專利名稱：：具有免疫作用的質(zhì)粒的制作方法具有免疫作用的質(zhì)粒描述本發(fā)明的目標(biāo)體現(xiàn)為用于轉(zhuǎn)染真核和原核細胞的重組質(zhì)粒，其具有介于7和12千堿基(kbase)的長度，并包含編碼免疫球蛋白的重鏈的序列。本發(fā)明的進一步目標(biāo)體現(xiàn)為前述質(zhì)粒用于在人類或動物生物體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥物制劑或疫苗制備的用途或治療性處理的用途。特別地，所描述和要求保護的是用于構(gòu)建質(zhì)粒的堿基序列，所述質(zhì)?？捎糜?轉(zhuǎn)染原核或真核細胞(間接體內(nèi)(exvivo))的過程，所述原核或真核細胞可接種于高等生物以誘導(dǎo)預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答(特別是用具有序列SEQIDNO.1的質(zhì)粒1);-基因免疫方法學(xué)中定向接種(directinoculation)(體內(nèi))于高等生物的方案，以誘發(fā)預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答(特別是用具有序列SEQIDNO.2的質(zhì)粒2)。還描述了可使用所述質(zhì)粒治療的病理學(xué)特性(profile)。技術(shù)狀態(tài)質(zhì)粒來源的DNA可通過已知方法用于轉(zhuǎn)染原核和真核細胞。為此目的構(gòu)建的質(zhì)粒一般由具有編碼某個蛋白的遺傳物質(zhì)的插入單元的骨架構(gòu)成，所述蛋白可提供或可不提供其自身的生物學(xué)活性。所述質(zhì)?？梢允巧虡I(yè)來源的，其中攜帶特異性的部分根據(jù)在所述質(zhì)粒所指定的生物體中待重建的某個特性被引入已經(jīng)知道和使用或自發(fā)產(chǎn)生(即通過組裝選擇的遺傳物質(zhì)的片段)的結(jié)構(gòu)構(gòu)建體。質(zhì)粒合成是對于獲得需要的細胞性能的目的具有基本重要性的操作。質(zhì)粒決定轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)基因蛋白合成的效率，并且也決定轉(zhuǎn)染的安全性，并由此在最終的分析中決定轉(zhuǎn)染細胞的蛋白表達的綜合效率。質(zhì)粒是遺傳數(shù)據(jù)的載體，遺傳數(shù)據(jù)影響宿主細胞的細胞周期，并因此影響容納(hosts)這些轉(zhuǎn)染的細胞的生物體的生命周期向質(zhì)粒中引入的數(shù)據(jù)越多，在轉(zhuǎn)染過程中遇到的風(fēng)險越大。質(zhì)粒的特征在于所包含的數(shù)據(jù)的特異性其復(fù)雜性越小，則其越易合成，其使用越安全。質(zhì)粒執(zhí)行轉(zhuǎn)染細胞群體的能力，這或多或少自發(fā)地取決于細胞的類型和執(zhí)行轉(zhuǎn)染的接觸/溫育實驗條件。質(zhì)粒對特定細胞群體的選擇性越強，其在安全條件下的用途越大。執(zhí)行轉(zhuǎn)染的條件對其成功具有決定作用待轉(zhuǎn)染細胞的均質(zhì)性和濃度、溫育時間和條件、使用特異性和選擇性方法監(jiān)控現(xiàn)象的可能性構(gòu)成了決定操作成功的極其重要的因素。在使用質(zhì)粒在患者體內(nèi)轉(zhuǎn)染待注射細胞的特異性情況下，對所述細胞的操作要極其小心，因為它們必須重新插入患者，并且不能有危險和致命的間接現(xiàn)象操作必須要少，方法的安全性越高，結(jié)果的可重現(xiàn)性越大。由上所述，必然得出，使用具有降低的大小的質(zhì)粒，特別是如果與具有有限操作的方法結(jié)合，是用于預(yù)防性和治療性目的的轉(zhuǎn)染中優(yōu)選的條件。在自體轉(zhuǎn)染方法中使用編碼免疫原性表位的質(zhì)粒是可用于在一些病理學(xué)中誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的系統(tǒng)之一，所述病理學(xué)的特征在于出現(xiàn)感染媒介(infectingagent),或在于自發(fā)的或誘導(dǎo)的細胞突變(致癌作用)，并且選擇的細胞或細胞系的凋亡過程具有修飾。WO90/09804描述了基因工程設(shè)計免疫球蛋白，其在所述免疫球蛋白的可變區(qū)或結(jié)合結(jié)構(gòu)域表達預(yù)定的肽表位。WO00/61766描述了端粒酶(telomerasis)來源的腫瘤抗原，其可用于產(chǎn)生針對端粒酶和因此針對腫瘤自身的T細胞介導(dǎo)的應(yīng)答。6wo00/64488描述了編碼嵌合的免疫球蛋白重鏈的質(zhì)粒，pN力Vh62質(zhì)粒，其是通過將鼠Vh62基因亞克隆至含有編碼人類yi恒定區(qū)的序列的pN力質(zhì)粒獲得的。此質(zhì)?？赏ㄟ^在可變區(qū)的任何互補性決定區(qū)域(complementaritydeterminingregions)引入異源表位進4亍〈'l"飾。