專利名稱：三疣梭子蟹ptssr36微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于三疣梭子蟹微衛(wèi)星DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，具體說是一種三疣 才炎子蟹ptssr36孩i衛(wèi)星DNA標(biāo)記的4全測:技術(shù)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明做出之前，國內(nèi)外在其他蟹類中有相關(guān)的研究報道，Pamela C. Jensen等在對鄧杰內(nèi)斯蟹((^/7cer鵬^ 'Wer)的研究中，設(shè)計了 99個微衛(wèi)星 引物，并對其中的9個進行了合成。在進一步的研究中，依據(jù)其擴增產(chǎn)物的多 態(tài)性情況、等位基因大小和是否易于計數(shù)等特點選取了 6個引物應(yīng)用于進一步 的研究。利用尼龍膜雜交法，Masatsugu takhano等在鋸緣青蟹(正蟮，it^/s "rra&)中發(fā)現(xiàn)5個具有可變性的微衛(wèi)星位點。David Gopurenko等在鋸緣青 蟹(沙螓，5^///a; "a鵬M ^//7)的研究中篩選到5個《效衛(wèi)星位點。利用常規(guī) 方法，E. S Yap等在遠(yuǎn)海梭子蟹(戶or/^/ ^ /^"g/cM)中篩選到7個含有二 核苷酸重復(fù)單元、1個含有四核苷酸重復(fù)單元的^:衛(wèi)星位點。0. Puebla等在蟲朱 雪蟹(C力y朋oecW" 中篩選出.5個微衛(wèi)星標(biāo)記。H. S. AN等利用PCR
篩選法，在中華絨螯蟹(j5Woc力e/r w'/7e/w/s)基因組富集文庫中篩選出9個 新的微衛(wèi)星位點。B. H紐fling等在中華絨螯蟹中篩選到12個具有高度多態(tài)性 的微衛(wèi)星位點。這些重要經(jīng)濟蟹類的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的開發(fā)，已應(yīng)用于親緣關(guān) 系鑒定、種群多樣性研究中。目前在國內(nèi)，除常玉梅等報道了中華絨螯蟹微衛(wèi)星 DNA的篩選情況外，很少有蟹類微衛(wèi)星方面的研究報道。至今為止，尚未見有 三疣梭子蟹微衛(wèi)星DNA檢測技術(shù)方面的報道。
微衛(wèi)星(microsatel 1 ites) 或稱簡單序歹'J重復(fù)(simple sequence repeats : SSR)是指由1~6個核苷酸組成的簡單串聯(lián)重復(fù)DNA序列。迄今研究過的所有 生物種類中都發(fā)現(xiàn)了它的存在，并且分布密度很大。由于微衛(wèi)星廣泛分布于基因 組中，具有密度大、多態(tài)性豐富、高度雜合且穩(wěn)定性好、遵循孟德爾分離定律 共顯性遺傳、易于PCR擴增等特點，已成為近年來最引人注目的新型DNA標(biāo)記， 并廣泛應(yīng)用于生物資源的家系譜系認(rèn)證、基因連鎖分析、遺傳圖語構(gòu)建、種質(zhì) 鑒定、種群遺傳多樣性等許多研究領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種三疣梭子蟹ptssr36微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測技術(shù)， 主要利用建立的三疣梭子蟹部分基因組文庫中的ptssr36的微衛(wèi)星DNA序列， 使用01 igo (Version 6. 31)和Primer Premier (Version 5.00) 軟件在其核心 序列的兩端設(shè)計相應(yīng)的PCR引物，將引物序列合成后對三疣梭子蟹的個體進行 PCR檢測，從而快速地檢測三疣梭子蟹每個個體在此微衛(wèi)星區(qū)的遺傳變異，獲 得該引物對三疣梭子蟹在ptssr36序列區(qū)的遺傳變異圖譜，通過該圖譜直觀地表現(xiàn)出每個個體的基因型。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的 一種三疣^f炎子蟹ptssr36 ^t衛(wèi) 星DNA標(biāo)記的檢測技術(shù)，其特征在于其技術(shù)操作程序為首先提取三疣梭子蟹 基因組DNA并稀釋備用；再利用三疣梭子蟹基因組文庫中的ptssr36微衛(wèi)星核 心序列，在其序列兩端設(shè)計特異性引物；然后使用該引物對三疣梭子蟹不同地 理群或三疣梭子蟹群內(nèi)個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行變性 聚丙烯酰胺凝膠檢測；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進行分析，確定每個個體的基因型， 從而獲得三疣梭子蟹在ptssr36核心序列區(qū)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜。
提取三疣梭子蟹基因組DNA,將其稀釋為50ng/ jj 1 ，每個PCR反應(yīng)中加入 2jal，反應(yīng)總體積為25jal。
ptssr36微衛(wèi)星核心序列的特異性引物序列分別為正鏈5， -GGTCTATCAAGGCGTTACAGG -3，，負(fù)鏈3， - GTGGAATCAGTGGAGGAGGAAG -5，，使用 該引物時的退火溫度為53°C。
PCR擴增的加樣參數(shù)為每個PCR反應(yīng)總體積為25 |a 1,包括lOOng三疣梭 子蟹基因組飄;10X PCR Buffer, 2.5|al; Mg" 2. Ommol/L; Tag酶lu; dNTP 各O. l腿ol/L ;本發(fā)明的引物各0. 2 jnmol/L;力。ddH20至25 ju 1 。使用該引物 時設(shè)置P C R儀的程序參數(shù)為9 4 °C變性2 m i n; 9 4 °C 4 0 s e c ， 5 3 °C 1 m i n ， 7 2 °C, 1 m i n ， 25個循環(huán)；72。C延伸5min, 4。CM呆存。
