專利名稱：快速高通量篩選多環(huán)芳烴降解菌的改進(jìn)固體雙層平板法的制作方法
快速高通量篩選多環(huán)芳烴降解菌的M固體雙層平板法 駄領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種快速高通量篩選多環(huán)芳烴降解菌的改進(jìn)固體雙層平板法，采用6M的固體雙層平板法從土壤樣品中快速、高通量篩選多環(huán)芳烴降解菌，屬于 污染土壤生物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，適用于從環(huán)境樣品中挖掘多環(huán)芳烴污染土壤生物修 復(fù)微生物資源。 背景獄多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbon, PAHs)是倍受關(guān)注的一大類環(huán) 境污染物，分布十分廣泛，在空氣、土壤、地表水和地下水中均能檢出PAHs組 分。由于其生物可禾擁度差、半衰期較長，并且具有潛在的致畸、致癌和致突變 效應(yīng)，因lt樹人類健康產(chǎn)生了巨大劇辦。菲、芘、熒蒽、苯并芘等16種多環(huán)芳烴 化合物已被美國環(huán)保局(EPA)列入優(yōu)先控制污染物黑名單。原油開采和冶煉過 程中的工業(yè)污水排放和溢油泄漏事故是導(dǎo)致土壤PAHs污染的主要原因，我國石 油工業(yè)發(fā)展迅速，但也隨之帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，有近千萬畝的耕地受到不 同禾號(hào)的石油烴污染。因此，對PAHs污染土壤進(jìn)行修復(fù)、恢復(fù)其生態(tài)功能以保 障農(nóng)產(chǎn)品安全是一項(xiàng)十分迫切的任務(wù)。PAHs污染微生物降解技術(shù)是一種新型原位生物修復(fù)技術(shù)。它利用微生物種 類繁多、代謝類型極為豐富等生物多樣性原理與特點(diǎn)，M從土著微生物群落中 篩選高效PAHs降解菌株并回接原位污染土壤，達(dá)到清除土壤PAHs污染的目的。 采用生物修復(fù)法降解PAHs污染物操作簡單，可以克服物理、化學(xué)處理修^(隹度 大、成本高，還會(huì)有二次污染的缺陷，應(yīng)用前景廣闊。其中，高效PAHs降解菌 的篩選皿行有效生物修復(fù)的技術(shù)關(guān)鍵。傳統(tǒng)PAHs降解功能菌株的篩選一iK取"富集培養(yǎng)一隨機(jī)挑取菌株一液體 搖瓶魁正降解率"的技術(shù)路線，這種方法往往帶有一定的盲目性和隨機(jī)性，工作 量大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，皿用高效液相色譜(HPLC)測定成*^高。開發(fā)一種快速、 便捷、高通量的篩選方法從環(huán)境樣品中分離PAHs降解功能微生物資源對于環(huán)境微生物學(xué)者是一種迫切需求，類似的研究方法也能為其他功能微生物資源的開發(fā) 提供借鑒。此前，也有學(xué)者提出采用"單層平板法"初步篩選PAHS降解菌。"單層平板分離法"為在固體無機(jī)培養(yǎng)基上涂一層PAHs的丙酮或乙醇溶液，待有機(jī)溶劑充 分揮發(fā)后，接種土壤樣品懸液，使之均勻分布在PAHs表層；l-3星期后，在離 的旁邊可形成一個(gè)降解圈的則為PAHs降解菌。但在劍門的實(shí)踐操作中發(fā)現(xiàn)，采 用涂布法制備以PAHs為唯一碳源單層固體平板不可行，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑揮發(fā)比較 快，未等涂布均勻便析出PAHs晶體，因此不能制備均勻的PAHs固體平板；采 用噴霧法制備單層固體平板較涂布法效果稍好，PAHs晶體分布比較均勻，但形 成的降解圈邊緣不整齊，不容易辨認(rèn)，且噴霧過程需在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，t歡隹控制 無菌緣 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種從土壤樣品中快速高通量篩選多環(huán)芳烴高效降解菌 的固體"雙層平板分離法"。針對傳統(tǒng)隨機(jī)篩選方法的盲目性和費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)， 在單層平板法改進(jìn)的基礎(chǔ)上開發(fā)一種快速、便捷的篩選方法從環(huán)境樣品中分離 PAHs降解功能微生物。