專利名稱：：用于治療與dna重復不穩(wěn)定性相關(guān)的遺傳病的方法和手段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及治療與在其編碼或非編碼序列中具有不穩(wěn)定重復的基因相關(guān)的遺傳病，最特別地，涉及在引起人亨廷頓舞蹈癥的HD基因或引起I型肌強直性營養(yǎng)不良的DMPK基因中的不穩(wěn)定重復。
背景技術(shù)：
：基因特異性的微衛(wèi)星及小衛(wèi)星重復序列導致衛(wèi)星中重復序列長度增加，這種不穩(wěn)定性與約35種人遺傳病相關(guān)。例如，三核苷酸重復不穩(wěn)定可見于造成X連鎖脊延髓肌萎縮癥(spinalandbulbarmuscularatrophy,SBMA)、I型肌強直性營養(yǎng)不良(myotonicdystrophytype1,DM1)、脆性X綜合征(FRAX基因A、E、F)、亨廷頓舞蹈癥(HD)和一些脊髓小腦共濟失調(diào)疾病(SCA基因家族)的基因中。不穩(wěn)定重復還可見于基因(例如亨廷頓舞蹈癥基因)的編碼區(qū)中，由此通過改變蛋白質(zhì)功能和/或蛋白質(zhì)折疊而導致疾病表型。不穩(wěn)定重復單元還可見于非翻譯區(qū)中，例如I型肌強直性營養(yǎng)不良(DM1)在3，UTR中，或者在內(nèi)含子序列中，例如II型肌強直性營養(yǎng)不良(DM2)。對于DMPK來說，正常重復數(shù)約為5至37，但突變前和完全疾病狀態(tài)增加到2至10倍或更多，多至50、100有時1000個或更多重復單元。對于DM2/ZNF9來說，已有報道稱增加到10000個或更多重復(Cleary和Pearson,Cytogenet.GenomeRes.100:25-55,2003)。造成亨廷頓舞蹈癥的基因HD位于第4號染色體。亨廷頓舞蹈癥以常染色體顯性方式遺傳。當該基因具有編碼一段多谷氨酰胺的超過35個CAG的三核苷酸重復時，重復數(shù)可在后續(xù)世代中擴大。由于該重復的長度逐漸增加，疾病的嚴重程度通常增加，并且在后續(xù)世代中在更小的年齡出現(xiàn)，這一過程稱為早現(xiàn)遺傳。HD基因的產(chǎn)物是348kDa的胞質(zhì)蛋白亨廷頓蛋白(huntingtin)。在正常形式中，亨廷頓蛋白具有少于40個谷氨酰胺氨基酸殘基的特征序列；致病的突變亨廷頓蛋白具有超過40個殘基。突變4體亨廷頓蛋白分子在神經(jīng)元細胞中的連續(xù)表達導致形成大的蛋白質(zhì)沉積物，最終導致細胞死亡，尤其是在額葉和基底神經(jīng)節(jié)(主要在尾狀核中)中。疾病的嚴重程度一般與額外殘基的數(shù)目成正比。DM1是成年人中最常見的肌營養(yǎng)不良，它是一種主要發(fā)生在骨骼肌、心臟和腦中的進行性、退行性、多系統(tǒng)遺傳病。DMl是由人19q染色體上DMPK基因(強直性肌營養(yǎng)不良蛋白激酶)的3，非翻譯區(qū)中不穩(wěn)定三核苷酸(CTG)n重復的擴增造成的(Brook等，Cell,1992)。II型強直性肌營養(yǎng)不良(DM2)是由ZNF9基因的內(nèi)含子1中CCTG的擴增造成的(Liquori等，Science2001)。在I型強直性肌營養(yǎng)不良的情況下，DMPK轉(zhuǎn)錄物的核-胞質(zhì)輸出被該重復序列長度的增加所阻斷，其形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)，積累于核小點(nuclearfoci)中。帶有一段長(CUG)n重復序列的DMPK轉(zhuǎn)錄物可形成發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)，其與肌盲蛋白(muslceblind)家族的蛋白質(zhì)結(jié)合然后在核中的核糖核小點(ribonuclearfoci)中聚集。這些核內(nèi)含物^M^人為與肌盲蛋白螯合，并且有可能與其它因子螯合，隨后對細胞產(chǎn)生限制性。在DM2中，帶有(CCUG)n已擴增重復的ZNF9RNA的積累在核中形成相似的小點。因為肌盲蛋白是剪接因子，因此它們的缺乏導致其它轉(zhuǎn)錄物剪接的顯著重排。許多基因的轉(zhuǎn)錄物隨之開始異常剪接，例如包含胎兒外顯子，或排除外顯子，導致產(chǎn)生非功能性蛋白質(zhì)和細胞功能受損。上文的論述和新見解已經(jīng)帶來這樣的理解，即不穩(wěn)定重復疾病(例如I型強直性肌營養(yǎng)不良、亨廷頓舞蹈癥等)可通過完全或至少部分去除導致該疾病的異常轉(zhuǎn)錄物來進行治療。對于DM1，在核內(nèi)積累的異常轉(zhuǎn)錄物可被下調(diào)或部分去除。就DM而言，甚至異常轉(zhuǎn)錄物相對小的降低也可釋放大量(有可能AA量)被螯合的細胞因子，由此幫助恢復正常RNA加工和細胞代謝(Kanadia等，PNAS2006)。在HD的情形中，HD患者細胞中亨廷頓蛋白沉積物積累的減少可改善疾病癥狀。已有一些使用反義核酸、RNA干擾或核酶來設(shè)計用于不穩(wěn)定重復疾病I型肌強直性營養(yǎng)不良的治療方法和藥劑的嘗試。(i)Langlois等(MolecularTherapy,Vol.7No.5,2003)設(shè)計了能夠切割DMPKmRNA的核酶。提供了具有與緊臨CUG重復之前的DMPK3，UTR互補的一段RNA的錘頭狀核酶。在體內(nèi)，載體轉(zhuǎn)錄的核酶能夠在轉(zhuǎn)染細胞中將包含已擴增CUG重復的mRNA以及正常mRNA切割并且分別減少63%和50%。因此，正常轉(zhuǎn)錄物也受到此方法的嚴重影響，所影響的含有已擴增重復的mRNA沒有被特異性地靶向。(ii)Langlois等(JournalBiologicalChemistry,vol280，no.17，2005)使用RNA干擾進行了另一種方法。將慢病毒遞送的短發(fā)夾RNA(shRNA)引入DM1成肌細胞中，證明其下調(diào)核中保留的突變體DMPKmRNA。測試了4種shRNA分子，兩種與DMPK編碼區(qū)互補，一種與3，UTR中的獨特序列互補，一種帶有無關(guān)序列的陰性對照。前兩種shRNA能夠?qū)в幸褦U增重復的突變體DMPK轉(zhuǎn)錄物下調(diào)至約50%，但是甚至更有效地將胞質(zhì)野生型轉(zhuǎn)錄物下調(diào)至約30%或更低。通過陽離子型脂質(zhì)遞送等同的合成siRNA是無效的。針對3，UTR序列的shRNA被證明對兩種轉(zhuǎn)錄物都是無效的。因此，此方法也不選擇性耙向至已擴增重復的mRNA類型。(iii)Furling等(GeneTherapy,Vol.10,p795-802,2003)的第三種方法使用了表達149bp長反義RNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒來抑制人DM1成肌細胞中的DMPKmRNA水平。將逆轉(zhuǎn)錄病毒i殳計成為DM1細胞提供與39bp長的(CUG)13次重復及該重復后的110bp區(qū)域互補的149bp長的反義RNA，以提高特異性。此方法使突變(重復序列已擴增的)DMPK轉(zhuǎn)錄物減少80%，相比較而言，野生型DMPK轉(zhuǎn)錄物減少50%，并恢復了受感染DM1成肌細胞中的分化和功能性特征。因此，此方法也不選擇性靶向至已擴增重復的mRNA種類，其依賴于非常長的反義RNA，并且僅可與重組病毒遞送技術(shù)聯(lián)合使用。發(fā)明詳述上文所述方法和技術(shù)提供了基于核酸的方法，其非選擇性地致使與重復不穩(wěn)定性和/或擴增相關(guān)的遺傳病的受影響的重復序列已擴增的等位基因和未受影響的(正常)等位基因均進行降解。另外，現(xiàn)有技術(shù)利用對疾病相關(guān)基因具有特異性的序列，并且沒有提供可應用于數(shù)種與重復序列擴增相關(guān)的遺傳病的方法。