專利名稱：一種質(zhì)粒dna提取和純化方法及生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從原核生物中提取和純化質(zhì)粒DNA的方法及其生產(chǎn)工藝，是分子生物學(xué)的最基本的步驟之一，涉及了基因克隆、基因序列分析、核酸疫苗、基因治療和各種基因重組技術(shù)等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
質(zhì)粒DNA的提取和純化是分子生物學(xué)的最基本的步驟之一，涉及了基因克隆、基因序列分析、核酸疫苗、基因治療和各種基因重組等領(lǐng)域。經(jīng)典的從原核生物中提取和純化質(zhì)粒DNA是分為三個(gè)步驟菌體裂解、質(zhì)粒分離和純化。目前菌體裂解最常用的方法有兩個(gè)堿裂解法(Bimboim and Doly，Nucleic Acids Res.，71513-1523，1979)和煮沸裂解法。(Holmes and Quigley，Anal.Biochem.，114193-197，1981)。提取規(guī)模從小量制備(5毫升培養(yǎng)液)到大量制備(1升培養(yǎng)液)，一般可以得到1ug到1-3毫克的質(zhì)粒DNA，對滿足實(shí)驗(yàn)室分子克隆工作的需求已足夠。然而，隨著DNA疫苗和基因重組藥物研究和應(yīng)用的快速發(fā)展，對重組質(zhì)粒的需求量在不斷增加，常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室制備及其方法已很難滿足；另外一個(gè)不足是使用這兩種方法不僅成本高、產(chǎn)量低、質(zhì)量差外、而且不易擴(kuò)大規(guī)模。從而影響了后期工作的效率，目前稱其為DNA疫苗和基因重組藥物研究和應(yīng)用瓶頸。目前還有一些大規(guī)模提取的方法是用各種類型的親和層析柱，提取效果較好但費(fèi)用很高，也不易擴(kuò)大規(guī)模。堿裂解法由于提取過程中要加入多種試劑，最終產(chǎn)品中存在試劑污染，產(chǎn)量和質(zhì)量都不高；而煮沸裂解法雖然產(chǎn)量高，但操作復(fù)雜，裂解過程不易掌握，結(jié)果不穩(wěn)定，污染不易去除。所以目前，許多核酸技術(shù)發(fā)展受制于大量制備質(zhì)粒DNA技術(shù)不足。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述存在的問題，我們有針對性的對煮沸大提質(zhì)粒的方法作了改進(jìn)，其中改進(jìn)了菌體裂解溫度、質(zhì)粒分離和純化各個(gè)環(huán)節(jié)，最終解決了以上提到的問題，并使其可以順利地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐和規(guī)?；a(chǎn)。我們的目的是用簡便的方法制備出大量符合品質(zhì)要求的質(zhì)粒DNA。
本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下措施來達(dá)到的1、工程菌進(jìn)行高密度發(fā)酵后，利用中空纖維膜柱進(jìn)行濃縮，收集濃縮菌液，而不是常規(guī)的高速離心來完成；2、使用TE溶液(10mM Tris-HCL，50mM EDTA，pH＝8.0)將濃縮菌液稀釋到OD600＝100后，加入終濃度優(yōu)選為0.5～2％(重量體積比)的TritonX-100，0.1～0.5M氯化鈉和50～300微克/毫升的溶菌酶。
3、在優(yōu)選為25～37℃，更優(yōu)選為35～37℃的溫度下溫育，溫育時(shí)間優(yōu)選為20～60分鐘，更優(yōu)選為20～30分鐘，使其有效地進(jìn)行反應(yīng)；4、上述反應(yīng)菌體通過在菌體裂解時(shí)的溫度從100℃煮沸溫度降低到更易于控制的50～80℃，優(yōu)選為70～80℃裂解20～60秒，而該改進(jìn)依然能夠很好地裂解細(xì)菌。
