專利名稱：：胡楊DREB2轉(zhuǎn)錄因子cDNA序列、含有該序列的表達載體及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物AP2/EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子的cDNA序列，尤其涉及沙生植物胡楊(P叩Wuseuj^ra"ca)W朋2轉(zhuǎn)錄因子cDNA序列。本發(fā)明還涉及能夠在植物中高效表達該cDNA序列的植物表達載體、該cDNA序列在提高植物抗逆性中的應，屬于植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：干旱、鹽堿和低溫是影響陸生植物生長和限制作物產(chǎn)量的三種主要的非生物脅迫因子。據(jù)統(tǒng)計，世界干旱半干旱地區(qū)涉及50多個國家和地區(qū)，約占全球陸地面積的34.9%。目前全世界用于農(nóng)業(yè)的57億公頃可耕旱地中，約70%的耕地由于干旱等因素導致土質(zhì)退化，亞洲受此影響的土地面積最廣，近14億公頃。而我國的干旱、半干旱地區(qū)約占國土面積的一半以上，年受旱面積達200—270萬公頃。其危害相當于其它自然災害之和。此外，世界鹽堿地占全球陸地面積的7.6%,隨著工業(yè)化進程加快，灌溉地和塑料大棚面積的不斷擴大，我國的土壤鹽漬化面積不斷擴大，目前鹽漬化土壤面積約有2600萬公頃，其中鹽堿耕地約有670萬公頃，嚴重制約了農(nóng)業(yè)對土地的利用。低溫作為經(jīng)常發(fā)生且危害嚴重的逆境因素之一，它不僅影響著植物的季節(jié)性生長，也影響著植物的地理性分布。據(jù)統(tǒng)計，我國每年因冷害造成的農(nóng)業(yè)損失高達數(shù)十億元，這些非生物脅迫對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)建設(shè)、可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略有著直接或間接的危害作用。干旱、鹽堿和低溫等非生物逆境都會構(gòu)成對植物的滲透脅迫，致使環(huán)境滲透勢低于植物細胞滲透勢而導致植物細胞失水，嚴重的可造成細胞膨壓完全喪失，甚至導致植物死亡。當然，植物為了適應環(huán)境，在長期演化過程中也形成了復雜而精細的調(diào)節(jié)機制，提高了自身對不良環(huán)境脅迫的抵抗或忍耐能力，以適應不良環(huán)境。轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,TF)也稱反式作用因子，是指能夠與真核生物基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白，通過他們之間以及與其它相關(guān)蛋白之間的相互作用激活或抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄。自從1987年P(guān)az—Ares首次報道玉米轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆以來，相繼從高等植物中分離出的調(diào)控干旱、高鹽、低溫、激素、病原反應及生長發(fā)育等相關(guān)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子已達數(shù)百種。擬南芥基因組測序已經(jīng)完成，據(jù)推測，至少有1553個編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，約占其估計基因總數(shù)的5.9%。擬南芥中轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量如此之大，種類之多，表明了高等植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復雜性，同時也表明轉(zhuǎn)錄因子研究的重要性。AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子是植物中所特有的一個龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族，它主要參與植物發(fā)育、激素、病原反應以及干旱、高鹽和低溫脅迫應答。這個基因家族的成員都含有由60個左右氨基酸殘基組成的非常保守的DNA結(jié)合區(qū)(即AP2/EREBP結(jié)合域)，這類蛋白根據(jù)DNA結(jié)合區(qū)的同源性又可以分為5類AP2類、DREB類、ERF類、RAV類以及其它類型。很多研究已經(jīng)證明，DREB類和ERF類轉(zhuǎn)錄因子在逆境抗性中起重要作用。AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子所具有的快速、瞬時、早期的表達特點為其參與信號轉(zhuǎn)導途徑，發(fā)揮其早期的基因調(diào)控作用提供可能，一旦有生物或非生物脅迫出現(xiàn)，該轉(zhuǎn)錄因子家族基因便能快速表達，通過結(jié)合下游功能基因啟動子中的順式作用元件調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達，并最終開啟植物防衛(wèi)反應體系進行防衛(wèi)應答反應。EREBP亞家族轉(zhuǎn)錄因子(如TINY、CBF1、Ptis、AtEBP、DREB1、DREB2)主要參與對乙烯和病原的分子應答反應。其中，該亞家族的DREB轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆響應中起關(guān)鍵作用，其通常識別結(jié)合干旱應答元件DRE/CRT，從而調(diào)控一些與干旱、高鹽和低溫耐性有關(guān)的基因表達(LiuQ,KasugaM，SakumaY，AbeH，MiuraS，Yamaguchi—ShinozakiK，ShinozakiK.Twotranscriptionfactors，DREB1andDREB2，withanEREBP/AP2DNA-bindingdomainseparatetwocellularsignaltransductionpathwayindroughtandlow—temperature—responsivegeneexpressionrespectivelyinArabidopsis.PlantCell,1998，10:13911406)。然而，ERF轉(zhuǎn)錄因子在生物脅迫應答中起著重要作用，如擬南芥AtEFRl基因在擬南芥中超表達后，對灰霉病、菌核病及白粉病都具有抗性。ERF亞家族轉(zhuǎn)錄因子主要調(diào)控乙烯應答以及抗病相關(guān)(Pathogenesis—Related,PR)基因的表達。PR基因的啟動子中常常含有與乙烯信號應答有關(guān)的順式作用元件GCC盒，ERF亞家族轉(zhuǎn)錄因子通過與GCC盒的相互作用，調(diào)控PR基因的表達，從而調(diào)控植株的抗病能力。DREB轉(zhuǎn)錄因子(DehydrationResponsiveElementBindingProtein),艮卩干旱應答元件結(jié)合蛋白，是一類和植物脫水條件下的抗逆性反應有關(guān)的、在信號傳遞和調(diào)控基因表達中起作用的轉(zhuǎn)錄因子，能特異結(jié)合DRE/CRT順式作用元件，并激活下游目的基因的轉(zhuǎn)錄。DRE/CRT(dehydrationresponsiveelement)順式作用元件，核心序列為TACCGACAT，1994年YamaguchiShinozaki在分析擬南芥rd29A基因的啟動子中首次發(fā)現(xiàn)了含9bpTACCGACAT序列的DRE核心序列，它能對干旱、高鹽和低溫下逆境誘導基因表達起重要作用，且表達不依賴ABA信號轉(zhuǎn)導途徑。與此同時，在一些受干旱、高鹽或低溫的啟動子中也發(fā)現(xiàn)DRE元件或DRE核心序列，如受低溫誘導擬南芥基因corl5a的啟動子中發(fā)現(xiàn)相似于DRE元件的序列TGGCCGAC,稱為CRT(C-r印eat)元件，受低溫誘導的甘藍型油菜基因BNIIS啟動子中也發(fā)現(xiàn)具有DRE核心序列的5bp(CCGAC)中心序列，被稱為低溫應答元件LTRE。DREB的發(fā)現(xiàn)是近年來植物抗逆性研究方面最具突破性的進展。Liu等(LiuQ，KasugaM,SaklamY，etal.Twotranscriptionfactors,DREB1andDREB2，withanEREBP/AP2DNA—bindingdomains印aratetwocellularsignaltransductionpathwayindroughtandlowtemperatureresponsivegeneexpressioninArabidopsis[J].PlantCell,1998，10:1391—1406)利用rd29A基因啟動子區(qū)域中的DRE順式作用元件和酵母單雜交方法，從低溫處理的擬南芥cDNA文庫中克隆到3個與DRE元件結(jié)合，在低溫脅迫下調(diào)控報告基因GUS表達的轉(zhuǎn)錄因子，命名為DREB1A、DREB1B、DREB1C。Gilmour等(GihmurSJ，ZarkaDG，StockingerEJ，etal.lowtemperatureregulationoftheArsbldopsisCBFfamilyofAP2transcriptionalactivatorasanearlystepincoldinducedcorgeneexpression[J].PlantJ，1998，16(4):433—442)也分離到這三個基因，分別命名為CBF1(DREB1B)、CBF2(DREB1C)和CBF3(DREB1A)。它們受冷誘導表達，為冷應答基因。用4。C低溫處理，15min內(nèi)，DREB1A、DREB1B和DREB1C基因被快速強烈誘導，但它們不受外源ABA的誘導。Liu等研究表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥中DREB1B的組成型超表達提高了植物對干旱、高鹽和低溫的耐受性。Liu等還從干旱處理的擬南芥cDNA文庫中克隆到2個與DRE元件結(jié)合，在干旱、高鹽脅迫下調(diào)控報告基因GUS表達的基因，定名為DREB2A和DREB2B。它們受干旱和高鹽誘導表達，為干旱和高鹽應答基因，如用干旱或高鹽進行脅迫處理，15min內(nèi)，DREB2A和DREB2B基因也被快速強烈誘導，尤其在植物根部，這兩個基因不受外源ABA的誘導。在與DRE元件結(jié)合的DREB1(CBF)和DREB2兩類轉(zhuǎn)錄因子各自同源性都很高，但是除了AP2結(jié)構(gòu)域高度保守外，兩類基因之間基本沒有序列的相似性。DREB1(CBF)的表達被低溫誘導，卻不被干旱和高鹽脅迫所誘導，而DREB2被干旱和高鹽脅迫所誘導，卻不被低溫所誘導。在脅迫誘導后，植物中的內(nèi)源ABA水平有所提高，但兩種DREB轉(zhuǎn)錄因子均不受外源ABA的誘導。產(chǎn)生的DREB轉(zhuǎn)錄因子可激活具有DRE順式作用元件的一系列目的基因，如rdl7、kinl、cor6.6、corl5a、erdlO以及rd29A。這些基因表達的產(chǎn)物在植物抗逆反應中發(fā)揮著不同的功能，從而使植株的抗逆性提高。同一家族不同亞族蛋白功能的差異，常由少數(shù)幾個關(guān)鍵位置的氨基酸決定，這些氨基酸往往在亞族中保守，但在亞族間不同。