專利名稱：：戈壁異常球菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種具有輻射耐受性的異常球菌。技術(shù)背景近年來，輻射對(duì)環(huán)境有很大的影響，尤其是核電技術(shù)的發(fā)展，造成了不同程度的核泄漏問題。因此，篩選具有優(yōu)良輻射耐受性的菌株，對(duì)于輻射環(huán)境的修復(fù)有著積極的意義。同時(shí)，通過對(duì)其耐輻射機(jī)理的研究，可以進(jìn)一步加深人們對(duì)于輻射耐受性產(chǎn)生機(jī)理的認(rèn)識(shí)，構(gòu)建新的轉(zhuǎn)基因生物，使其獲得其它優(yōu)良性狀。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有優(yōu)良的輻射耐受性的菌種。本發(fā)明從新疆某地的戈壁表層黃砂土中分離培養(yǎng)獲得了一個(gè)新的異常球菌，屬于一種微生物的新的菌種。該菌命名為戈壁異常球菌，De/wococcwsgo6/ms/sgobi.en，sis.N丄.masc.adj.。該菌種已在國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏日期為2008年1月25日，保藏登記號(hào)為CGMCCNo.2358。所述的戈壁異常球菌的培養(yǎng)條件為(1)培養(yǎng)基采用TGY瓊脂培養(yǎng)基。具體配方為胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖lg/L(2)pH7.0;(3)培養(yǎng)溫度30°C。1.形態(tài)特征在電子顯微鏡下可見，為球狀革蘭氏陽性細(xì)菌，多為二聯(lián)，少量四聯(lián)，偶見單體。2.在各種培養(yǎng)基上的特征在TGY瓊脂培養(yǎng)基上，菌落呈現(xiàn)磚紅色、凸起狀，表面濕潤，邊緣整齊，無胞外分泌物。在LB瓊脂培養(yǎng)基上，不可生長。3.生理生化特征該菌株為嚴(yán)格好氧生長，革蘭氏陽性，接觸酶陽性，氧化酶陰性，脲酶陽性，不產(chǎn)生H》，明膠液化快，能水解淀粉及酪蛋白，能還原硝酸鹽。4.碳源利用能以葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、D-棉籽糖、L-天冬氨酸、L-組氨酸為碳源，但不能以L-樹膠醛糖、麥芽糖、D-海藻糖、D-木糖、L-鼠李糖、L-色氨酸和L-精氨酸等為碳源。5.其它性質(zhì)最適生長溫度30°C。細(xì)胞壁糖分測定含有葡萄糖和少量核糖。細(xì)胞壁脂肪酸含有十二酸、十三酸、十四酸、十五酸、十六酸、十六碳一烯酸、十七酸、十七碳一烯酸、十八酸、油酸、亞油酸和環(huán)氧化亞麻酸，其中以十六酸、十六碳一烯酸、十七酸、十七碳一烯酸和油酸為主。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的戈壁異常球菌的16SrDNA與同屬的其它種的差異顯著(相似度〈95%):與/7ei/7ococciA力o/oA柳e/7W'sKR245的相4以度為93.273%;與Zfei/OCOCC〃5"的相似度為93.182%;與Zfej'/30coccwsofesem'VCD115的相似度為93.182%;與Zfei雄oc譜勝a乂o細(xì)sisKR-39的相似度為93.182%;與Zfe^7歸ccwsz^j'油r雄KR-39的相似度為93.066%;與"ei/ococc^j';7o7c〃sWt/laT的相似度為93.052%;與ZeiyococczAKR125的相似度為92.238%;與"e眾ococc〃sstwore/^isKR136的相似度為91.603%;與"ehococcysy朋/7a/7e/^is7的相似度為91.454%等等。此外，經(jīng)與異常球菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌株——耐輻射異常球菌R1(Z).ra&o血ramRl)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的戈壁異常球菌與該菌株的微生物學(xué)特性有顯著差異(見表1)。