專利名稱：：一種豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropne咖oniae，APP)引起的豬的一種致死性呼吸道傳染病，以急性出血性纖維素性胸膜肺炎和慢性局灶性壞死性肺炎為特征，急性病例大多死亡，亞急性和慢性病例常能耐過，但會導(dǎo)致生長遲滯，是目前世界上嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的五大疫病之一。近20年來，豬傳染性胸膜肺炎曾在歐洲、亞洲、美洲等許多區(qū)域暴發(fā)，我國臺灣省及國內(nèi)許多省份均有發(fā)病報(bào)道，且呈逐年增長的趨勢。由于急性耐過豬?；悸苑闻K病變(包囊形成，膿腫及胸膜粘連)成為帶菌豬；慢性豬的飼料轉(zhuǎn)化率降低，藥物費(fèi)用增加，斷奶仔豬生長率及市場價(jià)值降低，所以豬傳染性胸膜肺炎帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬胸膜肺炎放線桿菌分為生物I型和生物II型，其中生物I型包括1至12血清型，在我國血清l、2、3、4、5、7、8、9、10型均有分布。另外，在臨床上豬胸膜肺炎放線桿菌也常常會與豬瘟、藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒、巴氏桿菌、支原體或偽狂犬等混合感染。因此，豬胸膜肺炎放線桿菌的凈化及防治需要(感、特異的檢測病原的診斷技術(shù)。豬胸膜肺炎放線桿菌的現(xiàn)有檢測方法很多，大致可以分為三大類，即病原學(xué)診斷方法、血清學(xué)診斷方法和分子生物學(xué)診斷法。病原學(xué)診斷方法需要細(xì)菌分離、培養(yǎng)和鑒定，周期較長；血清學(xué)診斷方法包括補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、熒光抗體、間接血液凝集試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等，血清學(xué)診斷方法的缺點(diǎn)是只能檢測動(dòng)物體內(nèi)胸膜肺炎放線桿菌的抗體而無法檢測病原；分子生物學(xué)診斷方法主要包括反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)與熒光核酸探針，分子生物學(xué)方法比前兩種方法快速，靈敏，但需要使用特殊的儀器，如PCR儀，而熒光探針的制備比較昂貴，不適于基層應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技術(shù)的快速檢測豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)的試劑盒。本發(fā)明提供的豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒，包括針對豬胸膜肺炎放線桿菌GenBankAccessionNumberAF021919序列中自5，端第5550位至6549位的核苷酸序列的三對引物，一對引物是與所述序列結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對，一對引物是與所述序列結(jié)合的外側(cè)引物對，一對引物是與所述序列結(jié)合的環(huán)形引物對。該豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒在使用過程中，所述的內(nèi)側(cè)引物對、外側(cè)引物對和環(huán)形引物對作為一個(gè)整體組使用，使用時(shí)應(yīng)該盡量避免引物二聚體的形成。所述內(nèi)側(cè)引物對包括上游引物(FIP)和下游引物(BIP)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5;所述外側(cè)引物對包括上游引物(F3)和下游引物(B3)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3;所述環(huán)形引物對包括上游引物(LF)和下游引物(LB)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。所述試劑盒還包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑、陽性對照、陰性對照；所述陽性對照為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌DNA。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑具體可為含有如下溶質(zhì)的水溶液Tris-HC1、KC1、(NH4)2S04、Tween20、MgS04、甜菜堿、脫氧核苷酸和BstDNA聚合酶。在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中加入所述內(nèi)側(cè)引物對、所述外側(cè)引物對及所述環(huán)形引物對，形成環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液；每23uL所述環(huán)/K導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中，所述溶質(zhì)的物質(zhì)的量如下Tris-HC10.5umol、KC10.25umol、(NH4)2S040.25umol、Tween200.025uL、MgS040.2-20umol、甜菜堿20umol、4種脫氧核苷酸各0.035umol、BstDNA聚合酶16U，所述內(nèi)側(cè)引物對的上游引物和下游引物各0.04-0.06umol，所述外側(cè)引物對的上游引物和下游引物各0.004-0.008nmol，所述環(huán)形引物對的上游引物和下游引物各0,02-0.04ixmol。每23uL所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中，所述溶質(zhì)的物質(zhì)的量優(yōu)選如下Tris-HCl0.5umo1、KC10.25nmol、(NH4)2S040.25umol、Tween200.025uL、MgS040.2umol、甜菜堿20iimol、4種脫氧核苷酸各0.035umol、BstDNA聚合酶16U，所述內(nèi)側(cè)引物對的上游引物和下游引物各0.04ymo1，所述外側(cè)引物對的上游引物和下游引物各0.004umo1，所述環(huán)形引物對的上游引物和下游引物各0.02umol。