因此，公開了其在用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法中的應(yīng)用。但是，如果將pN力Vh62質(zhì)粒注射至人類，此質(zhì)粒含有有害的部分。此外，此質(zhì)粒的大小使其獲得非常低的轉(zhuǎn)染產(chǎn)率(transfectionyield)。發(fā)明描述本發(fā)明人現(xiàn)在開發(fā)了包含編碼免疫球蛋白的重鏈的序列的質(zhì)粒，當(dāng)用于在人類或動物生物體中體內(nèi)或間接體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答時，所述質(zhì)粒不存在pNyiVh62質(zhì)粒的缺點。特別地，所開發(fā)的質(zhì)粒具有更好的安全特性，并在轉(zhuǎn)染至細胞時顯示增加的產(chǎn)率。這些質(zhì)粒具有介于7和12千堿基、優(yōu)選地介于8和12千堿基、更優(yōu)選地介于9和11千堿基和甚至更優(yōu)選地介于9和10千堿基的長度，并且在它們被轉(zhuǎn)染至淋巴細胞時能夠表達免疫球蛋白的重鏈。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，這些質(zhì)粒表達嵌合的免疫球蛋白重鏈，所述免疫球蛋白重鏈優(yōu)選地包含鼠可變區(qū)和人類恒定區(qū)(優(yōu)選地Igyl)。所述鼠可變區(qū)優(yōu)選地是產(chǎn)生自成年高免疫小鼠脾細胞的雜交瘤62的Vn區(qū)(Zanetti等人.j./附ww"o/.,1983，131:2452),下文稱作VH62區(qū)。VH62雜交瘤62分泌具有抗甲狀腺球蛋白(anti-tyroglobulin)活性的單克隆抗體。Igyl區(qū)基因優(yōu)選地克隆自載體pNYl。所述質(zhì)?？蛇M一步含有淋巴細胞特異性啟動子(優(yōu)選地大約50bp),或病毒來源的啟動子(優(yōu)選地CMV啟動子)。本發(fā)明的質(zhì)粒優(yōu)選地還包含多聚腺苷酸化序列AATAAA。優(yōu)選的是本發(fā)明的質(zhì)粒不表達對(3內(nèi)酰胺抗生素特別是氨千青霉素的抗性和/或不包含SV40的復(fù)制起點。7因此，所述質(zhì)粒優(yōu)選地含有大腸桿菌(Esc/2^7c/2/aCO")的復(fù)制起點，優(yōu)選地PBR322。此外，所述質(zhì)粒優(yōu)選地表達對新霉素的抗性。本發(fā)明的優(yōu)選質(zhì)粒是質(zhì)粒1和2。質(zhì)粒1長9727bp(SEQIDNO.1和圖1)，質(zhì)粒2長10004bp(SEQIDNO.2和圖2)。所述的兩種質(zhì)粒均編碼嵌合的免疫球蛋白重鏈。兩種質(zhì)粒間的唯一結(jié)構(gòu)差異是由特異性啟動子確定的，其在質(zhì)粒l的情況下為50bp的淋巴細胞特異性啟動子，在質(zhì)粒2的情況下為大小742bp的病毒啟動子。所述質(zhì)粒的骨架由pSV2neo表示，其為一種含有新霉素抗性基因和復(fù)制起點PBR322的細菌來源的DNA。編碼重免疫球蛋白鏈的基因序列主要由以下區(qū)域組成-大約2.5kb的鼠可變區(qū)(VH62)，其最初克隆自分泌具有抗甲狀腺球蛋白活性的單克隆抗體的小鼠雜交瘤(雜交瘤62)(Sollazzo等人，,//^■"o/.，1989);-產(chǎn)生自pNyl載體(HybritechCorporation,SanDiego，CA)的人類Igyl恒定區(qū)。質(zhì)粒1的免疫球蛋白啟動子是Vh62的完整部分，而質(zhì)粒2的病毒啟動子產(chǎn)生自質(zhì)粒phMGFP(Promega，WI，USA)。新霉素抗性基因還賦予對卡那霉素的抗性，以用于原核細胞的選擇性生長。多聚腺苷酸化序列位于所述質(zhì)粒的位置5178:5183，在人類恒定區(qū)之后。所述序列如下AATAAA。細菌復(fù)制的起點是大腸桿菌的，位于位置8324:9264。本發(fā)明的質(zhì)粒的特殊特征是所編碼的蛋白的決定互補性的區(qū)域(CDR)可進行誘變，以向其中引入具有抗原性能的表位(5至25個氨基酸殘基)(Gerloni等人iVaft/w說'0&c/2"0/0gy1997)。所述性能使得使用相關(guān)質(zhì)粒誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答成為可能，所述誘導(dǎo)是通過用自發(fā)轉(zhuǎn)染的細胞接種物間接體內(nèi)轉(zhuǎn)染，或通過體內(nèi)定向"t妻種(基因免疫)。因此，本發(fā)明的一個目標(biāo)是使用本發(fā)明的質(zhì)粒制備用于DNA疫苗接種，特別是用于在人類或動物生物體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥物制劑。此外，本發(fā)明的另一個目標(biāo)是含有至少一種如前述權(quán)利要求的任一項所述的質(zhì)粒以及藥學(xué)可接受賦形劑和/或輔佐劑的制劑。