專利名稱：質(zhì)粒dna的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從大規(guī)模微生物發(fā)酵的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中純化超螺旋質(zhì)粒DNA的一種方法，所述方法包括(a)裂解含有超螺旋質(zhì)粒DNA的微生物宿主細(xì)胞，形成宿主細(xì)胞溶胞產(chǎn)物；和(b)通過絮凝宿主細(xì)胞碎片來澄清步驟(a)中所述的溶胞產(chǎn)物。裂解微生物宿主細(xì)胞可以在溶菌酶存在下或者在沒有溶菌酶存在的情況下進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中宿主細(xì)胞碎片用聚乙二醇(PEG)進(jìn)行絮凝。用于澄清細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的絮凝劑，包括但不僅限于聚乙二醇，可以作為溶解緩沖液(例如標(biāo)準(zhǔn)STET緩沖液)的一個(gè)組成成份包括在內(nèi)，或者在裂解細(xì)胞后再加入溶胞產(chǎn)物中。絮凝的宿主細(xì)胞碎片能以如沉降、傾倒或離心的方法，包括但不限于連續(xù)離心，從宿主細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中除去，最后得到澄清的溶胞產(chǎn)物。在去除絮凝的細(xì)胞碎片后，澄清后的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中的超螺旋質(zhì)粒DNA用下游純化工藝可進(jìn)一步從殘留污染物中純化出來。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及使用此處描述的上游純化工藝生產(chǎn)含超螺旋質(zhì)粒DNA的澄清的宿主細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的一種方法。
本發(fā)明還涉及從大規(guī)模微生物發(fā)酵的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中純化超螺旋質(zhì)粒DNA的一種方法，所述方法包括(a)裂解含超螺旋質(zhì)粒DNA的微生物宿主細(xì)胞，形成宿主細(xì)胞溶胞產(chǎn)物；(b)調(diào)節(jié)步驟(a)中得到的宿主細(xì)胞溶胞產(chǎn)物至堿性pH，然后再中和；(c)通過絮凝宿主細(xì)胞碎片，來澄清步驟(b)所述的pH調(diào)節(jié)后的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。在此描述的調(diào)至堿性pH然后再中和的步驟有助于制備宿主細(xì)胞溶胞產(chǎn)物來用于絮凝過程；不過，所述的溶胞產(chǎn)物的pH調(diào)節(jié)既可在加入絮凝劑之前進(jìn)行，也可以在加入之后進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用一定濃度的堿溶液將最初細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的pH值調(diào)至堿性(比如，大概12-13)，使可溶的宿主細(xì)胞染色質(zhì)DNA能夠變性。然后將已調(diào)至堿性的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物加入一定濃度的酸溶液中和至接近初始裂解緩沖液的pH值，優(yōu)選使細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的pH介于8-9之間。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及到一種從大規(guī)模微生物發(fā)酵的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中純化超螺旋質(zhì)粒DNA的方法，所述方法包括(a)在生理緩沖液中裂解含有超螺旋質(zhì)粒DNA的微生物宿主細(xì)胞，形成宿主細(xì)胞溶胞產(chǎn)物；(b)將步驟(a)的宿主細(xì)胞溶胞產(chǎn)物調(diào)節(jié)至堿性pH值，即向所述的溶胞產(chǎn)物中加入堿，升高其pH值至約12至約13之間；(c)中和步驟(b)中堿化的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，使其pH值大約為細(xì)胞裂解時(shí)的生理緩沖液的pH；(d)通過加入絮凝劑，包括但不僅限于PEG，絮凝宿主細(xì)胞碎片，澄清所述的堿化又中和后的溶胞產(chǎn)物。