DREB/CBF和ERF同屬AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族，但功能不同。ERF亞家族轉(zhuǎn)錄因子識別結(jié)合的順式作用元件GCC盒，主要參與對乙烯和病原的分子應答反應；而DREB/CBF亞家族轉(zhuǎn)錄因子識別結(jié)合CRT/DRE順式作用元件，主要參與對低溫、干旱和高鹽等的分子應答。氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，ERF亞家族轉(zhuǎn)錄因子的AP2DNA結(jié)合域中，第14和19位為保守的丙氨酸(A)和天冬氨酸(D);而DREB亞家族轉(zhuǎn)錄因子的AP2DNA結(jié)合域中，第14和19位為保守的纈氨酸(V)和谷氨酸(E)。迄今報道的DREB轉(zhuǎn)錄因子，其基因內(nèi)均無內(nèi)含子。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，DREB蛋白具有轉(zhuǎn)錄因子的普遍結(jié)構(gòu)特征在C-末端富含酸性氨基酸，功能是作為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)；N-末端富含堿性氨基酸，是核定位信號區(qū)；中間由58個氨基酸殘基組成的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域序列以及空間構(gòu)象均有一定的特點，包括YRG區(qū)和RAYD區(qū)，前者為N-端富含有20個氨基酸殘基組成的堿性和親水性的區(qū)域，蛋白質(zhì)的三維分析表明，該區(qū)有3個反向平行e—折疊，對識別各類順式作用元件并與元件相互結(jié)合作用起關(guān)鍵作用，該區(qū)的第14位和第19位的氨基酸分別為保守的纈氨酸(V14)的谷氨酸(E19)，特別是第14位的纈氨酸(V)，對決定DREB轉(zhuǎn)錄因子與DRE順式作用元件的特異性結(jié)合起關(guān)鍵作用。Sakuma等和Qin等分別對擬南芥和玉米的DREB轉(zhuǎn)錄因子的這兩個位點的氨基酸進行點突變，當14位的纈氨酸(V)變成丙氨酸(A)后，DREB不與DRE序列結(jié)合，DREB轉(zhuǎn)錄因子幾乎喪失其轉(zhuǎn)錄激活能力；而19位的谷氨酸(E)變成天冬氨酸(D)后，DREB轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合DRE序列，但轉(zhuǎn)錄激活能力受到較大影響。另外，在擬南芥數(shù)據(jù)庫中檢索到的56個DREB/CBF類的蛋白，在V14處都為纈氨酸，而有19個基因在E19處并不是谷氨酸，這些均表明在DREB與順式作用元件的結(jié)合中，V14起著更為重要的作用。RAYD區(qū)位于AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的C-末端，其中約18個氨基酸殘基組成的核心區(qū)可形成雙親性的a_螺旋。DNA結(jié)合依賴于YRG元件，但RAYD元件并不直接參與同一順式作用元件的特異識別，而通過影響YRG區(qū)構(gòu)象或通過與其它蛋白發(fā)生相互作用調(diào)節(jié)AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域與DRE順式作用元件的結(jié)合。CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子在植物中廣泛存在。比較雙子葉和單子葉植物CBF/DREB1轉(zhuǎn)錄因子AP2結(jié)合域的第14位和19位氨基酸發(fā)現(xiàn)，雙子葉植物中第14位和19位氨基酸為V14和E19;單子葉植物中相應位置的氨基酸除了V14和E19外，大多數(shù)為V14和V19。綜上所述，從最初擬南芥CRT/DRE元件的鑒定和CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子的克隆距今，只短短10年，但卻從各種植物鑒定出了CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子。DREB/DRE是植物中廣泛存在而不依賴于ABA的逆境脅迫信號轉(zhuǎn)導途徑。CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子特異識別結(jié)合CRT/DRE元件，調(diào)控一系列干旱低溫應答基因表達，這些基因所編碼的產(chǎn)物使植物適應或抵御逆境。另外，超表達CBF3/DREB1A的擬南芥耐旱耐寒，而耐性的提高，不僅與CRT/DRE基因的表達增強有關(guān)，還與脯氨酸和糖含量的升高有關(guān)。因此，CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子的功能，可能不簡單局限于對CRT/DRE基因的調(diào)控，可能還以某種方式、通過某種途徑調(diào)控其它與耐逆相關(guān)的基因表達。目前對CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子的認識還十分膚淺，對其功能和所參與調(diào)控的信號傳導途徑的準確理解和把握，還需要不懈的努力。到目前為止，己經(jīng)從多種植物中克隆分離到上百種DREB轉(zhuǎn)錄因子，包括單子葉植物和雙子葉植物，并且DRE/DREB順式作用元件與反式作用因子相互作用的調(diào)控模式已經(jīng)在草本植物種發(fā)現(xiàn)并被證明，如擬南芥、小麥、黑麥草、番茄、玉米、大麥、水稻等。但是僅在為數(shù)不多的幾種木本植物中分離得到了少數(shù)DREB轉(zhuǎn)錄因子。目前，植物抗逆基因工程的研究取得了一定進展，但是其重點均在導入個別功能基因來提高某種抗性，從而達不到使植物的抗逆性得到綜合的、根本性的改良。植物的抗逆性并不是由單個或少數(shù)幾個基因的表達來體現(xiàn)的，而是由多基因控制的數(shù)量性狀。雖然目前已陸續(xù)從各種植物中克隆出大量的抗逆相關(guān)基因，但這些基因大多數(shù)只能增加植物的某種單一抗性，并不能從整體上綜合提高植物的抗逆性。轉(zhuǎn)錄因子作為功能基因表達的調(diào)節(jié)開關(guān)，可以對不同的基因進行精確的調(diào)節(jié)，在植物逆境信號傳遞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，所以通過增強某個轉(zhuǎn)錄因子的作用，可促使多個與抗逆有關(guān)的功能基因表達，這是使植物抗逆性狀獲得綜合改良的一條非常有效的途徑。DREB正是這一類的轉(zhuǎn)錄因子，在脅迫信號傳遞過程中起重要作用，它可以調(diào)控多個與植物干旱、高鹽及低溫耐性有關(guān)的功能基因的表達，從整體上增強植物的抗逆性，提高其穩(wěn)定性，對于基因工程改良植物的耐逆性具有巨大的潛在應用價值，并將有巨大的應用前景。因此，克隆新的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因，研究其基本的生物學特性和功能，將為整個植物抗逆基因調(diào)控網(wǎng)絡及脅迫應答反應機理提供理論基礎(chǔ)，為改良作物抗逆性、創(chuàng)造新的抗逆材料提供物質(zhì)基礎(chǔ)。胡楊(PopuJuse叩/7ra"ca)系楊柳科楊屬中最古老、最原始的一個樹種，它是第三紀上遺留下來的孑遺植物，落葉喬木，為國家三級保護漸危種。在我國主要分布于新疆、青海、內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏等海拔較低的干旱荒漠地區(qū)，在亞洲的中西部、北非和歐洲南端也有分布。胡楊可耐極端最高氣溫45'C和極端最低氣溫-4(TC，具有極強的抗旱、耐鹽堿、防風、固沙、改良土壤等能力，能夠在極度干旱缺水的環(huán)境中生長，除了其形態(tài)學上的部分特點外，更主要的是由于胡楊在長期生長進化過程中形成了其特有的基因構(gòu)成及精密的表達調(diào)控方式。因此，從沙生植物胡楊中克隆與抗逆性緊密相關(guān)的DREB轉(zhuǎn)錄因子基因，不僅能為基因工程育種提供優(yōu)良基因源，而且對于作物抗逆育種顯得尤為重要和迫切。綜上所述，對于一個水資源緊缺、鹽漬化土壤面積不斷擴大、耕地面積有限、人口眾多的農(nóng)業(yè)大國來說，克隆在植物抗逆過程中起重要作用的調(diào)控基因，對于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一是提供一類從沙生植物胡楊(Popu化se叩/3ratica)中所分離、克隆的與抗逆性緊密相關(guān)的DREB轉(zhuǎn)錄因子cDNA序列。本發(fā)明目的之一是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種從沙生植物胡楊中所分離、克隆的與抗逆性緊密相關(guān)的DREB轉(zhuǎn)錄因子cDNA序列，該cDNA序列為以下(a)或(b)的核苷酸序列(a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或(b)將SEQIDNO:1所示的核苷酸序列一個或多個的堿基進行替換、缺失或/和插入而得到的核苷酸序列，該核苷酸序列所編碼的蛋白仍具有DREB轉(zhuǎn)錄因子的功能。本發(fā)明根據(jù)植物中5iffiS基因DNA結(jié)合域保守區(qū)設(shè)計簡并引物，利用RT-PCR方法從沙生植物胡楊中分離到i)i5S2基因的同源片段，然后通過RACE—PCR技術(shù)克隆得到新的DREB2轉(zhuǎn)錄因子基因PeZ)ifiB2a(SEQIDNO:1)，并對其進行了序列分析和蛋白的三維結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果顯示該基因具有DREB轉(zhuǎn)錄因子所特有的三個功能結(jié)構(gòu)域，即核定位信號、DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域。序列比對表明該基因和其它已知的DREB基因除了在保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域處具有很高的同源性外，在其它區(qū)域的序列同源性不高。通過構(gòu)建植物DREB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)該PeDREB2a蛋白主要與DREB2類轉(zhuǎn)錄因子聚在一起，并且與雙子葉植物的DREB2類轉(zhuǎn)錄因子的親緣關(guān)系更近;分別以基因組DNA和cDNA為模板對PeW朋2a進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)序列分析表明，該基因不含內(nèi)含子；通過半定量RT-PCR對其在不同的脅迫條件下進行脅迫反應檢測，結(jié)果顯示該基因的表達均受干旱、高鹽和低溫環(huán)境逆境的誘導，并且其表達不依賴于ABA的調(diào)控。