本發(fā)明的制劑可用于預(yù)防性或治療性目的。本發(fā)明的制劑可特別地用于受或曾受以下侵害的人類或動物生物體-屬于癌和/或腺瘤和/或肉瘤和/或脂瘤和/或?qū)嶓w瘤和/或腹水瘤家族的腫瘤，前列腺或胰腺、腎或肺癌。優(yōu)選地，在此情況下，所述生物體受或曾受在表面上具有至少一個抗原性表位的腫瘤細胞的存在的侵害，所述抗原性表位的編碼序列包含在所述質(zhì)粒中。-細菌、病毒、真菌和/或寄生物感染。本發(fā)明的進一步目標(biāo)是在人類或動物生物體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。所述方法包括間接體內(nèi)轉(zhuǎn)染原核和/或真核細胞，將所述原核和/或真核細胞隨后接種于所述人類或動物生物體。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)染細胞屬于淋巴細胞(limphocytes)家族，并且優(yōu)選地釆自所述人類或動物生物體的外周血管?？蛇x地，所述方法包括將質(zhì)粒體內(nèi)接種于所述人類人類或動物生物體。將所述質(zhì)粒或所述原核和/或真核細胞接種于所述人類或動物生物體優(yōu)選地是通過注射或跨縣膜施用執(zhí)行的。本發(fā)明的質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)像所有免疫球蛋白一樣擁有3個CDR，CDR1具有用于插入肽序列AfiIII的限制位點，CDR2具有Ncol位點，CDR3具有Acc65I位點。因此可以向所述CDR插入不同的肽序列，所述肽序列能夠誘發(fā)體液同免疫應(yīng)答；例如，可以在每個CDR上插入至少一個序列，總共三個序列，所述序列能夠誘發(fā)不同免疫應(yīng)答；可以進一步在每個CDR上插入一個或多個序列，所述序列任選地彼此融合。向CDR插入抗原性表位的實例顯示于圖3。優(yōu)選用于本發(fā)明目的的抗原性表位是-腫瘤抗原，如例如端粒酶的抗原和甚至更優(yōu)選地p540(ILAKFLHWL)、p572(RLFFYRKSV)、pY572(YLFFYRKSV)和p865(RLVDDFLLV);畫產(chǎn)生自傳染性微生物的抗原，如例如流感病毒(influenza)的抗原，優(yōu)選地表位pNP(ASNENMETM)。由質(zhì)粒1和2編碼的(encoded)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物是分子量為大約156.000道爾頓的蛋白質(zhì)(圖4)。所編碼的重區(qū)(heavyregion)本質(zhì)上是嵌合的部分人類的(恒定區(qū))和部分鼠的(可變區(qū))。不過，鼠部分含有與人類可變區(qū)80%同源的序列。前述質(zhì)粒的重要特征是不存在氨千青霉素抗性基因，但存在卡那霉素抗性基因，這提供了其在可能對卩內(nèi)酰胺抗生素過敏的受治療者中的安全應(yīng)用。另一個有利因素是卡那霉素是在37。C(所述質(zhì)粒的培養(yǎng)條件)下穩(wěn)定24-48小時的抗生素，而氨節(jié)青霉素僅穩(wěn)定3-4小時，因此允許培養(yǎng)產(chǎn)率更高(更廉價的生產(chǎn))和更穩(wěn)定的質(zhì)粒。前述質(zhì)粒還完全沒有"無用"序列(例如序列SV40或基因組物質(zhì)的片斷(piece)),其可代表與宿主細胞基因組同源的更大風(fēng)險，因而有在細胞本身中整合的更大風(fēng)險。質(zhì)粒的限制圖諶分析通過用限制酶進行消化獲得的限制圖語是確定質(zhì)粒的同一性要考慮的第一標(biāo)準(zhǔn)。特別地，圖5中顯示的圖譜以嚴(yán)格的(exclusive)方式鑒定了質(zhì)粒1和2。還接連顯示了質(zhì)粒1消化后的片段在瓊脂糖凝膠上運行(與已知大小的標(biāo)準(zhǔn)(lKb梯)平行)的圖像，以確定其精確大小。質(zhì)粒1的序列顯示為SEQIDNO.1，而質(zhì)粒2的序列顯示為SEQIDNO.2。質(zhì)粒的生物表征前文已經(jīng)表明轉(zhuǎn)染方法中編碼免疫原性表位的質(zhì)粒是可用于在一些病理學(xué)中誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的系統(tǒng)之一，所述病理學(xué)的特征在于出現(xiàn)感染媒介，或在于自發(fā)的或誘導(dǎo)的細胞突變(致癌作用)，并且選擇的細胞或細胞系的凋亡(apoptic)過程具有修飾。所述質(zhì)粒的進一步用途是體內(nèi)定向注射(directinjection)至具有免疫能力的生物體中，以誘導(dǎo)針對外源性質(zhì)的蛋白質(zhì)和病原性微生物的免疫應(yīng)答(Tang等人，Ato騰1992，Ulmer等人，S"'ewce1993，Gerloni等人,說ofecA"o/ogv1997)。