5、裂解后的菌液利用優(yōu)選為400～1000目的濾膜分離上清液和裂解的菌體碎片及細(xì)菌染色體；6、在分離后的上清液中加入1/10總體積的3M NaAc(pH5.2)和0.6倍總體積的異丙醇沉淀核酸，并利用優(yōu)選為100～400目網(wǎng)管中進(jìn)行過濾分離。
7、并用70％乙醇清洗此沉淀物后。
8、干燥沉淀物后，加TE溶液進(jìn)行溶解。
本發(fā)明是通過利用中空纖維膜柱將發(fā)酵后工程菌進(jìn)行濃縮，收集濃縮菌液，而不是常規(guī)的高速離心來完成。也可通過利用切向流濾膜及裝置進(jìn)行濃縮。
為使上述濃縮菌液的pH適宜裂解反應(yīng)，本發(fā)明通過加入TE溶液(10mMTris-HCL，50mM EDTA，pH＝8.0)到上述濃縮菌液中，使其平衡并抑制其中的DNase活性。
為使上述濃縮菌充分裂解，在裂解前，本發(fā)明通過加入的溶菌液其成份為Triton X-100，終濃度優(yōu)選為0.5～2％(重量體積比)；氯化鈉，終濃度優(yōu)選為0.1～0.5M；溶菌酶，終濃度優(yōu)選為50～300微克/毫升，并在適當(dāng)溫度和反應(yīng)時(shí)間下反應(yīng)，使其成為原生質(zhì)體。
本發(fā)明將制備原生質(zhì)體的最適反應(yīng)溫度和時(shí)間優(yōu)選為25～37℃，更優(yōu)選為35～37℃的溫度下溫育，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為20～60分鐘，更優(yōu)選為20～30分鐘而得原生質(zhì)體，使其易于充分裂解。
為使菌體充分裂解，在裂解過程中，本發(fā)明通過將菌體裂解時(shí)的溫度從100℃煮沸溫度降低到更易于控制的50～80℃，優(yōu)選為70～80℃。
為達(dá)到溫度均勻目的，本發(fā)明通過將菌體通過加熱管中，菌體在加熱管中的時(shí)間優(yōu)選為10～60秒，更優(yōu)選為20～30秒，該改進(jìn)依然能夠很好地裂解細(xì)菌，同時(shí)在生產(chǎn)實(shí)踐中易于做到。
本發(fā)明通過將裂解后的菌液利用優(yōu)選為200～1000目的濾膜，更優(yōu)選為400～500目的濾膜，在壓力下分離出上清液，去掉裂解的菌體碎片及細(xì)菌染色體。
本發(fā)明將裂解后的菌液利用離心機(jī)在12000g離心分離出上清液，去掉裂解的菌體碎片及細(xì)菌染色體。
本發(fā)明通過對分離后的上清液中加入總體積1/10的3M NaAc(pH5.2)和0.6倍體積的異丙醇沉淀核酸，并在100～400目的濾膜，優(yōu)選為100～200目的濾膜中，進(jìn)行過濾分離出核酸沉淀物。
本發(fā)明通過70％乙醇清洗分離出核酸沉淀物后，進(jìn)行干燥。
本發(fā)明優(yōu)選通過氯仿和70％乙醇清洗分離出核酸沉淀物后，進(jìn)行干燥。
本發(fā)明通過干燥核酸沉淀物后，加入適量的TE溶液進(jìn)行溶解，而得到純化的質(zhì)粒DNA產(chǎn)物。
因此，發(fā)明對煮沸大提質(zhì)粒的方法作重大的改進(jìn)，其中改進(jìn)了菌體裂解溫度、質(zhì)粒分離和純化各個(gè)環(huán)節(jié)，得到高產(chǎn)量和高純度的質(zhì)粒DNA產(chǎn)品。
本發(fā)明利用中空纖維膜柱對發(fā)酵后工程菌進(jìn)行有效的濃縮，而不使用高速離心機(jī)，從而避免了工業(yè)生產(chǎn)不易放大的問題。
本發(fā)明有效對濃縮菌體進(jìn)行處理產(chǎn)生原生質(zhì)，使得后一步菌體的裂解溫度降低到更易于控制的范圍，從而避免在工業(yè)生產(chǎn)中難于控制的煮沸溫度，也節(jié)約了能源。