本發(fā)明目的之二是提供一類由上述cDNA序列所編碼的胡楊DREB轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明目的之二是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一類由上述cDNA序列所編碼的胡楊DREB轉(zhuǎn)錄因子，為以下(a)或(b)所示的氨基酸序列(a)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或(b)將SEQIDNO:2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而獲得的仍具有DREB轉(zhuǎn)錄因子功能的氨基酸序列。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的胡楊DREB轉(zhuǎn)錄因子為SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本文中，所述的"多個"通常意味著28個，優(yōu)選為24個，這些取決于DREB轉(zhuǎn)錄因子三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類；所述的"替換"是指分別用不同的氨基酸殘基取代一個或多個氨基酸殘基；所述的"缺失"是指氨基酸序列的改變，其中分別缺少一個或多個氨基酸殘基；所述的"插入"是指氨基酸序列的改變，相對天然分子而言，所述改變導致添加一個或多個氨基酸殘基。本發(fā)明還涉及可以在植物中高效表達所述DREB轉(zhuǎn)錄因子cDNA序列(SEQIDNO:1)的植物表達載體。將所述DREB轉(zhuǎn)錄因子cDNA序列插入到植物表達載體合適的限制性酶切位點之間，可操作的與表達調(diào)控序列相連接，即可得到可以在植物中表達該cDNA序列的表達載體。該表達載體可以5'非編碼區(qū)、SEQIDNO:1所示的cDNA序列以及3'非編碼區(qū)，其中，所述的5'非編碼區(qū)可以包括啟動子序列、增強子序列或/和翻譯增強序列；所述的啟動子序列可以是組成型、誘導型、組織或器官特異性誘導子。作為一個優(yōu)選的實施方案，所述的植物表達載體是p2MDK。所述的3'非編碼區(qū)可以包含終止子序列、mRNA切割序列等，SEQIDNO:1所示的cDNA序列可由將其一個或多個的堿基進行替換、缺失或/和插入而得到的核苷酸序列所替換，該核苷酸序列所編碼的蛋白仍具有DREB轉(zhuǎn)錄因子的功能。作為優(yōu)選的，所述的植物表達載體還可含有報告基因，更優(yōu)選的，所述的報告基因為GFP。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，所述的高效植物表達載體是p2MDK_PeWES2a。本發(fā)明還涉及包含上述植物表達載體的植物細胞。另外，本發(fā)明還涉及所分離、克隆的DREB轉(zhuǎn)錄因子cDNA序列、含有該cDNA序列的植物表達載體在提高植物抗逆性中的應用。例如，可以將含有該cDNA序列的植物表達載體導入到植物細胞中，培育篩選得到對環(huán)境脅迫的抗性提高了的轉(zhuǎn)基因植株，其中，所述的環(huán)境脅迫可以是干旱、高鹽或低溫等逆境。轉(zhuǎn)錄因子通過與下游基因啟動子區(qū)域的順式元件結(jié)合可以調(diào)控一系列相關(guān)功能基因的表達，因此，在植物抗性分子育種中，導入轉(zhuǎn)錄因子基因能有效地提高轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性。為了進一步分析克隆到的PeWEi52轉(zhuǎn)錄因子基因的功能，本發(fā)明首先構(gòu)建得到含有PeWfS2a基因的植物高效表達載體p2MDK—Pei)if52a，利用農(nóng)桿菌介導將其轉(zhuǎn)化到煙草中；通過Kan抗性、基因組PCR及RT-PCR篩選鑒定陽性苗，對轉(zhuǎn)基因煙草苗進行干旱、高鹽及低溫等抗逆性分析并且對其相關(guān)生理生化指標進行測定，通過測定生理生化指標得出，轉(zhuǎn)基因植株的可溶性糖、胞質(zhì)總蛋白和脯氨酸含量高于對照，這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的大量積累有助于減少滲透脅迫和干旱脅迫對植物的傷害，成為轉(zhuǎn)基因植物抗?jié)B透能力和抗旱能力提高的重要生化證據(jù)，也進一步說明過表達PeZ)iffiS2a基因可能通過調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性和滲透脅迫抗性，以維持植株正常的生理生化功能。DREB轉(zhuǎn)錄因子對一系列抗逆功能基因的轉(zhuǎn)錄以及對脯氨酸和糖含量的促進作用說明DREB因子在植物抗逆反應中起著重要作用。圖l為簡并PCR擴增結(jié)果；圖2為3'RACE—PCR擴增。圖3為5'RACE—PCR擴增。圖4為Pe朋朋2acDNA全長序列的擴增結(jié)果。圖5為Pe朋朋2a蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)預測。圖6為胡楊ZWEB2a基因的基因組DNA結(jié)構(gòu)分析。圖7為不同脅迫處理下PeZ)iffiB2a基因的表達模式分析。圖8為表達載體p2MGK—Pe5i^S2a的構(gòu)建流程圖圖9植物表達載體p2MDK的圖譜。圖10重組質(zhì)粒p2MGK-PeDi￡52a菌落PCR擴增結(jié)果圖11重組質(zhì)粒p2MGK-PeiWEB2a的酶切結(jié)果；1，Sa_ZI單酶切，2，I和SaH雙酶切。圖12含有表達載體p2MGK-Pe/)i朋2a的農(nóng)桿菌LBA4404的菌落PCR;pCK:連接有目的基因的pMD19-T(陽性對照)，nCK:農(nóng)桿菌LBA4404(陰性對照)。圖13轉(zhuǎn)基因煙草DNA水平的PCR檢測。圖14轉(zhuǎn)基因煙草的RT-PCR檢測。圖15轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性分析；A:轉(zhuǎn)p2MGK-Pe^fS2a基因陽性煙草株系；B:p2MGK對照。圖16轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性分析；A:轉(zhuǎn)p2MGK-Pe^￡B2a基因陽性煙草株系；B:p2MGK對照。圖17剪葉7h后轉(zhuǎn)基因和對照植株葉片；A.p2MGK-PeDREB2aB.p2MGK對照。圖18單位葉面積累計失水量。圖19高鹽對胞質(zhì)總蛋白含量的影響。圖20干旱對胞質(zhì)總蛋白含量的影響。圖21高鹽對脯氨酸含量的影響。圖22干旱對脯氨酸含量的影響。圖23高鹽對葉片可溶性糖含量的影響。圖24干旱對葉片可溶性糖含量的影響。具體實施例方式以下通過實施例來進一步描述本發(fā)明的制備方法及有益效果，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版，J.薩姆布魯克)一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行。實施例l胡楊DREB轉(zhuǎn)錄因子(PeDi￡B2a)基因的分離、克隆1材料和方法1.1材料1.1.1植物材料培養(yǎng)及脅迫處理胡楊(P叩tihse叩/jratica)幼苗采集于新疆羅布泊地區(qū)，現(xiàn)定植于河北廊坊實驗基地，采樣時剪取胡楊短枝將其插入20%PEG6000溶液中進行模擬干旱脅迫處理10小時后，采集葉片經(jīng)液氮處理后保存于超低溫冰箱中備用。不同脅迫材料的處理剪取胡楊短枝，分別將其插入250mM的氯化鈉、20%PEG6000、100uM的ABA溶液、100uM的GA3溶液、100uM的BA溶液、100uM的NM溶液以及置于4°C冰箱中分別處理0.5、3、6、12和24小時。將處理后的材料用液氮迅速冷凍，放置于超低溫冰箱中備用。1.1.2菌株大腸桿菌(Esc力eric/n'aco』2'):DH5a農(nóng)桿菌04grobacterj'Uffltumefaciens):LBA44041.1.3載體pMD19-T克隆載體購自TaKaRa生物公司1.1.4酶與試劑DNA回收試劑盒購自北京天根科技有限公司；SuperScriPtIIIReverseTranscriptase及GeneRacerTMkit購自Invitrogen公司；pMD19_T載體及限制性內(nèi)切酶、Taq酶等常用酶類購自寶生物公司；EasyPureMiniPlasraidPurificationKit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。1.1.5其它試劑蛋白胨、酵母提取物、氯仿、異丙醇、乙醇、異戊醇、NaCl、MgCl2、磷酸二氫鈉、水飽和酚、Tris飽和酚等均為國產(chǎn)分析純試劑；5-溴-4-氯-3-11引哚--D-半乳糖苷(X-gal)、已丙基-e-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素等購自北京鼎國生物公司；瓊脂糖為Spain產(chǎn)品，焦碳酸二乙酯(DEPC)為美國Genview公司產(chǎn)品；溴代十六垸基三甲胺(CTAB)購自北京拜爾迪生物公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVPK-25)購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；乙二胺四乙二鈉鹽(EDTANa2)購自北京普博欣生物科技有限責任公司。1.1.6培養(yǎng)基LB液體及固體培養(yǎng)基按照文獻所公開的方法配制(分子克隆實驗指南(第三版)J.薩姆布魯克)。B5培養(yǎng)基及貯存液的配制按照有關(guān)教材所公開的方法進行配制(《植物組織培養(yǎng)》，王蒂主編，中國農(nóng)業(yè)出版社出版)。1.2方法1.2.1胡楊總RNA的提取(熱CTAB法)按照《植物分子生物技術(shù)應用手冊》(彭學賢主編，化學工業(yè)出版社)一書所公開的熱CTAB法提取胡楊總RNA;1.2.2第一鏈cDNA的合成(按Invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行)1.預變性以胡楊總RNA為模板，以01igo-dT為引物(工作濃度為10pmol/ul)。反應體系如表l，混勻后，65'C變性5min，立即置于冰上l-2min。表1RNA預變性體系成分用量TotalRNAlOng-l^gOligo-dTPrimer(10pmol/|il)1.O^ildNTPs(10mMeach)l羊DEPCH20XTotal_13|il2.反轉(zhuǎn)錄向上述離心管中加入表2中所列成分后混勻，42°Clh;70'C下15min滅活反轉(zhuǎn)錄酶；表2反轉(zhuǎn)錄體系_<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3.RNaseH消化向反應液中加入1u1(2U/u1)的RNaseH,37。C20min，消化與c腿結(jié)合的單鏈RNA，-2CTC冰箱保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。1.2.3Z^fS基因同源片段的克隆1.2.3.1引物的設(shè)計與合成利用DNAMAN軟件對GENBANK中已公布的相關(guān)科屬植物0/￡52類基因的氨基酸和核苷酸序列進行同源分析，然后，根據(jù)"/^S基因DNA結(jié)合域保守區(qū)設(shè)計合成一對簡并引物(表3)。_表3簡并PCR中使用的引物_<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>根據(jù)植物中PiES2基因DNA結(jié)合域保守區(qū)設(shè)計一對簡并引物S和AS，以葉片為材料提取總RNA進行RT-PCR，PCR條件為94°C5min;94。