應(yīng)用本發(fā)明所述的上游裂解和溶胞產(chǎn)物澄清技術(shù)后，能進(jìn)行多種下游的純化過程，包括但不僅限于(i)使用陽離子去垢劑，包括但不僅限于CTAB，來從澄清后的溶胞產(chǎn)物中沉淀質(zhì)粒DNA；(ii)用鹽溶液溶解質(zhì)粒；(iii)用水合硅酸鈣吸附殘留雜質(zhì)；(iv)在進(jìn)行最后臨床級質(zhì)粒制備前，使用聚乙二醇或醇來沉淀純化的質(zhì)粒DNA。
本發(fā)明還涉及一種從大規(guī)模發(fā)酵方案中提取臨床級質(zhì)粒DNA的新型下游純化工藝，即使用最后的濃縮/精加工步驟得到粉狀的質(zhì)粒DNA產(chǎn)品。本發(fā)明的下游純化工藝的作用是，從前期純化所得到的富含超螺旋質(zhì)粒DNA的溶胞產(chǎn)物中除去殘留雜質(zhì)。因此，本發(fā)明涉及一種從大規(guī)模微生物發(fā)酵的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中純化超螺旋質(zhì)粒DNA的方法，所述方法包括(a)沉淀所述的超螺旋質(zhì)粒DNA；(b)用切向流過濾模式的微孔過濾濃縮所述的沉淀后的超螺旋質(zhì)粒DNA。在步驟(a)中沉淀超螺旋質(zhì)粒DNA可用大家熟知的方法，使用聚乙二醇或醇類包括但不僅限于乙醇、甲醇和異丙醇。步驟(b)中的微孔過濾可直接替代在質(zhì)粒DNA純化工藝中最后濃縮/交換緩沖液過程中常用的超濾法，能減小循環(huán)率、濾膜面積以及整個(gè)批次的體積。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，作為在此公布的新型下游濃縮/精加工純化工藝的第一步驟，使用PEG將超螺旋質(zhì)粒DNA從富含它的澄清細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(即通過上游工藝和前期的下游純化工藝富集超螺旋質(zhì)粒DNA的宿主細(xì)胞溶胞產(chǎn)物)中沉淀出來。然后將所述的沉淀質(zhì)粒DNA進(jìn)行切向流過濾模式下的微孔過濾。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種從大規(guī)模微生物發(fā)酵的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中純化超螺旋質(zhì)粒DNA的方法，所述方法包括(a)使用PEG沉淀所述的超螺旋質(zhì)粒DNA；(b)使用切向流過濾模式下的微孔過濾濃縮該沉淀后的超螺旋質(zhì)粒DNA。本發(fā)明提涉的微孔過濾可能是一種分級過濾工藝的一部分。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，上述PEG沉淀的超螺旋質(zhì)粒DNA通過一種分級過濾工藝得以濃縮，該分級過濾工藝包括第一個(gè)過濾步驟，其中使用微孔過濾和后續(xù)的透析過濾濃縮沉淀的質(zhì)粒DNA漿液，并清除殘留的RNA和雜質(zhì)。第二個(gè)過濾步驟用乙醇置換DNA沉淀中的聚乙二醇，并進(jìn)一步濃縮質(zhì)粒DNA，最后得到一種脫水質(zhì)粒DNA的濕品，其可干燥后獲得細(xì)粉狀質(zhì)粒DNA。該第二步過濾可以在一種過濾干燥設(shè)備中進(jìn)行，在攪動(dòng)細(xì)胞的操作下(如，單板Nutsche過濾干燥器)允許加壓過濾和真空干燥。