最后，現(xiàn)有技術(shù)僅教導了涉及使用重組DNA載體遞送系統(tǒng)的方法，它需^4h對每種寡核香酸和靶細胞進行調(diào)整，并仍需要進一步優(yōu)化。本發(fā)明提供了通過使用短單鏈核酸分子解決這些問題的方案，所述短單鏈核酸分子包含僅與已擴增重復區(qū)域互補的序列，或者由其組成，即它不依賴于與包含重復序列的基因的外顯子或內(nèi)含子中的獨特序列雜交。另外，不要求所采用的核酸(寡核苷酸)通過RNA酶H介導的降解機制減少轉(zhuǎn)錄物。不希望受到理論的限制，本發(fā)明可通過改變未成熟RNA的轉(zhuǎn)錄后加工和/或剪接來引起轉(zhuǎn)錄物水平下降。通過選擇性剪接和/或轉(zhuǎn)錄后加工降低轉(zhuǎn)錄物水平被認為產(chǎn)生缺少過度擴增或不穩(wěn)定的(三)核苷酸重復但仍具有功能活性的轉(zhuǎn)錄物。通過改變RNA加工和/或剪接減少異常轉(zhuǎn)錄物可防止細胞中重復序列已擴增的異常轉(zhuǎn)錄物在細胞中積累和/或翻譯。不希望受到理論的限制，還認為本發(fā)明的方法提供了針對包含已擴增重復序列的受影響轉(zhuǎn)錄物的特異性，因為與已擴增重復序列進行雜交的動力學更有利。重復序列特異性的互補核酸寡核苷酸分子與RNA或DNA分子中互補區(qū)段雜交的可能性隨著重復區(qū)段大小的增加而增加。RNA分子(特別是包含重復序列的RNA分子)通常內(nèi)部配對，形成包含開口環(huán)和閉合發(fā)夾部分的二級結(jié)構(gòu)。僅有開口部分對互補核酸來說是相對可接近的。與疾病不相關(guān)的野生型轉(zhuǎn)錄物的短重復區(qū)段經(jīng)常僅為5至約20-40個重復，因為二級結(jié)構(gòu)相對不易于與互補核酸威基配對。相反，已擴增重復序列和疾病相關(guān)等位基因的重復單元通常擴增至少2倍，但經(jīng)常更多，3、5、10倍、多達100倍，甚至對一些不穩(wěn)定重復的疾病來說擴增超過1000倍。這種擴增提高了該重復的部分(至少暫時)位于開放環(huán)結(jié)構(gòu)中的可能性，并因此相對于野生型等位基因更易于與互補核酸分子堿基配對。因此，盡管寡核苷酸與野生型和重復序列已擴增的轉(zhuǎn)錄物中存在的重復序列都互補并且理論上與兩種轉(zhuǎn)錄物都可以雜交，但是本發(fā)明教導的是，與重復部分互補的寡核苷酸優(yōu)先與疾病相關(guān)或?qū)е录膊〉霓D(zhuǎn)錄物雜交，而正常轉(zhuǎn)錄物功能相對不受影響。這種選擇性對于治療與重復不^l定性相關(guān)的疾病來說是有益的，而與異常轉(zhuǎn)錄物減少的機制無關(guān)。因此，本發(fā)明提供了通過提供僅與重復序列互補和/或僅能夠與其雜交的核酸分子來治療與不穩(wěn)定順式元件DNA重復相關(guān)的遺傳病的方法。因此，本發(fā)明優(yōu)先靶向已擴增重復的轉(zhuǎn)錄物，而正常的野生型等位基因相對不受影響。這是有利的，因為正常等位基因因此提供了基因的正常功能，這至少是理想的并且取決于帶有不穩(wěn)定DNA重復的特定基因而在許多情況下可能對受治細胞和/或個體來說是必要的。另外，此方法不僅限于與特定的不穩(wěn)定DNA重復相關(guān)的遺傳病，而是可應用于任何已知不穩(wěn)定DNA重復疾病，例如但不限于具有多谷氨酰胺(CAG)重復的編碼區(qū)重復疾病亨廷頓舞蹈癥、Haw-River綜合征、肯尼迪病/脊髓延髓肌萎縮癥、脊髓小腦共濟失調(diào)；或者具有多丙氨酸(GCG)重復的疾病，例如嬰兒痙攣綜合征、顱骨鎖骨發(fā)育不全(deidocranialdysplasia),瞼裂狹小/上瞼下垂/倒轉(zhuǎn)型內(nèi)眺贅皮綜合征、手-足-生殖器綜合征、并指多指、眼咽肌營養(yǎng)不良、前腦無裂畸形。根據(jù)本發(fā)明治療的在基因非編碼區(qū)具有重復的疾病包括三核苷酸重復疾病(大多數(shù)是CTG和/或CAG和/或CCTG重復)I型肌強直性營養(yǎng)不良、II型肌強直性營養(yǎng)不良、弗里德賴希共濟失調(diào)(主要是GAA)、脊髓小腦共濟失調(diào)、孤獨癥。另外，本發(fā)明方法可用于脆性位點相關(guān)的重復疾病，包括多種脆性X綜合征、雅各布森綜合征和其它不穩(wěn)定重復元件疾病，例如肌陣享型癲癇、面肩肱型營養(yǎng)不良和某些形式的II型糖尿病.本發(fā)明的另一個優(yōu)點是可將重復區(qū)域特異性寡核苷酸直接施用于細胞，它不依賴于基于載體的遞送系統(tǒng)。現(xiàn)有技術(shù)中已描述的技術(shù)(例如上文提及的用于治療DM1和從細胞中除去DMPK轉(zhuǎn)錄物的技術(shù))需凍—吏用基于載體的遞送系統(tǒng)以將足夠水平的寡核苷酸施用至細胞。質(zhì)?；虿《据d體的使用對于治療目的來說不是很理想，這是由于目前對治療性重組DNA載體的嚴格安全性規(guī)定、用于大范圍臨床應用的足夠重組載體的生產(chǎn)以及對施用后過度(或非特異性)應答而言有限的控制和可逆性。盡管如此，未來很可能在這些領(lǐng)域進行優(yōu)化，質(zhì)粒的病毒遞送可具有有利的長期效果。本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)了，與對轉(zhuǎn)錄物中獨特序列具有特異性的寡核普酸相比，包含與已擴增重復的轉(zhuǎn)錄物中重復序列互補的序列或者由所述序列組成的寡核苷酸由于其雜交分子靶標的擴增而對其靶標具有高得多的親和力/親合力。由于對重復序列已擴增的乾轉(zhuǎn)錄物的高親和力和親合力，較少量的寡核苷酸就足以通過RNA酶H降解、RNA干擾降解或改變翻譯后加工(包括但不限于剪接或外顯子跳躍(exonski卯ing))活性對重復序列已擴增的等位基因產(chǎn)生充分的抑制和/或減少。僅與重復序列互補的本發(fā)明寡核苷酸可通過合成產(chǎn)生，并在使用用于直接遞送寡核苷酸到細胞和/或組織的常用技術(shù)直接遞送到細胞時具有足夠有效的效力。需要時，可通過使用本發(fā)明的方法和寡核苷酸分子來避免4吏用重組載體遞送系統(tǒng)。在第一個方面中，本發(fā)明公開并教導了包含僅與人基因轉(zhuǎn)錄物中重復序列互補的序列或由所述序列組成的寡核普酸在制備用于診斷、治療或預防順式元件重復不穩(wěn)定性相關(guān)的人遺傳病的藥物中的用途。因此，本發(fā)明提供了用于治療與順式元件重復不穩(wěn)定性相關(guān)的遺傳病的方法。在第二個方面中，本發(fā)明還涉及可用于本發(fā)明第一方面的和/或用于本發(fā)明方法來阻止重復已擴增的轉(zhuǎn)錄物在細胞中積累和/或翻譯的寡核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸可包含僅與下文所定義重復序列互補的序列。優(yōu)選地，所述重復序列是本發(fā)明寡核苷酸長度的至少50%,更優(yōu)選至少60%,再優(yōu)選至少70%，再優(yōu)選至少80%,甚至更優(yōu)選至少卯％或更多。在一個最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明寡核苷酸由僅與下文所定義重復序列互補的序列組成。例如，寡核苷酸可包^^僅與下文所定義重復序列互補的序列和乾向部分，后者下文被稱為靶向配體。本文將重復或重復元件或重復序列或重復區(qū)段定義為在受試者(包括人受試者)基因組中的轉(zhuǎn)錄基因序列中的重復單元或重復性核苷酸單元(包括三核普酸重復單元，或者是4、5或6個核普酸的重復單元)的至少3、4、5、10、100、1000次或更多次重復。寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈的。