C45sec,50°C45sec,72°C30sec，30個循環(huán)；72°C10min。反應結(jié)束后用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定。1.2.3.3PCR產(chǎn)物的回收采用北京天根科技有限公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒，按照試劑盒說明書的方法進行操作1.2.3.4目的片段與克隆載體的連接將回收的PCR產(chǎn)物連接至pMD19-T載體上，連接反應體系如表4，16。C連接過夜。表4連接反應體系<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>1.2.3.5大腸桿菌感受態(tài)的制備參照《分子克隆實驗指南》(第三版，J.薩姆布魯克)一書中所列的具體方法進行。1.2.3.6重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化參照《分子克隆實驗指南》(第三版，J.薩姆布魯克)一書中所列的具體方法進行。1.2.3.7菌落PCR鑒定以含有Amp的LB平板上挑取的白色單菌落，轉(zhuǎn)入lmlLB(Amp+)液體培養(yǎng)基中，37°C,200r/min搖菌2h，分別吸取1P1菌液作為模板，進行菌落PCR鑒定，引物為S和AS，擴增條件為94。C5min;94°C45sec，50°C45sec,72。C30sec，30個循環(huán)；72°C10min。反應結(jié)束后用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定。1.2.3.8重組質(zhì)粒的核苷酸序列測定將菌落PCR陽性的菌落轉(zhuǎn)入含Amp的LB液體培養(yǎng)基，37'C下200r/min過夜培養(yǎng)，制備成甘油菌，送中國農(nóng)業(yè)科學院測序部測序。1.2.4胡楊WfS基因的3'cDNA的克隆1.2.4.1引物的設(shè)計與合成根據(jù)已獲得的W朋基因的同源片段，設(shè)計1對3'RACE的巢式基因特異引物，見表5。_表53'RACE反應中使用的引物_引物編號引物序列3HY1-GSP15'-CAGAGGAGTGAGGCAGAGACATTG-3'3HY1-GSP25，-GGAGTGAGGCAGAGACATTGGGG-3'QT5'-GCTGTCMCGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)24-3'Ql5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3'_9_5'-CGCTACGTMCGGCATGACAGTG-3'_1.2.4.2胡楊總RNA的提取以胡楊葉片為材料提取總RNA，提取方法同1.2.1。1.2.4.3第一鏈cDNA的合成方法同1.2.2。1.2.4.4巢式PCR擴增3'-端cDNA1.以QT引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA為模板，用基因特異引物3HY1-GSP1與通用引物Ql進行第一輪PCR，反應參數(shù)94°C5min;94。C45sec，60°C45sec,72。Clmin,30個循環(huán);72。C10min;4。C保存。2.將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，用基因特異引物3HY1-GSP2與通用引物Q2進行第二輪巢式PCR，反應參數(shù)94°C5min;94°C45sec，63。C45sec，72°Clmin,30個循環(huán)；72°C10min;4。C保存。3.0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產(chǎn)物并連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5a,利用ci互補及菌落PCR篩選陽性克隆，并送測序公司測序，方法同1.2.3。1.2.5巢式PCR擴增5'端cDNA1.2.5.1引物的設(shè)計與合成根據(jù)已獲得的3'-端cDNA序列設(shè)計1對巢式基因特異引物，見表6。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2.RNA純化參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行。3.去帽在PCR管中加入下表所列成分混勻，離心，37'C條件下處理lhr后，離心，置于冰上l-2min。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>4.RNA純化方法同步驟2。5.RNA接頭序列的連接1)將經(jīng)去磷酸化和去帽處理的RNA轉(zhuǎn)入另一PCR管中，加入RNA接頭片段，輕輕混勻，離心；2)65。C，5min，冰浴2min，離心；3)在PCR管中加入下表所列成分混勻，離心，37。C條件下處理lhr后，離心，置于冰上1-2min。6.RNA純化方法同步驟27.反轉(zhuǎn)錄方法同1.2.2。_表9RNA片段連接反應體系_成分用量DephosphorylateddecappedRNAandRNAOligo7.0^110xLigaseBufferl.OjilRNaseOut(40U/til)l単ATP(10mmol/L)1.0^1TAP(0.5，)l羊_Total_]j^_1.2.5.3巢式PCR擴增5'-端cDNA1.以QT引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA為模板，用基因特異引物5HY1-GSP1與GeneRacer5'primer進行第一輪PCR，反應參數(shù)94°C5min;94°C45sec,60°C45sec,72。Clmin，30個循環(huán)；72°ClOmin;4'C保存。2.將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，用基因特異引物5HY1-GSP2與GeneRacer5'Nestedprimer進行第二輪巢式PCR，反應參數(shù)94°C5min;94°C45sec，62°C45sec，72°Clmin，30個循環(huán)；72。ClOmin;4。C保存。3.0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產(chǎn)物并連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5a，利用a互補及菌落PCR篩選陽性克隆，并送測序公司測序，方法同1.2.3。1.2.6基因cDNA全長擴增1.2.6.1引物的設(shè)計與合成拼接已知的3'-端和5'-端cDNA序列，獲得cDNA全長序列，據(jù)此，設(shè)計基因特異引物，擴增Z)iffiB基因的cDNA全長序列，所用引物見表IO。表10cDNA全長序列擴增所使用的引物引物編號引物序列HY1-F15'-CAACTTGAAGGGTTTGTTTTTGGTCC-3'HY1-F25'國GGTTTGTTTTTGGTCCCTCAAGGTT-3'1.2.6.2第一鏈cDNA的合成方法同1.2.2。1.2.6.3WES基因cDNA全長序列的克隆及生物信息學分析1.以QT引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA為模板，利用基因特異引物HY1-F1與通用引物Q1，進行第一輪PCR，反應參數(shù)94°C5min;94°C45sec，64°C45sec，72°C2min，30個循環(huán)；72'C10min;4'C保存2.將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，利用基因特異引物HY1-F2與通用引物Q2，進行第二輪巢式PCR，反應參數(shù)94°C5min;94°C45sec，60°C45sec,72°C2min,30個循環(huán)；72°C10min;4'C保存。3.0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產(chǎn)物并連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5oc,利用a互補及菌落PCR篩選陽性克隆，并送測序公司測序，方法同1.2.3。4.利用DNAMAN軟件進行序列比對和分析；利用SMART服務器(http:〃coot.embl-heidelberg.de/SMART/)分析PeZ)ifiS2a基因的結(jié)構(gòu)域；利用CPHmodels-2.0服務器分析預測PeDREB2a蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)(http://genome,cbs.dtu.dk/services/CPHmodels-2.0Server-3D.htm);禾'J用ScanProsite服務器(http:〃爾.expasy.org/cgi-bin/prosite)分析Pei)i￡S2a基因的結(jié)構(gòu)功能位點。1.2.7DNA序列的擴增及分析1.2.7.1引物的設(shè)計與合成根據(jù)已獲得的Pe"/￡S2a基因的cDNA序列，分別在基因5'-端和3'-端設(shè)計基因特異引物，所用引物見表ll。表ll戶aWEB2a基因的基因組擴增所使用的引物引物編號引物序列Gn陽HYl(F)5'隱CGTAATTTTGCCACCTCTTTAGTTT-3'Gn-HYl(R)5'-AGAATCTAAAACTGACTGACCCCTT-3'1.2.7.2胡楊基因組DNA的提取參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的DNA提取方法提取胡楊基因組DNA。1.2.7.3PCR擴增以胡楊的基因組DNA為模板，以基因特異引物Gn-HY1(F)和Gn-HY1(R)進行PCR擴增；0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產(chǎn)物并連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5cc，利用a互補及菌落PCR篩選陽性克隆，并測序，方法同1.2.3。1.2.9Di五5基因在不同脅迫條件下的表達模式分析1.2.9.1引物的設(shè)計與合成以胡楊肌動蛋白基因Actin(EF148840)為內(nèi)標基因，設(shè)計胡楊肌動蛋白基因特異引物HYActin-F和HYActin-R;根據(jù)已得到的Pe朋朋2a基因cDNA序列，在基因的非保守區(qū)設(shè)計基因特異引物，所用引物見表13。表13Pe/)ifiS2a基因在非生物脅迫下的表達分析所使用的引物引物編號引物序列HY1-RT(F)5'-GTTTGTTTTTGGTCCCTCAAGGT-3'HY1-RT(R)5'-AAGCTAAGGTCCAAGTTGGGATATG-3'HYActin-F5'-AAGTCCTCTTCCAGCCATCTCTCAT-3'HYActin-R5'-GTATTTTCTCTCTGGTGGTGCAACC-3'1.2.9.2DREB轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)Ω珊?、高鹽及低溫脅迫條件的應答將剪取的胡楊新鮮短枝分別插入含有250mM的NaCl溶液、20%PEG6000溶液以及置于4'C冰箱中進行高鹽脅迫、干旱脅迫以及低溫脅迫處理。