所述試劑盒還包括熒光顯色劑，任何常規(guī)熒光顯示劑均可，如熒光染料SYBRGREENI。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液與所述熒光顯色劑的體積比為23:(1-3)，優(yōu)選23:1。本發(fā)明還提供了一種檢測死亡動(dòng)物中是否攜帶豬胸膜肺炎放線桿菌的方法，是用所述的豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒對來自死亡動(dòng)物的樣品的總DNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，確定死亡動(dòng)物中是否攜帶豬胸膜肺炎放線桿菌；所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的條件為60-65°C、20-90分鐘。所述檢測死亡動(dòng)物中是否攜帶豬胸膜肺炎放線桿菌的方法中還包括將進(jìn)行完所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的樣本80-9(TC反應(yīng)2-10分鐘的步驟。應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒檢測豬胸膜肺炎放線桿菌，可以通過直接檢視判斷樣本是否含有豬胸膜肺炎放線桿菌，也可以通過顯色檢測判斷樣本是否含有豬胸膜肺炎放線桿菌。直接檢視時(shí)，LAMP反應(yīng)液陽性對照陰性對照的體積配比為23:2:2。顯色檢測時(shí)，LAMP反應(yīng)液陽性對照陰性對照熒光顯色劑的體積配比為23:2:2(1-3);LAMP反應(yīng)液陽性對照陰性對照熒光顯色劑的體積配比優(yōu)選為23:2:2:1?？梢酝ㄟ^直接檢視判斷樣本是否含有豬胸膜肺炎放線桿菌，也可以通過顯色檢測判斷樣本是否含有豬胸膜肺炎放線桿菌。①直接檢視裝有陽性對照的反應(yīng)管有白色沉淀，裝有陰性對照的反應(yīng)管仍為澄清液體。如果裝有待檢測樣品的反應(yīng)管仍為澄清液體，則說明待檢樣品中豬胸膜肺炎放線桿菌檢測結(jié)果為陰性。如果裝有待檢測樣品的反應(yīng)管有白色沉淀，則說明樣品中豬胸膜肺炎放線桿菌檢測結(jié)果為陽性。②顯色檢測在反應(yīng)管中加入熒光顯色劑，在紫外燈照射下觀察顏色變化。裝有陽性對照的反應(yīng)管顏色為綠色，裝有陰性對照的反應(yīng)管仍為黃色。如果裝有待檢樣品的反應(yīng)管顏色為黃色，則說明豬胸膜肺炎放線桿菌檢測結(jié)果為陰性。如果裝有待檢樣品的反應(yīng)管顏色為綠色，則說明樣品中豬胸膜肺炎放線桿菌檢測結(jié)果為陽性。本發(fā)明提供的豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒的檢測原理如下根據(jù)豬胸膜肺炎放線桿菌GenBankAccessionNumberAF021919的lOOObp的保守區(qū)(GenBankAccessionNumberAF021919序列中自5，端第5550位至6549位的核苷酸序列，見序列表的序列l(wèi))設(shè)計(jì)了一組用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物，即內(nèi)側(cè)引物對(內(nèi)側(cè)上游引物FIP和內(nèi)側(cè)下游引物BIP)、外側(cè)引物對(外側(cè)上游引物F3和外側(cè)下游引物B3)和環(huán)形引物對(環(huán)形上游引物L(fēng)F和環(huán)形下游引物L(fēng)B)。三對引物和豬胸膜肺炎放線桿菌AF021919序列中的保守區(qū)的八個(gè)特定區(qū)域的序列完全配對，確保反應(yīng)的徹底進(jìn)行，也保證了豬胸膜肺炎放線桿菌檢測方法的特異性。F3:GACACCTTAAAATTTACTGATGTG(序列表的序列2);B3:CGTTGATATTATCATCACCGTC(序列表的序列3);FIP:GACCGAATCCGTATCATGATAACCGTTTTCGGAAGTGAAATTCCGACG(序列表的序列4);BIP:GGMTTTGCTGACCGCAGTTTTTGCCAAATAATGCCATACCTTG(序列表的序列5);LF:GAGTAGATAATGACTTAATGTTATTCGG(序列表的序列6);LB:TATAACTCGTGATGAACTAGGTAAA(序列表的序列7)。所述的引物組與所述的豬胸膜肺炎放線桿菌AF021919序列中的保守區(qū)的8個(gè)特定區(qū)域結(jié)合，見表l。表1引物組與AF021919序列中的保守區(qū)的結(jié)合區(qū)域<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>上述引物組在具有高度鏈置換催化活性的DNA聚合酶的作用下可完成對模板DNA的擴(kuò)增。擴(kuò)增過程分為兩個(gè)階段，具體如下(1)循環(huán)起始階段一端內(nèi)側(cè)引物先與模板結(jié)合并啟動(dòng)DNA合成。相同一端的外側(cè)引物隨后與模板結(jié)合啟動(dòng)DNA合成，并發(fā)生鏈置換釋放出含有內(nèi)側(cè)引物序列的DNA單鏈。該單鏈DNA作為模板先后與另一端的內(nèi)側(cè)引物和外側(cè)引物結(jié)合，啟動(dòng)DNA合成并發(fā)生鏈置換，最后形成一個(gè)初始的莖環(huán)DNA。(2)反應(yīng)循環(huán)階段內(nèi)側(cè)引物與初始莖環(huán)DNA結(jié)合，啟動(dòng)鏈置換DNA合成，可產(chǎn)生另一個(gè)初始莖環(huán)DNA和一個(gè)新的兩倍長度的莖環(huán)DNA。這些莖環(huán)DNA可作為模板繼續(xù)與內(nèi)側(cè)引物結(jié)合啟動(dòng)鏈置換DNA合成，并且每次合成均可使莖環(huán)DNA的莖長度成倍增長。進(jìn)入循環(huán)階段后，會產(chǎn)生許多分子大小不同的莖環(huán)DNA，這些莖環(huán)DNA還可作為模版與環(huán)形引物結(jié)合，啟動(dòng)更多的DNA合成并發(fā)生鏈置換。最后經(jīng)過一個(gè)小時(shí)的等溫?cái)U(kuò)增，目的DNA可累積1(T拷貝。