雙鏈意為由兩個互補鏈形成的異源二聚體，例如siRNA。在一個優(yōu)選實施方案中，寡核苷^A單鏈的。單鏈寡核苷酸相比于雙鏈siRNA寡核苷酸來說具有幾個優(yōu)點(i)預計其合成比兩條互補siRNA鏈更容易；(ii)有更寬范圍的化學修飾有可能用于優(yōu)化更有效的細胞^v、更好的(生理)穩(wěn)定性和降低潛在的一般副作用；和(iii)siRNA更有可能產(chǎn)生非特異性作用和過度的藥理學作用(例如對治療方案或劑量的有效性和選擇性的控制可能性較小)和(iv)siRNA較不可能作用于核內(nèi)，不能針對內(nèi)含子。因此，在第一方面的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及包含僅與人基因轉(zhuǎn)錄物中重復序列互補的序列或者由所述序列組成的單鏈寡核普酸在制備用于診斷、治療或預防與元件重復不穩(wěn)定性相關(guān)的人遺傳病的藥物中的用途。所述寡核苷酸優(yōu)選包含至少10個至約50個與重復元件互補的連續(xù)核苷酸，優(yōu)選12至45個、更優(yōu)選12至30個、最優(yōu)選12至25個與重復區(qū)段(優(yōu)選具有三核香酸重復單元或四核普酸重復單元)互補的核普酸。所述寡核苷酸可與轉(zhuǎn)錄物中編碼區(qū)內(nèi)的重復區(qū)段(優(yōu)選多谷氨酰胺(CAG)或多丙氨酸(GCG)編碼區(qū)段)互補和/或與之雜交。所述寡核苷酸還可9與非編碼區(qū)(例如5，或3，非翻譯區(qū))或前體RNA分子中存在的內(nèi)含子序列互補和/或能與之雜交。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明方法中使用的寡核苷酸包含與下述重復元件互補的序列，或者由其組成，所述重復元件具有選自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n、(GAA)n、(GCC)n和(CCUG)n的重復核苷酸單元作為重復核苷酸單元，并且所述寡核苷i^A單鏈或雙鏈寡核苷酸。優(yōu)選地，所述寡核普^A雙鏈的。應用包含與轉(zhuǎn)錄物中多谷氨酰胺(CAG)n節(jié)段互補的序列或由其組成的寡核苦酸在以下疾病的診斷、治療和/或預防中特別有用由人基因HD、HDL2/JPH3、SBMA/AR、SCA1/ATX1、SCA2/ATX2、SCA3/ATX3、SCA6/CACNAIA、SCA7、SCA17、AR或DRPLA中重M列的擴增造成的人疾病亨廷頓舞蹈癥、一些形式的脊髓小腦共濟失調(diào)或Haw-River綜合征、X連鎖脊髓延髓肌營養(yǎng)不良和/或齒狀核紅核蒼白球丘腦下部核萎縮。應用包含與轉(zhuǎn)錄物中多丙氨酸(GCG)n節(jié)段互補的序列或由其組成的寡核苷酸在以下疾病的診斷、治療和/或預防中特別有用由人基因ARX、CBFA1、FOXL2、HOXA13、HOXD13、OPDM/PABP2、TCFBR1或ZIC2中重復序列的擴增造成的人疾病嬰兒痙攣綜合征、顱骨鎖骨發(fā)育不全、瞼裂狹小、手-足-生殖器綜合征、并指多指、眼咽肌營養(yǎng)不良和/或前腦無裂畸形。應用包含與轉(zhuǎn)錄物中(CUG)n節(jié)段互補的序列或由其組成的寡核苷酸在以下疾病的診斷、治療和/或預防中特別有用分別由人基因DM1/DMPK、SCA8或JPH3中重復序列的擴增造成的人遺傳病I型肌強直性營養(yǎng)不良、8型脊髓小腦共濟失調(diào)和/或2型亨廷頓舞蹈癥樣疾病(Huntington'sdisease-like2)。優(yōu)選地，這些基因為人類來源。應用包含與轉(zhuǎn)錄物中(CCUG)n節(jié)段互補的序列或由其組成的寡核苷酸在以下疾病的診斷、治療和/或預防中特別有用由DM2/ZNF9基因中重復序列的擴增造成的人遺傳病II型肌強直性營養(yǎng)不良。應用包含與轉(zhuǎn)錄物中(CGG)n節(jié)段互補的序列或由其組成的寡核苷酸在以下疾病的診斷、治療和/或預防中特別有用由FRAXA/FMR1、FRAXE/FMR2和FRAXF/FAM11A基因中重Jjf列的擴增造成的AJ^性x綜合征。應用包含與轉(zhuǎn)錄物中(CCG)n節(jié)段互補的序列或由其組成的寡核苷酸在以下疾病的診斷、治療和/或預防中特別有用由FRA11B/CBL2基因中重復的擴增造成的人遺傳病雅各布森綜合征。應用包含與轉(zhuǎn)錄物中(GAA)n節(jié)段互補的序列或由其組成的寡核苷酸在以下疾病的診斷、治療和/或預防中特別有用人遺傳病弗里德賴希共濟失調(diào)。應用包含與內(nèi)含子中(ATTCT)n節(jié)段互補的序列或由其組成的寡核苷酸在以下疾病的診斷、治療和/或預防中特別有用人遺傳病IO型脊髓小腦共濟失調(diào)(SCAIO)。用于本發(fā)明方法的與重復序列互補的寡核苷酸可包含以下分子或由其組成RNA、DNA、鎖核酸(Lockednucleicacid,LNA)、肽核酸(PNA)、嗎啉4戈磷酰二胺(morpholinophosphorodiamidate，PMO)、亞乙基橋聯(lián)核酸(ethylenebridgednucleicacid,ENA)或其混合物/雜交物，其包含天然DNA及RNA分子與合成的修飾核苷酸的組合。在這些寡核普酸中，磷酸二酯骨架化學結(jié)構(gòu)可進一步被其它修飾所替換，例如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯。還存在其它寡核苷酸修飾，新的修飾也有可能被開發(fā)并用于實踐中。但是，所有這些寡核苷酸都具有能序列特異性地結(jié)合RNA的寡聚物性質(zhì)。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，所述寡核苷酸包含以下分子或者由其組成帶有或不帶有包含硫代磷酸酯之骨架的RNA核苷酸、DNA核苷酸、鎖核酸(LNA)核苷酸、肽核酸(PNA)核苷酸、嗎啉代磷酰二胺、亞乙基橋聯(lián)核酸(ENA)核苷酸或其混合物。含有至少部分天然DNA核苷酸的寡核香酸可用于誘導通過RNA酶H活性(EC.3.1.26.4)降解細胞中的DNA-RNA雜交分子。包含天然RNA核糖核苷酸或RNA樣合成核糖核苷酸的寡核香酸可用于本發(fā)明的方法，以形成雙鏈RNA-RNA雜交體，其通過RNA干擾或沉默(RNAi/siRNA)途徑發(fā)揮Sl^賴性反義核酸的作用，通過有義-反義鏈配對參與靶標RNA識別，然后通過RNA誘導的沉默復合物(RISC)降解乾標RNA。作為替代或補充，立體封閉的反義寡核苷酸(非RNA酶H依賴性反特別是(但不限于)RNA剪接和外顯子跳躍，這通過結(jié)合乾標序列RNA轉(zhuǎn)錄物并阻礙諸如翻譯的過程或者封閉剪接供體或剪接受體位點來實現(xiàn)。使用修飾反義寡核苷酸進行的剪接和外顯子跳躍技術(shù)已充分描述，是本領(lǐng)域普通技術(shù)已知的，例如可見于US6,210，892、W09426887、WO04/083446和WO02/24卯6。另外，空間位阻可抑制蛋白質(zhì)、核因子等的結(jié)合，因此有助于減少疾病如DM1中核積累或核糖核小點?？砂c(已擴增的)重復序列互補的合成或修飾核苷酸的本發(fā)明寡核苷酸可用于本發(fā)明方法，以通過siRNA/RNA干擾或沉默途徑減少含有重復的轉(zhuǎn)錄物或使其失活。用于本發(fā)明方法的單鏈或雙鏈寡核苷酸可包含以下分子或由其組成DNA核普酸、RNA核普酸、2，-0取代的核糖核苷酸(包括烷基和甲fL^乙g代)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)和嗎啉代(PMO)反義寡核苷酸和亞乙基橋核苷酸(ENA)及其組合，任選地是與RNA酶H依賴性反義核酸的嵌合體。鎖核酸在寡核苷酸中的整合改變了堿基配對后雙鏈體的構(gòu)象，提高了雙鏈體的穩(wěn)定性。