專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種葡聚糖酶及其分離純化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種纖維素酶及其分離純化的方法。
背景技術(shù)：
：目前，在棉織品(牛仔服等)水洗整理工藝中廣泛采用李氏木霉(7:^0產(chǎn)生的纖維素酶，由于這類(lèi)真菌纖維素酶制劑的適宜反應(yīng)pH條件通常是酸性的，所以在水洗前要加酸將水洗液調(diào)至特定的酸性環(huán)境，操作麻煩。同時(shí)，在酸性條件下水洗液中的染料容易玷污織物，造成"反沾色"現(xiàn)象，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的外觀(guān)與質(zhì)量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有應(yīng)用于棉織品水洗整理工藝中的纖維素酶存在應(yīng)用時(shí)需要特定的酸性環(huán)境而影響產(chǎn)品的外觀(guān)與質(zhì)量的缺陷，而提供一種葡聚糖酶及其分離純化的方法。本發(fā)明的葡聚糖酶用于降解羧甲基纖維素鈉，它既具有內(nèi)切酶的特性，也具有外切酶的特性，它的酶促反應(yīng)最適pH值為8.0，酶促反應(yīng)最適溫度為55°C，分子量為51.3kDa，Km值為2.1218mg/mL，Vm肪值為5.3706|xg/mL'min;其中Km值和Vn^值為葡聚糖酶降解羧甲基纖維素鈉反應(yīng)中的特征值。本發(fā)明葡聚糖酶的分離純化按照以下步驟進(jìn)行一、發(fā)酵粗酶液的預(yù)處理將蠟樣芽胞桿菌發(fā)酵60h后收集發(fā)酵液，以3000r/min的速度離心15min，取上清液加入(NH4)2S04至(NH4)2S04的濃度為飽和度的30%，在4。C條件下以10r/min的速度攪拌2h，靜置2h，再以5000r/min的速度離心15min，取上清液中補(bǔ)加(NH4)2S04至,)2804的濃度為飽和度的90%，然后再在4'C條件下以10r/min的速度攪拌2h，靜置2h后，以5000r/min的速度離心15min，收集蛋白沉淀，并用透析袋將收集的蛋白沉淀物進(jìn)行脫鹽，而后再進(jìn)行超濾濃縮，即得到柱層析前的酶液；二、柱層析用葡聚糖凝膠SephadexG-75進(jìn)行柱層析，洗脫液為濃度為0.02mol/L、pH值為4.8的乙酸一乙酸鈉緩沖液，洗脫液流速為12mL/h;洗脫即得到葡聚糖酶。本發(fā)明的葡聚糖酶具有以下優(yōu)點(diǎn)-1、本發(fā)明的葡聚糖酶在中性或堿性的條件下、降解羧甲基纖維素鈉的反應(yīng)中保持著較高的酶活和良好的穩(wěn)定性這一酶學(xué)特性顯示，本發(fā)明的葡聚糖酶在棉織品的生物整理工業(yè)中將會(huì)克服當(dāng)前使用真菌來(lái)源的葡聚糖酶帶來(lái)的不利，具有良好的應(yīng)用前景。2、本發(fā)明的葡聚糖酶在中性或堿性的條件下、降解羧甲基纖維素鈉的反應(yīng)中不但保持著高酶活和良好的穩(wěn)定性，而且在表面活性劑(SDS)和螯合劑(EDTA)存在時(shí)表現(xiàn)出來(lái)的顯著的穩(wěn)定性，說(shuō)明本發(fā)明的葡聚糖酶能夠作為洗滌劑產(chǎn)品的添加劑。圖1為具體實(shí)施方式二分離純化出的葡聚糖酶的電泳圖譜，其中1號(hào)條帶為標(biāo)準(zhǔn)條帶，2號(hào)和3號(hào)條帶分別為具體實(shí)施方式二分離純化出的葡聚糖酶兩個(gè)平行樣的條帶；圖2為具體實(shí)施方式二分離純化出的葡聚糖酶酶活隨溫度變化圖；圖3為溫度對(duì)具體實(shí)施方式二分離純化出的葡聚糖酶活性穩(wěn)定性的影響曲線(xiàn)；圖4為具體實(shí)施方式二分離純化出的葡聚糖酶酶活隨pH值變化圖；圖5為pH值對(duì)具體實(shí)施方式二分離純化出的葡聚糖酶活性穩(wěn)定性的影響曲線(xiàn)；圖6為具體實(shí)施方式二分離純化出的葡聚糖酶的Lineweaver-Burk作圖曲線(xiàn)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。