分別提取處理0、0.5、3、6、12和24小時的葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作為PCR擴增模板，以胡楊肌動蛋白基因為內(nèi)標基因，利用基因特異引物HY1-RT(F)和HY1-RT(R)進行RT-PCR擴增，檢測Pe朋朋2a基因的表達變化。1.2.9.3DREB轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)Σ煌に貤l件脅迫的應答將剪取的胡楊新鮮短枝分別插入含有100uM的生長素萘乙酸NM溶液、IOOpM的細胞分裂素6—芐基氨基嘌呤(BA)溶液、100uM的赤霉素GA3溶液以及100^M的脫落酸(ABA)溶液中進行不同激素脅迫處理；分別提取處理0、0.5、3、6、12和24小時的葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作為PCR擴增模板，以胡楊肌動蛋白基因為內(nèi)標基因，利用基因的特異引物HY1-RT(F)和HY1-RT(R)進行RT-PCR擴增，檢測Pe5i￡B2a基因的表達變化。2試驗結(jié)果與分析2.1Z^ES基因同源片段的獲得對胡楊與擬南芥、構(gòu)樹、石刁柏以及銀白楊已報道的DREB2蛋白序列進行了同源比對分析，發(fā)現(xiàn)DREB2蛋白的DNA結(jié)合域的氨基酸序列在不同植物、不同DREB2家族中都呈現(xiàn)出高度保守的特性，因此利用該保守區(qū)域進行了簡并引物的設(shè)計，以葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，通過簡并PCR擴增出約200bp的目標帶(圖1)，與預期大小一致。將回收的PCR產(chǎn)物連接至pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5cc,利用ct互補及菌落PCR篩選出4個陽性克隆，測序后得到l條183bp的序列。序列檢索結(jié)果顯示，與大豆、棉花、及擬南芥的ZWfiB基因核苷酸序列具有較高的一致性，初步判斷該片段為胡楊Z)iES基因保守區(qū)。2.2"i5fl基因cDNA3'序列和5'序列的獲得經(jīng)序列比對，利用已獲得的WES基因同源片段，設(shè)計基因特異引物；利用基因特異引物3HY1-GSP1和3HY1-GSP2分別與3'通用引物Q1、Q2進行3，RACE擴增，電泳檢測，得到1條約1000bp的擴增產(chǎn)物(圖2)，測序結(jié)果表明，該片段為969bp，且5'端序列與原同源片段部分重疊，判斷為目標5iffifl基因的3'端序列。利用基因特異引物5HY1-GSP1和5HY1-GSP2分別與GeneRacer5'Primer和5，NestedPrimer進行5'RACE擴增，電泳檢測得到1條約900bp的擴增產(chǎn)物(圖3)，測序結(jié)果表明，該片段為893bp，且3'端序列與原同源片段部分重疊，判斷為目標Z)i^B基因的5'端序列。2.3Z)iES基因cDNA全長序列的獲得利用基因全長特異引物HY1-F1和HY1-F2分別與3'通用引物Q1、Q2,巢式PCR獲得1條約1.7KB的擴增產(chǎn)物(圖4)。測序結(jié)果表明，其全長序列為1601bp，序列比對結(jié)果顯示，與多種植物W朋家族的基因有較高相似性，推斷為新的Wffi基因，命名為PePiffiB2a。2.4胡楊i)i^S基因的生物信息學分析2.4.1基因的序列特征分析及編碼蛋白的結(jié)構(gòu)功能預測利用DNAMAN軟件對PeZ}i￡B2a基因的全長cDNA序列進行分析，結(jié)果表明該基因序列全長為1601bp，完整開放閱讀框1125bp，編碼375個氨基酸，5'—UTR和3、UTR分別包括151bp和322bp。通過利用ComputepI/Mwtool軟件預測其分子量為41.7kDa，等電點為6.16。SMART軟件對PaDi朋2a編碼的蛋白功能分析表明，該蛋白含有一個典型的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由58個氨基酸組成，在AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的前端存在一個核定位信號(NLS)，它引導該蛋白定位于細胞核；并且發(fā)現(xiàn)在其序列中存在兩個絲氨酸富集區(qū)和一個谷氨酰胺富集區(qū)，該區(qū)域可能起到增強轉(zhuǎn)錄激活的功能；在C末端有酸性活化域的末端序列(PSXEIDW)保守區(qū)。2.4.2DREB蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)預測利用CHPmodels-2.O(http://genome,cbs.dtu.dk/services/CPHmodels-2.0server)月艮務器來預測DREB2a蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示DREB2a蛋白的空間結(jié)構(gòu)中具有1個oc-螺旋，3個p-折疊組成，這是一個典型的DREB轉(zhuǎn)錄因子所具有的空間結(jié)構(gòu)，這從蛋白所具有的空間結(jié)構(gòu)的角度證明了該基因所編碼的蛋白可能是DREB類轉(zhuǎn)錄因子(圖5)。2.4.3PeDREB2a蛋白與其它DREB2類蛋白的同源性比對及系統(tǒng)進化樹分析植物中的DREB類基因可以分為兩大類，一類是由低溫誘導的DREB1類轉(zhuǎn)錄因子；另一類是由干旱、高鹽環(huán)境脅迫誘導的DREB2類轉(zhuǎn)錄因子。通過DNAMAN軟件對胡楊PeflW￡￡2a基因與其它已經(jīng)克隆的DREB基因進行系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果表明Pe5i￡B2a基因主要與DREB2類轉(zhuǎn)錄因子聚在一起，并且與雙子葉植物的DREB2類轉(zhuǎn)錄因子的親緣關(guān)系更近。因此，將克隆到的DREB轉(zhuǎn)錄因子基因PeWEB2a主要與植物中的DREB2類轉(zhuǎn)錄因子進行同源性比對分析。序列比對結(jié)果顯示:該轉(zhuǎn)錄因子基因全序列在蛋白水平上與其它植物DREB2類蛋白的同源性不高，一致性約為33.42%,僅在AP2/EREBP結(jié)合域中有高度保守性。并且發(fā)現(xiàn)DREB類轉(zhuǎn)錄因子第14位的纈氨酸(V14)非常保守，而第19位的氨基酸并不保守，有的為谷氨酸(E19),有的為亮氨酸(L19)。進一步證明在DREB相關(guān)蛋白中決定DNA結(jié)合特異性方面，V14的作用明顯要比E19和L19重要。2.5胡楊朋朋2a基因的基因組DNA結(jié)構(gòu)分析以胡楊基因組DNA和cDNA為模板，以Gn-HY1(F)、Gn-HY1(R)為引物對Pe朋朋2a進行PCR擴增，得到1條約1.5Kb的擴增產(chǎn)物；經(jīng)回收測序表明，這條帶為1303bp。測序結(jié)果分析顯示，PeM朋2a基因無內(nèi)含子(圖6)。2.6Di丑B基因在不同脅迫條件下的表達模式分析對胡楊短枝分別進行低溫、高鹽和干旱(PEG)等脅迫處理，在不同處理時間，分別提取其葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，當用250mMNaCl高鹽溶液處理后，Pe^fiB2a基因在轉(zhuǎn)錄水平明顯受高鹽脅迫誘導，鹽處理0.5h后表達量就開始提高，隨著處理時間的延長，表達量迅速增加，到3h達到最大值。而短枝處于模擬干旱條件的時候(20%PEG溶液)，Pe/)i￡S2a基因可以被其誘導表達，而且較高鹽處理先達到峰值，在處理6h后基因表達量達到最大，然后又迅速下降。在用4'C低溫處理后，結(jié)果顯示該基因也受到低溫的誘導表達，而且變化也比較明顯，在0.5h就已經(jīng)誘導表達，3h表達量達到最高，在隨后的處理中又逐漸減弱，表明該基因受到干旱、高鹽以及低溫非生物脅迫環(huán)境的誘導表達。用脫落酸ABA處理中PeiWES2a在轉(zhuǎn)錄水平上的表達基本上沒有變化，這也說明其不依賴于ABA的信號調(diào)節(jié)途徑。用激素NAA誘導表達的要比GA3和BA誘導表達時間提前，0.5h時就巳經(jīng)明顯表達，而且其后的整個過程中誘導表達量又明顯降低，而用GA3和BA處理中都在12h和24h才誘導表達，這些均說明這三種激素也誘導PeZWES2a基因的表達。由此看出，PeDREB2a對非生物脅迫具有明顯的應答(圖7)。綜上所述，Pe"i朋2a基因能被高鹽、干旱和低溫所誘導表達，并且這種誘導作用并不依賴于ABA信號調(diào)節(jié)途徑。利用生物學軟件對PeW￡S2a基因進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域中的第14位存在著已被證實與DRE順式作用元件具有特異性結(jié)合機制的功能性氨基酸，即纈氨酸(14V)。而第19位均為亮氨酸，并非谷氨酰胺，這也充分說明19位氨基酸的非保守性，進一步證明在DREB相關(guān)蛋白中決定DNA結(jié)合特異性方面，V14的作用明顯要比E19和L19重要。此外，根據(jù)植物DREB受不同條件的誘導表達，植物中的DREB類轉(zhuǎn)錄因子可分為DREB1和DREB2兩種類型。對不同植物DREB轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系的分析表明，PeDREB2a被歸類在雙子葉植物的DREB2轉(zhuǎn)錄因子類中，與大豆的GmDREB關(guān)系最近。研究表明，在DREB轉(zhuǎn)錄因子的C-端一般存在一個轉(zhuǎn)錄激活域,它們以富含酸性氨基酸、谷氨酰胺、脯氨酸或絲氨酸和蘇氨酸為特征，此結(jié)構(gòu)域是激活目標基因轉(zhuǎn)錄所必須的。在PeZ)iEB2a轉(zhuǎn)錄因子基因C-端具有明顯的轉(zhuǎn)錄激活域，推測該轉(zhuǎn)錄因子蛋白應該具有轉(zhuǎn)錄激活功能，其生物學功能有待進一步深入研究。同時推測PeDREB2a蛋白中的絲氨酸富集區(qū)可能通過位點的磷酸化作用分別調(diào)控蛋白的DNA結(jié)合域?qū)RE元件的結(jié)合能力和酸性激活域的轉(zhuǎn)錄激活能力。試驗例1植物高效表達載體的構(gòu)建及胡楊PeWES2a基因在煙草中的相關(guān)功能驗證2.材料與方法2.1材料2.1.1植物材料煙草NC89，由本實驗室保存。菌株及載體大腸桿菌(E.coh'):DH5a農(nóng)桿菌G4gro;bacterj'ufflt咖efaciens)菌株LBA4404pUC-ST4ApCAMBIA2301pMD19-T克隆載體PUC19本室保存本室保存本室保存本室保存TaKaRaTaKaRa說明pCAMBIA2301的全序列已公開于NCBI中AF234316BinaryvectorpCAMBIA-2301。2.1.3實驗中所用試劑與藥品各種限制性內(nèi)切酶、rTaq酶、ExTaq酶購自Takara公司，T4DNA連接酶購自NewEnglandBiolabs，Taq酶購自北京普博欣生物技術(shù)公司；SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase購自Invitrogen公司；TRNzol總RNA提取試劑購自北京天根科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天根科技有限公司；EasyPureMiniPlasmidPurificationKit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。