(jié)合，創(chuàng)建了一種全新的、極其敏感的抗 原分子檢測(cè)技術(shù)，即免疫PCR。免疫PCR運(yùn)用PCR的高度敏感性來放大抗原抗體反應(yīng)的 特異性，實(shí)驗(yàn)中可檢測(cè)到數(shù)百個(gè)抗原分子，在理論上甚至可檢測(cè)到1至數(shù)個(gè)抗原分子。 但免疫PCR影響因素較多，如連接分子、顯示系統(tǒng)的選擇、DNA報(bào)告分子的濃度、PCR 循環(huán)次數(shù)等，都影響它的敏感性和特異性，目前該技術(shù)尚未完全成熟，限制了它的進(jìn)-步應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于核酸適體的PCR方法。用于高靈敏度的檢測(cè)微量目標(biāo)
物質(zhì)。
本發(fā)明所提供的方法，稱為核酸適體PCR (aptamer based polymerase chain reaction, A-PCR)，包括以下步驟
1固定能與目標(biāo)分子結(jié)合的核酸片段或者核酸適體。 在核酸適體的一端上(3'端或者5'端)上預(yù)先標(biāo)記硫基或者生物素(為便于 描述，我們將此核酸適體命名為A鏈)，以固定在支持物上。如可以標(biāo)記硫基，以 固定在鉑金電極上；或者標(biāo)記生物素和標(biāo)記鏈霉親和素或者親和素的支持物相連接。 與電極固定時(shí)，首先將電極磨好，將電極浸放在含有核酸適體的溶液中過夜，核酸 適體的濃度在10—8—1(T"mol/L之間。
2在固定A鏈后，為了使固定在電極上的A鏈直立不倒伏，我們用硫基來飽和電極上 的結(jié)合位點(diǎn)。
3設(shè)計(jì)一個(gè)核酸片段，特征在于與步驟l中的核酸片段部分互補(bǔ)；長度大于30堿基 (為便于描述，我們將此核酸適體命名為B鏈)。為了后面步驟的有效分離，可以在 B鏈的一端標(biāo)記生物素，以和標(biāo)記鏈霉親和素或者親和素的磁珠結(jié)合。
4將B鏈與A鏈雜交，形成部分互補(bǔ)的雜交雙鏈。雜交溫度45°C，雜交時(shí)間大于30 min， 雜交時(shí)B鏈過量，雜交后從溶液中取出電極并沖洗，以去除多余的B鏈。
5將形成的雜交雙鏈核酸與包含目標(biāo)分子的樣品溶液混合?；旌虾螅怂徇m體(A鏈) 和目標(biāo)分子(配體)結(jié)合，形成核酸片段和目標(biāo)分子復(fù)合物，這種結(jié)合造成B鏈和 A鏈的解離。
6用磁珠吸附游離在樣品溶液中的B鏈，進(jìn)行富集，并去除樣品溶液中對(duì)PCR擴(kuò)增有
負(fù)面影響的成分。 7如果B鏈為RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
8用PCR或者熒光定量PCR方法擴(kuò)增步驟5中解離的B鏈；或者步驟6中富集的B鏈； 或者步驟7中反轉(zhuǎn)錄的cDNA。
9用擴(kuò)增的DNA的量或者熒光定量PCR計(jì)算出的Ct值來間接的定量目標(biāo)分子。
將擴(kuò)增的DNA用電泳進(jìn)行特異PCR產(chǎn)物檢測(cè)，根據(jù)目標(biāo)條帶的有無或者強(qiáng)弱來判斷 目標(biāo)分子的多少，或者根據(jù)熒光定量PCR計(jì)算出的Ct值來判斷。Ct和PCR體系中起始 模板數(shù)的對(duì)數(shù)之間有嚴(yán)格的線性關(guān)系，利用不同梯度的陽性定量標(biāo)準(zhǔn)模板擴(kuò)增的Ct值 和該陽性定量標(biāo)準(zhǔn)的模板數(shù)經(jīng)過對(duì)數(shù)擬和作圖，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的Ct
值就可以準(zhǔn)確的確定起始模板的數(shù)量。 本發(fā)明的原理如圖l所示。
1在支持物(電極)上固定核酸適體(A鏈)；2用硫基來飽和電極上的結(jié)合位點(diǎn)；3 將B鏈與A鏈雜交，形成部分互補(bǔ)的雜交雙鏈；4將形成的雜交雙鏈核酸與樣品溶液混 合，核酸適體和目標(biāo)分子(配體)結(jié)合后，B鏈和A鏈的解離；5用磁珠吸附游離在樣 品溶液中的B鏈，進(jìn)行富集；6用PCR或者熒光定量PCR方法擴(kuò)增并檢測(cè)。