本發(fā)明有效利用加熱管對原生質(zhì)進(jìn)行加熱處理，產(chǎn)生溫度均勻，反應(yīng)充分，有效的克服了常規(guī)煮沸法中存在的裂解不充分的不足。
本發(fā)明能夠通過兩種不同濾膜對裂解后的菌液和異丙醇沉淀的核酸進(jìn)行有效的分離，而不使用高速離心機(jī)，從而避免了工業(yè)生產(chǎn)不易放大的問題，同時(shí)提高了提取后質(zhì)粒的產(chǎn)量和質(zhì)量。
本發(fā)明的技術(shù)效果利用本發(fā)明提供的生產(chǎn)和使用方法不僅使分離和純化步驟易于控制和操作，同時(shí)也提高了提取后質(zhì)粒的產(chǎn)量和質(zhì)量，而且避免了分離和純化過程中復(fù)雜設(shè)備，所以易于實(shí)施和生產(chǎn)放大。


圖137℃溫育對細(xì)菌裂解的影響不經(jīng)37℃溫育(第1道)，和經(jīng)過37℃溫育10(第2道)，20(第3道)，30(第4道)，40分鐘(第5道)，分別在70℃煮30秒裂解XL1-blue細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)37℃溫育20分鐘的裂解效果最好。
圖2不同溫度下裂解細(xì)菌獲得質(zhì)粒比較37℃溫育20分鐘后，在不同的溫度50℃(第1道)，60℃(第2道)，70℃(第3道)，80℃(第4道)，90℃(第5道)，100℃(第6道)分別裂解細(xì)胞，經(jīng)過比較，70℃～80℃之間，細(xì)菌已經(jīng)可以很好地裂解。隨著裂解溫度的提高，細(xì)菌裂解后產(chǎn)生的RNA的量逐漸增加。
圖3溶菌酶用量的比較用TE將濃縮液OD600稀釋到100后，按每毫升菌液0.05毫克(第1道)，0.1毫克(第2道)，0.2毫克(第3道)，0.3毫克(第4道)的量加入溶菌酶，發(fā)現(xiàn)在OD600為100的情況下，0.05毫克溶菌酶可以對原生質(zhì)體進(jìn)行有效的裂解。
圖4利用濾膜洗滌去除RNA效果將分離后的上清加入異丙醇沉淀核酸，并在70％乙醇中，反復(fù)震蕩洗滌去除RNA等雜質(zhì)。經(jīng)70％乙醇洗滌(第1道)，未經(jīng)70％乙醇洗滌(第2道)。
圖5大提質(zhì)粒定量及酶切鑒定結(jié)果梯度稀釋大提質(zhì)粒(第1至7道)，用標(biāo)準(zhǔn)Marker定量(M道)，每升發(fā)酵液提取質(zhì)粒約95毫克圖5A。用EcoRI和XhoI對大提的pc3d-N質(zhì)粒雙酶切，得到1200bp大小的條帶，與N基因大小相同(第2道)，第1道為Marker。用OD260/OD280進(jìn)行純度測定，測得比值為1.91圖5B。
具體實(shí)施例方式
借助以下實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，下面這些實(shí)施例是示范性的，而不是限制性的，可根據(jù)上述本發(fā)明的技術(shù)方案和實(shí)際情況，來確定具體的實(shí)施例1工程菌的發(fā)酵將質(zhì)粒pc3d-N轉(zhuǎn)化XL1-blue感受態(tài)細(xì)胞，從AMP瓊脂平板上挑取一單菌落于5毫升LB(加適量抗生素)37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期。取1.5毫升培養(yǎng)物于150毫升LB(加適量抗生素)37℃培養(yǎng)過夜。將150毫升過夜培養(yǎng)物加入盛有3升LB培養(yǎng)基(加適量抗生素)的發(fā)酵罐內(nèi)37℃發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵至5～6小時(shí)后流加補(bǔ)料400毫升。發(fā)酵15h后OD600不再有顯著增加時(shí)，停止發(fā)酵，測得OD600為45。