2.1.4培養(yǎng)基LB細菌培養(yǎng)基、.YEB培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基按照《分子克隆實驗指南》(第三版，J.薩姆布魯克)所公開的方法進行配制；MS選擇培養(yǎng)基:MS基本培養(yǎng)基中加入6-BA(3.Omg/L)，NAA(O.2mg/L)，頭孢拉定(500mg/L)及卡那霉素(100mg/L)。MS生根培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基中加入頭孢拉定(500mg/L)及卡那霉素(200mg/L)。2.2方法2.2.1引物設(shè)計與合成設(shè)計合成含有酶切位點Sa]J和XbaJ的引物p35SGKN0S-PeDREB2a(F)和p35SGKN0S-PeDREB2a(R)，引物序列見表14。表14構(gòu)建植物表達載體所用引物引物編號引物序列p35SG腦S-PeDREB2a(F)p35SGKN0S-PeDREB2a(R)5'-5,-GGAGTCGACACCATGGCAGCAGCT-3'GGATCTAGACTGACTGACCCCTTM-3，2.2.2植物表達載體的構(gòu)建2.2.2.1植物高效表達載體p2MDK-PeZWEB2a的構(gòu)建利用引物p35SGKN0S-PeDREB2a(F)和p35SGKN0S-PeDREB2a(R)從連接有全長Pe朋朋2acDNA的pMD19-T載體上擴增出完整的開放閱讀框。擴增產(chǎn)物和載體經(jīng)雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳、回收后，T4連接酶，構(gòu)建植物高效表達載體p2MGK-PeWfiS2a。2.2.2.2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a及菌落PCR鑒定方法同實施例1的2.2.3.6和2.2.3.72.2.2.3重組質(zhì)粒的小量提取及酶切鑒定2.2.3煙草的遺傳轉(zhuǎn)化2.2.3.1農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化按照《植物基因工程原理與技術(shù)》(王關(guān)林主編，大連師范大學出版社)所公開的方法進行農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化操作。2.2.3.2含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的PCR鑒定挑取YEB平板上的單菌落，接種于5mlYEB液體培養(yǎng)基(含50mg/LRif，100mg/LKan)中，28'C培養(yǎng)l-2d，以未轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌作對照，進行菌落PCR鑒定。2.2.3.3煙草的遺傳轉(zhuǎn)化1.將含有植物表達載體的農(nóng)桿菌菌液均勻涂于YEB平板(含50mg/LRif,100mg/LKan)，lml/板，28'C培養(yǎng)過夜；2.用槍頭輕輕刮取菌體，并轉(zhuǎn)入MS液體培養(yǎng)基中，使懸浮液ODe。。約為0.5;3.取無菌苗的葉片，切去邊緣和主要葉脈，切成0.5cm大小的方塊；4.將切好的外植體在農(nóng)桿菌菌液(006。。=0.5)中浸泡5-lOmin;5.用無菌濾紙吸干植物材料表面的菌液，轉(zhuǎn)入表面鋪有一層濾紙的MS固體基本培養(yǎng)基，28°C，暗培養(yǎng)3d;6.將材料轉(zhuǎn)到含有Kan(100mg/L)的分化培養(yǎng)基中25'C培養(yǎng)(光周期為16h光照/8h黑暗)至抗性芽分化。2.2.4轉(zhuǎn)基因煙草的篩選2.2.4.1Kan抗性苗的篩選待抗性芽生長至2-3cm高時，切下小芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中Kan濃度降至50mg/L以利于誘導生根。待幼苗生根后，將其轉(zhuǎn)入新的生根培養(yǎng)基中，此時將Kan的濃度提高至200mg/L，用以降低轉(zhuǎn)化植株的假陽性率，從而減少后續(xù)篩選的工作量。2.2.4.2轉(zhuǎn)基因煙草的DNA水平鑒定利用CTAB法小量提取在含有Kan培養(yǎng)基中生長的生根煙草苗的總DNA，通過PCR檢測進一步篩選陽性轉(zhuǎn)化煙草植株。若擴增出了目標片段，而陰性對照中沒有擴增出片段，初步證明目的基因整合到煙草基因組中。2.2.4.3轉(zhuǎn)基因煙草的RT-PCR檢測選擇PCR確定的陽性轉(zhuǎn)化株，剪取葉片，TRNzol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為模板，RT-PCR檢測篩選陽性轉(zhuǎn)化苗。方法參照第二章的2.2.1和2.2.S.42.2.5轉(zhuǎn)基因煙草的耐脅迫分析2.2.5.1轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性分析將大小生長一致的轉(zhuǎn)Pe/)iES2a基因陽性煙草苗與轉(zhuǎn)入p2MGK空質(zhì)粒的對照煙草苗帶根取出，將其轉(zhuǎn)移至含有20XPEG的MS培養(yǎng)基中，在28i:的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4天后，將根部鹽水用無菌水洗凈后，重新移入MS培養(yǎng)基，恢復生長14天，觀察植株生長變化情況，并拍照記錄實驗結(jié)果。試驗設(shè)3個重復。2.2.5.2轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性分析將大小生長一致的轉(zhuǎn)Pe"ifS2a基因陽性煙草苗與轉(zhuǎn)入p2MGK空質(zhì)粒的對照煙草苗帶根取出，將其轉(zhuǎn)移含有300mMNaCl的MS培養(yǎng)基中，在28'C的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7—10天后觀察植株生長變化情況，并拍照記錄實驗結(jié)果。試驗設(shè)3個重復。2.2.5.3轉(zhuǎn)基因煙草的耐低溫分析將大小生長一致的轉(zhuǎn)Pei)i￡S2a基因陽性煙草苗與轉(zhuǎn)入p2MGK空質(zhì)粒的對照煙草苗置于一4t:冰箱中進行低溫處理20h后轉(zhuǎn)移至正常條件下培養(yǎng)，觀察小苗是否能恢復正常生長，并拍照記錄實驗結(jié)果。試驗設(shè)3個重復。2.2.6轉(zhuǎn)基因煙草在逆境條件下的生理生化指標測定2.2.6.1保水性實驗剪取PCR檢測呈陽性的轉(zhuǎn)Pe/^ES2a的煙株和轉(zhuǎn)p2MGK空質(zhì)粒的對照煙株的自上而下第3片展開葉，C1-202AREAMETER型葉面積儀測量葉面積，然后置濾紙上，室溫條件下，自然失水7h，每隔半小時稱量一次葉重，記錄葉片失水情況，計算單位葉面積累計失水量。2.2.6.2胞質(zhì)總蛋白含量的測定將洗去根部基質(zhì)的轉(zhuǎn)基因陽性煙草苗和轉(zhuǎn)p2MGK空質(zhì)粒的對照煙株分別放于含有20%PEG6000的MS溶液和含有300mmol/LNaCl的MS溶液中分別進行干旱和高鹽處理，在處理7h和12h后，取第3和4片葉測定胞質(zhì)總蛋白含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量。1.實驗原理考馬斯亮藍G-250測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種，是一種比較好的蛋白質(zhì)定量法。2.蛋白質(zhì)含量標準曲線繪制參照文獻所公開的方法繪制蛋白質(zhì)含量標準曲線(高淑梅.TERF1在轉(zhuǎn)基因水稻中得功能分析[D].2006年)3.樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測定參照文獻所公開的方法測定樣品提取液中蛋白質(zhì)的濃度(高淑梅.TERF1在轉(zhuǎn)基因水稻中得功能分析[D].2006年)。2.2.6.3脯氨酸含量的測定1.實驗原理在酸性條件下，茚三酮和脯氨酸反應生成穩(wěn)定的紅色化合物，此產(chǎn)物在520nm波長下具有最大吸收峰，顏色的深淺即表示脯氨酸含量的高低，酸性氨基酸和中性氨基酸不能與酸性茚三酮反應，堿性氨基酸含量甚微，可以忽略不計。2.脯氨酸含量標準曲線繪制參照文獻所公開的方法繪制脯氨酸含量的標準曲線(高淑梅.TERF1在轉(zhuǎn)基因水稻中得功能分析[D].2006年)。3.樣品中脯氨酸含量的測定參照文獻所公開的方法測定樣品中脯氨酸的含量(高淑梅.TERF1在轉(zhuǎn)基因水稻中得功能分析[D].2006年)。2.2.6.4可溶性糖含量的測定1.實驗原理苯酚法測定可溶性糖原理糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在lO—lOOmg范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比，且在485nra波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定。2.可溶性糖含量的標準曲線繪制參照文獻所公開的方法繪制可溶性糖含量的標準曲線(高淑梅.TERF1在轉(zhuǎn)基因水稻中得功能分析[D].2006年)。3.樣品中可溶性糖含量的測定參照文獻所公開的方法測定樣品中可溶性糖的含量(高淑梅.TERF1在轉(zhuǎn)基因水稻中得功能分析[D].2006年)。3.實驗結(jié)果與分析3.1植物表達載體的構(gòu)建3.1.1高效表達載體p2MGK-PeW朋2a的構(gòu)建3.1.1.1通過PCR擴增，得到帶有2個增強子的CaMV35S啟動子序列，兩端分別帶有HindIII和PstI酶切位點，HindIII和PstI雙酶切此片段與克隆載體PUC19,經(jīng)T4連接酶連接得到載體PUC-35S.3.1.1.2從植物表達載體pTQ4A上PCR擴增得到兩端分別帶有EcoRI和KpnI酶切位點的PolyA、NOS序列，EcoRI和KpnI酶切此片段與載體PUC-35S，經(jīng)T4連接酶連接得到載體PUC-35SN0S。3.1.1.3設(shè)計兩條長鏈引物，兩端分別帶有PstI酶切點，兩條引物退火，得到帶酶切位點粘性末端的Q序列，PstI酶切PUC-35SN0S，經(jīng)T4連接酶與Q連接得到載體PUC-Q35SN0S。3.1.1.4從載體163上PCR擴增得到兩端分別帶有BamHI和KpnI酶切位點的GFP+KDEL序列，BamHI和KpnI酶切此片段與載體PUC-Q35SN0S，經(jīng)T4連接酶連接得到載體PUC-Q35SG腦S。3.1.1.5將連接到克隆載體PMD-19上的PeDREB2a與PUC-Q35SGKN0S分別SalI和XbaI雙酶切，經(jīng)T4連接酶與Q連接得到載體PUC-Q35SN0S-PeDREB2a。3.1.1.6HindIII和EcoRI雙酶切PUC-Q35SN0S-PeDREB2a，回收小片段，連接到HindIII和EcoRI雙酶切后的pCAMBIA2301植物表達載體上得到載體pGK.3.1.1.7從載體PMD-MAR上PCR擴增得到兩端分別帶有EcoRI酶切位點的MAR序列，EcoRI酶切此片段與載體pGK，經(jīng)T4連接酶連接得到載體pMGK。