專利名稱：：3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸的酶合成法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及來源于耐熱性細(xì)菌嗜熱脂肪地芽孢桿菌("o/^"Wws"esrot/7e27Z7op力i7ws)的月泉昔5'—三石粦酸硫酸4七酵(adenosine5'—triphosphatesulfurylase:ATPS)禾口月泉昔5'—憐酸硫酸;敷酷(adenosine5'—phosphosulfatekinase:APSK)、來源于綠膿桿菌(尸seW咖朋asaer收j'/7asa)的多磷酸依賴性核苷5'-二磷酸激酶(Polyphosphate-DrivenNucleosideDiphosphateKinase:PNDK)、利用該P(yáng)NDK的腺苷5'-三磷酸(adenosine5'-triphosphate:ATP)供給再生體系以及使該APTS和APSK與ATP供給，再生體系結(jié)合的實用的3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(3'-phosphoade謹(jǐn)ine5'-phosphosulfate:PAPS)的酶合成法。
背景技術(shù)：
：PAPS是從微生物到植物、高等動物在生物體內(nèi)廣泛被利用的硫酸供體。此外，也報道了以蛋白多糖疾病為代表的若干種疾病與PAPS的關(guān)聯(lián)，PAPS在生物體內(nèi)的作用非常重要，可以在藥品等領(lǐng)域中得到利用。作為PAPS的酶合成法，例如已知通過使用提取自面包酶和大鼠肝臟的ATPS和APSK這兩種酶的2步反應(yīng)由ATP進(jìn)行制造的方法(下述式1和2)。但是，通過該方法，僅能制造數(shù)毫克數(shù)十毫克的PAPS，而且需要高價的ATP，不能說是產(chǎn)業(yè)上實用的方法。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(式l)APS+ATP腿>PAPS+ADP(式2)(上述式中，ATP表示腺苷5'-三磷酸，ADP表示腺苷5'-二磷酸，APS表示腺苷5'-磷酸硫酸，PPi表示無機(jī)焦磷酸，S0,表示硫酸離子)因此，為了實用性地生產(chǎn)PAPS，必須使用生產(chǎn)性和操作性良好的來源于微生物的酶(第l課題)，并且必須構(gòu)筑不需要高價ATP的ATP供給再生體系(第2課題)。為了解決第l課題，恩田等報告了通過使用來源于芽孢桿菌屬細(xì)菌或嗜熱菌屬細(xì)菌的熱穩(wěn)定性高的ATPS和APSK這2種酶，可以由2步反應(yīng)高效地生產(chǎn)PAPS的技術(shù)方案(專利文獻(xiàn)13)。但是，為了實施恩田等的方法，必須從該耐熱性細(xì)菌的菌體破碎液純化ATPS和APSK。然而，這兩種酶的細(xì)胞內(nèi)含量低，因此存在需要大量的菌體培養(yǎng)且兩種酶的純化操作非常繁雜的問題。另一方面，為了解決第2課題，伊吹等報告了使由乙酰磷酸和乙酸激酶構(gòu)成的ATP再生體系與PAPS合成體系結(jié)合，將APSK反應(yīng)中生成的ADP轉(zhuǎn)化為ATP進(jìn)行再利用的方法(非專利文獻(xiàn)l)。但是，因為反應(yīng)最初依然使用高價的ATP作為底物，而且作為用于ATP再生的磷酸供體大量使用高價的乙酰磷酸，所以該方法無法成為實用性的方法。目前，作為廉價的磷酸供體，己知有多磷酸(PolyPn)，作為使用該多磷酸的源于腺苷5'-單磷酸(adenosine5'-monophosphate:AMP)的ATP供給再生體系，己知以下述式(3)和(4)表示的利用多磷酸激酶(PPK)和腺苷酸激酶(ADK)的協(xié)調(diào)作用的體系(專利文獻(xiàn)4)以及以下述式(5)和(6)表示的利用多磷酸AMP磷酸轉(zhuǎn)移酶(PAP)和ADK的體系(專利文獻(xiàn)5)。PolyPn+AMP面皿協(xié)翻>Polypn-i+ADp(式3)PolyPn+ADPPPK>PolyPn_,+ATP(式4)PolyPn+AMPPAP>Poly+ADP(式5)2ADP皿>ATP+AMP(式6)(上述式中，ATP表示腺苷5'-三磷酸，ADP表示腺苷5'-二磷酸，AMP表示腺苷5'-單磷酸，PolyPn表示多磷酸，n表示整數(shù))雖然該利用PPK和ADK的協(xié)調(diào)作用的ATP供給再生體系在PAPS的酶合成中的應(yīng)用已有報道(專利文獻(xiàn)6)，但是仔細(xì)分析該方法后，發(fā)現(xiàn)PAPS的生成量最多也僅達(dá)到5raM左右。