在此領(lǐng)域中，已證明使用功能基因接種誘導(dǎo)體液應(yīng)答(由抗體介導(dǎo))和細胞介導(dǎo)的應(yīng)割由CD4和CD8型的T-淋巴細胞介導(dǎo))有效治療或預(yù)防感染和癌起源的病理學(xué)。因此，全世界的疫苗學(xué)家現(xiàn)在已采用基因免疫的概念，他們使用編碼產(chǎn)生自細菌、病毒和寄生物以及自不同類型的腫瘤的抗原的質(zhì)粒，以誘發(fā)特異性和保護性免疫應(yīng)答。治療或預(yù)防HIV、皰滲、流感、禽流感、SARS、乙型和丙型肝炎和不同類型的癌的臨床試驗?zāi)壳罢谶M行中。有待在體內(nèi)使用的質(zhì)粒的基本組成是編碼感興趣的抗原(或其片斷)的基因、指導(dǎo)所述抗原的轉(zhuǎn)錄的啟動子序列(一般產(chǎn)生自巨細胞病毒，CMV)、確保其翻譯的多聚腺香酸化區(qū)。此外，同用于在細菌細胞中擴增質(zhì)粒的復(fù)制起點一起的還有編碼抗生素抗性的基因，以確保細菌群體的選擇和消除培養(yǎng)過程中的污染。DNA疫苗的另一個固有性質(zhì)是細菌來源的質(zhì)粒含有非甲基化胞嘧啶以及鳥嘌呤殘基的序列(CpG)。這些CpG單元能夠增加質(zhì)粒本身的免疫能力，并因此充當(dāng)佐劑。將核酸定向接種至體細胞看起來是模擬天然感染誘導(dǎo)的免疫，并提供不同的優(yōu)點，包括可以廉價、容易和快速的方式產(chǎn)生和檢驗所述質(zhì)粒。此外，所述質(zhì)粒比常規(guī)的疫苗穩(wěn)定得多，并可以凍干物保存。所述質(zhì)粒通常通過肌內(nèi)或皮內(nèi)路徑進行體內(nèi)接種，但是也可使用其它路徑，如口、陰道、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下路徑。所述質(zhì)粒于各種稀釋劑中施用，所述稀釋劑包括蒸餾水、鹽水或糖溶液、生理緩沖液、等滲化合物(isotonicisingcompounds)、防腐劑或《氐溫防護物質(zhì)(如果凍干過程是必需的)。免疫方案中使用的質(zhì)粒劑量因情況不同而有所差異，但是一般說來，使用每次給藥25至200嗎的量，3次給藥/注射，每次間隔三周。因此本發(fā)明的進一步目標(biāo)由兩個重組質(zhì)粒組成，所述質(zhì)粒的特征在于分別對應(yīng)于SEQIDNO.1和SEQIDN0.2的序列，或與SEQIDNO.1和SEQIDN0.2至少90%同源、優(yōu)選地95%同源的序列。這些質(zhì)粒具有降低但適合所述目的的大小，和合適的、可重復(fù)的、安全的和有效的轉(zhuǎn)染方法。所述質(zhì)粒的用途具有特異的特征-生產(chǎn)過程中的最佳產(chǎn)率，因為如果降低大小(amplitude),測量含量的質(zhì)粒更加容易生產(chǎn)，并產(chǎn)生更好的產(chǎn)率；-細胞培養(yǎng)物的最佳穩(wěn)定性，因為質(zhì)粒含有抗生素卡那霉素的抗性基因，卡那霉素在37°C下穩(wěn)定24-48小時(與氨千青霉素在相同溫度下僅穩(wěn)定4-6小時相反)，所述細菌培養(yǎng)物的穩(wěn)定性因此顯著增加，這對產(chǎn)量無疑是有利的；-高效率的自發(fā)轉(zhuǎn)染(滲透入細胞的能力)，因為所含的分子大小和更小的空間體積，其為其中正視自發(fā)轉(zhuǎn)染的使用的方案中不容忽視的細節(jié)；-如果預(yù)先安排與氨卡青霉素的過敏反應(yīng)，治療的受治療者無誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的可能性，因為所述質(zhì)粒不含有氨卡青霉素抗性基因，其在存在該抗生素時不生長；-整合至宿主細胞基因組的低可能性(如果不是沒有)，因為轉(zhuǎn)染使用的質(zhì)粒的量極小，使得實際可忽略整合的風(fēng)險(因此降低的在宿主細胞中誘導(dǎo)致癌突變的可能性)；-定向整合至宿主細胞基因組的低可能性(如果不是沒有)，因為質(zhì)粒不含有可能與細>5包自身的基因組具有同源性的外源序列(extraneoussequence)(如SV40),所述外源序列代表更高的整合風(fēng)險；-基因免疫方案中使用所述質(zhì)粒進行體內(nèi)定向注射的高靈活性。事實上，通過將核苷酸序列中B細胞特異性的啟動子置換為具有更廣泛表達的病毒啟動子(CMV),所述質(zhì)粒的用途通過簡單的間4妻體內(nèi)轉(zhuǎn)染擴大至在高等生物中定向"l妻種的用途。12本發(fā)明的進一步目標(biāo)由使用間接體內(nèi)轉(zhuǎn)染方法，而不使用可能促進該過程的任何物理或化學(xué)手段構(gòu)成。所述方法不誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細胞的功能性的擾亂，并且不誘導(dǎo)其遺傳轉(zhuǎn)化。所述方法的特征在于從其余的外周血的顆粒(corpuscular)和體液部分中分離待轉(zhuǎn)染的特異性細胞材料，其可使用比普通的離心方法具有更少的操作的過程獲得使用單采血液成分術(shù)(apheresis)使得分離大量的淋巴細胞成為可能，其可用于以對患者無痛并且對于實驗?zāi)康挠杏玫枚嗟姆绞綀?zhí)行轉(zhuǎn)染。