因此本發(fā)明涉及一種從大規(guī)模微生物發(fā)酵的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中純化超螺旋質(zhì)粒DNA的方法，所述方法包括(a)使用PEG沉淀所述的超螺旋質(zhì)粒DNA；和(b)用分級過濾工藝，包括切向流過濾模式下的微孔過濾，濃縮所述的沉淀后超螺旋質(zhì)粒DNA。所述的分級過濾工藝包括(a)第一個(gè)過濾濃縮步驟，包括切向流過濾模式下的微孔過濾；(b)第一個(gè)透析過濾步驟，使用含有PEG的透析過濾緩沖液進(jìn)行透析過濾，該透析過濾緩沖液中含有足夠濃度的PEG和任選鹽以保持所述的超螺旋質(zhì)粒DNA的沉淀狀態(tài)；(c)脫水步驟，加入乙醇對沉淀的超螺旋質(zhì)粒DNA進(jìn)行部分脫水；(d)第二次的過濾濃縮步驟；和(e)第二次的透析過濾步驟，用100％(v/v)乙醇進(jìn)行透析過濾。在其它實(shí)施方案中，第二次的過濾和透析過濾，步驟(d)和步驟(e)，是在一個(gè)過濾干燥器中，包括但不僅限于單板Nutsche過濾干燥器，以加壓和攪動(dòng)細(xì)胞模式進(jìn)行的。
本發(fā)明涉及從大規(guī)模微生物發(fā)酵的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中純化超螺旋質(zhì)粒DNA的方法，所述方法包括(a)使用醇類，包括但不僅限于乙醇、甲醇和異丙醇，沉淀超螺旋質(zhì)粒DNA；(b)使用切向流過濾模式下的微孔過濾來濃縮所述沉淀的質(zhì)粒DNA。在本發(fā)明該部分的一個(gè)實(shí)施方案中，所述微孔過濾濃縮步驟是一個(gè)分級過濾工藝的一部分，包括(a)第一次過濾濃縮步驟，包括切向流過濾模式下的微孔過濾；(b)使用乙醇溶液進(jìn)行第一次透析過濾步驟，其中該溶液的乙醇濃度足以保持所述超螺旋質(zhì)粒DNA的沉淀狀態(tài)；(c)第二次過濾濃縮步驟；和(d)使用100％(v/v)乙醇進(jìn)行第二次透析過濾步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二次過濾和透析過濾，步驟(c)和步驟(d)，是在一個(gè)過濾干燥器中，包括但不僅限于單板Nutsche過濾干燥器，以加壓和攪動(dòng)細(xì)胞模式進(jìn)行的。
作為本處可交替使用的術(shù)語“臨床級質(zhì)粒DNA”和“藥用級質(zhì)粒DNA”指從宿主細(xì)胞中分離制備的質(zhì)粒DNA，其純度能夠達(dá)于用于人體進(jìn)行任何已知的預(yù)防和治療的要求，包括但不僅限于基因治療和/或多聚核苷酸疫苗的應(yīng)用。
這里使用的“非超螺旋質(zhì)粒DNA”指任何不是超螺旋質(zhì)粒DNA的DNA，包括任何其它形式的，比如缺刻的、開環(huán)的、線性的質(zhì)粒DNA，以及宿主基因組DNA。
這里使用“NTU”指標(biāo)準(zhǔn)化濁度單位。濁度定義為使用一種光學(xué)領(lǐng)域的液面下探頭對液體中顆粒的“計(jì)數(shù)”。溶液濁度能用基于激光的光散射裝置進(jìn)行測定。
這里使用的“PEG”指聚乙二醇。
這里使用的“OD600”是600nm處的光密度值，由一種光散射分光光度計(jì)測定的每毫升細(xì)胞數(shù)。
這里使用的“L.O.D.”指檢測極限。
這里使用的“MW”是道爾頓分子量。
這里使用的“LRATM”指除脂試劑TM 這里使用的“CTAB”指溴化十六烷基三甲銨或西曲溴銨。
這里使用的“hcCaSiO3”指水合結(jié)晶硅酸鈣。
這里使用的“IPA”指異丙醇。
這里使用的“MF”指微孔過濾。
這里使用的“UF”指超濾。
這里使用的“STET緩沖液”指含有約50mM Tris-HCl(pH 7.0-9.0)、約50-100mM EDTA、約8％蔗糖以及約2％

-X-100的緩沖液。



圖1展示了沉降超過兩天的大腸桿菌溶胞產(chǎn)物。在瓶1中的溶胞產(chǎn)物是用STET緩沖液(本處定義的)重懸細(xì)胞并與溶菌酶(500U/mL)在20℃孵育得到。瓶2中的溶胞產(chǎn)物與瓶1中的相似，只是在用溶菌酶孵育后，先加堿將pH調(diào)至pH 12，再加酸中和。瓶3中的溶胞產(chǎn)物用含3％PEG 3000的STET緩沖液重懸細(xì)胞并與溶菌酶在20℃孵育得到。瓶4中的溶胞產(chǎn)物與瓶3中相似，只是像瓶2描述那樣，先后加入堿和酸進(jìn)行堿化后再中和。本圖顯示了PEG作為絮凝劑從堿性溶胞產(chǎn)物中絮凝細(xì)胞碎片的潛力。