認(rèn)真研究該低產(chǎn)量的原因后發(fā)現(xiàn)，利用PPK和ADK的協(xié)調(diào)作用的ATP供給再生體系未有效地運(yùn)作，難以使反應(yīng)體系內(nèi)的ATP濃度相對于ADP和AMP維持于主導(dǎo)地位，因此使PAPS生成的效率差。PPK被認(rèn)為在生物體內(nèi)起到多磷酸合成酶的作用，以式(4)表示的該酶反應(yīng)的平衡大幅偏向多磷酸合成側(cè)(非專利文獻(xiàn)2)。此外，已知由于其ATP合成活性微弱，因此利用該酶的ATP供給再生體系雖然在例如底物濃度5mM左右以下的低濃度下的反應(yīng)中良好地運(yùn)作，但是在例如底物濃度超過10mM的高濃度下的反應(yīng)中無法充分發(fā)揮作用。此外，雖然未報道有將利用PAP和ADK的ATP供給再生體系應(yīng)用于PAPS的酶合成的例子，但是由于ADK完全可逆地催化式(6)的反應(yīng)，因此如后述的比較例2所示，無法保持反應(yīng)體系內(nèi)的較高的ATP濃度，因而PAPS的生成效率差。因此，為了實現(xiàn)PAPS的實用性的制造，必須構(gòu)筑可將ATP濃度相對于ADP和AMP維持于主導(dǎo)地位的強(qiáng)力的新ATP供給再生體系。作為用于構(gòu)筑這樣的強(qiáng)力的ATP供給再生體系的一種手段，考慮利用來源于綠膿桿菌的多磷酸依賴性核苷5'-二磷酸激酶。即，最近鑒定了來源于綠膿桿菌的PNDK(非專利文獻(xiàn)3、4)，也獲得了編碼該酶的基因(非專利文獻(xiàn)2、5)。另外，該P(yáng)NDK雖然表現(xiàn)出與PPK類似的多磷酸依賴性的ADP的磷酸化活性，但是其氨基酸序列與PPK完全不具有同源性，而且具有達(dá)到來源于大腸桿菌的PPK的100倍以上、來源于綠膿桿菌的PPK的約1000倍以上的明顯更高的比活性(非專利文獻(xiàn)2)，與PPK相比，多磷酸合成活性弱到事實上可以忽略的程度，反應(yīng)平衡大幅偏向于ATP合成側(cè)，因此認(rèn)為作為用于ATP的供給再生體系的酶是理想的。然而，因為該酶在綠膿桿菌中的生產(chǎn)性低，所以為了在產(chǎn)業(yè)上利用該酶，需要利用基因重組技術(shù)克隆該酶的基因，將大腸桿菌等作為宿主，使該酶大量生產(chǎn)，但在本發(fā)明人過去進(jìn)行的實驗中，即使利用基因重組技術(shù)，該酶的生產(chǎn)性仍舊較低，該酶的實用化困難。專利文獻(xiàn)l:日本專利特許第3098591號專利文獻(xiàn)2:日本專利特許第3078067號專利文獻(xiàn)3:日本專利特許第3029915號專利文獻(xiàn)4:W098/48031專利文獻(xiàn)5:W003/100056專利文獻(xiàn)6:日本專利特開2002-78498號非專利文獻(xiàn)l:NucleicAcidsSymp.Ser.，27，171-172(1992)非專利文獻(xiàn)2:Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99，16684-16688(2002)非專利文獻(xiàn)3:Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，439-442(1997)非專利文獻(xiàn)4:Biochem.Biophys.Res.Commun.，281，821-826(2001)非專利文獻(xiàn)5:Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99，16678-16683(2002)發(fā)明的揭示因此，為了確立實用的PAPS制造方法，本發(fā)明的目的最初在于從耐熱性細(xì)菌嗜熱脂肪地芽孢桿菌(原嗜熱脂肪芽孢桿菌UacW7^"e^"力eim^M7ws))染色體中發(fā)現(xiàn)編碼ATPS和APSK的基因，使用重組DNA方法大量制造該酶。接著，本發(fā)明的目的在于確立利用重組DNA技術(shù)的PNDK的高效生產(chǎn)。