3.1.1.8從載體PMD-MAR上PCR擴增得到兩端分別帶有HindIII酶切位點的MAR序列，HindIII酶切此片段與載體pMGK，經(jīng)T4連接酶連接得到載體p2MGK-PeW^B2a。具構(gòu)建流程見圖8。圖9為p2MGK的圖譜。3.1.2重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定在三個重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化LB(Kan+)平板上，分別挑取兩個白色單菌落，進行菌落PCR鑒定，結(jié)果均為陽性，見圖10。3.1.3重組質(zhì)粒的酶切鑒定將PCR檢測的陽性菌落轉(zhuǎn)入LB(Kan+)液體培養(yǎng)基，37'C搖菌過夜，堿法小量提取重組質(zhì)粒，進行酶切鑒定。p2MGK-Pe5i^S2a重組質(zhì)粒被切出目標帶，酶切結(jié)果正確，見圖ll。3.2含有表達載體的農(nóng)桿菌PCR檢測將重組質(zhì)粒p2MGK-PaWffl2a轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404以轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌的菌液作模板，未轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌作對照，進行菌落PCR鑒定。檢測結(jié)果表明，重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，見圖12。3.3轉(zhuǎn)基因煙草的篩選和檢測3.3.1轉(zhuǎn)基因煙草的DNA水平檢測采用經(jīng)典的農(nóng)桿菌介導法對煙草進行遺傳轉(zhuǎn)化。選擇已經(jīng)生根的Kan抗性苗，剪取其葉片，采用CTAB法提取煙草DNA，以煙草DNA為模板，以構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體時設(shè)計的p35SGKN0S-PeDREB2a(F)和p35SGKN0S-PeDREB2a(R)引物為引物，采用PCR技術(shù)，對Kan抗性苗進行DNA水平的檢測。結(jié)果表明，檢測p2MGK-Pe朋朋2a轉(zhuǎn)化的Kan抗性苗36株，PCR檢測24株為陽性，陽性率67%，證明PeWES2a己經(jīng)整合到煙草基因組中。見圖13。3.3.2轉(zhuǎn)基因煙草的RT-PCR檢測選取DNA水平鑒定的24個陽性煙草株為材料，提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，RT-PCR對陽性苗作進一步的檢測。結(jié)果表明，24株p2MGK-PeZWES2a轉(zhuǎn)化的煙草株中，18株檢測為陽性，陽性率75%，見圖14。3.4轉(zhuǎn)基因煙草對非生物脅迫的耐受分析3.4.1轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性分析以p2MGK空質(zhì)粒的煙草轉(zhuǎn)化苗作對照，將轉(zhuǎn)基因陽性煙草苗與對照小苗帶根取出，將其轉(zhuǎn)移到含有20XPEG的MS培養(yǎng)基中，進行抗旱性分析。處理6天后，可以觀察到對照煙草植株葉片萎蔫較轉(zhuǎn)基因煙草嚴重，轉(zhuǎn)基因煙草葉片的心葉和上數(shù)第二片葉仍然保持一定膨壓，而對照煙草葉片的心葉就已經(jīng)開始萎蔫，葉緣巻曲、葉片下垂等現(xiàn)象，超過95%的對照煙草苗在含PEG的培養(yǎng)基上基本都死亡。將此煙草重新恢復培養(yǎng)20天后，可以看到轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片的恢復程度好于對照(圖15)。3.4.2轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性分析以p2MGK空質(zhì)粒的煙草轉(zhuǎn)化苗作對照，將轉(zhuǎn)基因和對照煙草苗轉(zhuǎn)入含有300mmol/LNaCl的MS培養(yǎng)基中，連續(xù)處理7d后，對照煙草苗葉片發(fā)生明顯萎蔫，且部分發(fā)黃，萎蔫程度較嚴重，轉(zhuǎn)基因植株發(fā)生萎蔫的程度較輕，恢復培養(yǎng)20天后，可以看到轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片的恢復程度明顯好于對照(圖16)，上述試驗結(jié)果表明胡楊PeDREB2A基因在煙草中的過量表達確實能夠提高轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫的抗性。3.4.3轉(zhuǎn)基因煙草的耐低溫分析以p2MGK空質(zhì)粒的煙草轉(zhuǎn)化苗作對照，將對照與轉(zhuǎn)基因植株放在一6'C低溫光照培養(yǎng)箱中，處理8小時，觀察對照與轉(zhuǎn)基因植株的表型，發(fā)現(xiàn)對照植株的葉片凍傷萎蔫，轉(zhuǎn)基因植株也有少數(shù)苗萎蔫但絕大多數(shù)仍然正常，然后放至正常條件下生長，3天后發(fā)生萎蔫的植株均黃化死去。對照與轉(zhuǎn)基因植株凍害處理后的存活率分別為43.3%和83.4%。由此可見，轉(zhuǎn)入Pei)i丑B2a基因使植株的抗寒性得到了一定的提高。3.5轉(zhuǎn)基因煙草在逆境條件下的生理生化指標測定3.5.1轉(zhuǎn)基因煙草葉片保水性分析由圖17可以明顯看出，剪葉7h后，轉(zhuǎn)p2MGK空質(zhì)粒的煙草對照苗葉片失水量大，萎蔫程度嚴重，葉面積明顯縮小，葉片周圍已經(jīng)失水變干，呈無規(guī)則形狀；而轉(zhuǎn)Pe/)i^B2a陽性苗葉片萎蔫較輕，僅葉邊緣巻曲，葉色較亮，葉面積縮小程度沒有對照嚴重，并且具有一定膨壓，保持葉片基本形狀。由圖18可知，對照與轉(zhuǎn)基因陽性植株在剪葉后半小時內(nèi)，葉片失水均較快，失水量大；半小時后，失水速率減慢，但累計失水不斷增加。相比而言，總體上對照明顯比轉(zhuǎn)基因失水快，這也說明Pe/)i^B2a基因提高了煙草的葉片保水性能。通過兩樣本均值差異t測驗，其均值差異顯著性測驗t二4.3998，顯著水平p二0.0064，差異極顯著。3.5.2轉(zhuǎn)基因煙草植株胞質(zhì)總蛋白含量的測定表15轉(zhuǎn)基因植株與對照高鹽脅迫下胞質(zhì)總蛋白含量差異<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表16轉(zhuǎn)基因植株與對照干旱脅迫下胞質(zhì)總蛋白含量差異<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>根據(jù)BSA濃度及其對應的0D595nm值制作標準曲線，所得回歸方程y二0.0715X-0.0412,R2=0.9417,從而計算出樣品胞質(zhì)總蛋白的含量。由圖19和圖20可以看出，鹽處理7h和干旱處理12h后，對照和轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的蛋白質(zhì)含量都有所升高，相比較而言，處理后的蛋白質(zhì)含量均比處理前的要高，由表15看出轉(zhuǎn)基因株系6、7、IO高鹽前后胞質(zhì)總蛋白含量增加百分比分別達到48.13%、40.95%、37.36%。而對照高鹽前后含量增加百分比為19.83%、11.71%。證明轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性高于對照植株。由表16可以得到結(jié)論對照干旱前后對照胞質(zhì)總蛋白含量增加百分比遠不及轉(zhuǎn)基因植株的，相差顯著，證明了轉(zhuǎn)基因植株抗旱性明顯高于對照植株。3.5.3轉(zhuǎn)基因煙草植株脯氨酸含量的測定表17轉(zhuǎn)基因植株與對照高鹽脅迫下脯氨酸含量差異<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表18轉(zhuǎn)基因植株與對照干旱脅迫下脯氨酸含量差異<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>脯氨酸作為一種有效的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在干旱、低溫、高溫、冰凍、鹽漬等非生物逆境脅迫中起著重要的作用。幾乎所要的逆境都會造成植物體內(nèi)脯氨酸的積累，并且積累的指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)。因此，脯氨酸常作為植物抗旱的一項生理指標。根據(jù)脯氨酸濃度測定的0D520nm值制作標準曲線，得到回歸方程Y=0.3167X-0.0595，R2=0.9492，從而計算出樣品中脯氨酸含量。研究結(jié)果見圖20和21和表17、18，由圖21和22直觀看出高鹽和干旱處理前后對照與轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的脯氨酸都提高了，經(jīng)過表17和18的分析，數(shù)據(jù)顯示總體來說，轉(zhuǎn)基因植株的增加百分比均高于對照，從而推出轉(zhuǎn)基因植株的抗旱、耐鹽性明顯高于對照。3.5.4轉(zhuǎn)基因煙草植株可溶性糖含量的測定表19<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>逆境條件下植物體內(nèi)常常積累大量的可溶性糖，它是一類滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物通過滲透調(diào)節(jié)作用可提高其對逆境的抵抗能力。已有研究證明在細胞的幾種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)中，對穩(wěn)定滲透調(diào)節(jié)能力的相對貢獻大小是K+〉可溶性糖〉其它游離氨基酸〉Ca2+〉Mg2+〉脯氨酸。因此，在干旱條件下，細胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物特別是K+和可溶性糖的積累是反映抗旱性強弱的有效指標之一。由柱狀圖(圖23和圖24)看出高鹽和干旱處理后比處理之前植株體內(nèi)的可溶性糖含量都有較明顯的提高，通過計算比較轉(zhuǎn)基因植株與對照在高鹽和干旱脅迫下可溶性糖含量的差異，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株在脅迫處理后可溶性糖增加百分比均明顯高于對照，并且有些轉(zhuǎn)基因株系增加百分比已經(jīng)達到155.68%，由此可以證明轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽、抗旱能力明顯高于對照。植物對滲透脅迫和干旱的抗性一方面表現(xiàn)在逆境下的形態(tài)特征，另一方面，植物生理生化的變化也高度適應逆境抗性。脯氨酸的含量作為植物抗旱指標，成為衡量植物是否抗旱的生化依據(jù)，可溶性糖、胞質(zhì)總蛋白作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在滲透脅迫下的積累，有助于植物細胞降低滲透勢和水勢，減少滲透脅迫對植物的危害，這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量也成為植物抗?jié)B透脅迫的重要指標。