應(yīng)用本發(fā)明提供的豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒進(jìn)行檢測，特異性高且靈敏度高，可檢測出6-IO個(gè)拷貝的目的DNA。與PCR檢測方法相比，應(yīng)用本發(fā)明提供的豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒檢測，不需要昂貴的PCR儀，只需普通的金屬或水浴鍋即可，并且檢測結(jié)果使用熒光染料來觀察即可，操作簡單方便。本發(fā)明的試劑盒可應(yīng)用于基層現(xiàn)場進(jìn)行的臨床醫(yī)學(xué)檢測及食品中可能污染的豬胸膜肺炎放線桿菌的檢測，特別適于基層臨床醫(yī)學(xué)檢測工作及現(xiàn)場即時(shí)檢測。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。具體實(shí)施例方式應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒檢測豬胸膜肺炎放線桿菌可包括如下步驟(1)DNA的提取本發(fā)明提供的試劑盒可用于檢測鼻腔、支氣管分泌物、肺部病變、扁桃體和胸水中的豬胸膜肺炎放線桿菌。不同來源的總DNA提取可參考相應(yīng)資料，或使用相應(yīng)DNA提取試劑盒，也可用FTA卡提取。(2)環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增①在裝有23y1的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2u1模板RNA;②于水浴鍋或金屬恒溫加熱器上60-65'C放置20-90分鐘，取出。在步驟②完成后，取出前，還可以再調(diào)水浴鍋溫度到80-9(TC反應(yīng)2-10分鐘，目的是能夠終止反應(yīng)，以便長期保存反應(yīng)結(jié)果。(3)結(jié)果判定可以通過直接檢視判斷樣本是否含有豬胸膜肺炎放線桿菌，也可以通過顯色檢測判斷樣本是否含有豬胸膜肺炎放線桿菌。①直接檢視裝有陽性對照的反應(yīng)管有白色沉淀，裝有陰性對照的反應(yīng)管仍為澄清液體。如果裝有待檢測樣品的反應(yīng)管仍為澄清液體，則說明待檢樣品中豬胸膜肺炎放線桿菌檢測結(jié)果為陰性。如果裝有待檢測樣品的反應(yīng)管有白色沉淀，則說明待檢樣品中豬胸膜肺炎放線桿菌檢測結(jié)果為陽性。②顯色檢測在反應(yīng)管中加入熒光顯色劑，在紫外燈照射下觀察顏色變化。裝有陽性對照的反應(yīng)管顏色為綠色，裝有陰性對照的反應(yīng)管仍為黃色。如果裝有待檢樣品的反應(yīng)管顏色為黃色，則說明豬胸膜肺炎放線桿菌檢測結(jié)果為陰性。如果裝有待檢樣品的反應(yīng)管顏色為綠色，則說明樣品中豬胸膜肺炎放線桿菌檢測結(jié)果為陽性。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例l、豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒的制備一、引物的合成人工合成以下3對引物F3:5'-GACACCTTAAAATTTACTGATGTG-3';B3:5'-CGTTGATATTATCATCACCGTC-3';FIP:5'-GACCGAATCCGTATCATGATAACCGTTTTCGGAAGTGAAATTCCGACG-3';BIP:5'-GGAATTTGCTGACCGCAGTTTTTGCCAAATAATGCCATACCTTG-3';LF:5'-GAGTAGATAATGACTTAATGTTATTCGG-3';LB:-TATAACTCGTGATGAACTAGGTAAA-3;。二、配制LAMP反應(yīng)液每23uLLAMP反應(yīng)液，含有以下組分0.5umo1Tris-HCl、0.25umolKC1、0.25umol(NH4)2S04、Tween200.025uL、0.2umolMgS04、20umol甜菜堿(Betaine)、四種脫氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.04ymol上游內(nèi)側(cè)引物(FIP)、0.04uraol下游內(nèi)側(cè)引物(BIP)、0.004umol上游外側(cè)引物(F3)、0.004nmol下游外側(cè)引物(B3)、0.02umol上游環(huán)形引物(LF)、0.02umol下游環(huán)形引物(LB)、16U的BstDNA聚合酶、滅菌雙蒸水。三、試劑盒的組裝該試劑盒由以下物質(zhì)組成步驟二配制的LAMP反應(yīng)液、豬胸膜肺炎放線桿菌血清I型菌株DNA(陽性對照)(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種庫)、滅菌雙蒸水(陰性對照)、熒光染料SYBRGREENI。實(shí)施例2、豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒的制備一、引物的合成同實(shí)施例1的步驟一。二、配制LAMP反應(yīng)液每23uLLAMP反應(yīng)液，含有以下組分0.5umo1Tris-HC1、0.25umolKC1、0.25umol(NH4)2S04、Tween200.025uL、20umolMgS04、20umol甜菜堿(Betaine)、四種脫氧核苷酸(dNTPs)各0.035,1、0.06umol上游內(nèi)側(cè)引物(FIP)、0.06iimol下游內(nèi)側(cè)引物(BIP)、0.008umol上游外側(cè)引物(F3)、0.008umol下游外側(cè)引物(B3)、0.04umol上游環(huán)形引物(LF)、0.04umol下游環(huán)形引物(LB)、16U的BstDNA聚合酶、滅菌雙蒸水。三、試劑盒的組裝同實(shí)施例1的步驟三。實(shí)施例3、豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒的制備一、引物的合成同實(shí)施例l的步驟一。二、配制LAMP反應(yīng)液每23uLL細(xì)P反應(yīng)液，含有以下組分0.5umolTris-HC1、0.25umolKC1、0.25umol(NH4)2S04、Tween200.025uL、10ymolMgS04、20umol甜菜堿(Betaine)、四種脫氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.05umol上游內(nèi)側(cè)引物(FIP)、0.05"mol下游內(nèi)側(cè)引物(BIP)、0.006umol上游外側(cè)引物(F3)、0.006umol下游外側(cè)引物(B3)、0.03umol上游環(huán)形引物(LF)、0.03umol下游環(huán)形引物(LB)、16U的BstDNA聚合酶、滅菌雙蒸水。