克服了單層平板法的許多不足，采用雙層平板法能夠使 PAHs晶體均勻分布于上層培養(yǎng)基形成的菌斑邊緣清晰，易于辨認(rèn)，且可在超 凈臺(tái)中操作，容易控制無菌^#。從而，滿足在實(shí)驗(yàn)室決速高通量初步篩選多環(huán) 芳烴高效降解功能菌株的要求。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供一種快速高通量篩選多環(huán)芳烴降解菌的固體雙層平板法，主要特 征為下層培養(yǎng)基為普通無機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基添加多種維生素和微量元素，從而能 夠盡可能滿足各種微生物的營養(yǎng)需求；上層培養(yǎng)基為以多環(huán)芳烴(PAHs)為唯一 碳源的無機(jī)鹽低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)基，選擇低烙點(diǎn)瓊脂糖代#^通瓊脂制作上層培 養(yǎng)基， 一方面可防止加入PAHs時(shí)由于高溫導(dǎo)致的降解或者揮發(fā)；另一方面可使 降解暗圈更清晰易辨。^fOT上述"固體雙層平板法"從土壤樣品中快速高通量篩選PAHs高效卩賴牟 菌的主要技術(shù)路線為土壤樣品采集—多環(huán)芳烴耐受菌群的富集培養(yǎng)和菌株分離 4應(yīng)用雙層平板法初步篩選多環(huán)芳烴降解菌—HPLC法測定初篩菌株P(guān)AHs降解 率復(fù)篩—確認(rèn)高效菌株。詳細(xì)實(shí)施步驟為1) 土壤樣品采集和處理采集表層土壤樣品(0-20cm)，過1腿篩，4。C冰 箱保存；2) 多環(huán)芳烴耐受菌群的富集培養(yǎng)采用逐步提高底物濃度的方法對多環(huán)芳 烴耐受菌群進(jìn)行富集培養(yǎng)。稱取供試土壤樣品5g (干重)，接入45ml以某PAHs 組分為唯一碳源的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，PAHs的初始濃度為50mgi;1，置于30 'C恒溫?fù)u床上180rpm富集培養(yǎng)。富集培養(yǎng)一定時(shí)間后(7~10天)，移取第一次富 集培養(yǎng)液按10%的體積比例接入45 ml新鮮的以PAHs為唯一碳源的液體無機(jī)鹽 培養(yǎng)基中，進(jìn)行第二次富集培養(yǎng)，共重復(fù)4次，每轉(zhuǎn)接1次，PAHs的濃度提高 50 mg L" ， PAHs的濃度逐步提高至200 mg U1 。3) 多環(huán)芳烴耐受菌群的分離將2)中的富集培養(yǎng) 用無菌生理鹽水(重 量濃度0.85%NaCl溶液)在無菌條件下進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，取O.lml、稀釋 度為10:10—7的富集培養(yǎng)液涂布LB固體培養(yǎng)基，置于3(TC恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 48 h。挑取具有不同M形態(tài)的單K^若干株，重新點(diǎn)種于LB固體培養(yǎng)基上， 并對離進(jìn)行順序編號(hào)。置于3(TC恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h。4) 多環(huán)芳烴固體雙層平板制備在無菌的平皿中先傾入20ml下層培養(yǎng)基， 既固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基添加0.1ml/L維生素母液。待下層培養(yǎng)基凝固后，再加入IO ml上層培養(yǎng)基，既以PAHs為唯一碳源的固體無機(jī)鹽低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)基。上層 培養(yǎng)基配制方法量取重量濃度1% PAHs無菌乙醇溶液100^1，加入10ml冷卻 至35T:的無機(jī)鹽低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)基中，使PAHs終濃度為100mglA5) 應(yīng)用雙層平板法高通量篩選多環(huán)芳烴降解菌用滅菌牙簽將3)中培養(yǎng)好 的離點(diǎn)種于4)中帝ij備的多環(huán)芳烴固體雙層平fch， 3(TC恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 2~4周(培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)不同PAHs而不同)。