具體實(shí)施方式一本實(shí)施方式的葡聚糖酶用于降解羧甲基纖維素鈉，它既具有內(nèi)切酶的特性，也具有外切酶的特性，它的酶促反應(yīng)最適pH值為8.0，酶促反應(yīng)最適溫度為55°C，分子量為51.3kDa，Km值為2.12mg/mL，V臓值為5.37pg/mL'min;其中尺m值和Kmax值為葡聚糖酶降解羧甲基纖維素鈉反應(yīng)中的特征值。具體實(shí)施方式二:本實(shí)施方式葡聚糖酶的分離純化按照以下步驟進(jìn)行:一、發(fā)酵粗酶液的預(yù)處理將蠟樣芽胞桿菌發(fā)酵60h后收集發(fā)酵液，以3000r/min的速度離心15min，取上清液加入(NH4)2S04至,)2804的濃度為飽和度的30%，在4。C條件下以10r/min的速度攪拌2h，靜置2h，再以5000r/min的速度離心15min，取上清液中補(bǔ)加(NH4)2S04至(NH4)2S04的濃度為飽和度的90%,然后再在4。C條件下以10r/min的速度攪拌2h，靜置2h后，以5000r/min的速度離心15min，收集蛋白沉淀，并用透析袋將收集的蛋白沉淀物進(jìn)行脫鹽，而后再進(jìn)行超濾濃縮，即得到柱層析前的酶液；二、柱層析用葡聚糖凝膠SephadexG-75進(jìn)行柱層析，洗脫液為濃度為0.02mol/L、pH值為4.8的乙酸一乙酸鈉緩沖液，洗脫液流速為12mL/h;洗脫即得到葡聚糖酶。本實(shí)施方式中的飽和度為質(zhì)量飽和度，步驟二中的葡聚糖凝膠S印hadexG-75的分子量為380kDa。將本實(shí)施方式分離純化出的葡聚糖酶經(jīng)過(guò)如下實(shí)驗(yàn)，以確定它的性質(zhì)1、將本實(shí)施方式分離純化出的葡聚糖酶通過(guò)SDS-PAGE，如果出現(xiàn)的是單一條帶，則說(shuō)明酶蛋白己經(jīng)達(dá)到電泳純，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE測(cè)定葡聚糖酶的分子量，電泳圖譜如圖l所示，計(jì)算得出葡聚糖酶的分子量為51.3kDa。2、分別以35。C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C和8(TC為反應(yīng)溫度，于pH4.8測(cè)定本實(shí)施方式分離純化出的葡聚糖酶的酶活，以酶活最高者為100%計(jì)，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，本實(shí)施方式分離純化出的酶組分的活性隨著溫度的升高而逐漸提高，在溫度達(dá)到55。C時(shí)酶活最高，而高于此溫度后，隨著溫度的升高，酶活急劇下降，在達(dá)到75匸時(shí)酶活趨近于零。因此，該酶組分的酶促反應(yīng)的最適溫度分別為55t:。3、在pH值為4.8的條件下，將本實(shí)施方式分離純化出的葡聚糖酶的酶液分別于35。C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75。C和80。C下保溫30min后，恢復(fù)至室溫，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，測(cè)定殘存酶活力，以標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下未經(jīng)保溫的酶活力為100%，測(cè)得結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，在35。C一55'C的溫度范圍內(nèi)，本實(shí)施方式分離純化出的葡聚糖酶保持著相對(duì)穩(wěn)定的酶活性；當(dāng)溫度高于55'C，酶的穩(wěn)定性迅速下降，當(dāng)保溫溫度達(dá)到80。C時(shí)，酶的活性?xún)H為原酶活性的11.03%。因此，在55。C以下，CMCase具有良好的熱穩(wěn)定性。