實(shí)施例2菌體收集將發(fā)酵液3.5L用蠕動(dòng)泵泵入中空纖維膜柱中進(jìn)行濃縮，濃縮后用200毫升TE(10mM Tris-HCL，50mM EDTA，pH＝8.0)沖洗菌體。濃縮后在濃縮液中加入等體積的TE繼續(xù)濃縮，3.5L發(fā)酵液最終濃縮得到350毫升濃縮液。
實(shí)施例3菌體收集將發(fā)酵液15L用蠕動(dòng)泵泵入中空纖維膜柱中進(jìn)行濃縮，濃縮后用500毫升TE(10mM Tris-HCL，50mM EDTA，pH＝8.0)沖洗菌體。濃縮后在濃縮液中加入等體積的TE繼續(xù)濃縮，15L發(fā)酵液最終濃縮得到750毫升濃縮液。
實(shí)施例4質(zhì)粒提取與純化濃縮液中加入終濃度為0.1M的NaCl，終濃度為2％的Triton X-100，及每毫升濃縮液加入0.1毫克溶菌酶。
37℃溫箱溫育10～40分鐘，用磁力攪拌子低速攪拌。
用蠕動(dòng)泵將反應(yīng)液泵入50～70℃水浴中的加熱金屬管，控制蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速使反應(yīng)液在加熱金屬管中加熱20～30秒，引出管置于冰浴中，使反應(yīng)立即終止反應(yīng)。
將反應(yīng)液至于400～1000目濾膜過濾細(xì)胞裂解后產(chǎn)生的粘稠物。
上清中加入總體積1/10的3M NaAc(pH5.2)，加入0.6倍體積的異丙醇，充分混勻，室溫下放置10分鐘。
將反應(yīng)液倒入100～400目的濾膜中，濾除上清液，然后放至于燒杯中，加入70％乙醇震蕩洗滌，回收核酸沉淀，室溫下干燥。用2ml～5ml TE(10mMTris-HCL，1mM EDTA，pH＝7.0)溶解核酸沉淀。在1％的瓊脂糖膠中對純化的核酸進(jìn)行電泳鑒定。
實(shí)施例5質(zhì)粒提取與純化濃縮液中加入終濃度為0.1M的NaCl，終濃度為2％的Triton X-100，每毫升濃縮液加入0.1毫克溶菌酶。
37℃溫箱溫育10～40分鐘，用磁力攪拌子低速攪拌。
用蠕動(dòng)泵將反應(yīng)液泵入50～70℃水浴中的加熱金屬管，控制蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速使反應(yīng)液在加熱金屬管中加熱20～30秒，引出管置于冰浴中，使反應(yīng)立即終止反應(yīng)。
將反應(yīng)液至于400～1000目濾膜過濾細(xì)胞裂解后產(chǎn)生的粘稠物。
上清中加入總體積1/10的3M NaAc(pH5.2)，加入0.6倍體積的異丙醇，充分混勻，室溫下放置10分鐘。
將反應(yīng)液倒入100～400目的濾膜中，濾除上清液，然后放至于燒杯中，加入氯仿和70％乙醇震蕩洗滌，回收核酸沉淀，室溫下干燥。用2ml～5ml TE(10mM Tris-HCL，1mM EDTA，pH＝7.0)溶解核酸沉淀。在1％的瓊脂糖膠中對純化的核酸進(jìn)行電泳鑒定。
權(quán)利要求
1.一種將發(fā)酵后工程菌進(jìn)行濃縮、高溫裂解、質(zhì)粒分離和純化的大規(guī)模制備和生產(chǎn)方法，其中包括如下步驟1)對發(fā)酵后工程菌進(jìn)行濃縮，收集濃縮菌液。2)加入溶菌液進(jìn)行反應(yīng)。3)上述反應(yīng)在25～37℃溫育10～60分鐘而得原生質(zhì)體。4)將上述原生質(zhì)體溶液通過加熱管使原生質(zhì)體溫度上升到50～80℃使其原生質(zhì)徹底裂解。5)將裂解后的菌體通過400～1000目的濾膜分離上清液和裂解液中的菌體碎片及細(xì)菌染色體。6)通過對分離后的上清液加入適量的NaAc和異丙醇沉淀其核酸，并在200～400目濾膜中進(jìn)行過濾分離出核酸沉淀物。7)通過70％乙醇清洗此核酸沉淀物。8)干燥此核酸沉淀物。8)加入適量的TE溶液進(jìn)行溶解，而得到質(zhì)粒DNA產(chǎn)物。