PCR產(chǎn)物的檢測將PCR產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠，12W恒功率電 泳1 ~ 1. 5h進行分離。將月交^反通過10%的冰醋酸溶液20min —蒸餾水6min — 0. 1% 的硝酸銀溶液25min — 3°/。的碳酸鈉溶液顯色數(shù)分鐘，終止反應(yīng)即可得到三疣梭 子蟹在ptssr36基因座位高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜。
應(yīng)用該引物和所述的技術(shù)方法，可以檢測三疣梭子蟹的每個個體在ptssr 36 微衛(wèi)星核心區(qū)的遺傳變異，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜即可讀出基因型，方 便、快捷、準(zhǔn)確。其次，相對于其它分子遺傳標(biāo)記技術(shù)而言微衛(wèi)星標(biāo)記符合孟 德爾遺傳模式，呈共顯性遺傳，因此，可以區(qū)分個體是純合子和雜合子狀態(tài)。
本發(fā)明適用于三疣梭子蟹群體遺傳標(biāo)記、系譜認(rèn)證、遺傳圖譜構(gòu)建等應(yīng)用。 ptssr36的PCR引物是本發(fā)明的核心，可在三疣梭子蟹總?cè)簷z測中呈現(xiàn)高度遺 傳變異的多態(tài)性。
本發(fā)明技術(shù)具有以下優(yōu)點
(1)本發(fā)明可快捷的獲得三疣梭子蟹的ptssr36遺傳標(biāo)記基因座位呈現(xiàn) 高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜，方法簡便，所得結(jié)果可直觀地檢測出三疣梭子蟹 在此位點的每個個體的基因型；
(2 )本發(fā)明主要應(yīng)用于三疣4炎子蟹群體間遺傳標(biāo)記、系i普認(rèn)證和遺傳圖語 的構(gòu)建等。


圖1本發(fā)明的ptssr36引物對三疣4炎子蟹20個個體的一全測圖譜，編號1-20是三疣梭子蟹的20個個體，M是DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量。
具體實施例方式
下面通過實施例詳細(xì)敘述本發(fā)明在三疣沖炎子蟹ptssr36 -微衛(wèi)星核心序列 DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)方法。首先提取三疣梭子蟹基因組DNA并稀釋備用；再 利用三疣梭子蟹基因組文庫中的含有ptssr36^f效衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端 設(shè)計特異性引物；然后使用該引物對三疣梭子蟹不同地理群或三疣梭子蟹群內(nèi) 個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳;險測； 利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進行分析，確定每個個體的基因型，并獲得三疣梭子蟹在 ptssr36核心序列區(qū)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜。
1、 三疣梭子蟹基因組DNA的提取取肌肉組織100mg,剪碎后放入1. 5ml 離心管中，加入pH8. 0的TE溶液(1O腿ol/L Tris-CI, 1O醒ol/L EDTA ) 500 ju 1,用研磨棒研磨。加入10 % SDS溶液25 ia 1 ，混勻。加入20mg/ml蛋白酶K 4pl，混勻，55。C消化2. 5 ~ 3h。重蒸酴抽提兩次，每次10min， 12000轉(zhuǎn)/min 離心5min，取上清；酚氯仿(l: l)抽提一次，10min， 12000轉(zhuǎn)/min離心 5min，取上清；氯仿抽提一次5min， 5000g離心5min,取上清。力口入1/25體 積的5mol/L NaCl溶液，混勻后再加入兩倍體積的-20°C的無水乙醇沉淀DNA 15min;挑出的DNA，用70%的乙醇洗滌數(shù)十分鐘，使DNA干燥，用滅菌水500 Hi 1充分溶解后，定量將其稀釋成50ng/ p 1的濃度備用。
2、 微衛(wèi)星引物的設(shè)計在三疣梭子蟹基因組文庫基礎(chǔ)上，利用微衛(wèi)星DNA 兩側(cè)的序列在同一物種相對于核心序列的高度保守性，在ptssr36核心序列的 兩端設(shè)計特異性引物，用其擴增出該位點的微衛(wèi)星DNA片段。由于微衛(wèi)星核心 序列突變率相對較高，造成微衛(wèi)星DNA核心序列重復(fù)次數(shù)的增加或減少，即微 衛(wèi)星DNA序列長度的變化，這是檢測微衛(wèi)星多態(tài)性的主要依據(jù)。本發(fā)明的 ptssr36微衛(wèi)星核心序列區(qū)域兩端的特異性引物序列為正鏈5，-GGTCTATCAAGGCGTTACAGG —3'，負(fù)鏈3， - GTGGAATCAGTGGAGGAGGAAG -5，，使用 該引物時，其退火溫度是53X:。
3、 PCR擴增
首先加樣，加樣量如下三疣梭子蟹基因組DNA (50ng/jul), 2yl; 10X PCR Buffer, 2. 5 n 1; Mg" (25腿ol/l), 2pl; Tag酶 (5u/jj 1 )， 0. 2/a 1; dNTP (各2. 5mmol/L)， 2 |u 1 ;本發(fā)明的引物(各10Pmo1/ja 1) , 2 加滅菌 水至25pl。其次，進行PCR反應(yīng)，其PCR擴增〗義程序參數(shù)為94。C變性2min; 94°C40 see, 53°C1 min, 72。Clmin， 25個循環(huán)；72。C延伸5 min， 4。C保存。