該技術(shù)把核酸適體和配體結(jié)合的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高靈敏性有機(jī)結(jié)合起
來，其本質(zhì)是一種以PCR擴(kuò)增一段DNA報(bào)告分子來放大核酸適體和配體結(jié)合率，從而檢 測(cè)目標(biāo)配體的一種方法。它利用核酸適體和目標(biāo)分子的結(jié)合力高于核酸適體和互補(bǔ)序列 的結(jié)合力這一特點(diǎn)，已結(jié)合配體的核酸適體將和DNA報(bào)告分子解離，PCR擴(kuò)增這段解離 下的DNA分子并檢測(cè)特異PCR產(chǎn)物。將蛋白質(zhì)和小分子的檢測(cè)轉(zhuǎn)換為特異識(shí)別的核酸適 體的檢測(cè)，不僅避免了傳統(tǒng)蛋白質(zhì)檢測(cè)方法中操作復(fù)雜、常需對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記、不易 保持活性等缺點(diǎn)，還有效地提高了蛋白質(zhì)檢測(cè)的效率與靈敏度。核酸適體PCR是迄今最 敏感的檢測(cè)方法之一，理論上可以檢測(cè)單個(gè)目標(biāo)分子。相比于免疫PCR，具有操作和過 程簡(jiǎn)單，影響因素少，結(jié)果更加可靠的特點(diǎn)；敏感性比現(xiàn)行的ELISA法高102 10M咅， 可以被廣泛的應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子和小分子的微量檢測(cè)。將會(huì)在生物傳感器、新藥開發(fā)以 及納米技術(shù)等方面有著廣泛的用途。
本發(fā)明的核酸適體PCR具有以下優(yōu)點(diǎn)
1操作和步驟簡(jiǎn)單，影響因素少，結(jié)果可靠。
2高特異性。
3高靈敏性，理論上可以檢測(cè)單個(gè)目標(biāo)分子。
4可以在溶液中直接對(duì)生物分子進(jìn)行識(shí)別和檢測(cè)。
5可以在生物體液中直接對(duì)生物分子進(jìn)行識(shí)別和檢測(cè)。


附圖1為Aptamer based PCR原理圖
附圖2為熒光定量PCR
附圖3為依據(jù)Ct值確定擴(kuò)增前B鏈的量
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本
發(fā)明。
實(shí)施例l:用Aptamer based PCR進(jìn)行血清或血漿中微量可卡因的檢測(cè)(小分子檢測(cè)) (不用磁珠富集和分離)
本實(shí)驗(yàn)所用的DNA序列 A鏈序列(39 bases)
3-HS-(CH2)6陽CTG GGT GAA GTA ACT TCC TAA AAG GAA C/AG AGG GGG
/\G7"-5 B鏈序列(58 bases)
5-GTGTGAAGCGGCATCTAAAGCG7"CT"CCCCCrCAAGACTAGGTCCAGCCCA GAGGTGTC -biotin -3
斜體部分是模板的雜交部位
B鏈引物
S: 5-GTG TGA AGC GGC ATC TAA AGC-3 (21 bases) A: 5-GAC ACC TCT GGG CTG GAC C-3(19bases)
實(shí)驗(yàn)步驟
一、 金電極的處理
1、 首先滴一滴分離試劑在金電極上，15 mhi后，用雙蒸水沖掉。 分離試劑&02:濃H2S04=7: 3 (體積比)
2、 用Al2Cb泥漿對(duì)金電極進(jìn)行拋光。磨金電極時(shí)要用力均勻，金電極一定要垂直。
3、 用雙蒸水將金電極沖洗干凈，用濾紙和洗耳球吹干電極。
4、 用銀/氯化銀電極、鉑電極、金電極在鐵氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)液中表征，得到的循環(huán)伏安圖(后 面簡(jiǎn)稱CV圖)上顯示的電壓差70-85 mv時(shí)，表示電極已磨好。