在紫外燈下觀察， 周圍出現(xiàn)降解 暗圈則表明底物被降解，該菌株可確認(rèn)為多環(huán)芳烴降解菌。6) 根據(jù)降解率進(jìn)行復(fù)篩選取5)中降解暗圈較大的部分菌株，接種于LB 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD6oH).6^.8，按10%接種量接入以PAHs為唯一碳源的液 體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，置于30。C恒溫?fù)u床上180rpm培養(yǎng)5-10天(培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)不 同PAHs組分而定)。提取培養(yǎng)基中剩余PAHs組分，采用HPLC方法測定，與對 照比較，計(jì)算降解率。本發(fā)明中，液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基配方為:K2HP04 2g、 KH2PO40.5g、 NaC10.5g、 NH4Cl 0.5g、 MgS04 0.2g、 CaCl2 10mg、微量元素溶液lml，用蒸餾7乂定容至1000ml;其中，微量元素溶液配方為FeS02 7H20 2g、 MnS04 H20 2g、 Na2MoS04 '2H20 0.5g、 H3B04 0.2g、 CuS04 '5恥0.4g、 ZnS04 0.5g、 NHtVOs 0.2g、 CoCl2 6H2O0.5g、 MC12 6H2O0.2g，用蒸餾水定容至lOOOml。本發(fā)明中，以PAHs為唯一碳源的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基配制方法取丙酮配制 的PAHs母液，濃度為5g/L， 0.22,濾膜除菌，量取50~200 (ol PAHs丙酮母液， 加入已滅菌的250ml三角瓶中，待丙酮揮發(fā)完畢，加入50ml滅菌的液體無機(jī)鹽 培養(yǎng)基，使PAHs的終濃度為50-200 mg U1 。本發(fā)明中，固體無機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基配方為液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基，加入2%重 量的普通瓊脂粉。本發(fā)明中，固體無機(jī)鹽低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)基配方為液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基，加 入1%重量的低熔點(diǎn)瓊脂糖(熔點(diǎn)為3(TC)。本發(fā)明中，維生素母液配方為硫胺素10mg、核黃素5mg、維生素B6 5mg、 泛酸轉(zhuǎn)20mg、對-氨基苯甲酸5mg、煙堿5mg、肌醇100mg，用無菌水定容至 1000ml，用0.4pm濾膜過濾除菌。本發(fā)明中，LB固體培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g， NaC110g， 瓊脂粉20g，用蒸餾水定容至1000ml， pH7.2~7.4。本發(fā)明中，多環(huán)芳烴為菲、芘或熒蒽等。本發(fā)明的有益效果如下-1、 本發(fā)明掛共了一種 的"固體雙層平板法"，操作簡便,，育g夠高通 量從土壤樣品中分離具有,PAHs功能的菌株，大大提高了初篩效率。本發(fā)明 針對傳統(tǒng)降解菌株篩選的盲目性、隨機(jī)性且工作量大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，開發(fā)研 制出一種艦的固體雙層平板法，為在實(shí)驗(yàn)室中高通量篩選多環(huán)芳烴降解菌，挖 掘新的生物修復(fù)微生物資源提供了一種快速便捷的手段。2、 本發(fā)明所采用的固體雙層平板法，下層培養(yǎng)基為普通無機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基添 加多種維生素和微量元素；上層培養(yǎng)基為以多環(huán)芳烴(PAHs)為唯一碳源的無機(jī) 鹽低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)基，選擇低熔點(diǎn)瓊脂糖代替普通瓊脂制作上層培養(yǎng)基， 一方 面可防止加入PAHs時(shí)由于高溫導(dǎo)致的降解或者揮發(fā)；另一方面可使降解暗圈更 清晰易辨。