因此，LNA^ai^寡核苷酸序列中的整合可用于提高本發(fā)明互補寡核苷酸的以下能力即在體外和體內(nèi)主動提高轉(zhuǎn)錄物的RNA、降解抑制積累或者提高外顯子的跳躍能力。肽核酸(PNA)是其中骨架是假肽而不是糖的人工DNA/RNA類似物，由于結(jié)合提高和更高的解鏈溫度而能夠與互補DNA寡聚物形成特別穩(wěn)定的復合體。PNA也是用于本發(fā)明反義核酸和外顯子跳躍應用的優(yōu)良試劑。最優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法的寡核苷酸包含至少部分或全部的2，-0-甲H基乙差J克代磷酸酯RNA核苷酸或2，-0-甲基硫代磷酸酯RNA核苷酸。在本發(fā)明中最優(yōu)選使用包含以下序列或者由其組成的寡核苷酸來診斷、治療或預防順式元件重復不穩(wěn)定遺傳病，所述序列與選自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n、(CCG)n、(GAA)n、(GCC)n和(CCUG)n的重復序列互補，長度為10至50個、更優(yōu)選12至35個、最優(yōu)選12至25個核苷酸，并且包含2，-0-甲氧基乙^J9U義磷酸酯RNA核苷酸、2，-0-曱lJ^代磷酸酯RNA核普酸、LNA核苷酸或PMO核普酸。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的和用于本發(fā)明的寡核苷酸包含與選自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n、(GAA)n、(GCC)n和(CCUG)n的重復序列互補的序列或者由其組成，長度為10至50個核普酸，還具有以下特征U)包含2，-0-取代的RNA硫代砩酸酯核香酸(例如2'-0-曱基或2，-0-曱氧基乙基RNA硫代磷酸酯核苷酸)、LNA核苷酸或PMO核苷酸。所述核普酸可以任何組合使用和/或與DNA硫代磷酸酯或RNA核普酸一起使用；和/或(b)是單鏈寡核苷酸。因此，在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的和用于本發(fā)明的寡核苷酸包含與選自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n、(GAA)n、(GCC)n和(CCUG)n的重復序列互補的序列或者由其組成，長度為10至50個核苷酸，還具有以下特征(c)包含2，-0-取代的RNA硫代磷酸酯核香酸(例如2，-0-曱基或2，-0-甲氧基乙基RNA硫代磷酸酯核苷酸)、LNA核苷酸或PMO核苷酸。所述核苷酸可以任何組^使用和/或與DNA硫代磷酸酯或RNA核苷酸一起使用；和/或(d)是雙鏈寡核苷酸。如果本發(fā)明涉及具有兩條互補鏈的雙鏈寡核苷酸，其中反義鏈僅與人基因轉(zhuǎn)錄物中的重復序列互補，則此雙鏈寡核香酸優(yōu)選不是具有反義RNA鏈(CUG)7和有義RNA鏈(GCA)7的siRNA，其應用于轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染與GFP融合的人亨廷頓基因外顯子1的培養(yǎng)的猴成纖維細胞(COS-7)或人神經(jīng)母細胞(SH-SY5Y)細胞系，如WanzhaoLiu等((2003),Proc.JapanAcad,79:293-298)所述。更優(yōu)選地，本發(fā)明不涉及雙鏈寡核苷酸siRNA(帶有反義鏈(CUG)7和有義鏈(GCA)7)，也不涉及它在制備治療或預防亨廷頓舞蹈癥(更優(yōu)選治療或預防含有亨廷頓舞蹈癥基因外顯子l的構(gòu)建體)的藥物中的用途。盡管使用一種寡核苷酸可能就足以減少重復序列已擴增的轉(zhuǎn)錄物(例如核積累的DMPK或ZNF9轉(zhuǎn)錄物或其片段)的量，或者足以減少重復序列已擴增的HD蛋白的積累，但是組合2、3、4、5或更多種寡核苷酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？蓪c轉(zhuǎn)錄物重復部分互補的序列或由其組成的寡核苷酸有利地與包含以下序列或者由其組成的寡核苷酸組合，該序列與含有重復的轉(zhuǎn)錄物中的獨特序列互補和/或能與之雜交。包含重復序列特異性寡核苷酸的本發(fā)明方法和本發(fā)明藥物還可與任何其他用于順式元件重復不穩(wěn)定性遺傳病的治療或藥物相組合。對于診斷目的，本發(fā)明方法中使用的寡核苷酸可帶有放射性標記或熒光標記，以允許在樣品中、在體內(nèi)原位細胞中、離體或體外檢測轉(zhuǎn)錄物。對于肌強直性營養(yǎng)不良，可將標記的寡核苷酸用于診斷目的，以使DMPK或ZNF9RNA轉(zhuǎn)錄物分子與相關(guān)蛋白質(zhì)的核聚集體顯影。熒光標記可包含Cy3、Cy5、FITC、TRITC、羅丹明、GFP等。放射性標記可包含311、35S、32/33P、1251。還可使用酶和/或免疫原性半抗原，例如地高辛、生物素和其它分子標簽(HA、Myc、FLAG、VSV、lexA)。因此，在另一個方面中，本發(fā)明公開了其中使用上述寡核苷酸的體外或離體檢測和/或診斷方法。用于本發(fā)明的寡核苷酸適于直接體內(nèi)施用至患有或有風險發(fā)生順式元件重復不穩(wěn)定疾病的個體的細胞、組織和/或器官，并可體內(nèi)、離體或體外直接施用?；蛘?，所述寡核苷酸可由能使該寡核普酸在人細胞中表達的核酸載體提供，以獲得所述寡核苷酸的持續(xù)來源。本發(fā)明的寡核苷酸分子可以能使所述寡核苷酸在人細胞中表達的表達載體形式提供給受治療的細胞、組織、器官和/或受試者。所述載體優(yōu)選通過基因遞送運載體引入細胞中。優(yōu)選的用于遞送的運載體是病毒載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、糾目關(guān)病毒載體(AAV)、腺病毒載體、Semliki森林病毒載體(SFV)、EBV載體等。適用于靶向式同源重組和整合進人細胞基因組的質(zhì)粒、人工染色體、質(zhì)粒也可適用于遞送寡核香酸。本發(fā)明優(yōu)選的是轉(zhuǎn)錄由polIII啟動子驅(qū)動的載體和/或其中轉(zhuǎn)錄物是與Ul或U7轉(zhuǎn)錄物相融合的形式，這對于遞送小轉(zhuǎn)錄物得到良好的結(jié)果。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用約O.lnM至約lpM的寡核普酸濃度。更優(yōu)選地，所使用的濃度是約0.3至約400nM，甚至更優(yōu)選約1至約200nM。如果使用數(shù)種寡核苷酸，則此濃度可指寡核苷酸的總濃度或所加入的每種寡核苷酸的濃度。如上文給出的寡核苷酸的濃度范圍是體外或離體使用的優(yōu)選濃度。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會理解，根據(jù)所使用的寡核普酸、待治療的靶細胞、基因靶標及其表達水平、所使用的培養(yǎng)基以及轉(zhuǎn)染和孵育條件，所使用寡核苷酸濃度可進一步變化，并且可能需要進一步優(yōu)化。更優(yōu)選地，本發(fā)明中用于預防、治療或診斷順式元件重復不穩(wěn)定疾病的寡核苷^A通過合成產(chǎn)生的，并以配制成可藥用組合物中的形式直接施用至細胞、組織、器官和/或患者。遞送藥物組合物到受試者優(yōu)選通it4人體的一個或多個部位的一種或多種胃腸外注射來進行，例如靜脈內(nèi)和/或皮下和/或肌內(nèi)和/或堆管內(nèi)和/或心室內(nèi)給藥，優(yōu)選注射給藥。推管內(nèi)或心室內(nèi)給藥(腦脊液中)優(yōu)選地通過將擴散泵引入受試者身體來實現(xiàn)。多種灌注泵是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。