三、試劑盒的組裝同實(shí)施例1的步驟三。實(shí)施例4、豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒的應(yīng)用取兩頭豬，1只確診為血清1型豬胸膜肺炎放線桿菌感染的豬，l只健康豬。分別對兩只豬采鼻拭子，采用實(shí)施例1制備的試劑盒對樣本進(jìn)行檢測。一、提取總DNA將采鼻拭子其放入1.5ml離心管中，加lml生理鹽水，渦旋30s,取出鼻拭子，將余下液體12000rpm/min離心30s;棄上清液，沉淀添加的GTE溶液(500mraol/L葡萄糖、10mmol/LEDTA、25mol/LTris-HCl，pH8.0)，振蕩混勻；再加650W的GTE溶液，混勻；向懸浮液中加入7.5W100mg/ml的溶菌酶，混勻，37'C水浴30min;再向懸浮液中加入7.5W10mg/ml的蛋白酶K，混勻，于55""C溫浴1小時(shí)；結(jié)束后向溶液中加入等體積的氯仿，上下顛倒充分混勻；12000rpm/min離心10分鐘；將上清移至新的離心管中，再用等體積的氯仿/異戊醇抽提一次；取上清，加入l/10體積的3mol/L醋酸鈉，混勻，加入兩倍體積的無水乙醇，混勻，室溫靜置2min沉淀出DNA;12000rpra/min離心10分鐘；小心棄去上清液，用lml70%酒精洗漆沉淀，4°C、12000rpm離心5min，棄去上清，55。C烘干；加入TE溶解，37"C水浴30min;所制備DNA應(yīng)立即進(jìn)行檢測或貯存于-8(TC備檢。二、豬胸膜肺炎放線桿菌的檢測分別對上述2只豬的DNA樣本的進(jìn)行檢測，檢測步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到病豬的DNA樣本，做為檢測組l;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到健康豬的DNA樣本，做為檢測組2;在3支裝有23iiL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2"L豬胸膜肺炎放線桿菌DNA，做為陽性對照組；在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL滅菌雙蒸水，做為陰性對照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上6(TC放置90分鐘，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀。(3)顯色檢測在每個(gè)反應(yīng)管中加入1uL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色。實(shí)施例5、豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒的應(yīng)用取兩頭豬，1只確診為血清1型豬胸膜肺炎放線桿菌感染的豬，l只健康豬。分別對兩只豬采血，采用實(shí)施例2制備的試劑盒對樣本進(jìn)行檢測。一、提取總DNA同實(shí)施例4的步驟一。二、豬胸膜肺炎放線桿菌的檢測分別對上述2只豬的DNA樣本的進(jìn)行檢測，每個(gè)樣本的檢測步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2wL步驟一得到病豬的DNA樣本，做為檢測組l;在3支裝有23nL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到健康豬的DNA樣本，做為檢測組2;在3支裝有23"L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL豬胸膜肺炎放線桿菌DNA，做為陽性對照組；在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL滅菌雙蒸水，做為陰性對照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在金屬浴鍋上65"C放置70分鐘，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀。(3)顯色檢測在每個(gè)反應(yīng)管中加入2uL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色。實(shí)施例6、豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒的應(yīng)用取兩頭豬，1只確診為血清1型豬胸膜肺炎放線桿菌感染的豬，l只健康豬。分別對兩只豬采鼻拭子，采用實(shí)施例3制備的試劑盒對樣本進(jìn)行檢測。一、提取DNA同實(shí)施例4的步驟一。二、豬胸膜肺炎放線桿菌的檢測分別對上述2只豬的DNA樣本的進(jìn)行檢測，每個(gè)樣本的檢測步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23ixL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到病豬的DNA樣本，做為檢測組l;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到健康豬的DNA樣本，做為檢測組2;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL豬胸膜肺炎放線桿菌DNA，做為陽性對照組；在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2yL滅菌雙蒸水，做為陰性對照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上6(TC放置50分鐘，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀。(3)顯色檢測在每個(gè)反應(yīng)管中加入3yL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色。