事實上-其不會用重力或機械沖擊擾亂細胞的功能性；-其允許采集大量細胞以用于所述過程和保存作為后期治療性監(jiān)控階段的參照；-其不會使患者的功能和結(jié)構(gòu)資源或其凝血或修復(fù)過程枯竭；-其不會增加生物材料和/或患者污染的任何風(fēng)險。本發(fā)明的一個目標(biāo)是由通過采用下列形式的自發(fā)過程，使用所述質(zhì)粒影響所選細胞的間接體內(nèi)轉(zhuǎn)染而構(gòu)成1.將來源于患者的外周血轉(zhuǎn)移至能夠直接從剩余的顆粒組分和從血清中分離淋巴細胞家族(單釆血液成分術(shù)過程)的儀器；2.分離大量適合下文所述的處理應(yīng)用的淋巴細胞；然后轉(zhuǎn)移分離的淋巴細胞，用？88(不含03++和!\^++)洗滌并進一步離心；3.用錐蟲藍(tryptanblue)l:l稀釋，通過血J求計和顯微鏡對淋巴細胞進行計數(shù)，以確保它們保留了至少90%的活力；4.將淋巴細胞以大約20x106個細胞/ml的濃度重懸于PBS(不含Ca++和MgW)，并重新分成小份至具有U-形孔的平板中，其中加入了25貼具有SEQIDNO.1所示序列的質(zhì)粒；5.將具有轉(zhuǎn)染孔的平板在溫育器中于37°C和5%C02下溫育30-90分鐘；6.將合適小^盼的用質(zhì)粒處理的細胞轉(zhuǎn)移至合適的培養(yǎng)基中，讓其溫育一夜；7.檢查細胞活力保持在認為合適的閾值(通常70%)之上，計算待轉(zhuǎn)染至患者的劑量；8.將含有要重新施用至患者的劑量的合適體積的轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)移至靜脈輸液袋(通常具有數(shù)千至數(shù)千萬個細胞的差異)；9.在意在引起針對在表面表達所述質(zhì)粒中含有其表位的蛋白的細胞免疫應(yīng)答的治療范圍內(nèi)，向患者接種袋中含有的血液，通過使用具有SEQIDNO.1所示序列的質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)基因。作為上述方法的替代，要轉(zhuǎn)染的淋巴細胞的分離還可通過基于離心的經(jīng)典方法執(zhí)行；那樣的話，上文條目l和條目2中描述的單采血液成分術(shù)處理可置換為以下1.將來源于患者的外周血轉(zhuǎn)移至試管，加入含菲可(Ficoll)的緩沖液，離心，直至淋巴細胞層積為明顯的條帶；2.轉(zhuǎn)移分離的淋巴細胞，用PBS(不含Ca吣和MgW)洗滌并進一步離心。使用上文所述降低大小的質(zhì)粒和所選細胞群體使得從所述過程獲得優(yōu)勢成為可能，如減少的血液和其淋巴細胞組分的^f喿作時間、減少的溫育時間、基本可重復(fù)的過程產(chǎn)率、在所述過程的不同步驟實現(xiàn)高度自動化的可能性和在分離的設(shè)備內(nèi)直接執(zhí)行轉(zhuǎn)染過程的可能性，其不需要在設(shè)備自身以外的工作環(huán)境中釆用無菌條件，而這是操作意在用于人類施用的生物體液所需要的。本發(fā)明的一個目標(biāo)由以下構(gòu)成使用所含大小和特征在于所述序列的質(zhì)粒，使用具有減少的操作的分離待轉(zhuǎn)染的材料的方法，所述轉(zhuǎn)染條件在治療的患者中誘導(dǎo)針對引起感染或突變的媒介的免疫應(yīng)答，其中序列和構(gòu)象水平的特異性印跡包含在所述質(zhì)粒表示的遺傳物質(zhì)中。本發(fā)明的進一步目標(biāo)由在其中執(zhí)行質(zhì)粒和細胞溫育的設(shè)備的用途構(gòu)成，其特征在于存在其中容納所需體積的細胞的空間、通過其插入針以儲存質(zhì)粒溶液的端口(port)和通過其實現(xiàn)轉(zhuǎn)染細胞的取樣的任選的其它端口。在本發(fā)明的典型應(yīng)用中，具有SEQIDNO.1所示序列的質(zhì)粒用于通過單采血液成分術(shù)方法從血液中分離的淋巴細胞群體；這些轉(zhuǎn)染的細胞在于生物體液使用的普通條件下溫育之后被注射回患者，以誘導(dǎo)免疫類型的應(yīng)答。在本發(fā)明的進一步應(yīng)用中，按所述方法構(gòu)建的質(zhì)粒用于在所述條件下轉(zhuǎn)染通過單采血液成分術(shù)或離心從患者采集的淋巴細胞群體，所述患者受胰腺或前列腺、肺、腎或皮膚腫瘤侵害，或受一些其它類型的腺瘤性或癌性或其它腫瘤形式(無論是實體瘤或腹水瘤形式)侵害，以在患者自身中誘導(dǎo)僅針對在表面表達包含在所述質(zhì)粒中的蛋白組分的癌細胞的選擇性免疫應(yīng)答，和通過這些造成表達淋巴細胞，用作APC(呈遞抗原的細胞)。在本發(fā)明的進一步應(yīng)用中，SEQIDNO.1所示的質(zhì)粒進行了改良，將用于淋巴細胞的啟動子置換為病毒來源的啟動子(CMV)。