用于靶向包含與重復序列互補的序列或由其組成的寡核苷酸分子的藥物組合物可包含多種賦形劑，例如稀釋劑、填充劑、防腐劑、增溶劑等，例如可見于Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第二十版.Baltimore,勵LippincottWilliams&Wilkins，2000。對于本發(fā)明方法來說，特別優(yōu)選的是使用有助于將所述寡核苷酸遞送至和遞送進細胞的賦形劑，特別是能夠形成將被復合或俘獲的物質(zhì)和/或寡核苷酸遞送穿過細胞膜的復合體、運載體和/或脂質(zhì)體的賦形劑。許多這樣的物質(zhì)是本領(lǐng)域已知的。合適的物質(zhì)包括能夠自組裝成可遞送寡核苷酸至細胞的顆粒的聚乙烯亞胺(PEI)、ExGen500、合成的兩親性物質(zhì)(SAINT-18)、lipofectinTM、DOTAP和/或病毒衣殼蛋白。Lipofectin代表脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑的一個實例。它由兩種脂質(zhì)成分組成陽離子脂質(zhì)N-[l-(2，3二油酰氧基)丙基-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)(以及是其曱基-危酸鹽的DOTAP)和中性脂質(zhì)二油酰^^磷脂酰乙醇胺(DOPE)。所述中性成分介導胞內(nèi)釋放。另一組遞送系統(tǒng)是多聚納米顆粒。已知作為DNA轉(zhuǎn)染劑的多聚陽離子(例如二乙胺基乙基(DEAE)-葡聚糖)可與氛基丙烯酸丁酯(PBCA)和氰基丙烯酸己酯(PHCA)組合，配制成可遞送寡核苷酸跨過細胞膜進入細胞的陽離子納米顆粒。除了這些常見納米顆粒材料之外，魚精蛋白這種陽離子肽提供了將寡核苷酸配制成膠體的替代方法。此膠體納米顆粒系統(tǒng)可形成所謂的proticle,其可通過筒單的自組裝過程來制備，以包裝所述寡核普酸并介導其胞內(nèi)釋放。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可選擇并調(diào)整任何上述或其它市售的替代賦形劑及遞送系統(tǒng)來包裝和遞送寡核普酸，以在本發(fā)明中遞送用于治療人體中順式元件重復不穩(wěn)定疾病的寡核苷酸。另外，所述寡核苷酸可與特殊設(shè)計成促進^到細胞、細胞質(zhì)和/或細胞核內(nèi)的靶向配體共價或非共價連接。這樣的配體可包含(i)識別細胞、組織或器官特異性元件以促進細胞攝入的化合物(包括但不僅限于肽(樣)結(jié)構(gòu))和/或(ii)能夠促進攝入到細胞中和/或從嚢泡(例如內(nèi)體或溶酶體)中胞內(nèi)釋放寡核苷酸的化合物。這些耙向配體還涵蓋促進寡核普酸穿itifc腦屏障而才聶入到腦中的分子。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，為藥物中的核酸至少提供了用于遞送的賦形劑和/或靶向配體和/或遞送寡核苷酸到細胞和/或增強其細胞內(nèi)遞送的裝置。因此，本發(fā)明還涵蓋這種藥物組合物，其包含本發(fā)明寡核苷酸，并且還包含至少一種用于遞送的賦形劑和/或靶向配體和/或遞送寡核苷酸到細胞和/或增強其細胞內(nèi)遞送的裝置。本發(fā)明還涉及用于減少細胞中包含重復的基因轉(zhuǎn)錄物的方法，所述方法包括施用單鏈或雙鏈寡核苷酸分子，所述寡核普酸分子優(yōu)選包含2，-0-取代的RNA硫代磷酸酯核香酸(例如2，-0-甲基或2，-0-甲氡基乙基RNA硫代磷酸酯核苷酸)、LNA核苷酸或PMO核苷酸，長度為10至50個核苷酸，僅與重復序列互補。所述核普酸可組^^吏用和/或與DNA石危代磷酸酯核普酸一起使用。在本文件及其權(quán)利要求中，動詞"包含"及其變化形式以非限制性含義使用，意指包括此詞后面的項目在內(nèi)，但是不排除沒有具體提及的組合和/或項目。另外，沒有具體數(shù)詞修飾的要素不排除存在多于一個(種)要素的可能性，除非上下文明確要求存在一個(種)且僅存在一個(種)要素。因此，沒有數(shù)詞修飾通常指"至少一個(種)"。圖例圖1:從以不同寡輝苷酸或模擬對照轉(zhuǎn)染的肌管中分離的RNA的Northern印跡。肌管來i自永生化小鼠成肌細胞系，其含有與無(CTG)重復的正常小鼠DMPK基因相鄰的帶有擴增長度約500的(CTG)n重復的轉(zhuǎn)基因人DMPK基因。印跡顯示了人DMPKmRNA(上)、小鼠DMPK(mDMPK)mRNA(中)和小鼠GAPDHmRNA(下)。圖2:通過磷光成像儀(phosphoimager汾析對圖1的人和小鼠DMPK信號進行定量，相對于GAPDH信號進行歸一化。結(jié)^目對于模擬處理(設(shè)為100)來表示。圖3:從含有小鼠-人嵌合DMPK基因的小鼠肌管中分離的總RNA的Northern印跡，其中附DAff^基因的3'部分被包含(CTG)加重復的人16ZM/尸iT基因的相應區(qū)段替換。檢測印跡中的DMPKmRNA(上圖)和小鼠GAPDHmRNA(下圖)。用反義寡核苷酸PS58或?qū)φ辙D(zhuǎn)染細胞。圖4顯示用多種濃度的寡核普酸PS58處理過的DM500肌管的應答。通過Northern印跡分析lC^是磷光成像儀分析對hDMPK的表達進行定量。信號相對于GAPDH信號進行歸一化，并相對于模擬處理后的應答進行表示。圖5顯示在不同時間點(綠前2h、4h、8h和48h)用200nMPS58轉(zhuǎn)染的DM500肌管總RNA的Northern印跡。模擬處理在收獲前48小時進行。Northern印跡顯示人和小鼠DMPK以及小鼠GAPDH的mRNA。通過磷光成像儀分析對它們進行定量，歸一化的DMPK信號相對于模擬處理進行表示。圖6顯示在用200nMPS58或模擬對照轉(zhuǎn)染后2天、4天、6天和8天收獲的DM500肌管總RNA的Northern印跡。如上所述進行Northern印跡分析和定量。圖7顯示經(jīng)寡核苷酸PS58(20和200nM)或模擬對照處理的轉(zhuǎn)化有MyoD的成肌細胞總RNA的Northern印跡分析。所述成肌細胞來自獲得自先天性I型肌強直性營養(yǎng)不良患者的成纖維細胞，所述患者帶有具有長度為約1500的三聯(lián)體重復擴增的hDMPK等位基因以及具有正常長度的11次重復的hDMPK等位基因。將Northern印跡與人DMPK(hDMPK)探針和GAPDHmRNA探針雜交。將人DMPK信號相對于GAPDH信號進行歸一化，并相對于模擬對照進行表示。圖8顯示對轉(zhuǎn)染有200nM僅對(CUG)重復序列具有特異性的寡核苷酸PS58、對外顯子1中序列具有特異性的寡核苷酸PS113或者模擬對照的DM500肌管進行的RT-PCR分析。RT-PCR分析使用對hDMPKmRNA及小鼠中具有天然(CUG)重復的以下三種其它基因轉(zhuǎn)錄物具有特異性的引物來進行帶有(CUG)6的PtbplmRNA、帶有(CUG)6的多配體蛋白聚糖3(Syndecan3)mRNA和帶有(CUG)9的滑行蛋白p(Taxilinbeta)mRNA。將信號強度相對于肌動蛋白信號進行歸一化，并相對于模擬對照進行表示。圖9顯示用200nMPS58(B)或模擬對照(A)轉(zhuǎn)染的DM500成肌細胞的FISH分析。處理開始后48小時，洗滌并固定細胞，然后與熒光標記的寡核苷酸Cy3-(CAG)10-Cy3雜交。使用Bio-RadMRC1024激光共聚焦掃描顯微鏡和LaserSharp2000采集軟件顯現(xiàn)指示hDMPK(CUG)500mRNA在核中積累的核糖核小點。圖IO顯示圖9所示實驗中用PS58或模擬對照轉(zhuǎn)染的DM500成肌細胞的核中存在核糖核小點的相對細胞計數(shù).圖11顯示用PS58或模擬對照處理的DM500小鼠的肌肉中hDMPKmRNA的RT-PCR分析。