3、 與"單層平板法"相比，采用"雙層平板法"能夠使PAHs晶體均勻分布 于上層培養(yǎng)基，形成的菌斑邊緣清晰，易于辨認(rèn)。下層培養(yǎng)基添加多種維生素和微量元素，倉詢多盡可能滿足各種微生物對維生素和微量元素的需求，從而做到盡量不漏篩；制備上層培養(yǎng)基時(shí)，選用低熔點(diǎn)瓊脂糖代替普通瓊脂，使PAHs可以 在培養(yǎng)基、鵬降至較低時(shí)加入，可避免高溫加入時(shí)弓l起的揮發(fā)，從而降低對實(shí)驗(yàn) 操作人員的身體危害。4、實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)表明，采用本發(fā)明提供的"固體雙層平板法"，能夠快速大量 的從石油污染土壤中分離降解菲、芘和熒蒽的菌株，從而進(jìn)一步采用液體搖瓶方 法復(fù)篩。


圖1為菲,軍菌在雙層平板上形成的暗圈。 圖2為芘P絲軍菌在雙層平板上形成的暗圈。 圖3為熒蒽降解菌在雙層平板上形成的暗圈。實(shí)施例i采激撫灌區(qū)石油污水灌溉50姊的稻田表層(0-20cm) 土壤，過l纖篩， 4。C7水箱《呆存。稱取供試土壤樣品5g (干重)，接入45ml以PAHs為唯一碳源的 液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中(PAHs的初始濃度為50mgU1)，可以選擇加入玻璃珠，置 于3(TC恒溫?fù)u床上180rpm富集培養(yǎng)。富集培養(yǎng)一定時(shí)間后(7~10天)，移取第 一次富集培養(yǎng)液按10%的體積比例接入45 ml新鮮的以PAHs為唯一碳源的液體 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，進(jìn)行第二次富集培養(yǎng)，共重復(fù)4次，每轉(zhuǎn)接1次，PAHs的濃 度提高50mgi;1， PAHs的濃度逐步提高至200mglA將上述富集培養(yǎng)液無菌生 理鹽7K (重量濃度0.85%NaCl溶液)在無菌^j牛下進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，取 O.lml、稀釋度為10'5 10-7的富集培養(yǎng)液涂布LB固體培養(yǎng)基，置于30。C恒溫培養(yǎng) 箱中，培養(yǎng)48h。挑取具有不同m形態(tài)的單^S"軒株，重新點(diǎn)種于LB固 體培養(yǎng)基上，并對離進(jìn)行順序編號(hào)。置于30。C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h。取丙酮配制的PAHs母液，濃度為5g/L， 0.22pm濾膜除菌，量取50 200^1 PAHs丙酮溶液，加入已滅菌的250 ml三角瓶中，待丙酮揮發(fā)完取加入50 ml 滅菌的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基，使PAHs的終濃度為50 200mgi;1。其中液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基配方為:K2HP04 2g、 KH2P04 0.5g、 NaCl 0.5g、 NH4Cl 0.5g、 MgS04 0.2g、 CaCl210mg、微量元素溶液lml，用蒸餾水定容至1000ml。其中， 微量元素溶^夜配方為FeS02 '7H202g、 MnS04 'H202g、 Na2MoS04 '2H2O0.5g、H3BO40.2g、 CuS04 5H20 0.4g、 ZnSO40.5g、 NH4VO30.2g、 CoCl2 6H20 0.5g、 NiCl2*6H2O0.2g，用蒸餾水定容至lOOOml。LB固體培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g， NaCl 10g，瓊脂粉20g， 用蒸餾水定容至lOOOml， pH7.2~7.4。實(shí)施例2用滅菌牙簽將實(shí)施例1中培養(yǎng)好的菌株點(diǎn)種于多環(huán)芳烴固體雙層平板上，置 于3(TC恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24周(培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)不同PAHs而不同)。