通過測定生理生化指標得出，轉(zhuǎn)基因植株的可溶性糖、胞質(zhì)總蛋白和脯氨酸含量高于對照，這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的大量積累有助于減少滲透脅迫和干旱脅迫對植物的傷害，成為轉(zhuǎn)基因植物抗?jié)B透能力和抗旱能力提高的重要生化證據(jù)，也進一步說明過表達PeZ)iES2a基因可能通過調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性和滲透脅迫抗性，以維持植株正常的生理生化功能。DREB轉(zhuǎn)錄因子對一系列抗逆功能基因的轉(zhuǎn)錄以及對脯氨酸和糖含量的促進作用說明DREB因子在植物抗逆反應中起著重要作用。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所深圳市園林科學研究所<120〉胡楊DREB2轉(zhuǎn)錄因子cDNA序列、含有該序列的表達載體、其應用<130〉KLPI0788<歸2<170>Patentlnversion3.1<210〉1<211〉1601<212〉腿<213>Populuseuphratica<400>1ggtttgntttggtccctcaaggttggtttttgtgcaaaaaaacctcttcttttatctgg60gtmttutttttctcctcttcctttcgtttgtaaaactttcgtaattttgccacctct120ttagttttgtttcaagttctaatt犯c3ggaatggcagcagctatcgatatctacaacac180aacagcgccagttttttcagatccttgtagagaagaactcatgaaagcacttgaaccttt240tatgaaaagtgcttcgccacCEiccaa_cctccacttattcttcaccttctccttcaacttc300tcctcctttctcttcttacccttcttgcttttacaacaataactctcccatctcttcata360tcccaacttggaccttagcttttgctctccaacgagcacccagatgttttctaatgggtt420cttggattataaccaaatgggttttgagcaaacaggtccaattgggcttaaccaccttac480accttcacaaatcctccaaatccaagccaaaatccacttccaac幼caacagcagcagca540gaaaatggaaaatcttgctaccacatcacgigtgtgtccataaccg肌aggctagtaacta600cttggctccaaaacctgtccctatgaaacaatctggtgcttctcctcaaaagcc犯ca肌660gctttatagaggagtcaggcagaggcattgggg咖atgggttgctgagattagacttcc720aaagaacagaactagactctggcttggcacttatgacacagctgaagaggcagctttggc780ttatgataatgctgcttataagctgagaggagaatatgctaggctt肪ctttccacatct840tcgccaccagggagctcatgtgtctggtgaatttggtgactacaagcctctccattcctc900tgttgatgcaaagttacaagcaatttgtcaaagcctgggtttgcaaaaacag'ggga腿c960卿ggagcccagttctgttgctaattcaaaaaagaccgcaacEigctcctttgcaagcaaa1020aattgaagatgattgttctatgagaggtgaattgaaaacggagtacgagaattttggagt1080tgaggactataaggtgg柳tcccatcaccatcaccatcaccatcaccagcttcatctga1140cgaatcagtggctggttcttcttcaccagaatctgagatttctttcttggattttcccgg120031ttctttacattgggacgagtttgagaattttggtttggagaagtacccttcagttgagat1260tgactggtcatccatctaggtcttgaattattaccatgtaatcttttgtttttaggttta1320Uttggcgtctttcagtagcttctgcaatgaagtttttggcatttgcagaagtggtgtta1380aggggtcagtcagttttagattctaagttctattaactatgctgtcgatatgtacagtag1440gtcgctctctatctttggtctagctggtactttttttccttgcttgaccatggatgagtt1500tccatgtttggtctgtatttU鄉(xiāng)tcaggtgtaattaagcatcagtcttcgaatatatc1560aatctagtccaacttttctccaa幼aa犯aaa3aaaa肪aa1601<210〉2<211〉375<212〉PRT<213〉Populuseuphratica<400>2MetAlaAlaAlalieAsplieTyrAsnThrThrAlaProValPheSer151015AspProCysArgGluGluLeuMetLysAlaLeuGluProPheMetLys202530SerAlaSerProProProThrSerThrTyrSerSerProSerProSer354045ThrSerProProPheSerSerTyrProSerCysPheTyrAsnAsnAsn505560SerProlieSerSerTyrProAsnLeuAspLeuSerPheCysSerPro65707580ThrSerThrGinMetPheSerAsnGlyPheLeuAspTyrAsnGinMet859095GlyPheGluGinThrGlyProlieGlyLeuAsnHisLeuThrProSer100105110GinlieLeuGinlieGinAlaLyslieHisPheGinGinGinGinGin115120125GinGinLysMetGluAsnLeuAlaThrThrSerGinCysValHisAsn130135140ArgLysAlaSerAsnTyrLeuAlaProLysProValProMetLysGin145150155160SerGlyAlaSerProGinLysProThrLysLeuTyrArgGlyValArg165170175GinArgHisTrpGlyLysTrpValAlaGlulieArgLeuProLysAsn180185190LeuTrpLeuGlyThrTyrAspThrAlaGluGluAlaAla195200205LeuAlaTyrAspAsnAlaAlaTyrLysLeuArgGlyGluTyrAlaArg210215220LeuAsnPheProHisLeuArgHisGinGlyAlaHisValSerGlyGlu225230235240PheGlyAspTyrLysProLeuHisSerSerValAspAlaLysLeuGin245250255AlalieCysGinSerLeuGlyLeuGinLysGinGlyL_ysThrArgGlu260265270ProSerSerValAlaAsnSerLysLysThrAlaThrAlaProLeuGin275280285AlaLyslieGluAspAspCysSerMetArgGlyGluLeuLysThrGlu290295300TyrGluAsnPheGlyValGluAspTyrLysValGlulieProSerPro305310315320SerProSerProSerProAlaSerSerAspGluSerValAlaGlySer325330335SerSerProGluSerGlulieSerPheLeuAspPheProGlySerLeu340345350HisTrpAspGluPheGluAsnPheGlyLeuGluLysTyrProSerVal355360365GlulieAspTrpSerSerlie37037權(quán)利要求1、胡楊(Populuseuphratica)干旱應答元件結(jié)合蛋白，其特征在于其為(a)或(b)所示的氨基酸序列(a)SEQIDNO2所示的氨基酸序列；或(b)將SEQIDNO2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而獲得的仍具有干旱應答元件結(jié)合蛋白功能的氨基酸序列。2、編碼權(quán)利要求l所述胡楊(PopuJuse叩/7ra"ca)干旱應答元件結(jié)合蛋白的cDNA序列。3、按照權(quán)利要求2的cDNA序列，其特征在于所述的cDNA序列為(a)或(b)所示的核苷酸序列(a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或(b)將SEQIDNO:1所示的核苷酸序列一個或多個的堿基進行替換、缺失或/和插入而得到的核苷酸序列，該核苷酸序列所編碼的蛋白仍具有干旱應答元件結(jié)合蛋白的功能。4、植物表達載體p2MGK。5、植物表達載體，其特征在于含有權(quán)利要求2或3的cDNA序列。6、按照權(quán)利要求5的植物表達載體，其特征在于所述的植物表達載體是p2MDK—7、含有權(quán)利要求5或6所述植物表達載體的植物細胞。8、權(quán)利要求l所述的胡楊(Popi;Ji;seu;^ratica)干旱應答元件結(jié)合蛋白在提高植物對環(huán)境脅迫抗性中的應用。9、權(quán)利要求2或3所述的cDNA序列在提高植物對環(huán)境脅迫抗性中的應用，包括將所述的cDNA序列與植物表達載體的表達調(diào)控序列可操作相連接，得到重組植物表達載體；將重組植物表達載體導入到植物細胞，篩選獲得轉(zhuǎn)基因植物。10、權(quán)利要求5或6所述的植物表達載體在提高植物對環(huán)境脅迫抗性中的應用，包括將所述的植物表達載體導入到植物細胞，篩選獲得轉(zhuǎn)基因植物。全文摘要本發(fā)明公開了一類從沙生植物胡楊(Populuseuphratica)中所分離、克隆的與抗逆性緊密相關(guān)的DREB轉(zhuǎn)錄因子cDNA序列(PeDREB2a基因)，本發(fā)明還公開了含有該cDNA序列的高效植物表達載體，以及它們在提高植物抗逆性中的應用。本發(fā)明將PeDREB2a基因構(gòu)建到植物高效表達載體p2MDK-PeDREB2a中，利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化煙草，通過Kan抗性、基因組PCR及RT-PCR篩選鑒定陽性苗，對轉(zhuǎn)基因煙草苗進行干旱、高鹽及低溫等抗逆性分析并且對其相關(guān)生理生化指標進行測定。試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)PeDREB2a基因植株的可溶性糖、胞質(zhì)總蛋白和脯氨酸含量明顯高于對照，說明過表達PeDREB2a基因可顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性和滲透脅迫抗性。文檔編號C12N15/82GK101565460SQ20081009369公開日2009年10月28日申請日期2008年4月21日優(yōu)先權(quán)日2008年4月21日發(fā)明者吳燕民,唐益雄,麗未,哲梁,雷江麗申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所;深圳市園林科學研究所