簡言之，在GPS復合物中將PS58(2nmo1)注射到一歲齡DM500小鼠中，24小時后重復此過程。15天后，分離小鼠跖肌和腓腸肌中，使用總RNA對hDMPK和小鼠肌動蛋白進行RT-PCR。將hDMPK信號的強度相對于肌動蛋白信號進行歸一化，值相對于模擬對照進行表示。圖12顯示用不同寡核普酸(200nM)或模擬對照處理的DM500肌管的Northern印跡分析。PS58、PS146和PS147帶有完全的2，0畫甲J^克代砩酸酯骨架，但長度不同，分別為(CAG)7、(CUG)IO和(CUG)5。PS142具有帶有(CAG)7序列的完全的硫代磷酸酯DNA骨架。將hDMPK和mDMPK信號相對于小鼠GAPDH歸一化，并表示為相對于模擬對照的百分比。下圖顯示定量。實施例實施例1永生化成肌細胞系使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準技術(shù)來源于DM500或CTG110小鼠。DM500小鼠來源于得自巴黎Gourdon小組的小鼠。CTG110小鼠在下文描述，存在于Nijmegen的Wieringa和Wansink小組。將在DMPK基因中具有不同長度(CTG)n重復的永生化成肌細胞系DM500或CTG110生長至亞匯合，并在33匸下5%C02氣氛中維持在以0.1%明膠包被的平皿中。將成肌細胞在添加了20%FCS、50嗎/ml慶大霉素和20單位rf擾素/ml的DMEM中亞匯合培養(yǎng)。通過以下步驟誘導肌管形成在以Matrigel(BDBioscience)包被的平皿上培養(yǎng)成肌細胞，并將匯合的成肌細胞培養(yǎng)物置于37"C下添加有5。/。馬血清和50ng/ml慶大霉素的DMEM中。5天之后，在此低血清培養(yǎng)基上，培養(yǎng)物中出現(xiàn)收縮的肌管，用期望的寡核苷酸對其進行轉(zhuǎn)染。按以下特定順序加入NaCl(500mM，過濾除菌)、寡核苷酸和轉(zhuǎn)染試劑PEI(ExGen500，F(xiàn)ermentas)并直接混勻，以進行轉(zhuǎn)染。根據(jù)說明書(ExGen500,Fermentas),寡核苷酸轉(zhuǎn)染溶液^r微克寡核苷酸5微升的ExGen500。在室溫孵育15分鐘后，將寡核苷酸轉(zhuǎn)染溶液加入到帶有所培養(yǎng)肌管的低血清培養(yǎng)基中，并輕輕混勻。寡核苷酸終濃度為200nM。用不含寡核苷酸的轉(zhuǎn)染溶液進行模擬對照處理。在37t:孵育4小時后，將新鮮培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)物中(得到約2.3x的稀釋液)，繼續(xù)在37X:孵育過夜。第二天除去含有寡核苷酸的培養(yǎng)基，向肌管加入新鮮的低血清培養(yǎng)基，在37C再保持一天。在加入寡核苷酸到肌管培養(yǎng)物后48小時(在轉(zhuǎn)換成誘導肌管形成的低血清條件后第七天),用"總RNA小量試劑盒"(Bio-Rad份離并制備RNA，以用于Northern印跡和RT-PCR分析。將Northern印跡與放射性人DMPK(hDMPK)探針和小鼠GAPDH探針雜交。用于DMPK的探針是人DMPKcDNA，其由帶有完整3，UTR和11個CTG的DMPK開放讀碼框組成。通過磷光成像儀分析來定量人和小鼠DMPK信號，并相對于GAPDH信號進行歸一化。用于hDMPKmRNA的RT-PCR的引物位于3，非翻譯區(qū)，其序列是5，-GGGGGATCACAGACCATT-3，和5，-TCAATGCATCCAAAACGTGGA-3，，用于小鼠肌動蛋白的引物如下肌動蛋白有義5'-GCTAYGAGCTGCCTGACGG-3'和肌動蛋白反義5'-GAGGCCAGGATGGAGCC-3，。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進行電泳分析,信號用Labworks4.0(UVPBiolmagingsystems,Cambridge,UnitedKingdom)進行定量。將每個條帶的強度相對于相應肌動蛋白條帶的強度進行歸一化，并相對于模擬對照進行表示。如上所i^包含帶有長度約500的(CTG)n重復的轉(zhuǎn)基因人DMPK基因和不帶(CTG)重復的正常小鼠DMPK基因的永生化成肌細胞DM500細胞系上測試了13種不同寡核苷酸(總結(jié)見表1)。圖1顯示了從以所述寡核普酸轉(zhuǎn)染的肌管中分離的RNA的Northern印跡分析，其中使用hDMPK探針和用作上樣對照的GAPDH探針來顯現(xiàn)。Northern印跡上的人DMPK(具有CTG重復)和小鼠DMPK(不帶有CTG重復)的定量顯示于圖2。信號相對于小鼠GAPDH進行歸一化，并以相對于模擬對照的方式表示。表2顯示了特異性寡核普酸所引起的hDMPKmRNA水平降低。負(-)代表沒有減少，帶正(+)號的數(shù)字4義表hDMPKmRNA分解的相對水平。顯然，特異性靶向重復序列的寡核苷酸PS58在降低或改變hDMPK轉(zhuǎn)錄物方面比與hDMPK轉(zhuǎn)錄物獨特序列互補的其它寡核普酸強的多。圖3顯示PS58在來自CTG110小鼠的小鼠永生化肌管中的作用，所述小鼠為含具有包含約110個(CTG)重復的人DMPK基因之3，部分的01^卩1(:基因的1|^小鼠。Northern印跡分析顯示，寡核香酸PS58處理減少了含有(CTG)llO重復的DMPK轉(zhuǎn)錄物，但是模擬處理后其沒有減少。實施例2(圖4)如上所述培養(yǎng)、制備并轉(zhuǎn)染帶有包含約(CTG)500重復擴增的人DMPK基因的DM500永生化成肌細胞細胞系(參見實施例1)。在此實施例中，用不同濃度的PS58進行轉(zhuǎn)染。處理開始后84小時，收獲肌管，如上所述對所分離的RNA進行Northern印跡分析(參見實施例1)。圖4顯示用磷光成4象儀分析進行的hDMPKmRNA信號定量，相對于不同濃度的GAPDH進行歸一化。在這些條件下，在約lnM附近觀察到半最高作用。實施例3(圖5和6)如上所述培養(yǎng)、制備并轉(zhuǎn)染帶有包含約(CTG)500重復擴增的人DMPK基因的DM500永生化成肌細胞細胞系(參見實施例l)。但是，在此實施例中，在不同時間點用200nMPS58進行轉(zhuǎn)染。通常在轉(zhuǎn)換到低血清M誘導肌管形成7天后收獲DM500肌管。標準方法(如實施例1和2中)是在收獲前48小時(2天)開始ii行處理(轉(zhuǎn)染)?，F(xiàn)在，在收獲前2至48小時(圖5)或2至8天(圖6)用PS58進行處理。如前述進行Northern印跡分析和定量。圖5顯示，相比于模擬對照處理，DM500肌管中擴增的hDMPKmRNA在用寡核苷酸PS58處理的2小時內(nèi)迅速減少。圖6顯示了DM500肌管中擴增的hDMPKmRNA持續(xù)減少至少8天。應注意，對于8天實驗的情況，在成肌細胞期(約60%匯合度，33匸，高血清)轉(zhuǎn)染細胞，在收獲前它們多次接受新鮮培養(yǎng)基(包括轉(zhuǎn)染后2天時改變?yōu)榈脱?。實施例2和3表明了僅針對重復擴增的寡核苷酸所實現(xiàn)的高效抑制能力。這種作用的強度可受到這些模式細胞系統(tǒng)中相對低20水平hDMPK表達的影響，這也是人體中常見的。實施例4(圖7)在此實施例中，使用了獲得自先天性I型肌強直性營養(yǎng)不良(cDMl)人患者的成纖維細胞。這些患者細胞帶有一個具有長為1500的三聯(lián)體重復擴增的致病DMPK等位基因以及一個重M長為11的正常DMPK等位基因。用PCR和Southern印跡確認在兩個等位基因中的(CTG)n擴增的大小。亞匯合培養(yǎng)成纖維細胞，37°C下5%C02氣氛中維持在以0.1%明膠包被的平皿中。在添加有10%FCS和50嗎/ml慶大霉素的DMEM中亞匯合培養(yǎng)成纖維細胞。