實(shí)施例7、豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒的應(yīng)用取兩頭豬，1只確診為血清1型豬胸膜肺炎放線桿菌感染的死豬，l只健康豬。分別對兩只豬釆鼻拭子，采用實(shí)施例l制備的試劑盒對樣本進(jìn)行檢測。一、提取總DNA同實(shí)施例4的步驟一。二、豬胸膜肺炎放線桿菌的檢測分別對上述2只豬的DNA樣本的進(jìn)行檢測，檢測步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到病豬的DNA樣本，做為檢測組l;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2pL步驟一得到健康豬的DNA樣本，做為檢測組2;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2PL豬胸膜肺炎放線桿菌DNA,做為陽性對照組；在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL滅菌雙蒸水，做為陰性對照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上65"C放置30分鐘，調(diào)水浴鍋溫度到8(TC反應(yīng)10min，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀。(3)顯色檢測在每個(gè)反應(yīng)管中加入3uL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色。實(shí)施例8、豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒的應(yīng)用取兩頭豬，1只確診為血清1型豬胸膜肺炎放線桿菌感染的死豬，l只健康豬。分別對兩只豬采鼻拭子，采用實(shí)施例l制備的試劑盒對樣本進(jìn)行檢測。一、提取DNA同實(shí)例4的步驟一。二、豬胸膜肺炎放線桿菌的檢測分別對上述2只豬的DNA樣本的進(jìn)行檢測，檢測步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23uL的L細(xì)P反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2ixL步驟一得到病豬的DNA樣本，做為檢測組l;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2"L步驟一得到健康豬的DNA樣本，做為檢測組2;在3支裝有23iiL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL豬胸膜肺炎放線桿菌DNA，做為陽性對照組；在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL滅菌雙蒸水，做為陰性對照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上6(TC放置20分鐘，調(diào)水浴鍋溫度到9(TC反應(yīng)2min，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀。(3)顯色檢測在每個(gè)反應(yīng)管中加入3yL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。健康豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色，病豬檢測組的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色。實(shí)施例9、豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒靈敏度的檢測制備O.5Xl()4拷貝/uL、0.5Xl()3拷貝/uL、0.5X102拷貝/uL、5拷貝/uL和0.5拷貝/"L的含序列1所示DNA片段的質(zhì)粒樣本。采用實(shí)施例3制備的試劑盒對質(zhì)粒樣本進(jìn)行檢測。一、質(zhì)粒的制備使用豬胸膜肺炎放線桿菌血清1型菌株DNA，根據(jù)PCR方法擴(kuò)增得到血清1型菌株AF021919序列中自5，端第5550位至6549位的核苷酸序列。再與T載體連接后即形成含有AF021919序列中自5'端第5550位至6549位的核苷酸序列的質(zhì)粒，一個(gè)質(zhì)粒分子對應(yīng)一個(gè)拷貝的AF021919序列中自5'端第5550位至6549位的核苷酸序列。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，在合適的條件下培養(yǎng)感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)?？呻S著感受態(tài)細(xì)胞的繁殖而復(fù)制。最后從感受態(tài)細(xì)胞中提取純AF021919序列中3'端1000bp基因質(zhì)粒。得到的質(zhì)?？赏ㄟ^分光光度計(jì)法測定并計(jì)算拷貝數(shù)濃度。用雙蒸水將質(zhì)粒稀釋到所需要的濃度，即0.5X104拷貝/yL、0.5X103拷貝/iiL、0.5乂102拷貝/WL、5拷貝/wL禾n0.5拷貝/ixL。檢測時(shí)加入各濃度質(zhì)粒2uL，每個(gè)反應(yīng)中對應(yīng)含有l(wèi)(^拷貝/uL、103拷貝/1^、1(^拷貝/uL、10拷貝/iiL、l拷貝/uL的質(zhì)粒樣本。(可參考《分子克隆試驗(yàn)指南》第三版，所需要的試劑和儀器均為市面可購買的。)二、豬胸膜肺炎放線桿菌的檢測分別對上述各濃度的質(zhì)粒樣本進(jìn)行檢測，檢測步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到0.5X104拷貝/pL的質(zhì)粒樣本，做為檢測組l;在3支裝有23wL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到0.5X103拷貝/uL質(zhì)粒樣本，做為檢測組2;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到0.5X102拷貝/uL質(zhì)粒樣本，做為檢測組3;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到5拷貝/ML質(zhì)粒樣本，做為檢測組4;在3支裝有23nL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2yL步驟一得到0.5拷貝/uL質(zhì)粒樣本，做為檢測組5;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2nL豬胸膜肺炎放線桿菌DNA，做為陽性對照組；在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL滅菌雙蒸水，做為陰性對照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上65。