4、在溫度5(TC條件下，將本實(shí)施方式分離純化出的葡聚糖酶的酶液分別與pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0或12.0的緩沖液配制的底物混合后，反應(yīng)30min，然后分別測(cè)定在這些pH條件下本實(shí)施方式分離純化出的葡聚糖酶的酶活，以酶活最高者為100%計(jì)，結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，pH為3.08.0時(shí)酶的活性隨pH值的增加而逐漸升高，且在pH值在6.0-8.0的范圍內(nèi)提升的幅度較大'，當(dāng)pH值大于8.0時(shí)，酶的活性隨pH值的增加而逐漸下降；在pH值為12.0時(shí)，酶的活性降至最低點(diǎn)；在pH7.0~9.0,CMCase保持著最高活性；因此，此CMCase酶促反應(yīng)的最適pH為8.0。5、將本實(shí)施方式分離純化出的葡聚糖酶的酶液分別在pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0或12.0的緩沖液中，在溫度為30。C的條件下保溫30min，測(cè)定殘存CMCase活力，以標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下CMCase酶液的活力為100y。，得出相對(duì)酶活，測(cè)得結(jié)果如圖5所示。從圖5中可以看出，pH值為3.08.0時(shí)，酶活性逐漸升高，尤其在pH值為3.05.0酶活性提升較迅速，pH5.08.0范圍內(nèi)酶活較平穩(wěn)，且保持較高的酶活性；pH值為8.012.0時(shí)，酶活性逐漸下降，但在pH值為9.0時(shí)仍保持較高的酶活性，約為標(biāo)準(zhǔn)條件下的83%，pH值為9.012.0范圍內(nèi)酶活急劇下降。由此可見(jiàn)，本實(shí)施方式分離純化出的葡聚糖酶具有較寬的pH值穩(wěn)定范圍，在pH值5.09.0范圍內(nèi)酶液仍殘存有較高的酶活性，特別是在pH值7.09.0的中、堿性范圍內(nèi)保持著較好的穩(wěn)定性。6、向本實(shí)施方式分離純化出的葡聚糖酶的酶液分別添加一些離子和化合物后測(cè)得酶活力，以標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下酶液的酶活力為100%，得出相對(duì)酶活，測(cè)試結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，Mn2+、F^+和EDTA對(duì)本實(shí)施方式分離純化出的葡聚糖酶在酶促反應(yīng)中有一定的激活作用，尤其是Mi產(chǎn)的激活作用最為顯著，使得本實(shí)施方式分離純化出的葡聚糖酶的相對(duì)酶活高達(dá)113.40%;Ba2+、Cu2+、Mg2，nC2042-對(duì)本實(shí)施方式分離純化出的葡聚糖酶在酶促反應(yīng)中均有不同程度的抑制作用，其中以B^+和(32042-的抑制作用最為顯著，導(dǎo)致CMCase相對(duì)酶活分別僅為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的60.97%和62.98%;各種離子和化合物對(duì)CMCase的激活作用Mn2+〉Fe2+>EDTA>Zn2+;對(duì)CMCase的抑制作用Ba2+>C2042->Cu2+>Mg2+>SDS;脲、Ca2+、Co2+、K+和Na+對(duì)CMCase的作用效果不明顯。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>Zn2+100.67脲97.82SDS94.97EDTA101.84Mn2+113.40Ba2+60.97c2o42-62.98Mg2+8.91Ca2+97.82Cu2+70.85Co2+99.16K+98.49Na+97.827、底物專(zhuān)一性的測(cè)定測(cè)定本實(shí)施方式分離純化出的葡聚糖酶對(duì)不同底物的酶活，結(jié)果如表2所示。表2的數(shù)據(jù)說(shuō)明，本實(shí)施方式分離純化出的葡聚糖酶對(duì)底物羧甲基纖維素鈉的酶活性較強(qiáng)，同時(shí)對(duì)Whatman濾紙和木聚糖也顯示出微弱的酶活性，這表明本實(shí)施方式分離純化出的葡聚糖酶在對(duì)CMC表現(xiàn)出較強(qiáng)的酶活力的同時(shí)，還含有微弱的降解結(jié)晶纖維素和半纖維素的活性。