通過以下步驟誘導肌管形成在以Matrigel(BDBiosciences)包被的平皿上培養(yǎng)成纖維細胞，在75%匯合時在添加有2%HS和50嗎/ml慶大霉素的DMEM中用表達MyoD的腺病泰Ad5Fib50MyoD，Crucell，Leiden)(MOI-100)感染細胞2小時。賻育期過后，除去MyoD腺病毒，添加含10%FCS和50pig/ml慶大霉素的DMEM。所述細胞^此培養(yǎng)基中維持于37。C的5。/。CO2氣氛下直至100。/。匯合。此時，將細胞置于添加了2%FCS和50ng/ml慶大霉素的DMEM中。5天后，在此低血清培養(yǎng)基中，按照說明書的方法(ExGen500,Fermentas)并如上所述用PS58轉(zhuǎn)染細胞。最終寡核苷酸濃度是200nM和20nM。處理開始后48小時(轉(zhuǎn)換到低血清條件后7天)，用"總RNA小量試劑盒"(Bio-Rad)分離并制備RNA,以用于Northern印跡分析。將Northern印跡與放射性人DMPK(hDMPK)探針和小鼠GAPDHmRNA探針雜交。通過磷光成像儀分析來定量DMPK信號，并針對GAPDH信號進行歸一化，以相對于模擬對照的形式表示。圖7顯示經(jīng)寡核苦酸PS58(20和200nM)處理的轉(zhuǎn)化有MyoD的成肌細胞的Northern印跡分析。結(jié)果證明了對致病的hDMPK(CUG)1500RNA轉(zhuǎn)錄物有效的完全抑制，而較小的正常hDMPK(CUG)llRNA轉(zhuǎn)錄物^fsl僅在兩個濃度下受到輕微影響。因此，針對重復區(qū)域的寡核苷酸顯示出針對較大重復尺寸(或致病擴增)的選擇性。實施例5(圖8)在此實施例中，如上文實施例1中所述培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分析帶有包含約(CTG)500重復擴增的人DMPK基因的DM500永生化成肌細胞細胞系。收獲前48小時，用200nM僅對(CUG)重復序列具有特異性的寡核苷酸PS58、對外顯子1中序列具有特異性的寡核苷酸PS113或者模擬對照處理DM500肌管。針對此小鼠細胞系中表達的hDMPKmRNA(參見實施例1的引物)及小鼠中具有天然(CUG)重復的三種其它基因(帶有(CUG)6的Ptbpl、帶有(CUG)6的多配體蛋白聚糖3和帶有(CUG)9的滑行蛋白|5)的轉(zhuǎn)錄物進行RT-PCR分析。PCR所用引物如下Ptbpl:5'畫TCTGTCCCTAATGTCCATGG國3，和5'-GCCATCTGCACAAGTGCGT-3，；多配體蛋白聚糖3:5，-GCTGTTGCTGCCACCGCT國3"和5，-GGCGCCTCGGGAGTGCTA-3，；滑行蛋白P:5，-CTCAGCCCTGCTGCCTGT-3"和5，-CAGACCCATACGTGCTTATG-3，。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用Labworks4.0程序(UVPBioImagingsystems,Cambridge,UnitedKingdom)進行信號定量。使用相應的肌動蛋白信號對信號強度進行歸一化，表示為相對模擬對照的形式。圖8顯示PS58對hDMPKmRNA表達的最高抑制的RT-PCR結(jié)果。相比于與這些基因轉(zhuǎn)錄物沒有互補序列的寡核苷酸PSU3，帶有天然小(CUG)重復的其它基因轉(zhuǎn)錄物不受(CUG)重復特異性的寡核苷酸PS58影響或僅有輕微影響。此實施例證實了，僅針對重復區(qū)域的寡核苷酸對長片段重復(或引起疾病的擴增)相較于天然較短片段重復的選擇性。實施例6(圖9和10)在此實施例中，培養(yǎng)、用PS58(200nM)轉(zhuǎn)染帶有包含約(CTG)500重復擴增的人DMPK基因的DM500永生化成肌細胞系。本實施例中，對細胞進行FISH分析。開始處理后48小時，用4%甲醛、5mMMgCl2和1xPBS固定細胞30分鐘。與熒光標記的寡核苷酸Cy3-(CAG)10-Cy3在37。C下潮濕腔室中雜交過夜。雜交后，洗滌材料并包埋到mowiol中，使之干燥過夜。使用Bio-RadMRC1024激光共聚焦掃描顯微鏡和LaserSharp2000采集軟件顯現(xiàn)核包含體(核糖核小點)。對總共50個細胞計數(shù)，對這些細胞的核中包含體的存在情況進行評分。文獻顯示，含有(CUG)擴增重復的DMPKmRNA在核內(nèi)累積并聚集，與調(diào)節(jié)性核蛋白和轉(zhuǎn)錄因子一起形成核糖核小點。因此，正常的核基因加工和細胞功能受到損害。圖9顯示了在核內(nèi)含有核糖核包含體的模擬處理的細胞，而在用PS58處理后，它們不再存在于細胞核內(nèi)。圖IO顯示，用PS58處理4吏得DM500肌管中對照條件下可見的含核糖核小點的細胞核的百分比明顯降低。此結(jié)果證明，對hDMPKmRNA表達的抑制還抑制了富含疾病相關(guān)之三聯(lián)體重復(CUG)的包含體。實施例7(圖11)在本實施例中，在含有帶約500個三聯(lián)體(CTG)n擴增的hDMPK的DM500小鼠中體內(nèi)評價PS58的作用。DM500小鼠通過體細胞擴增來源于DM300小鼠(例如，參見Gomes-PereiraM等(2007)PLoSGenet20073(4):e52)。通過Southern印跡和PCR分析確i人約500的(CTG)三聯(lián)體重復擴增。簡言之，按照所附說明書將PS58與轉(zhuǎn)染試劑ExGen500(Fermentas)混合用于體內(nèi)應用。將PS58(2nmol,與Exgen500—^t轉(zhuǎn)染溶液中)(40jil)注射到一歲齡DM500小鼠的GPS復合體中，24小時后重復此過程。作為對照，類似地用不含PS58的轉(zhuǎn)染溶液處理DM500小鼠。15天后，處死小鼠，分離肌肉，從組織中分離總RNA(使用Trizol，Invitrogen)。與上文所述類似，進行RT-PCR分析以檢測肌肉中的hDMPKmRNA。使用Labworks4.0程序(UVPBiolmagingsystems,Cambridge,UnitedKingdom)確定每個條帶的強度，相對于相應肌動蛋白條帶的強度進行歸一化。引物位置如圖所示。圖11顯示相比于模擬處理，體內(nèi)用PS58處理DM500小鼠強烈減少跖肌和崩^腸肌中所存在的含有(CUG)n重復擴增的hDMPKmRNA。實施例8(圖12)在此實施例中，對不同寡核苷酸(在長度和骨架化學性質(zhì)方面不同)但都僅針對(CTG)n重復擴增的序列進行比較。如上文實施例1中所述培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分析DM500肌管。用磷光成像儀分析對Northern印跡定量，將DMPK信號針對GAPDH進行歸一化。這里，用下述寡核苷酸(200nM)處理DM500肌管，所有寡核苷酸均具有減/(戈磷酸酯骨架(參見表3)。圖12顯示，對于所測試的所有寡核苷酸來說，DM500肌管的處理均導致具有(CUG)n擴增的hDMPKmRNA完全減少。在此條件下，所獲得的最高效果不依賴于所用單鏈寡核苷酸的寡核苷酸長度、骨架修飾或可能的抑制機制。實施例9來自男性亨廷頓舞蹈癥患者的成纖維細胞(GM00305)獲得自CoriellCellRepository(Camden,NewJersey,US)，并才艮據(jù)所附說明書和本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標準技術(shù)進行培養(yǎng)。亨廷頓舞蹈癥患者帶有亨廷頓舞蹈癥基因的一個健康的等位基因和一個致病的等位基因，其導致同時表達兩種mRNA，分別帶有正常數(shù)量的和擴增數(shù)量的(CAG)重復。用帶有與亨廷頓mRNA中(CAG)三聯(lián)體重復互補的帶有(CUG)7序列的21聚體2，0-甲M代磷酸酯RNA反義寡核苷酸PS57轉(zhuǎn)染成纖維細胞。