C放置50分鐘，調(diào)水浴鍋溫度到8(TC反應(yīng)10rain，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。檢測組l的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測組2的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測組3的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測組4的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測組5的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。(3)顯色檢測在每個(gè)反應(yīng)管中加入3uL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。檢測組1的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測組2的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測組3的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測組4的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測組5的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色。以上結(jié)果表明，本發(fā)明的試劑盒靈敏度高，可檢測出6-IO個(gè)拷貝的目的DNA。實(shí)施例10、豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒血清1至10型的檢測提取血清1型至血清10型豬胸膜肺炎放線桿菌的總DNA(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種庫)，采用實(shí)施例3制備的試劑盒分別對上述DNA進(jìn)行檢測。各血清型在中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的菌株編號如見表2。表2血清1型至血清10型豬胸膜肺炎放線桿菌的編號<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>一、各血清型總DNA的提取分別提取10種血清型的豬胸膜肺炎放線桿菌的總DNA，方法相同，具體如下將lml菌液其放入1.5ml離心管中，12000rpm/min離心30s;棄上清液，沉淀添加的GTE溶液(500mmol/L葡萄糖、10腿ol/LEDTA、25mol/LTris-HC1,pH8.0)，振蕩混勻；再加650W的GTE溶液，混勻；向懸浮液中加入7.100mg/ml的溶菌酶，混勻，37。C水浴30min;再向懸浮液中加入7.10mg/ml的蛋白酶K，混勻，于55'C溫浴1小時(shí)；結(jié)束后向溶液中加入等體積的氯仿，上下顛倒充分混勻；12000rpra/min離心10分鐘；將上清移至新的離心管中，再用等體積的氯仿/異戊醇抽提一次；取上清，加入l/10體積的3mol/L醋酸鈉，混勻，加入兩倍體積的無水乙醇，混勻，室溫靜置2min沉淀出DNA;12000rpm/min離心10分鐘；小心棄去上清液，用lml70%酒精洗滌沉淀，4°C、12000rpm離心5min，棄去上清，55。C烘干；加入60WTE溶解，37。C水浴30rain。所制備DNA應(yīng)立即進(jìn)行檢測或貯存于-8(TC備檢。二、血清1至10型豬胸膜肺炎放線桿菌的檢測分別對上述10種血清型豬胸膜肺炎放線桿菌的DNA進(jìn)行檢測，檢測步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到血清1型的DNA作為檢測組1;在3支裝有23wL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2nL步驟一得到血清2型的DNA，作為檢測組2;在3支裝有23wL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2ixL步驟一得到血清3型的DNA，作為檢測組3;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2"L步驟一得到血清4型的DNA，作為檢測組4;在3支裝有23nL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2yL步驟一得到血清5型的DNA，作為檢測組5;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到血清6型的DNA，作為檢測組6;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各力口入2uL步驟一得到血清7型的DNA，作為檢測組7;在3支裝有23yL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到血清8型的DNA，作為檢測組8;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到血清9型的DNA，作為檢測組9;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到血清10型的DNA，作為檢測組10;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL滅菌雙蒸水，作為陰性對照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上65t:放置50分鐘，調(diào)水浴鍋溫度到8(TC反應(yīng)10min，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。