所述置換產(chǎn)生了大小稍微大一些(300bp)的質(zhì)粒(如SEQIDNO.2所示)，并用于通過直接腸胃外(肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi))施用或跨黏膜施用(通過鼻、口、腸或陰道黏膜)在生物體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。對所述質(zhì)粒進行以下能力的評估1.自發(fā)轉(zhuǎn)染人類淋巴細胞的能力；2.在間接體內(nèi)注射轉(zhuǎn)染細胞時在實驗小鼠中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力；3.在基因免疫方案中，在直接注射質(zhì)粒2時在實驗小鼠中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。下列實例僅意在作為本發(fā)明的非限制性說明。質(zhì)粒l根據(jù)下列方案構(gòu)建1.質(zhì)粒PSV2neo的改良-質(zhì)粒PSV2neo用限制酶Ahdl和Xmnl消化，以除去氨千青霉素抗性區(qū)段(amp1)。-PSV2neo(除去amp，用BsmBI和HindIII消化，以除去復(fù)制起點SV40(SV40)-PSV2neo(除去ampr和s"o)用AatII和BstBI消化。此過程結(jié)束時，得到含有大腸桿菌(五.Co/0復(fù)制起點和新霉素/卡那霉素抗性基因的2737堿基對片段。從瓊脂糖凝膠分離此片段，在柱上純化，并保持于4°C，直至后續(xù)使用。2.質(zhì)粒idVh62的改良-質(zhì)粒ylVH62用限制酶Fsel和BamHI消化，以除去編碼人類基因組DNA的4787堿基對區(qū)段-由此產(chǎn)生的質(zhì)粒(除去DNAM纟Jt)環(huán)化(circularised),具有10721堿基對的新大小。其用AatII和BstBI消化，純化含有可變和恒定區(qū)的片段以用于后續(xù)連接反應(yīng)3.最終的質(zhì)粒1的構(gòu)建醫(yī)產(chǎn)生自第1段的質(zhì)粒PSV2neo(除去amp"sv40，AatII和BstBI消化。畫產(chǎn)生自第2段的改良質(zhì)粒y1Vh62(除去DNA基目組)用AatII和BstBI消化。-由此消化的所述兩個改良質(zhì)粒連接，并用于轉(zhuǎn)染有能力的大腸桿菌細胞。從所述大腸桿菌細胞中提取的質(zhì)粒DNA然后通過PCR、限制圖鐠和測序用于鑒定測試。4.最終的質(zhì)粒2的構(gòu)建-質(zhì)粒1用DraII和Bcll消化，以除去其中包含的免疫球蛋白啟動子畫通過相同的消化從質(zhì)粒phMGFP除去病毒啟動子CMV-通過PCR，向無啟動子的質(zhì)粒1添加啟動子CMV,以獲得質(zhì)粒2。下列實施例僅意在作為本發(fā)明的非限制性說明。實施例1.將一小份大約50ml來自患者的外周血(已加入合適小份的抗凝血劑)轉(zhuǎn)移至50ml管中，以緩沖液1:1稀釋，加入20ml的菲可-帕克頂16(Ficoll-PaqueTM),離心于2000rpm下執(zhí)行20分鐘。離心后，收集包含于界面條帶的淋巴細胞，將其轉(zhuǎn)移至新的管，在PBS(不含Ca^和Mg")中洗滌3次，通過離心回收。一小份淋巴細胞在錐蟲藍(tryptanblue)中1:1稀釋，在血球計中用顯微鏡計數(shù)，以確定其活力(至少90%)。計數(shù)后，將淋巴細胞按20X1(^個細胞/ml的濃度重懸于PBS，分成小份至具有U-形底的孔的平板中。然后加入25昭具有SEQIDNO.1所示序列的質(zhì)粒，將所述平板置于溫育器中于37°C和5%C02下60-90分鐘。然后將所述細胞在合適的培養(yǎng)基中稀釋至1X106個細胞/1111的濃度，置于溫育器內(nèi)的燒瓶中，于37。C和5。/。C02下放置一夜。確認細胞活力高于70%后，將所述細胞在鹽水溶液中洗滌兩次，然后計算含有待接種劑量的總細胞的數(shù)量，其對應(yīng)于10,000至1億不等的大量細胞，然后將后者重懸于靜脈內(nèi)施用袋中，所述袋然后用于接種患者。使用前通過提取DNA和mRNA在巢式PCR測試中對一小份轉(zhuǎn)染的淋巴細胞進行檢驗，以便評估已發(fā)生的淋巴細胞轉(zhuǎn)染，并對其進行定量，甚至進行估計。圖6顯示PCR測試的來自用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的人類淋巴細月包的DNA的擴增。梯是用于確定擴增片段的大小的參照。數(shù)字指擴增的細胞的數(shù)量，天然指未用DNA轉(zhuǎn)染的淋巴細胞(陰性對照)。該圖顯示了已發(fā)生的患者的淋巴細胞的轉(zhuǎn)染，并首先表示其特異性，因為沒有從未接受轉(zhuǎn)染的淋巴細胞中擴增出片段。實施例2.從用編碼抗原性序列的DNA轉(zhuǎn)染的淋巴細胞能夠在接種于實驗動物后誘發(fā)免疫應(yīng)答和SEQIDNO.1所示的本發(fā)明質(zhì)粒編碼能夠誘發(fā)TCD4淋巴細胞部分的細胞應(yīng)答的表位的Wi設(shè)出發(fā)，為了確認DNA轉(zhuǎn)染的淋巴細胞的生物學(xué)活性，設(shè)計了實驗以驗證所述淋巴細胞在體內(nèi)的免疫原性，其i殳i十^口下文所述。