表2底物酶活性(U/mL)Whatman濾紙0.133微晶纖維素0棉花0木聚糖0.054甘露聚糖0羧甲基纖維素鈉(CMC-Na2)4.382對(duì)硝基苯纖維二糖苷(pNPC)0對(duì)硝基苯-卩-D-吡喃半乳糖苷(pNPG)0注表中數(shù)據(jù)為三次平行的平均值8、動(dòng)力學(xué)常數(shù)^n和Fn^的測(cè)定在與不同濃度CMC-Na作用下，測(cè)得本實(shí)施方式分離純化出的葡聚糖酶的酶活力，結(jié)果如表3所示。根據(jù)米氏方程^~^1_用雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk法)，取米氏方程的倒數(shù)式丄=^1丄+丄以l/v對(duì)l/問(wèn)作圖，如圖6所示，圖6中的線(xiàn)性方程為y-0.395x+0.1862。直線(xiàn)在少軸上的截距即為+，將直線(xiàn)反向延長(zhǎng)，交于x軸負(fù)軸，其橫軸截距為-+，由此求出《m=2.12mg/mL，^^5.37pg/ml/min。該菌的尺J直明顯高于以前所報(bào)道的其它芽胞桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶(0.59~1.6mg/mL)。表3(mg/mL)1/問(wèn)(mL/mg)v(ixg/mL'min)l/v(mL.min/|xg)20.5002.6600.37640.2503.6卯0.27150.2003.7700.26580.1254.2610.235100.1004.4350.225注表中數(shù)據(jù)為三次平行的平均值權(quán)利要求1、一種葡聚糖酶，其特征在于葡聚糖酶用于降解羧甲基纖維素鈉，它既具有內(nèi)切酶的特性，也具有外切酶的特性，它的酶促反應(yīng)最適pH值為8.0，酶促反應(yīng)最適溫度為55℃，分子量為51.3kDa，Km值為2.12mg/mL，Vmax值為5.37μg/mL·min；其中Km值和Vmax值為葡聚糖酶降解羧甲基纖維素鈉反應(yīng)中的特征值。2、如權(quán)利要求1所述的一種葡聚糖酶的分離純化方法，其特征在于葡聚糖酶的分離純化按照以下步驟進(jìn)行一、發(fā)酵粗酶液的預(yù)處理將蠟樣芽胞桿菌發(fā)酵60h后收集發(fā)酵液，以3000r/min的速度離心15min，取上清液加入(NH4)2S04至(NH4)2S04的濃度為飽和度的30。/。，在4匸條件下以10r/min的速度攪拌2h，靜置2h，再以5000r/min的速度離心15min，取上清液中補(bǔ)加(NH4)2S04至(NH4)2S04的濃度為飽和度的90%，然后再在4。C條件下以10r/min的速度攪拌2h，靜置2h后，以5000r/min的速度離心15min，收集蛋白沉淀，并用透析袋將收集的蛋白沉淀物進(jìn)行脫鹽，而后再進(jìn)行超濾濃縮，即得到柱層析前的酶液；二、柱層析用葡聚糖凝膠SephadexG-75進(jìn)行柱層析，洗脫液為濃度為0.02mol/L、pH值為4.8的乙酸一乙酸鈉緩沖液，洗脫液流速為12mL/h;洗脫即得到葡聚糖酶。全文摘要一種葡聚糖酶及其分離純化的方法，它涉及了一種纖維素酶及其分離純化的方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有應(yīng)用于棉織品水洗整理工藝中的纖維素酶存在應(yīng)用時(shí)需要特定的酸性環(huán)境而影響產(chǎn)品的外觀(guān)與質(zhì)量的缺陷。本發(fā)明的葡聚糖酶用于降解羧甲基纖維素鈉，它既具有內(nèi)切酶的特性，也具有外切酶的特性，它的酶促反應(yīng)最適pH值為8.0，酶促反應(yīng)最適溫度為55℃。本發(fā)明葡聚糖酶的分離純化按照以下步驟進(jìn)行一、發(fā)酵粗酶液的預(yù)處理；二、柱層析；洗脫即得到葡聚糖酶。本發(fā)明的葡聚糖酶在中性或堿性的條件下保持著較高的酶活和良好的穩(wěn)定性。文檔編號(hào)C12N9/44GK101381714SQ20081013742公開(kāi)日2009年3月11日申請(qǐng)日期2008年10月30日優(yōu)先權(quán)日2008年10月30日發(fā)明者謙楊,紅燕申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)