檢測組l的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測組2的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測組3的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測組4的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測組5的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測組6的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測組7的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測組8的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測組9的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測組10的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀。(3)顯色檢測在每個(gè)反應(yīng)管中加入3uL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陰性對照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。檢測組l的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測組2的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測組3的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測組4的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測組5的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測組6的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測組7的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測組8的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測組9的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測組10的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色。結(jié)果表明，本發(fā)明的試劑盒可應(yīng)用于所有血清型的豬胸膜肺炎放線桿菌的檢序列表<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉一種豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒及其應(yīng)用〈130〉CGG應(yīng)Y81637〈160〉7〈210〉1<211>1000<212>DNA〈213〉豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleurop畫moniae)<400〉1tttgax:a^ttggagtttgctgaccgcagtataactcgcg8tg犯ctgat60ta鄉(xiāng)C3gggcttcatctatacggcaccg3tggcaatgatgat3t犯eigg3tC3tgCgg3120ttgggacagca/ttttggaaggcggca卿gC33cgatattctaagaggtggctacggtgc180ggacacctatatctttagcaaaggac8cggacaggatatcgtttatgaagataccaataa240gcaagagatatcgacaccttaaaatttactgatgtgaattatgcggaagt300g犯attccgacgagtagataatgacttaatgttattcggttatcatgatacggattcggt360tccttctacattatcaatttgacaaattggaatttgctga420ccgcagtELtaactcg、tg3tg^ctaggtaa3C犯ggt3tggcattatttggcactgacgg■tg3tg3t犯t3tc^cgactgggg3Cgtaactcggtgattgatgccggtgcgggtaatga540tacggttaMggcggt組ggcg3tgax:accctcatcggcggcaaaggtaatgatattct600犯gaggtggctacggtgcggacacctatatcttt3gca^3gg3C3Cgg3C3ggatatcgt660ttatgaagatataaccgcgcgacaccttaaaattteictga720t3ttaattta<tccgaactttggttt柳cggatttgattattaaatcatt780gataaag"tcacggttcaaaattggtattcacaccaagatcat肌aataga8403aat3ttcgtttatcgaatgagca^cgttggtgagcactC3ggtgg卿agatggttga900gtcgatggccggctttgctcagaagcacggtctcttgtgtcgcttgaaga960ggtaaaacaatatatcaatagcttaacagctgctttataa1000〈210〉2<211>24〈212〉DNA,〈213>人工序列<400>2gacaccttaaaatttactgatgtg24〈210〉3<211〉22〈212>DNA<213>人工序列<400>3cgttgatattatcatcaccgtc22<210>4〈211〉48<212>DNA〈213>人工序列<400〉4gaccgaatccgtatcatgataaccgttttcggaagtgaaattccgacg48<210>5<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>5ggaatttgctgaccgcagtttttgccaaat犯tgccataccttg44〈210〉6<211>28<212〉DNA<213>人工序列〈400〉6gagtagataatgacttaatgttattcgg28<210>7<211>25<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉7tataactcgtgatgaactaggt犯a2權(quán)利要求1、一種豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒，包括針對豬胸膜肺炎放線桿菌GenBankAccessionNumberAF021919序列中自5’端第5550位至6549位的核苷酸序列的三對引物，一對引物是與所述序列結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對，一對引物是與所述序列結(jié)合的外側(cè)引物對，一對引物是與所述序列結(jié)合的環(huán)形引物對。