4、 PCR產(chǎn)物的檢測PCR反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物在8°/。的變性聚丙烯酰氨的凝 膠中進行電泳，電泳4義的功率為12瓦，電泳的時間在1 ~ 1. 5h左右，即可終止。 將膠板通過10%的冰醋酸溶液20min—蒸餾7jC 6min—(). 1%的硝酸銀溶液25min —3°/。的碳酸鈉溶液顯色數(shù)分鐘，終止反應(yīng)即得到如圖l所示的多態(tài)性圖譜。
權(quán)利要求
1、一種三疣梭子蟹ptssr36微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測技術(shù)，其特征在于其技術(shù)操作程序為首先提取三疣梭子蟹基因組DNA并稀釋備用；再利用三疣梭子蟹基因組文庫中的ptssr36微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計特異性引物；然后使用該引物對三疣梭子蟹不同地理群或三疣梭子蟹群內(nèi)個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行變性聚丙烯酰胺凝膠檢測；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進行分析，確定每個個體的基因型，從而獲得三疣梭子蟹在ptssr36核心序列區(qū)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜。
2、 按照權(quán)利要求1所述的三疣梭子蟹ptssr36微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測技術(shù)， 其特征在于提取三疣梭子蟹基因組DNA,將其稀釋為50ng/ n 1 ,每個PCR反應(yīng) 中加入2 ju 1，反應(yīng)總體積為25 ia 1。
3、 按照權(quán)利要求1所述的三疣梭子蟹ptssr36微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測技術(shù)， 其特征在于其ptssr36微衛(wèi)星核心序列的特異性引物序列分別為正鏈5，-GGTCTATCAAGGCGTTACAGG —3，，負(fù)鏈3， - GTGGAATCAGTGGAGGAGGAAG —5，，使用 該引物時的退火溫度為53°C。
4、 按照權(quán)利要求1所述的三疣梭子蟹ptssr36微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測技術(shù)， 其特征在于其PCR擴增的加樣參數(shù)為每個PCR反應(yīng)總體積為25 ji 1, 包括 100ng三疾梭子蟹基因組DNA; 10X PCR Buffer, 2. 5 ju 1; Mg++ 2. Ommol/L; Tag酶lu; dNTP各0. lmmol/L ;本技術(shù)的引物各0. 2 n mol/L;加ddH20至25 Ml;使用該引物時設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為94。C變性2min; 94°C40 sec, 53°C1 min， 72°C, lmin, 25個循環(huán)；72。C延伸5 min, 4。C保存。
5、 按照權(quán)利要求1所述的三疣梭子蟹ptssr36微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測技術(shù)， 其特征在于對PCR產(chǎn)物的檢測將PCR產(chǎn)物在6°/。的變性聚丙烯酰胺凝膠，12W 恒功率電泳1 ~ 1. 5h進4亍分離；將膠+反通過10%的冰醋酸溶液20min—蒸餾水 6min — 0. 1°/。的硝酸銀溶液25min — 3%的碳酸鈉溶液顯色數(shù)分鐘，終止反應(yīng)即可 得到三疣梭子蟹在p'tssr36基因座位高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜。
全文摘要
一種三疣梭子蟹ptssr36微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測技術(shù)，其特點是首先提取三疣梭子蟹基因組DNA并稀釋備用；再利用三疣梭子蟹基因組文庫中的ptssr36微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計特異性引物；然后使用該引物對三疣梭子蟹不同地理群或三疣梭子蟹群內(nèi)個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行變性聚丙烯酰胺凝膠檢測；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進行分析，確定每個個體的基因型，從而獲得三疣梭子蟹在ptssr36核心序列區(qū)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜?？煽旖莸墨@得三疣梭子蟹的ptssr36遺傳標(biāo)記基因座位呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜，方法簡便，所得結(jié)果可直觀地檢測出三疣梭子蟹在此位點的每個個體的基因型。主要應(yīng)用于三疣梭子蟹群體間遺傳標(biāo)記、系譜認(rèn)證和遺傳圖譜的構(gòu)建等。
文檔編號C12Q1/68GK101294218SQ200810017119
公開日2008年10月29日 申請日期2008年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月20日
發(fā)明者萍 劉, 宋來鵬, 健 李, 高保全 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所