專利名稱：：一種多孔整體材料固定化酶微反應(yīng)器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)樣品的酶解方法，具體地說是一種基于多孔整體材料的固定化酶微反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)樣品的高效、快速酶解。
背景技術(shù)：
：作為化學(xué)酶工程的一個(gè)重要分支，酶的固定化是指通過吸附、包埋、交聯(lián)、共價(jià)接合等方法使目標(biāo)酶分子固定于特定的載體上而發(fā)揮酶的生物催化作用。與溶液中的蛋白質(zhì)酶解反應(yīng)相比，固定化的酶具有更高的酶/底物比、更高的酶解效率、可重復(fù)使用，并能減少酶的自身降解等優(yōu)點(diǎn)。此外，使用固定化酶反應(yīng)器還可以避免樣品的手工處理，從而也就減少了蛋白樣品被污染的可能性。固定化酶的性能與載體材料和固定化方法密切相關(guān)。根據(jù)載體材料的不同，固定化酶反應(yīng)器可以分為顆粒填充型和整體材料型兩大類。顆粒填充型酶反應(yīng)器的制備往往是先將表面帶有某種官能團(tuán)的顆粒進(jìn)行活化而后固定上酶分子，再將顆粒填充到柱管中。對于填充型酶反應(yīng)器而言，液流主要通過顆粒之間的空隙，從流動(dòng)相向固定化酶的傳質(zhì)和從固定化酶向流動(dòng)相的傳質(zhì)主要由擴(kuò)散系數(shù)決定，與填料孔徑大小、流速和底物的擴(kuò)散系數(shù)等有關(guān)。蛋白質(zhì)這類生物大分子的擴(kuò)散系數(shù)較小，而填料顆粒之間往往有較大空隙，使得填充型酶反應(yīng)器的傳質(zhì)速率較低，活性不高。因此，填充型顆粒載體通常并非理想的酶固定化載體材料。多孔整體材料是近年發(fā)展起來的一種新型的色譜分離介質(zhì)。通過優(yōu)化合成條件，可以制備得到同時(shí)具有大的通孔和小的擴(kuò)散孔的多孔結(jié)構(gòu)整體材料載體。對于基于多孔整體材料的固定化酶反應(yīng)器而言，傳質(zhì)速率得以顯著提高，較快的傳質(zhì)使得蛋白分子更容易接近固定化酶的活性位點(diǎn)，因此可以大大提高固定化酶反應(yīng)的速度。最近，Zare等采用光引發(fā)聚合法制備了一種硅膠整體材料共價(jià)鍵合型酶反應(yīng)器，可使25mMBAEE(L-苯丙氨酸-精氨酸-乙酯)在2分鐘內(nèi)酶解(Dulay,M.T.;Baca,Q.J.;Zare,R.N.C/2泄2005,77，4604-4610)。Sakai畫Kato等采用溶膠-凝膠法制備了一種硅膠整體材料包埋型酶反應(yīng)器，可使50mMBAEE在2秒鐘內(nèi)酶解(Sakai-Kato,K.;Kato，M.;Toyo，oka,T.爿"a/.Ozew.2002,74，2943-2949)，然而該酶反應(yīng)器卻不能對大分子蛋白質(zhì)進(jìn)行有效酶解。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種多孔整體材料固定化酶反應(yīng)器的制備方法，而且所制備的酶反應(yīng)器可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)樣品的高效、快速的酶解。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為本發(fā)明采用四乙氧基硅垸(TEOS)和氨丙基三乙氧基硅垸(APTES)為前體分子，以十六烷基三甲基溴化氨(CTAB)為模板分子，以無水乙醇為共溶劑，經(jīng)由溶膠-凝膠法和模板分子自組裝法制備得到了一種多孔的有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體材料載體載體；對雜化硅膠整體材料用戊二醛活化，固定上胰蛋白酶后即制備得到有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體材料固定化酶反應(yīng)叫益。具體為1)采用四乙氧基硅垸TEOS或四甲氧基硅烷TMOS與氨丙基三乙氧基硅烷APTES—起作為前體分子，以帶有C8-C16烷基鏈的陽離子表面活性劑為模板分子，以無水乙醇或甲醇為共溶劑，加水后經(jīng)由溶膠-凝膠法及超分子模板法制備得到了一種有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體材料載體；步驟1)中TEOS或TMOS與APTES的物質(zhì)的量之比為3〃—7/3;水與前體分子(TEOS和APTES的物質(zhì)的量的總和)物質(zhì)的量之比為二2.5/l—1.2/l，模板分子的質(zhì)量mg與前體分子物質(zhì)的量mmol之比為6—10;無水乙醇或甲醇的體積與前體分子物質(zhì)的量mmol之比為175—250;溶膠-凝膠法聚合反應(yīng)溫度為25。C80。C，聚合時(shí)間為12~24小時(shí)；所述模板分子最好為十六烷基三甲基溴化氨CTAB;其采用的前體分子之一是氨丙基三乙氧基硅烷，其同時(shí)也是溶膠-凝膠反應(yīng)的催化劑。2)對雜化硅膠整體材料載體用戊二醛活化，最后連續(xù)泵過含有胰蛋白酶、芐甲脒及的氰基硼氫化鈉NaCNBH3的磷酸鹽緩沖溶液，即可制備得到一種有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體材料固定化酶微反應(yīng)器。步驟2)中載體用戊二醛活化過程為將含有體積濃度5—20%戊二醛的pH=7.5—8.5磷酸鹽緩沖液浸泡整體材料，在室溫下反應(yīng)4—12小時(shí)；步驟2)中酶的固定化過程為含有1—5mg/mL胰蛋白酶、25—100mM苯甲脒及2.5—7.5mg/mL的氰基-硼氫化鈉NaCNBH3的pH=7.5—8.5磷酸鹽緩沖溶液，在1—10。