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述內(nèi)側(cè)引物對包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5;所述外側(cè)引物對包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3;所述環(huán)形引物對包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。3、如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑、陽性對照、陰性對照；所述陽性對照為豬胸膜肺炎放線桿菌DNA。4、如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑為含有如下溶質(zhì)的水溶液Tris-HC1、KC1、(NH4)2S04、Tween20、MgS04、甜菜堿、脫氧核苷酸和BstDNA聚合酶。5、如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中加入所述內(nèi)側(cè)引物對、所述外側(cè)引物對及所述環(huán)形引物對，形成環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液;每23uL所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中，所述溶質(zhì)的物質(zhì)的量如下Tris-HC10.5umo1、KC10.25umol、(NH4)2S040.25umol、Tween200.025"、MgS040.2-20nrao1、甜菜堿20nmo1、4種脫氧核苷酸各0.035umol、BstDNA聚合酶16U，所述內(nèi)側(cè)引物對的上游引物和下游引物各0.04-0.06ymo1，所述外側(cè)引物對的上游引物和下游引物各0.00'4-0.008umol，所述環(huán)形引物對的上游引物和下游引物各0.02-0.04umol;每23uL所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中，所述MgS04優(yōu)選0.2umo1，所述內(nèi)側(cè)引物對的上游引物和下游引物優(yōu)選0.04umo1，所述外側(cè)引物對的上游引物和下游引物優(yōu)選0.004ixmol，所述環(huán)形引物對的上游引物和下游引物優(yōu)選0.02umol。6、如權(quán)利要求1至5中任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括熒光顯色劑。.7、如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述熒光顯色劑為熒光染料SYBRGREENIo8、如權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液與所述熒光顯色劑的體積比為23:(1-3)，優(yōu)選23:1。9、一種檢測死亡動(dòng)物中是否攜帶豬胸膜肺炎放線桿菌的方法，是用權(quán)利要求1至8中任一所述的試劑盒對來自死亡動(dòng)物的樣品的總DNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，確定死亡動(dòng)物中是否攜帶豬豬胸膜肺炎放線桿菌；所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的條件為60-65°C、20-90分鐘。10、如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述檢測死亡動(dòng)物中是否攜帶豬胸膜肺炎放線桿菌的方法中還包括將進(jìn)行完所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的樣本80-9(TC反應(yīng)2-IO分鐘的步驟。全文摘要本發(fā)明公開了一種豬胸膜肺炎放線桿菌檢測試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的試劑盒，包括三對引物，即與豬胸膜肺炎放線桿菌GenBankAccessionNumberAF021919序列中3’端1000bp基因結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對、外側(cè)引物對和環(huán)形引物對。試劑盒還包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑、陽性對照、陰性對照和熒光顯色劑，陽性對照為豬胸膜肺炎放線桿菌DNA。本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒檢測動(dòng)物中是否攜帶豬胸膜肺炎放線桿菌的方法。本發(fā)明的試劑盒，檢測靈敏度高，6-10個(gè)拷貝即可檢測出目的DNA，操作簡單方便，特別適于基層現(xiàn)場進(jìn)行的病原檢測及可能污染的動(dòng)物食品中豬胸膜肺炎放線桿菌的檢測。文檔編號C12Q1/04GK101358237SQ20081011977公開日2009年2月4日申請日期2008年9月9日優(yōu)先權(quán)日2008年9月9日發(fā)明者吳文學(xué),張躍偉,李佳禾,李旭妮,黃書林申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)