5、 表征時(shí)的參數(shù)
初始電壓-0.2V 高位電壓0.5v 低電壓-0.2V 掃描速度0.05
掃描段數(shù)6 靈敏度l.e-005
注電極磨好后要立即使用，否則重磨。
二、 將A鏈結(jié)合到金電極上
1、 取2nLlnM(相當(dāng)于1.2*109個(gè))的A鏈于1.5mL的EP管中，然后向EP管中加入 298 1.0M KH2P04緩沖液，使EP管中溶液總體積為300
2、 將金電極垂直懸于EP管溶液中
3、 將步驟2的裝置放置在室溫下孵育8-12h
4、 用10mMPBS (pH=7.3)沖洗電極3次，每次2005、 用約3-4 mL雙蒸水浸泡電極5 min，用洗耳球吹干電極，測(cè)CV圖
6、 測(cè)完CV圖，再用10mMPBS (pH=7.3)沖洗3次，吹干
7、 將金電極垂直懸于300nL1.0mM巰基乙酸中，室溫1 h
8、 再用3-4mL雙蒸水浸泡電極5min，取出電極，吹干，測(cè)CV圖
9、 測(cè)完CV圖，將電極浸泡于10mMPBS(0.3MNaCl， pH-7.3)中 注1、用水浸泡電極，沖掉未與金電極作用的A鏈與巰基乙酸
2、 Bare-Au電極CV圖，Au-A鏈CV圖，Au-A鏈-巰基乙酸CV圖進(jìn)行疊加，通 過觀察電極可逆性來判斷結(jié)果是否正確。
理論上裸金電極給出一個(gè)可逆對(duì)稱峰圖，組裝了 SH-aptamer鏈(A鏈)之后，電 極的可逆性應(yīng)該顯著降低，這是因?yàn)锳鏈?zhǔn)且欢蝧sDNA，其帶負(fù)電荷的磷酸骨 架為電極表面引入了大量的負(fù)電荷，排斥(Fe(CN)6) 3—/4—接近電極進(jìn)行電子交 換。當(dāng)自組裝了 SH-(CH2)-COOH之后，電極的可逆性又有所恢復(fù)。這是因?yàn)?SH-(CH2)-COOH填補(bǔ)了電極上的空位，使得原先整個(gè)橫躺在電極表面上的A 鏈除根部以外離開電極表面立起來。這樣，電極表面的負(fù)電荷就大大減少，電 極的可逆性得到部分恢復(fù)。
三、 將B鏈和A鏈雜交
1 、取2pL 10 nM的B鏈于小燒杯中，再加入498pL 10 mM PBS(0.3M NaCl pH=7.3) 混勻，總體系為500 ^L。
2、 將步驟二中準(zhǔn)備好的電極插入到上述溶液中，金電極既要接觸溶液，又不能碰觸 燒杯底部，并在小燒杯上蓋一塑料蓋子，蓋子要扣緊，以防電極接觸燒杯底部。
3、 將歩驟2的裝置放入4(TC下孵育45min，且震蕩使溶液混合均勻。
4、 反應(yīng)完成后，用10mMPBS (pH=7.3)徹底沖洗金電極，以除去未雜交上的B鏈。
5、 吹干電極，測(cè)CV圖。
6、 比較此次CV圖與前三次的異同，可判斷B鏈有沒有與A鏈雜交。理論上當(dāng)B 鏈與A鏈雜交之后，電極的可逆性也應(yīng)該顯著降低，這是因?yàn)锽鏈也是一段 ssDNA，其帶負(fù)電荷的磷酸骨架為電極表面引入了大量的負(fù)電荷，排斥(Fe(CN)6) 3—/4—接近電極進(jìn)行電子交換。
四、 與可卡因結(jié)合
1、 將歩驟三中準(zhǔn)備好的電極其中一根依次插入到上述4個(gè)不同濃度的可卡因溶液中(濃
度由低到高分別為1(T21M、 1(T20M、 1(T19M、 10"8M， 10mMPBS， 1MNaCI， pH=7.0， 溶液體積30(V1)。
2、 將步驟三中準(zhǔn)備好的電極直接加入到含有可卡因的待檢溶液中并在室溫下孵育20 min。
注由于可卡因與A鏈可特異性結(jié)合，所以先前與A鏈結(jié)合的B鏈從雜交鏈 上脫落下來，可卡因結(jié)合的量跟B鏈脫落下來的量一一對(duì)應(yīng)，所以可以通過檢測(cè)脫落B鏈的量從而推出溶液中可卡因的量。 五、熒光定量PCR
1、 熒光定量PCR儀器參數(shù)的設(shè)置
第一個(gè)階段 一共一個(gè)循環(huán)，條件是50.0°C 2min
第二個(gè)階段 一共一個(gè)循環(huán)，條件是95.0°C 10min
第三個(gè)階段 一共四十個(gè)循環(huán)，條件是95.0°C 15s; 60.0°C lmin