表1戈壁異常球菌與耐輻射異常球菌Rl的微生物學(xué)特性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注"+"表示陽性，"-"表示陰性，"W"表示弱陽性，ND表示無相關(guān)數(shù)據(jù)本發(fā)明所述的戈壁異常球菌具有較好的紫外線與伽瑪射線耐受性，與耐輻射異常球菌(nra^血ra似)Rl菌株在同等條件下進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的戈壁異常球菌在同樣紫外線照射量(254nm，567J.n^左右)下，其存活率高于對(duì)照菌株2倍以上(參見圖4);而在10kGy的伽瑪射線劑量照射下，其存活率高于對(duì)照菌株3倍以上(參見圖5)。本發(fā)明所述的戈壁異常球菌，不僅可以直接作為輻射環(huán)境修復(fù)的功能菌株，還可以作為新的轉(zhuǎn)基因生物的基因供體，將其優(yōu)良的輻射耐受性基因轉(zhuǎn)入其它生物體中，使其可以獲得優(yōu)良的抗逆性狀；同時(shí)，它也可能作為新的基因工程菌株，通過接受外來其它優(yōu)良基因從而獲得更多的優(yōu)良性狀；此外，通過傳統(tǒng)的誘變育種手段進(jìn)行性狀的改良，還可以獲得更多性狀的菌株。圖l戈壁異常球菌的菌落形態(tài)；圖2戈壁異常球菌的掃描電鏡圖片；圖3戈壁異常球菌與其它異常球菌屬成員之間的進(jìn)化分析(基于16SrDNA序列分析)；圖4戈壁異常球菌與對(duì)照菌株".ra力'^/wr^^Rl對(duì)紫外線照射的耐受對(duì)比，圖中，藍(lán)色曲線表示戈壁奇異球菌的生存曲線，紅色曲線表示對(duì)照菌株的生存曲線；圖5戈壁異常球菌與對(duì)照菌株".ra&o^/2^/7sRl對(duì)伽瑪射線照射的耐受對(duì)比，圖中，藍(lán)色曲線表示戈壁奇異球菌的生存曲線，紅色曲線表示對(duì)照菌株的生存曲線。具體實(shí)施方式實(shí)施例l戈壁異常球菌的分離培養(yǎng)方法于新疆某地的戈壁上采集黃砂土。取土樣2ci^左右，使用10kGy的伽瑪輻射照射。之后轉(zhuǎn)入20mlTGY培養(yǎng)基中于3(TC、200rpm下富集培養(yǎng)112小時(shí)，將富集培養(yǎng)物各以200yL涂布于TGY瓊脂培養(yǎng)基平板上，翻轉(zhuǎn)平板置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)幾天，即可獲得本發(fā)明所述的戈壁異常球菌。TGY瓊脂培養(yǎng)基葡萄糖，1%。；酵母提取物，5%。；胰蛋白胨，10%。；瓊脂，15%。。培養(yǎng)溫度為30°C。實(shí)施例2戈壁異常球菌的伽瑪射線耐受試驗(yàn)1、試驗(yàn)方法將本發(fā)明所述的戈壁異常球菌菌液通過5000rpm、10min、4。C離心收集菌體；將菌體重懸于等體積0.1M磷酸鉀Buffer(pH7.0)，之后再次使用5000rpm、10min、4'C離心收集菌體，如此洗滌菌體2次；最終將菌體再次重懸于等體積O.IM磷酸鉀Buffer(pH7.0)。將其分裝為4ml菌懸液/15ml離心管，對(duì)于離心管分別以0-15kGy劑量的伽瑪射線照射，稀釋涂布計(jì)數(shù)于TGY瓊脂培養(yǎng)基平板上，至數(shù)目不再變化后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。同時(shí)以耐輻射異常球菌(".ra&o血ram)Rl菌株為對(duì)照。試驗(yàn)菌和對(duì)照菌各進(jìn)行了5組平行試驗(yàn)。2、結(jié)果見表2、表3。本發(fā)明的戈壁異常球菌分別在5、10、15kGy的伽瑪射線劑量照射下，其存活率均高于對(duì)照菌株3倍以上(參見錯(cuò)誤！未找到引用源。)。表2De/"ococc^go6/e"^s伽瑪射線照射的存活情況處理劑量(kGy)051015存活率100.00%85.87%21.63%4.17%存活率的標(biāo)準(zhǔn)差42.46%11.30%1.43%0.40%表3Dd"。cocc附rad/odwra"5Rl伽瑪射線照射的存活情況處理劑量(kGy)051015存活率100.00%25.76%5.93%1.00%存活率的標(biāo)準(zhǔn)差13.41%3.22%0.60%0.12%實(shí)施例3戈壁異常球菌的紫外線耐受試驗(yàn)1、試驗(yàn)方法將本發(fā)明所述的戈壁異常球菌菌液通過5000rpm、10min、4'C離心收集菌體；將菌體重懸于等體積0.1M磷酸鉀Buffer(pH7.0)，之后再次使用5000rpm、10min、4'C離心收集菌體，如此洗滌菌體2次；最終將菌體再次重懸于等體積0.1M磷酸鉀Buffer(pH7.0)。將其置于用鐵絲攪拌的培養(yǎng)皿中，經(jīng)過0648.7J/m—2不同劑量的紫外照射，稀釋涂布計(jì)數(shù)于TGY瓊脂培養(yǎng)基平板上，至數(shù)目不再變化后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。