在紫外 燈下觀察，菌落周圍出現(xiàn)降解暗圈則表明底物被降解，該菌株可確認(rèn)為備選的 PAHs降解菌。多環(huán)芳烴固體雙層平板帝恪方法在無菌的平皿中先傾入20 ml 下層培養(yǎng)基，既固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基添加0.1ml/L維生素母液。待下層培養(yǎng)基凝固 后，再加入10 ml上層i咅養(yǎng)基，既以PAHs為唯一碳源的固體無機(jī)鹽低熔點(diǎn)瓊脂 糖培養(yǎng)基。上層培養(yǎng)基配制方法上層培養(yǎng)基配制方法量取重量濃度"/。PAHs 無菌乙醇溶液1(%1，加入10ml冷卻至35。C的無機(jī)鹽低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)基中，使 PAHs終濃度為100 mg L—1 。其中固體無機(jī)鹽瓊月針咅養(yǎng)基配方為液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基(同上)，加入2%重量的 劍謝。固體無機(jī)鹽低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)基配方為液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基(同上)，加入 1%重量的低熔點(diǎn)瓊脂糖。維生素母液配方為硫胺素10mg、核黃素5mg、維生素B6 5mg、泛酸f丐 20mg、對-氨基苯甲酸5mg、煙堿5mg、肌醇100mg，用無菌水定容至1000ml， 用0.4,濾膜過濾除菌。實(shí)施例3選取中實(shí)施例2中降解暗圈較大的初篩菌株，接種于LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng) 至OD6oo=0.6~0.8，按10%接種量接入以PAHs為唯一碳源的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基(同 上)中，置于3(TC恒溫?fù)u床上180rpm培養(yǎng)5-10天(培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)不同PAHs組 分而定)。提取培養(yǎng)基中乘l涂PAHs組分，采用HPLC方法測定，與對照比較，-計(jì)LB液體培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g， NaCl 10g，用蒸餾水 定容至畫ml， pH7.2~7.4。應(yīng)用例1采敏撫灌區(qū)石油污水灌溉50余年的稻田表層(0-20cm) 土壤作為供試土 壤，采用艦的"固體雙層平板法"，以三環(huán)PAHs菲為模式化合物，從該土壤樣 品中篩選菲P絲軍菌。富集培養(yǎng)菲的濃度從50mgL—1，逐漸提高至200mgL'1，每 輪富集i歸時(shí)間為7天；雙層平fei:層培養(yǎng)基菲的終濃度為100 mg L"，點(diǎn)種雙 層平板后培養(yǎng)時(shí)間為2周，共有7株菌在菲雙層平板上出現(xiàn)降解暗圈(見圖l); 選取其中3株降解暗圈較大的菌株經(jīng)液體搖瓶實(shí)驗(yàn)測定菲降解率，底物濃度為200 mgL'1，培養(yǎng)時(shí)間為5天，降解率分別為87%， 95%和92°/。。應(yīng)用例2采M:撫灌區(qū)石油污7jC灌溉50 ^的稻田表層(0-20cm) 土壤作為供試土 壤，采用改進(jìn)的"固體雙層平板法"，以四環(huán)PAHs芘為模式化合物，從該土壤樣 品中篩選芘降解菌。富集培養(yǎng)芘的濃度從50mgi;1，逐漸提高至200mgL'1，每 輪富集培養(yǎng)時(shí)間為10天；雙層平板上層培養(yǎng)基芘的終濃度為100mgL'1，點(diǎn)種雙 層平板后培養(yǎng)時(shí)間為4周，共有8株菌在芘雙層平板上出現(xiàn)降解暗圈(見圖2); 選取其中5株降解暗圈較大的菌株經(jīng)液體搖瓶實(shí)驗(yàn)測定芘降解率，底物濃度為100 mgU1，培養(yǎng)時(shí)間為10天，降解率分別為54%， 52%， 68%， 73%和61%。應(yīng)用例3采^t撫灌區(qū)石油污水灌'溉50余年的稻田表層(0^0cm) 土壤作為供試土 壤，采用M的"固體雙層平板法"，以四環(huán)PAHs熒蒽為模式化合物，從該土壤 樣品中篩選熒蒽,菌。富集培養(yǎng)熒蒽的濃度從S0mg1/1，逐漸提高至200 mg L—、每輪富集培養(yǎng)時(shí)間為10天;雙層平板上層培養(yǎng)基熒蒽的終濃度為100mgL—、 點(diǎn)種雙層平板后培養(yǎng)時(shí)間為4周，僅有1株菌在熒蒽雙層平板上出現(xiàn)降解暗斷見 圖3);該菌株經(jīng)液體搖瓶實(shí)驗(yàn)測定熒蒽降解率，底物濃度為講mgL—1，培養(yǎng)時(shí) 間為7天，降解率分別88%。