2、 熒光定量PCR: (15^L體系) 取步驟四中孵育后的溶液(在實(shí)際檢測(cè)中，需要先10000G離心10min,取上清)7.65 ^L于200 pL的熒光定量PCR管中，再加入3.75 pL ABI mix、 0.3 1(T5M的上下 游引物，最后用滅菌水補(bǔ)平體系，使體系體積為15^L。
3、 將熒光定量PCR管放入熒光定量PCR儀中，按照l中的程序進(jìn)行反應(yīng)，得到PCR 圖。
4、 通過PCR得到的Ct值與B鏈濃度做Ct值-B鏈濃度的關(guān)系曲線。
5、 通過實(shí)際樣品的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷實(shí)際樣品中可卡因的量。
實(shí)例2:用Aptamer based PCR進(jìn)行血清中凝血酶的檢測(cè)(蛋白質(zhì)檢測(cè))
本實(shí)驗(yàn)所用的DNA序列 A鏈序列
5-HS-(CH2)6-ATATAGG7TGGT"G7"GG7TGG墨3
B鏈序列
5- CAG TGA AGC GGC ATC TAA AGC ACG AGT CTG AGT CC/\ /\CC /ACM-3 B鏈的引物A: 5- TGT GGT TGG ACT CAG AC TCG -3 S: 5-GTG TGA AGC GGC ATC TAA AGC-3
實(shí)驗(yàn)步驟 一金電極的處理
1首先滴一滴分離試劑在金電極上，15min后，用雙蒸水沖掉。 分離試劑&02鄰H2S04=7: 3 (體積比) 2用八1203泥漿對(duì)金電極進(jìn)行拋光。磨金電極時(shí)要用力均勻，金電極一定要垂直。 3用雙蒸水將金電極沖洗干凈，用濾紙和洗耳球吹干電極。
4用銀/氯化銀電極、鉑電極、金電極在鐵氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)液中表征，得到的CV圖上顯示 的電壓差70-85mv時(shí)，表示電極磨好。 表征時(shí)的參數(shù)
初始電壓-0.2V 高位電壓0.5v 低電壓-0.2V 掃描速度0.05
掃描段數(shù)6 靈敏度l.e-005
注電極磨好后要立即使用，否則重磨。
二將A鏈結(jié)合到金電極上
1取2pLlnM(相當(dāng)于1.2*109個(gè))的A鏈于1.5mL的EP管中，然后向EP管中加
入298 pL 1.0MKH2PO4緩沖液，使EP管中溶液體積為300 2將金電極垂直懸于EP管溶液中 3將步驟2的裝置放置在室溫下孵育8-12h 4用10mMPBS (pH=7.3)沖洗電極3次，每次200
5將金電極垂直懸于300 ^L1.0mM巰基乙酸中，室溫lh，取出后將電極浸泡于10 mM PBS(0.3M NaCl,pf^7.3)中。 三B鏈和A鏈雜交
1取2pL 10 nM的B鏈于小燒杯中，再加入498pL 10 mM PBS(0.3M NaCl pP^7.3)混勻， 總體系為500 ^L。
2將步驟二中準(zhǔn)備好的電極插入到上述溶液中，金電極既要接觸溶液，又不能碰觸燒 杯底部，并在小燒杯上蓋一塑料蓋子，蓋子要扣緊，以防電極接觸燒杯底部。 3將步驟2的裝置放入4(TC下孵育45min，且要一直搖晃。
4反應(yīng)完成后，用lOmMPBS (pH=7.3)徹底沖洗金電極，以除去未雜交上的B鏈。
四、與凝血酶結(jié)合
1、標(biāo)準(zhǔn)凝血酶溶液的配制
將0.148 mg凝血酶溶于460 pL 10 mM PBS (pH=7.0)中，即可得到濃度為1(T5M的 凝血酶母液。稀釋此母液，依次得到濃度為10—21M、 10—2QM、 10—19M、 10—18M的凝 血酶溶液(lOmMPBS， 2mMMg2+, 10mMK+ ， pH=7.0,溶液體積300pl)。
3、 將步驟三中準(zhǔn)備好的電極依次插入到上述4個(gè)不同濃度的凝血酶溶液中(從濃度低 到濃度高)。
4、 電極與每個(gè)濃度的凝血酶均在室溫下孵育20 min
注由于凝血酶與A鏈可特異性結(jié)合，所以先前與A鏈結(jié)合的B鏈從雜交鏈上脫 落下來，凝血酶結(jié)合的量跟B鏈脫落下來的量一一對(duì)應(yīng)，所以可以通過檢測(cè)脫落B 鏈的量從而推出溶液中凝血酶的量。