2.如權(quán)利要求1所述的制備和方法中，濃縮菌通過以下方法得到對體積大于5升發(fā)酵后工程菌使用孔徑為0.2～0.4μ的中空纖維膜柱及裝置進(jìn)行濃縮。
3.如權(quán)利要求1所述的制備和方法，濃縮菌通過以下方法得到對體積大于5升發(fā)酵后工程菌使用孔徑為0.2～0.4μ的切向流濾膜及裝置進(jìn)行濃縮。
4.如權(quán)利要求1所述的制備和方法，濃縮菌通過以下方法得到對體積大于5升發(fā)酵后工程菌使用制備型離心機(jī)的進(jìn)行濃縮。
5.如權(quán)利要求1所述的制備和方法中，菌體的裂解通過以下方法得到使用TE溶液(10mM Tris-HCL，50mM EDTA，pH＝8.0)將濃縮菌液稀釋到OD600＝100后，再加入的溶菌液其特征在于含有0.5～2％(重量體積比)的Triton X-100，0.1～0.5M氯化鈉和50～300微克/毫升的溶菌酶進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)在25～37℃溫育20～60分鐘而得原生質(zhì)體，通過加熱管使原生質(zhì)體溫度上升到50～80℃裂解20～60秒，使其原生質(zhì)徹底裂解。
6.如權(quán)利要求1所述的制備和方法中，質(zhì)粒DNA產(chǎn)物通過以下方法得到徹底裂解原生質(zhì)體經(jīng)12000×g下離心分離去除裂解液中的菌體碎片及細(xì)菌染色體而得到上清液，加入1/10總體積的3M NaAc(pH5.2)和0.6倍總體積的異丙醇于上清中沉淀其核酸，在100～400目濾膜中過濾分離出核酸沉淀物，并用70％乙醇清洗此沉淀物后，進(jìn)行干燥，加入適量的TE溶液進(jìn)行溶解，而得到純化的質(zhì)粒DNA產(chǎn)物。
7.如權(quán)利要求1所述的制備和方法中，質(zhì)粒DNA產(chǎn)物通過以下方法得到徹底裂解原生質(zhì)體經(jīng)400～1000目的濾膜分離去除裂解液中的菌體碎片及細(xì)菌染色體而得到上清液，加入1/10總體積的3M NaAc(pH5.2)和0.6倍總體積的異丙醇于上清中沉淀其核酸，在200～400目濾膜中過濾分離出核酸沉淀物，并用70％乙醇清洗此沉淀物后，進(jìn)行干燥，加入適量的TE溶液進(jìn)行溶解，而得到純化的質(zhì)粒DNA產(chǎn)物。
8.如權(quán)利要求1所述的制備和方法中，質(zhì)粒DNA產(chǎn)物通過以下方法得到徹底裂解原生質(zhì)體經(jīng)400～1000目的濾膜分離去除裂解液中的菌體碎片及細(xì)菌染色體而得到上清液，加入1/10總體積的3M NaAc(pH5.2)和0.6倍總體積的異丙醇于上清中沉淀其核酸，在200～400目濾膜中過濾分離出核酸沉淀物，并分別用氯仿和70％乙醇清洗此沉淀物后，進(jìn)行干燥，加入適量的TE溶液進(jìn)行溶解，而得到純化的質(zhì)粒DNA產(chǎn)物。
全文摘要
一種從原核生物中提取和純化質(zhì)粒DNA的方法及其生產(chǎn)工藝，其方法含有原核生物菌液濃縮、菌體裂解、質(zhì)粒DNA分離和質(zhì)粒DNA純化；其生產(chǎn)工藝是過濾分離法菌體、在溶菌酶作用下熱裂解菌體、膜過濾法分離和純化質(zhì)粒DNA。本發(fā)明的技術(shù)效果利用本發(fā)明提供的方法及生產(chǎn)工藝不僅能夠有效的提高質(zhì)粒提取產(chǎn)量和質(zhì)量，而且制備過程簡單、易于實(shí)施。
文檔編號C07H1/06GK1546516SQ20031011715
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月4日
發(fā)明者王賓, 俞慶齡, 王 賓 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)