圖2展示了裝有不同細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的50ml離心管，這些溶胞產(chǎn)物的起始OD600都是45，然后在16,000×g下離心了5min。管1中的溶胞產(chǎn)物是用STET緩沖液重懸細(xì)胞并與溶菌酶在20℃孵育得到。管2中的溶胞產(chǎn)物與管1中相同，只是與溶菌酶孵育后進(jìn)行了堿化再中和(如圖1中所述)。管3中的溶胞產(chǎn)物是用含3％PEG 3000的STET緩沖液重懸細(xì)胞并與溶菌酶在20℃孵育得到。管4中溶胞產(chǎn)物與管3中相同，只是與溶菌酶孵育后進(jìn)行了堿化再中和。管5中的溶胞產(chǎn)物與管2中的相同，只是在堿化再中和步驟后加入了PEG。管6中的溶胞產(chǎn)物與管2中的相同，只是在堿性pH調(diào)節(jié)/中和步驟后加入了終濃度為5％的PEG 3000。
圖3顯示了圖2中展示的溶胞產(chǎn)物的濁度測量值。
圖4A和圖4B顯示了PEG分子量和絮凝大腸桿菌細(xì)胞碎片的效果。細(xì)胞與溶菌酶孵育后，進(jìn)行堿性pH調(diào)節(jié)/酸中和。將不同分子量(PEG 400-6000)的PEG貯液分別加入10ml等份試樣的溶胞產(chǎn)物中，得到PEG終濃度大概介于1.0％至15.0％之間。所得混合物在室溫下沉降大約16小時(shí)，然后測定各OD600值(圖4A)。圖4B顯示了只用PEG3000時(shí)OD600依賴性與溶液中DNA濃度的相關(guān)曲線。
圖5顯示了對于溶菌酶/pH調(diào)節(jié)后的溶胞產(chǎn)物中提高的PEG 6000濃度(0-8％w/v)，質(zhì)粒DNA沉降曲線。
圖6A和6B對比了大規(guī)模質(zhì)粒DNA純化工藝中兩種終濃縮/精加工步驟的一般過程流程圖。
圖7A和7B描述了DNA在不同PEG溶液中的溶解性。圖7A顯示在PEG 8000溶液中，當(dāng)PEG濃度大于2％w/v時(shí)，DNA的溶解性將大幅下降。但在所研究范圍內(nèi)，溶液溫度和DNA濃度則對DNA的溶解性沒有影響。圖7B顯示，在所研究范圍內(nèi)，DNA完全溶于400分子量的PEG中；而隨著分子量的增加，沉淀DNA所需PEG的臨界質(zhì)量降低。
圖8描述了在PEG 8000中DNA沉淀的動(dòng)力學(xué)。圖8顯示了5分鐘后，初始DNA有大于99％的都發(fā)生了沉淀。
圖9A和9B顯示了質(zhì)粒DNA在水-乙醇混合物中的溶解性數(shù)據(jù)。NaCl濃度是基于無乙醇時(shí)的濃度。圖9A顯示了NaCl濃度從1.8到3.4M時(shí)對質(zhì)粒的溶解性幾乎沒有什么影響。在圖9B中，對低濃度的NaCl與幾種不同濃度的乙醇一起進(jìn)行了研究。虛線表示質(zhì)粒的濃度，如沒有沉淀，在每個(gè)溶液中都應(yīng)出現(xiàn)。
圖10顯示了在不同濃度的乙醇中NaCl的溶解性。
圖11顯示了在兩個(gè)IPA濃度不同的IPA-NaCl系統(tǒng)中，“鹽析”和“鹽溶”的極限。
圖12A與12B描述了質(zhì)粒在含有氯化鈉和醋酸鈉的25％(A)或67％(B)IPA中的溶解度。
圖13顯示了質(zhì)粒DNA從3M NaCl溶液中沉淀(0.22μm的纖維素膜，2.1cm2的過濾面積，20in.Hg真空)死端式過濾數(shù)據(jù)的Vmax曲線。該過濾數(shù)據(jù)首先從初始濃度為40％的乙醇中校準(zhǔn)，然后再增加乙醇至50％濃度。在t/V對V的關(guān)系曲線上，相對直的線性表明了一個(gè)幾乎不可壓縮的濾餅。在50％乙醇中，可以觀察到過濾效率顯著增高。
圖14A顯示了沉淀質(zhì)粒的微孔過濾期間隨時(shí)間變化收集到的滲透體積。對每個(gè)數(shù)據(jù)組都出示了沉淀懸濁液的初始DNA濃度；初始懸濁液體積為500ml。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中沒有降低滲透流出量并在過濾時(shí)一直維持壓力讀數(shù)為10psig，懸濁液可以很容易地以15mL/min流速進(jìn)行過濾。圖14B顯示了沉淀質(zhì)粒的80％v/v乙醇懸濁液在進(jìn)行透析過濾時(shí)乙醇和NaCl的濃度。