如制造商所指示，在100或200nM的PEI存在下進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時，收獲細胞，分離總RNA，通過RT-PCR進行分析。4吏用下游外顯子64中的引物(5，GAAAGTCAGTCCGGGTAGAACTTC3，和5，CAGATACCCGCTCCATAGCAA3，)確定亨廷頓轉(zhuǎn)錄物。此方法對兩種類型的亨廷頓mRNA(正常的和具有額外(CAG)擴增的突變轉(zhuǎn)錄物)都進行檢測。還測定了GAPDHmRNA(看家基因)。對信號進行定量，將亨廷頓mRNA的總量相對于相同樣品中GAPDHmRNA的量進行歸一化。結(jié)果以相對于來自成纖維細胞的對照處理(無寡核苷酸，其為100%)樣品的形式表示。在來自用100或200nMPS57轉(zhuǎn)染的成纖維細胞的樣品中，觀察到相比于對照處理的細胞分別為約53%和66%的顯著更低的總亨廷頓mRNA水平。因此，僅針對(CAG)重復的寡核普酸PS57誘導亨廷頓mRNA水平的降低，這些結(jié)果與相對于正常亨廷頓舞蹈癥mRNA而選擇性抑制突變體相一致。表l:所測試的寡核苷酸總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>*所有寡核苷酸均全長為硫代磷酸酯并取代權(quán)利要求1、單鏈寡核苷酸用于制備治療或預防人順式元件重復不穩(wěn)定性相關(guān)遺傳病的藥物中的用途，所述單鏈寡核苷酸包含僅與基因轉(zhuǎn)錄物中重復序列互補的序列，或者由所述序列組成。2、根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中所述重復元件存在于基因轉(zhuǎn)錄物的編碼序列中。3、根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述重復元件存在于基因轉(zhuǎn)錄物的非編碼序列中。4、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述寡核苷酸包含與選自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n、(CCG)n、(GAA)n、(GCC)n和(CCUG)n的重復元件互補的序列，或者由所述序列組成。5、根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述寡核苷酸包含與多谷氨酖胺(CAG)n節(jié)段互補的序列或者由所述序列組成，并且其中所述重復不穩(wěn)定性疾病是亨廷頓舞蹈癥、脊髓小腦共濟失調(diào)、Haw-River綜合征、X連鎖脊M髓肌營養(yǎng)不良和/或齒狀核紅核蒼白球丘腦下部核萎縮。6、根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述寡核苷酸包含與多丙氨酸(GCG)n節(jié)段互補的序列或者由所述序列組成，并且其中所述重復不穩(wěn)定性疾病選自嬰兒痙攣綜合征、顱骨鎖骨發(fā)育不全、瞼裂狹小、手-足-生殖器綜合征、并指多指、眼咽肌營養(yǎng)不良和/或前腦無裂畸形。7、根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述寡核苷酸包含與(CUG)n重復互補的序列或者由所述序列組成，并且其中所述重復不穩(wěn)定性疾病是I型肌強直性營養(yǎng)不良、8型脊髓小腦共濟失調(diào)和/或2型亨廷頓舞蹈癥樣疾病。8、根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述寡核苷酸包含與(CCUG)n重復互補的序列或者由所述序列組成，并且其中所述重復不穩(wěn)定性疾病是II型肌強直性營養(yǎng)不良。9、根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述寡核苷酸包含與(CGG)n重復互補的序列或者由所述序列組成，并且其中所述重復不穩(wěn)定性疾病AJ晚性X綜合征。10、根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述寡核苷酸包含(GAA)n重復互補的序列或者由所述序列組成，并且其中所述重復不穩(wěn)定性疾病是弗里德賴希共濟失調(diào)。11、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述寡核苷酸的長度為約10至約50個核普酸，優(yōu)選12至30個核普酸。12、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述寡核苷酸由以下構(gòu)成具有或不具有包含石危代磷酸酯的骨架的RNA核苷酸、DNA核苷酸、鎖核酸(LNA)核苷酸、肽核酸(PNA)核苷酸、嗎啉代磷酰二胺(PMO)、亞乙基橋聯(lián)核酸(ENA)核苷酸或其混合物。13、根據(jù)權(quán)利要求12的用途,其中所述寡核苷酸包含2，-0-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸。14、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述藥物中的寡核苷酸由能夠表達所述寡核苷酸的核酸載體來提供。15、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述藥物中的寡核苷酸至少與用于遞送所述寡核苷酸至細胞和/或增強其胞內(nèi)遞送的賦形劑和/或靼向配體一起提供。16、單鏈寡核苷酸，其包含與選自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n、(GAA)n、(GCC)n和(CCUG)n的重復序列互補的序列或者由其組成長度為10至50個核苷酸。17、根據(jù)權(quán)利要求16的寡核普酸，其還包含2，-0-取代的RNA硫代磷酸酯核苷酸、DNA硫代磷酸酯核苷酸、鎖核酸(LNA)核苷酸、嗎啉代核苷酸和/或其組合。18、根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項所定義的寡核苷酸，其帶有放射性標記或熒光標記。19、包含根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項所定義寡核苷酸的藥用組合物。20、權(quán)利要求19的可藥用組合物，其還包含至少一種用于遞送所述寡核苷酸至細胞和/或增強其胞內(nèi)遞送的賦形劑和/或靶向配體。21、能夠使得權(quán)利要求1-18中任一項所定義的寡核苷酸在人細胞中表達的核酸載體，優(yōu)選病毒載體。22、減少細胞中含重復的基因轉(zhuǎn)錄物的方法，其包括施用權(quán)利要求1-18中任一項所定義的寡核普酸。23、體外或離#^測和/或診斷方法，其中使用權(quán)利要求17-18中任一項所述的寡核苷酸。全文摘要本發(fā)明提供了施加僅與人基因轉(zhuǎn)錄物中重復性序列互補的寡核苷酸分子的方法和藥劑，還提供了對用以診斷、治療或預防人體中與順式元件重復不穩(wěn)定性相關(guān)的遺傳病之藥劑的制備。因此，本發(fā)明提供了治療與順式元件重復不穩(wěn)定性相關(guān)的遺傳病的方法。本發(fā)明還涉及可在本發(fā)明中應用以阻止重復序列擴增的轉(zhuǎn)錄物在細胞內(nèi)積累和/或翻譯的經(jīng)修飾寡核苷酸。文檔編號C12N15/11GK101501193SQ200780029848公開日2009年8月5日申請日期2007年8月10日優(yōu)先權(quán)日2006年8月11日發(fā)明者德里克·格特·萬辛克,約瑟夫斯·約翰內(nèi)斯·德金佩,赫拉德·約翰內(nèi)斯·普拉滕伯格申請人:普羅森那技術(shù)公司