權(quán)利要求
1、一種快速高通量篩選多環(huán)芳烴降解菌的改進(jìn)固體雙層平板法，其特征在于，下層培養(yǎng)基采用普通無機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基添加多種維生素和微量元素；上層培養(yǎng)基為以多環(huán)芳烴為唯一碳源的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基，但選擇低熔點(diǎn)瓊脂糖代替普通瓊脂；具體步驟如下1)土壤樣品采集和處理采集表層土壤樣品，過1mm篩，4℃冰箱保存；2)多環(huán)芳烴耐受菌群的富集培養(yǎng)采用逐步提高底物濃度的方法對多環(huán)芳烴耐受菌群進(jìn)行富集培養(yǎng)；3)多環(huán)芳烴耐受菌群的分離將2)中的富集培養(yǎng)液采用無菌生理鹽水在無菌條件下進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，取0.1ml、稀釋度為10-5～10-7的富集培養(yǎng)液涂布LB固體培養(yǎng)基，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h；挑取具有不同菌落形態(tài)的單菌落各若干株，重新點(diǎn)種于LB固體培養(yǎng)基，并對菌落進(jìn)行順序編號(hào)，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h；4)多環(huán)芳烴固體雙層平板制備在無菌的平皿中先傾入20ml下層培養(yǎng)基，既固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基添加0.1ml/L維生素母液；待下層培養(yǎng)基凝固后，再加入10ml上層培養(yǎng)基，既以PAHs為唯一碳源的固體無機(jī)鹽低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)基；上層培養(yǎng)基配制方法量取重量濃度1％PAHs無菌乙醇溶液100μl，加入10ml冷卻至35℃的無機(jī)鹽低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)基中，使PAHs終濃度為100mgL-1；5)應(yīng)用雙層平板法高通量篩選多環(huán)芳烴降解菌用滅菌牙簽將3)中培養(yǎng)好的菌落點(diǎn)種于4)中制備的多環(huán)芳烴固體雙層平板上，30℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2～4周；在紫外燈下觀察，菌落周圍出現(xiàn)降解暗圈則表明底物被降解，該菌株可確認(rèn)為多環(huán)芳烴降解菌。
2、 按照權(quán)利要求l戶脫的固體雙層平板法，其特征在于，所述步驟l)中， 表層土壤樣品在距地面0-20cm艦取。
3、 按照權(quán)利要求1所述的固體雙層平板法，其特征在于，戶，步驟2)中， 逐步提高底物濃度的方法是稱取供試土壤樣品5g，接入45ml以某PAHs組分為唯一碳源的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，第一輪富集培養(yǎng)PAHs濃度為50mgi;1，置 于3(TC恒溫?fù)u床上180rpm富集培養(yǎng)，富集培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)不同PAHs組分而定， 為7~10天，富集培養(yǎng)后，移取第一次富集培養(yǎng)液按10%的體積比例接入45 ml 以PAHs為唯一碳源的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，進(jìn)行第二次富集培養(yǎng)，共重復(fù)4次， 每轉(zhuǎn)接1次，PAHs的濃度提高50 mg L—1 ，即最后一次PAHs的濃度提高至200 mg L"。