C下反應(yīng)12一8小時(shí)；所制備得到的微反應(yīng)器用含有體積濃度5—30%ACN的pH=7.5—8.5磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶反應(yīng)器2—6小時(shí)；最后，用0.5-1.25M的pH=7.5—8.5Tris-HCl沖洗酶反應(yīng)器2—6小時(shí)。所述微反應(yīng)器不使用時(shí)，用含有5—15mMCaCl2、質(zhì)量濃度0.01—0.04%NaN3的50—100mMpH=7.5—8.5Tris-HCl保護(hù)液保護(hù)起來，貯存于1—10。C下。所述有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體材料載體的制備可在10300pm內(nèi)徑的毛細(xì)管中進(jìn)行。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為本發(fā)明在毛細(xì)管中以兩種硅烷化試劑為前體分子，以表面活性劑為模板分子，經(jīng)由溶膠-凝膠法和模板分子自組裝法原位聚合得到一種連續(xù)的、均一的多孔有機(jī)無機(jī)雜化硅膠整體材料載體，對載體表4面進(jìn)行活化后即可用于酶的共價(jià)固定。其制備方法簡便，成本低；制備得到的酶反應(yīng)器的通透性好，反壓小，機(jī)械強(qiáng)度好，酶活性高，與自由溶液酶解相比，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，避免了酶的自降解(即降低了最終質(zhì)譜譜圖解析的復(fù)雜性)，可反復(fù)使用(減少了酶的消耗)，也可與HPLC-MS/MS或CE-MS/MS系統(tǒng)聯(lián)用從而實(shí)現(xiàn)在線分析。圖1有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體材料固定化酶反應(yīng)器的制備示意圖；其中(a)有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體材料載體的制備；(b)載體材料上酶的固定化。圖2有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體材料固定化酶反應(yīng)器的截面掃描電鏡圖(x600)。圖3BAEE經(jīng)酶反應(yīng)器酶解后的產(chǎn)物經(jīng)HPLC-UV分析得到的色譜當(dāng)200mMBAEE經(jīng)酶反應(yīng)器5秒后幾乎完全酶解，這說明本發(fā)明所制備的酶反應(yīng)器可以對小分子底物進(jìn)行高效、快速的酶解。圖4肌紅蛋白經(jīng)酶反應(yīng)器酶解后的產(chǎn)物經(jīng)HPLC-MS/MS分析得到的基峰色譜圖；當(dāng)200ng肌紅蛋白經(jīng)酶反應(yīng)器30秒后即得以完全酶解，這說明本發(fā)明所制備的酶反應(yīng)器可以對蛋白進(jìn)行高效、快速的酶解。具體實(shí)施例方式按照如下步驟制備有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體材料固定化酶反應(yīng)器。1)按下述所列比例取一定量的TEOS、APTES、無水乙醇、水和CTAB充分混勻，而后經(jīng)注射器引入預(yù)處理好的內(nèi)徑為10300pm的毛細(xì)管中，引入過程在原料混合后的2分鐘內(nèi)完成。用硅橡膠封口，于25~80。C下聚合反應(yīng)12~24小時(shí)；經(jīng)由溶膠-凝膠法及超分子模板法制備得到了一種有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體材料載體；合成實(shí)例具體參數(shù)如下表1所示；2)活化所制備的整體材料先經(jīng)恒流泵先用乙醇沖洗去CTAB，再先后用水及100mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)沖洗30min。而后，將含有體積濃度10%戊二醛的100mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)泵入柱中，在室溫下反應(yīng)6小時(shí)。酶的固定化用緩沖液沖洗去多余的戊二醛，再連續(xù)泵入含有2.5mg/mL胰蛋白酶、50mM苯甲脒及5mg/mL的氰基-硼氫化鈉NaCNBH3的lOOmM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)，在4。C下反應(yīng)24小時(shí)。再用含有體積濃度20。/。ACN的lOOmM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)沖洗酶反應(yīng)器4小時(shí)。最后，用1M的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)沖洗酶反應(yīng)器4小時(shí)。載體活化及酶的固定化實(shí)例具體參數(shù)如下表2所示。不使用時(shí)，用含有10mMCaCl2、質(zhì)量濃度0.02%NaN3的50mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)保護(hù)液保護(hù)起來，貯存于4。C下。表l.有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體材料載體的合成實(shí)例。5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>按照上表所示比例制備得到有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體材料載體后，先后用無水乙醇和水沖洗掉模板分子，再經(jīng)活化后即可用于酶的固定化。表2.