5、用另外一根電極和待檢的含凝血酶的溶液在室溫下孵育20 min。
五、熒光定J匱PCR
1、熒光定量:PCR儀器參數(shù)的設(shè)置
Stage1Stage2Stage3
ReplReplReps40
50.0°C95.0°C95.0°C 60.0°C
2minlOmin15s lmin
2、熒光定量:PCR: (15jiL體系)
取步驟四中孵育后的溶液7.65 pL (實(shí)際檢測(cè)的樣品，需要先10000G離心10min, 取上清)于200 pL的熒光定量PCR管中，再加入3.75 ^LABImix、 0.3 1(T5M的 上下游引物，最后用滅菌水補(bǔ)充體系，使體系體積為15^L。
3、 將熒光定量PCR管放入熒光定量PCR儀中，按照l中的程序進(jìn)行反應(yīng)。
4、 通過PCR得到的Ct值與B鏈濃度做Ct值-B鏈濃度的關(guān)系曲線。
5、 通過實(shí)際樣品的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷實(shí)際樣品中凝血酶的量。
權(quán)利要求
1.一種基于核酸適體和PCR(polymerase chain reaction)擴(kuò)增來檢測(cè)目標(biāo)分子的方法。包含目標(biāo)分子的溶液中含有目標(biāo)分子和核酸，步驟包括(a)固定能與目標(biāo)分子結(jié)合的核酸片段或者核酸適體；(b)將與步驟(a)中的核酸片段部分互補(bǔ)的另一核酸片段與步驟(a)中的核酸片段雜交；(c)將步驟(b)中形成的雜交雙鏈核酸與包含目標(biāo)分子的樣品混合；(d)步驟(a)中的核酸片段與目標(biāo)分子結(jié)合，形成核酸片段和目標(biāo)分子復(fù)合物，這種結(jié)合，造成與步驟(a)中核酸片段互補(bǔ)的核酸片段的解離；(e)如果在(b)中與步驟(a)中部分互補(bǔ)的核酸片段為RNA，則將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA(complementary DNA)；(f)用PCR或者熒光定量PCR方法擴(kuò)增步驟(d)解離的核酸片段或者步驟(e)中反轉(zhuǎn)錄的cDNA；(g)用擴(kuò)增的DNA的量或者計(jì)算出的Ct(cycle threshold)值來間接的檢測(cè)或者定量目標(biāo)分子。
全文摘要
基于核酸適體的PCR(aptamer based polymerase chain reaction，A-PCR)是一種檢測(cè)微量目標(biāo)物質(zhì)的高靈敏度技術(shù)。該技術(shù)把核酸適體和配體結(jié)合的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性有機(jī)結(jié)合起來，其本質(zhì)是一種以PCR擴(kuò)增一段DNA報(bào)告分子來放大核酸適體和配體結(jié)合率，從而檢測(cè)目標(biāo)配體的一種方法。核酸適體PCR是迄今最敏感的檢測(cè)方法之一，理論上可以檢測(cè)單個(gè)目標(biāo)分子。相比于免疫PCR，具有操作和過程簡(jiǎn)單，影響因素少，結(jié)果更加可靠的特點(diǎn)；敏感性比現(xiàn)行的ELISA法高10²～10⁸倍，可以被廣泛的應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子和小分子的微量檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101368209SQ200810160859
公開日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2008年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日
發(fā)明者孔建美, 張書圣, 超 石, 馬翠萍 申請(qǐng)人:青島科技大學(xué)