最后，本發(fā)明的目的在于提供使用PNDK的非常強(qiáng)力的ATP供給再生體系的構(gòu)成以及使該ATP供給再生體系與來源于耐熱性細(xì)菌嗜熱脂肪地芽孢桿菌的ATPS和APSK結(jié)合的PAPS的高效制造方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人反復(fù)認(rèn)真研究后，首次從耐熱性細(xì)菌嗜熱脂肪地芽孢桿菌染色體中發(fā)現(xiàn)編碼ATPS和APSK的基因，使使用重組DNA方法大量制造該酶成為可能。另外，通過對高效生產(chǎn)該酶的大腸桿菌粗提取液實施加熱處理，PAPS合成活性顯著提高，由此不對該兩種酶實施特別的純化就可以實現(xiàn)高效的PAPS制造。接著，對已經(jīng)報道的編碼由357個氨基酸殘基構(gòu)成的PNDK的多核苷酸進(jìn)行精密檢查，發(fā)現(xiàn)通過使用人為地使N末端側(cè)的相當(dāng)于數(shù)十個氨基酸殘基的量的堿基序列缺失的DNA片段，該酶的生產(chǎn)性顯著提高，作為目標(biāo)的酶活性也不會失去。然后，選擇PAP作為磷酸化AMP而生成ADP的酶，選擇上述的PNDK作為磷酸化ADP而生成再生ATP的酶，發(fā)現(xiàn)通過組合兩者，可以非常強(qiáng)力地由AMP供給ATP，而且可以使供給的ATP維持在高濃度(參照下述式7和8)。PolyPn+AMPPAP>PolyPn—,+ADP(式7)PolyPn+ADPPNDK>PolyPn_,+ATP(式8)另外，還發(fā)現(xiàn)使PNDK與ADK共存的情況、使PPK與ADK共存的情況與專利文獻(xiàn)4同樣，由于兩者的協(xié)調(diào)作用產(chǎn)生多磷酸依賴性的AMP的磷酸化活性，生成的ADP通過PNDK單獨(dú)的強(qiáng)力ADP磷酸化活性立即被轉(zhuǎn)化為ATP，PNDK和ADK的組合果然可以起到基于AMP的強(qiáng)力的ATP供給再生體系的作用(參照下述式9和10)。PolyPn+AMPP麗皿協(xié)糊>Poly^+ADP(式9)PolyPn+ADP腿>PolyPn_，+ATP(式10)而且，發(fā)現(xiàn)將由PAP和PNDK構(gòu)成的ATP供給再生體系或者由ADK和PNDK構(gòu)成的ATP供給再生體系中的任一種應(yīng)用于使用來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的ATPS和APSKPAPS的PAPS的酶合成的情況下，在任一種ATP供給再生體系中都使反應(yīng)體系內(nèi)的ATP濃度相對于ADP和認(rèn)P維持在主導(dǎo)地位，從而可以高效地合成PAPS。因此，本發(fā)明具有如下的技術(shù)內(nèi)容。(1)由以序列編號l表示的堿基序列構(gòu)成，編碼來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的腺苷5'-三磷酸硫酸化酶(ATPS)的DNA片段。(2)由以序列編號1表示的堿基序列中缺失、置換、插入或添加了l個或數(shù)個堿基的堿基序列構(gòu)成，編碼具有ATPS活性的酶的DNA片段。(3)與上述(1)所述的DNA片段在嚴(yán)格條件下雜交，編碼具有ATPS活性的酶的DNA片段。(4)ATPS或具有ATPS活性的酶的調(diào)制方法，其特征在于，使用上述(1)(3)所述的任一種DNA片段，通過重組DNA方法調(diào)制具有ATPS活性的粗酶，對得到的粗酶進(jìn)行加熱處理。(5)在4565。C下進(jìn)行加熱處理的上述(4)的調(diào)制方法。(6)由以序列編號2表示的堿基序列構(gòu)成，編碼來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的腺苷5'-磷酸硫酸激酶(APSK)的DNA片段。(7)由以序列編號2表示的堿基序列中缺失、置換、插入或添加了l個或數(shù)個堿基的堿基序列構(gòu)成，編碼具有APSK活性的酶的DNA片段。(8)與上述(6)所述的DNA片段在嚴(yán)格條件下雜交，編碼具有APSK活性的酶的DNA片段。(9)APSK或具有APSK活性的酶的調(diào)制方法，其特征在于，使用上述(6)(8)所述的任一種DNA片段，通過重組DNA方法調(diào)制具有APSK活性的粗酶，對得到的粗酶進(jìn)行加熱處理。(10)在4565t:下進(jìn)行加熱處理的上述(9)的調(diào)制方法。