圖15A-C顯示了在切向流過濾模式(TFF)條件下的微孔過濾時(shí)進(jìn)行三種連續(xù)乙醇沉淀的嘗試，在過濾期間使用Masterflex size 14(5/16″)管輸送和加入乙醇。圖15A顯示了使用100kD PES膜和40％v/v乙醇沉淀進(jìn)行連續(xù)沉淀/微孔過濾研究的結(jié)果。輸送至濾筒的流速大約為30ml/min。大約收集到200ml滲透液時(shí)，流量需下降至初始值的20％。圖15B顯示了使用0.1微米PVDF膜和40％v/v乙醇沉淀進(jìn)行連續(xù)沉淀/微孔過濾研究的結(jié)果。輸送流速也大約為30ml/min，但在容器和濾器之間含1分鐘延遲時(shí)間。圖15C顯示了一個(gè)與圖15B相似實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(0.1微米PVDF膜，1分鐘延遲時(shí)間)，但使用了50％的乙醇而不是40％的乙醇來進(jìn)行質(zhì)粒DNA的沉淀。在用40％v/v乙醇嘗試時(shí)，滲透液流量的下降程度輕微減弱(圖15B)，但壓力的升高使過濾實(shí)驗(yàn)難以連續(xù)進(jìn)行超過30分鐘。
圖16A和16B顯示了使用TFF模式的微孔過濾所進(jìn)行的兩種連續(xù)乙醇沉淀的嘗試，在過濾期間使用HPLC管道輸送和加入乙醇。圖16A顯示了使用40％濃度乙醇進(jìn)行的連續(xù)沉淀/微孔過濾并沒有延遲時(shí)間。
圖17A和17B顯示了使用實(shí)施例8所述的質(zhì)粒DNA純化工藝的兩個(gè)純化流程中的過程產(chǎn)量(A)和雜質(zhì)含量(B)。每個(gè)質(zhì)粒的純化都開始于由17.5-18.6L的發(fā)酵液處理出來的75-80L OD600＝70的大腸桿菌溶胞產(chǎn)物。圖17A比較了在純化藝中的不同階段超螺旋質(zhì)粒DNA質(zhì)量數(shù)(“scDNA(g)”)和超螺旋DNA百分比(“％scDNA”)細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(“Lys”)；通過絮凝宿主細(xì)胞碎片后的澄清溶胞產(chǎn)物(“CL”)；由硅酸鈣第一次吸附和過濾后的DNA漿(“LRA1F”)；由硅酸鈣第二次吸附和過濾后的DNA漿(“LRA2F”)；重懸在PEG沉淀和后續(xù)微孔過濾步驟中成為干粉的DNA(“FRB”)。圖17B在圖17A描述的純化工藝的同一階段比較了內(nèi)毒素的量(log EU/mL)，蛋白含量(％)和RNA含量(％)。
圖18顯示了用BCA法測定在PEG 6000絮凝的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物經(jīng)最終CTAB沉淀后的蛋白含量，這里的CTAB是由加入含2％(w/v)CTAB的40mM NaCl溶液的方式引入的。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及一種純化臨床級質(zhì)粒DNA的可調(diào)節(jié)的方法學(xué)，該方法可降低生產(chǎn)成本并提高生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。通常認(rèn)為質(zhì)粒DNA純化的主要單元操作包括細(xì)胞溶解、過濾(微孔過濾/超濾)以及色譜分離。然而，在大規(guī)模分離藥用級質(zhì)粒DNA時(shí)，所述的被確認(rèn)為是主要單元操作的方法一定要適應(yīng)生產(chǎn)目標(biāo)，即高產(chǎn)量和最低單位成本下的高質(zhì)量。比如，原材料的花費(fèi)，如樹脂和緩沖液，在應(yīng)用于大規(guī)模質(zhì)粒DNA純化工藝時(shí)，已發(fā)現(xiàn)多步層析造成了高昂單位成本以及低下的生產(chǎn)量。在最近公開的一份美國專利申請No.09/875,379(美國
發(fā)明者D·B·博伊德, A·J·克里斯托佩特, R·J·蘭德, J·C·墨菲, M·A·溫特斯 申請人:默克公司