17-4只C57/B16小鼠接種5，000個轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒的鼠淋巴細胞，如本發(fā)明包含的方案所述。接種是在尾靜脈中靜脈內(nèi)執(zhí)行的；-接種后14天，處死小鼠，脾細胞用于存在轉(zhuǎn)染使用的質(zhì)粒編碼的表位下的增殖測試；-所述脾細胞與參考表位培養(yǎng)72小時，然后向其中加入含氖的timidine(tritiatedtimidine)(—種能夠顯示細胞增殖的放射性同位素)；-18小時后，收獲細胞，使用p計數(shù)器裝置測量^t射性。增殖用刺激指數(shù)(SI)表示，其計算為存在特異性表位時的放射性計數(shù)除以存在無關(guān)表位(非特異性增殖)時的放射性計數(shù)。常規(guī)地，大于3的SI被視為陽性。表I:通過向?qū)嶒瀯游锝臃N用相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的淋巴細胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的實例。特異性肽指結(jié)合入本發(fā)明質(zhì)粒的DNA編碼的表位，對照肽具有無關(guān)的序列。小鼠SI對照肽SI特異性肽#10.811.8#21.314.3#3113.3#41.116.3上述實驗顯示了用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的淋巴細胞免疫時在小鼠中誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答，證明了其在用于體內(nèi)測試時的明確生物學(xué)性能。實施例3.-使用具有SEQIDNO.2所示序列的質(zhì)粒，將于100pl鹽水溶液中稀釋的100嗎DNA肌內(nèi)接種于10只C57/B16小鼠的四頭肌(組A)。免疫方案由^t三周的間隔分開的共3次注射組成。另一組10只C57/B16用相同方式進行免疫，使用CDR為空白(不含任何表位)的相同質(zhì)粒(組B)作為疫苗接種的特異性對照；誦最后一次接種后14天，處死小鼠，脾細胞用于細胞毒性測試，與用轉(zhuǎn)染使用的質(zhì)粒編碼的表位(NP)沖激(pulse)的細胞進行比較。特異性表位是流感病毒A/PR8的核蛋白的細胞毒性序列；-所述脾細胞與參考表位培養(yǎng)5天，然后用作細胞毒性測試的效應(yīng)(effectric)細胞；-細胞毒性測試在于測量用表位NP沖激的細胞(EL-4)釋放的放射性(51Cr)，其被來自免疫小鼠的效應(yīng)細胞殺傷；細胞毒性表示為某個效應(yīng):靶(E:T)比率下的裂解百分比，其計算為用所述肽沖激的細胞釋放的放射性的量除以未沖激的細胞釋放的放射性的量(特異性細胞毒性)。表II:用質(zhì)粒DNA#2免疫的動物中由特異性TCD8細胞介導(dǎo)的細胞毒性的實例。上述實驗顯示了用質(zhì)粒DNA免疫時小鼠中誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答，證明了其在用于體內(nèi)測試時的明確生物學(xué)性能。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>權(quán)利要求1.一種重組質(zhì)粒，其具有介于7和12千堿基的長度并包含編碼免疫球蛋白的重鏈的序列。2.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于它具有介于8和12千堿基的長度。3.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于它具有介于9和11千g，優(yōu)選地介于9和10千堿基的長度。4.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于所述免疫球蛋白的重鏈?zhǔn)乔逗系摹?.如權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒，其特征在于所述免疫球蛋白的重鏈包含鼠可變區(qū)和人類恒定區(qū)。6.如權(quán)利要求5所迷的質(zhì)粒，其特征在于所述鼠可變區(qū)是Vw62。7.如權(quán)利要求6所述的質(zhì)粒，其特征在于所述鼠可變區(qū)Vh62克隆自分泌具有抗曱狀腺球蛋白活性的單克隆抗體的小鼠雜交瘤。8.如權(quán)利要求5所述的質(zhì)粒，其特征在于所述人類恒定區(qū)是Igyl。9.如權(quán)利要求8所述的質(zhì)粒，其特征在于所述人類恒定區(qū)Igyl克隆自載體pNyl。10.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于它包含優(yōu)選地大約50bp的用于淋巴細胞的啟動子或優(yōu)選地大約742bp的病毒啟動子。11.