(11)PAPS的制造方法，其特征在于，使用通過上述(4)所述的方法調(diào)制的ATPS和通過上述(9)所述的方法調(diào)制的APSK，由硫酸離子和腺苷5'-三磷酸(ATP)以酶法合成3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS)。(12)由以序列編號9表示的堿基序列中的1011171構(gòu)成的編碼多磷酸依賴性核苷5'-二磷酸激酶(PNDK)的多核苷酸中，缺失N末端側(cè)的相當(dāng)于至少72個氨基酸殘基的堿基序列的DNA片段。(13)缺失相當(dāng)于至少73個氨基酸殘基的量的堿基序列的上述(12)所述的DNA片段。(14)缺失相當(dāng)于72個以上、87個以下的氨基酸殘基的量的堿基序列的上述(12)所述的麗A片段。(15)缺失相當(dāng)于73個以上、83個以下的氨基酸殘基的量的堿基序列的上述(12)所述的DNA片段。(16)缺失相當(dāng)于73、77、80或83個的氨基酸殘基的量的堿基序列的上述(12)所述的DNA片段。(17)由上述(12)(16)中任一項的堿基序列中缺失、置換、插入或添加了l個或數(shù)個堿基的堿基序列構(gòu)成，編碼具有PNDK活性的酶的DNA片段。(18)與上述(12)(16)中任一項所述的DNA片段在嚴(yán)格條件下雜交，編碼具有PNDK活性的酶的DNA片段。(19)使用上述(12)(18)所述的任一種DNA片段，通過重組DNA方法調(diào)制PNDK的PNDK的制造方法。(20)通過上述(19)所述的方法調(diào)制的，具有序列編號10的缺失N末端側(cè)的至少72個氨基酸的氨基酸序列的PNDK。(21)由腺苷5'-單磷酸(AMP)、多磷酸、多磷酸依賴性核苷5'-二磷酸激酶(PNDK)和多磷酸AMP磷酸轉(zhuǎn)移酶(PAP)構(gòu)成的腺苷5'-三磷酸(ATP)的供給'再生體系。(22)由腺苷5'-單磷酸(AMP)、多磷酸、多磷酸依賴性核苷5'-二磷酸激酶(PNDK)和腺苷酸激酶(ADK)構(gòu)成的腺苷5'-三磷酸(ATP)的供給再生體系。(23)PNDK來源于屬于假單胞菌(Pseudomonas)屬的微生物的上述(21)或(22)所述的ATP的供給再生體系。(24)PNDK為上述(20)所述的PNDK的上述(21)或(22)所述的ATP的供給再生體系。(25)PAP來源于屬于不動桿菌(Acinetobacter)屬的微生物的上述(21)或(22)所述的ATP的供給再生體系。(26)ADK來源于大腸桿菌或酵母的上述(21)或(22)所述的ATP的供給再生體系。(27)使用通過重組DNA方法轉(zhuǎn)化了的轉(zhuǎn)化體、該轉(zhuǎn)化體的處理物或由該處理物得到的酶作為酶源的上述(21)或(22)所述的ATP的供給再生體系。(28)有用物質(zhì)的制造方法，它是低成本且高效地制造通過將ATP作為能量源和/或底物進(jìn)行消耗的酶反應(yīng)生成的有用物質(zhì)的方法，其特征在于，利用上述(21)(26)中任一項所述的ATP的供給再生體系替代ATP。(29)通過將ATP作為能量源和/或底物進(jìn)行消耗的酶反應(yīng)生成的有用物質(zhì)為3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS)、糖核苷酸、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)中的任一種的上述(28)所述的有用物質(zhì)的制造方法。(30)PAPS的制造方法，它是使用腺苷5'-三磷酸硫酸化酶(ATPS)和腺苷5'-磷酸硫酸激酶(APSK)將ATP硫酸化和磷酸化而制造3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS)的方法，其特征在于，利用上述(21)(27)中任一項所述的ATP的供給再生體系替代ATP。(31)ATPS和APSK來源于屬于地芽孢桿菌(Geobacillus)屬的微生物的上述(30)所述的PAPS的制造方法。(32)使用通過上述(4)所述的方法調(diào)制的ATPS和通過上述(9)所述的方法調(diào)制的APSK的上述(30)所述的PAPS的制造方法。(33)在305(TC的反應(yīng)溫度下進(jìn)行PAPS的酶合成的上述(30)所述的PAPS的制造方法。在來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的ATPS和APSK的氨基酸序列和堿基序列都完全未被報道的情況下，本發(fā)明人首次成功地克隆了對應(yīng)于來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的ATPS和APSK的基因，由此可以通過基因工程的方法大量地制造來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的ATPS和APSK。