整體材料活化及酶的固定化合成參數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>15，51.5604.54，2422，41，4108，824052，2620，41，4115，101252.51，485，60.5，61220，451007.510，1230，21.25，2具體應(yīng)用如圖3所示，當(dāng)200mMBAEE經(jīng)酶反應(yīng)器5秒后幾乎完全酶解，這說明本發(fā)明所制備的酶反應(yīng)器可以對小分子底物進(jìn)行高效、快速的酶解。如圖4所示，當(dāng)200ng肌紅蛋白經(jīng)酶反應(yīng)器30秒后即得以完全酶解，這說明本發(fā)明所制備的酶反應(yīng)器可以對蛋白進(jìn)行高效、快速的酶解。權(quán)利要求1.一種多孔整體材料固定化酶微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于1)采用四乙氧基硅烷TEOS或四甲氧基硅烷TMOS與氨丙基三乙氧基硅烷APTES一起作為前體分子，以帶有C8-C16烷基鏈的陽離子表面活性劑為模板分子，以無水乙醇或甲醇為共溶劑，加水后經(jīng)由溶膠-凝膠法及超分子模板法制備得到了一種有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體材料載體；2)對雜化硅膠整體材料載體用戊二醛活化，最后連續(xù)泵過含有胰蛋白酶、芐甲脒及的氰基硼氫化鈉NaCNBH3的磷酸鹽緩沖溶液，即可制備得到一種有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體材料固定化酶微反應(yīng)器。2.按照權(quán)利要求1所述多孔整體材料固定化酶微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于所述步驟1)中TEOS或TMOS與APTES的物質(zhì)的量之比為3/7-7/3;水與前體分子物質(zhì)的量之比為=2.5/1—1.2/1，模板分子的質(zhì)量mg與前體分子物質(zhì)的量mmol之比為6—10;無水乙醇或甲醇的體積與前體分子物質(zhì)的量mmol之比為175—250;溶膠-凝膠法聚合反應(yīng)溫度為25°C80°C，聚合時(shí)間為12~24小時(shí)。3.按照權(quán)利要求1或2所述多孔整體材料固定化酶微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于所述模板分子為十六烷基三甲基溴化氨CTAB。4.按照權(quán)利要求1所述多孔整體材料固定化酶微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于所述步驟2)中載體用戊二醛活化的過程為將含有體積濃度5—20%戊二醛的pH=7.5—8.5磷酸鹽緩沖液浸泡整體材料，在室溫下反應(yīng)4—12小時(shí)。5.按照權(quán)利要求1所述多孔整體材料固定化酶微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于所述步驟2)中含有1—5mg/mL胰蛋白酶、25—100mM苯！脒及2.5—7.5mg/mL的氰基-硼氫化鈉NaCNBH3的pH=7.5—8.5磷酸鹽緩沖溶液，在1—10。C下反應(yīng)12—48小時(shí)。6.按照權(quán)利要求1所述多孔整體材料固定化酶微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于所述制備得到的微反應(yīng)器用含有體積濃度5—30%ACN的pH=7.5—8.5磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶反應(yīng)器2—6小時(shí)；最后，用0.5-1.25M的pH=7.5—8.5Tris-HCl沖洗酶反應(yīng)器2—6小時(shí)。7.按照權(quán)利要求1所述多孔整體材料固定化酶微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于所述微反應(yīng)器不使用時(shí)，用含有5—15mMCaCl2、質(zhì)量濃度0.01—0.04%NaN3的50—100mMpH=7.5—8.5Tris-HCl保護(hù)液保護(hù)起來，ie存于1一10。C下。8.按照權(quán)利要求1所述多孔整體材料固定化酶微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體材料載體的制備可在10~300^im內(nèi)徑的毛細(xì)管中進(jìn)行。全文摘要本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)樣品的酶解方法，具體地說是采用四乙氧基硅烷和氨丙基三乙氧基硅烷為前體分子，以十六烷基三甲基溴化氨為模板分子，以無水乙醇為共溶劑，經(jīng)由溶膠-凝膠法和模板分子自組裝法制備得到了一種多孔的有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體材料載體載體；對雜化硅膠整體材料用戊二醛活化，固定上胰蛋白酶后即制備得到有機(jī)-無機(jī)雜化硅膠整體材料固定化酶反應(yīng)器。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為制備方法簡便，酶反應(yīng)器的通透性好，反壓小，機(jī)械強(qiáng)度高，具有高的酶解活性，與自由溶液酶解相比，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，避免了酶的自降解，可反復(fù)使用，也可與HPLC-MS/MS或CE-MS/MS系統(tǒng)聯(lián)用從而實(shí)現(xiàn)樣品的在線分析。文檔編號C12N11/14GK101497879SQ20081001034公開日2009年8月5日申請日期2008年2月3日優(yōu)先權(quán)日2008年2月3日發(fā)明者張麗華,張玉奎,振梁,馬俊鋒申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所