同時(shí)以耐輻射異常球菌(D.ra&odMra"s)Rl菌株為對(duì)照。試驗(yàn)菌和對(duì)照菌各進(jìn)行了4組平行試驗(yàn)。2、結(jié)果見表4、表5。本發(fā)明的戈壁異常球菌在同樣9個(gè)不同劑量紫外線照射量下，存活率均顯著高于對(duì)照菌株(參見錯(cuò)誤！未找到引用源。)。表4De/nococcusgoib/ens/s紫外線照射的存活情況處理劑量(J-m2)081.1162.2243.2324.3405.4486.5567.7648.6100.跳111.108.102.108.112.73.681.7存活率(％)0060499101620780存活率的方差(％)7.336.701.532.493.077.474.607.2811.05表5De/力ococcwsracf/'ocfwransR1紫外線照射的存活情況處理劑量(J.m-2)081.1162.2243.2324.3405.4486.5567.7648.6存活率(%)100.00101.60115.71124.3699.0452.5642.6314.396.28存活率的方差(％)4.815.985.3413.0326.920.432.992.480.17實(shí)施例4戈壁異常球菌菌株16SrDNA的提取方法本發(fā)明還提供了該戈壁異常球菌("""oco"附goZ^m&)的基因組提取、16SrDNA的擴(kuò)增及測序方法，具體按照下述操作進(jìn)行1.基因組提取方法本發(fā)明所述的戈壁異常球菌的基因組使用TIANGEN⑩公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱形)進(jìn)行提取，詳見其說明書。2.PCR擴(kuò)增方法本發(fā)明所述的戈壁異常球菌的16SrDNA的PCR擴(kuò)增所用的通用引物序列的設(shè)計(jì)參照WilliamG.Weisburg(1991)的文章，引物由北京擎科生物技術(shù)公司合成。擴(kuò)增所用的試劑盒購買于寶生物工程(大連)有限公司。正向引物F27(5，-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3，)，反向引物Rl492(5，國TACGGTTACCTTGTTACGACTT國3，)，PCR擴(kuò)增體系為成分加入量ExTaqDNA聚合酶dNTPs5^1F27引物lplR1492引物1^1ExTaqBuffer(10X)模板ddH20定容至50WPCR反應(yīng)程序30個(gè)循環(huán)95°C95°C55°C72°C72°C5min0.5min0.5minlmin5min將擴(kuò)增得到的16SrDNA序列，連接于Galen公司的pSURE-T載體上，委托寶生物工程(大連)有限公司對(duì)于插入序列進(jìn)行測序，在GenBank數(shù)據(jù)庫上的登錄號(hào)是EU427464。權(quán)利要求1.戈壁異常球菌(Deinococcusgobiensis)CGMCC2358。2.權(quán)利要求1所述的戈壁異常球菌，其16SrDNA部分的序列的GenBank登錄號(hào)是EU427464。3.權(quán)利要求1或2所述的戈壁異常球菌作為輻射環(huán)境修復(fù)的功能菌株方面的應(yīng)用。4.權(quán)利要求1或2所述的戈壁異常球菌在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因生物方面的應(yīng)用。5.權(quán)利要求1或2所述的戈壁異常球菌在誘變育種，改良植物性狀方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一種具有優(yōu)良的輻射耐受性的菌種。從戈壁表層黃砂土中分離培養(yǎng)獲得了一個(gè)新的菌種——戈壁異常球菌(Deinococcusgobiensis)。所述戈壁異常球菌可作為輻射環(huán)境修復(fù)的功能菌株，并可構(gòu)建轉(zhuǎn)基因生物，培育耐輻射生物。文檔編號(hào)C12N1/20GK101245330SQ200810057559公開日2008年8月20日申請(qǐng)日期2008年2月3日優(yōu)先權(quán)日2008年2月3日發(fā)明者維張,敏林,袁夢龍,明陳申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所