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于它包含多聚腺苷酸化序列AATAAA。12.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于它包含大腸桿菌的細菌復(fù)制起點。13.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于它表達對新霉素的抗性和/或它包含復(fù)制起點PBR322。14.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于它不表達對P內(nèi)酰胺抗生素的抗性和/或它不包含SV40的復(fù)制起點。15.—種重組質(zhì)粒，其特征在于它具有序列SEQIDNO.1或與SEQIDNO.1至少90%同源、優(yōu)選地至少95%同源的序列。16.—種重組質(zhì)粒，其具有序列SEQIDNO.2或與SEQIDNO.2至少90%同源、優(yōu)選地至少95%同源的序列。17.如前述權(quán)利要求的任一項所述的質(zhì)粒，其特征在于它含有至少一個編碼抗原性表位的序列。18.如前述權(quán)利要求的任一項所述的質(zhì)粒，其特征在于所述抗原性表位選自p540(ILAKFLHWL)、p572(RLFFYRKSV)、pY572(YLFFYRKSV)、p865(RLVDDFLLV)和pNP(ASNENMETM)。19.一種制劑，其含有至少一種如前述權(quán)利要求的任一項所述的質(zhì)粒以及藥學(xué)可"f妻受賦形劑和/或輔佐劑。20.如前述權(quán)利要求的任一項所述的質(zhì)粒用于制備在人類或動物生物體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥物制劑的用途。21.如權(quán)利要求20所迷的用途，其特征在于所述人類或動物生物體受或曾受屬于癌和/或腺瘤和/或肉瘤和/或脂瘤和/或?qū)嶓w瘤和/或腹水瘤家族的肺瘤、前列腺或胰腺、腎或肺癌侵害。22.如權(quán)利要求20所迷的用途，其特征在于所述人類或動物生物體受或曾受細菌、病毒、真菌和/或寄生物感染侵害。23.如權(quán)利要求20所述的用途，其特征在于所述制劑是用于預(yù)防性目的。24.如權(quán)利要求20所述的用途，其特征在于所述生物體受或曾受在表面上具有至少一個抗原性表位的腫瘤細胞的存在的侵害，所述抗原性表位的編碼序列包含在所述質(zhì)粒中。25.在人類或動物生物體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括用如權(quán)利要求1-18所述的質(zhì)粒和/或如權(quán)利要求19所述的制劑間接體內(nèi)轉(zhuǎn)染原核和/或真核細胞，和將所述原核和/或真核細胞隨后接種于所述人類或動物生物體。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于待轉(zhuǎn)染的細胞屬于淋巴細胞家族。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于所述細胞采自所述人類或動物生物體的外周血管。28.如;f又利要求25所述的方法，其特征在于所述質(zhì)粒具有序列SEQIDNO.1或與SEQIDNO.1至少90%同源、優(yōu)選地至少95%同源的序列。29.在人類或動物生物體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述人類或動物生物體體內(nèi)接種如權(quán)利要求1-18所述的質(zhì)粒和/或如權(quán)利要求19所述的制劑。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于所述質(zhì)粒具有序列SEQIDNO.2或與SEQIDN0.2至少90%同源、優(yōu)選地至少95%同源的序列。31.如前述權(quán)利要求的任一項所述的方法，其中所述質(zhì)?；蛟撕?或真核細胞向所述人類或動物生物體的接種是通過注射或跨黏膜施用執(zhí)行的。全文摘要描述了用于轉(zhuǎn)染真核和原核細胞的重組質(zhì)粒；所述質(zhì)粒具有介于7和12千堿基的長度，并包含編碼免疫球蛋白的重鏈的序列；特別地，它們可用于-轉(zhuǎn)染原核或真核細胞(間接體內(nèi))的過程，所述原核或真核細胞可接種于高等生物以誘導(dǎo)預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答；-基因(genie)免疫方法學(xué)中定向接種(體內(nèi))于高等生物的方案，以誘發(fā)預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答。文檔編號C12N15/79GK101500604SQ200780029708公開日2009年8月5日申請日期2007年7月13日優(yōu)先權(quán)日2006年8月10日發(fā)明者瑪拉·格爾隆尼申請人:國際投資和專利控股公司