4、 按照權(quán)利要求3戶腿的固體雙層平板法，其特征在于，以PAHs為唯一 碳源的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基配制方法取5g/L丙酮配制的PAHs母液，0.22pm濾 膜除菌，量取50 ~200|il PAHs丙酮母液，加入已滅菌的250 ml三角瓶中，待丙 酮揮發(fā)完畢，加入50ml滅菌的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基，使PAHs的終濃度為5(K200 mgiA
5、 按照權(quán)利要求1所述的固體雙層平板法，其特征在于，戶艦步驟3)中， LB固體培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g， NaC110g，瓊脂粉20g，用 蒸餾水定容至謂Oml， pH7.2~7.4。
6、 按照權(quán)禾腰求1戶脫的固體雙層平板法，其特征在于，戶腿步驟4)中， 固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基配方為液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基，加入2%重量的瓊脂粉；維生素 母液配方為硫胺素10mg、核黃素5mg、維生素B6 5mg、泛酸f丐20mg、對-氨基苯甲酸5mg、煙堿5mg、肌醇100mg，用無菌水定容至1000ml，用0.4(om 濾膜過濾除菌。
7、 按照權(quán)利要求1所述的固體雙層平板法，其特征在于，所述步驟4)中， 無機(jī)鹽低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)基配方液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基，加入1%重量的低熔點(diǎn)瓊 脂糖。
8、 按照權(quán)利要求4、 6或7所述的固體雙層平板法，其特征在于，液體無 機(jī)鹽培養(yǎng)基配方為K2HP。4 2g、 KH2PO40.5g、 NaCl 0.5g、 NH4C10.5g、 MgS04 0.2g、 CaCl210mg、微量元素溶液lml，用蒸餾水定容至1000ml;其中，微量元 素溶液配方為FeS02 '7H202g、 MnS04 'H202g、 Na2MoS04 '2H2O0,5g、 H3B04 0.2g、 CuS04 '5恥0.4g、 ZnS04 0.5g、 NHtVOs 0.2g、 CoCl2 "6恥0.5g、 NiCl2 6H20 0.2g，用蒸餾水定容至lOOOml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速高通量篩選多環(huán)芳烴降解菌的改進(jìn)固體雙層平板法，屬于污染土壤生物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，適用于多環(huán)芳烴污染土壤生物修復(fù)微生物資源的挖掘。所采用的固體雙層平板法，下層培養(yǎng)基為普通無機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基添加多種維生素和微量元素；上層培養(yǎng)基為以多環(huán)芳烴為唯一碳源的無機(jī)鹽低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)基，選擇低熔點(diǎn)瓊脂糖代替普通瓊脂制作上層培養(yǎng)基，一方面可防止加入PAHs時(shí)由于高溫導(dǎo)致的降解或者揮發(fā)；另一方面可使降解暗圈更清晰易辨。本發(fā)明針對傳統(tǒng)降解菌株篩選的盲目性、隨機(jī)性且工作量大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，開發(fā)的固體雙層平板法，為在實(shí)驗(yàn)室中高通量篩選多環(huán)芳烴降解菌，挖掘新的生物修復(fù)微生物資源提供了一種快速便捷的手段。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101245366SQ20081001056
公開日2008年8月20日 申請日期2008年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日
發(fā)明者倪志龍, 史榮久, 穎 張, 張忠澤, 慧 徐, 慧 李, 楊偉超, 陳冠雄, 韓斯琴 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所