此外，雖然通過基因工程得到的兩種酶在活性上不足，但發(fā)現(xiàn)通過實施加熱處理這一非常簡便且實用的處理，兩種酶的PAPS合成活性大幅提高，由此首次可以更簡便且大量地制造PAPS。此外，通過使用已經(jīng)報道的PNDK的N末端側(cè)的相當(dāng)于至少72個氨基酸殘基的堿基序列缺失的DNA片段，首次可以更簡便且大量地制造具有N末端側(cè)的相當(dāng)于至少72個氨基酸殘基的量缺失的氨基酸序列的PNDK。由于該N末端缺損的PNDK維持了PNDK本身的活性，因此利用該P(yáng)NDK，可以構(gòu)筑實用性的ATP合成再生體系和GTP合成再生體系。另外，本發(fā)明的ATP合成再生體系僅使用AMP、多磷酸等廉價的原料，將其應(yīng)用于PAPS的合成的情況下，可以將反應(yīng)體系內(nèi)的ATP濃度相對于ADP和AMP維持在主導(dǎo)地位，能夠以相對于AMP的轉(zhuǎn)化率在60X以上的效率合成PAPS。該合成效率為應(yīng)用以往的利用PPK和ADK的協(xié)調(diào)作用的ATP合成再生體系時的5倍以上的效率，為應(yīng)用利用PAP和ADK的ATP合成*再生體系時的1.5倍以上的效率。另外，通過ATPS和APSK使用來源于屬于地芽孢桿菌屬的微生物的酶，PNDK使用來源于屬于假單胞菌屬的微生物的酶，PAP使用來源于屬于不動桿菌屬的微生物的酶，ADK使用來源于大腸桿菌或酵母的酶，即使在3050。C的反應(yīng)溫度下也不會導(dǎo)致酶活性的下降，各酶協(xié)調(diào)，可以高效地合成PAPS附圖的簡單說明圖1為表示不同時采用ATP供給再生體系時的PAPS的經(jīng)時的生成量的圖(實施例1的(3))，B表示對照反應(yīng)中的PAPS生成量，A表示使用未加熱處理的粗酶的反應(yīng)中的PAPS生成量，參表示使用加熱處理粗酶液的反應(yīng)中的PAPS生成圖2為表示同時采用利用ADK和PNDK的本發(fā)明的ATP供給再生體系的PAPS合成反應(yīng)中的經(jīng)時變化的圖(實施例3的(7))。圖3為表示同時采用利用PAP和PNDK的本發(fā)明的ATP供給再生體系的PAPS合成反應(yīng)中的經(jīng)時變化的圖(實施例3的(8))。圖4為表示同時采用利用PPK和ADK的協(xié)調(diào)作用的以往的ATP供給再生體系的PAPS合成反應(yīng)中的經(jīng)時變化的圖(比較例1)。圖5為表示同時采用利用PAP和ADK的以往的ATP供給再生體系的PAPS合成反應(yīng)中的經(jīng)時變化的圖(比較例2)。實施發(fā)明的最佳方式(A)來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的ATPS和APSK來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的ATPS和APSK分別為具有序列編號3和序列編號4中表示的氨基酸序列的酶或者具有序列編號3和序列編號4的氨基酸序列中缺失、置換或添加了l個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列的酶。數(shù)個氨基酸的缺失是指例如30個氨基酸以內(nèi)、較好是10個氨基酸以內(nèi)的缺失。此外，數(shù)個氨基酸的置換是指例如25個氨基酸以內(nèi)、較好是10個氨基酸以內(nèi)的置換。另外，數(shù)個氨基酸的添加是指例如40個氨基酸以內(nèi)、較好是20個氨基酸以內(nèi)的添加。此外，氨基酸的缺失、置換或添加包括與序列編號3或序列編號4的氨基酸序列具有85%以上、更好是90%以上、特別好是95%以上的同源性的情況。即使是具有這些改變的情況下，也必須分別具有ATPS或APSK活性。編碼來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的ATPS和APSK的基因分別為具有基因序列編號1和序列編號2中表示的堿基序列的基因或者具有序列編號1和序列編號2的氨基酸序列中缺失、置換或添加了l個或數(shù)個堿基的堿基序列的基因。作為具有缺失、置換或添加了l個或數(shù)個堿基的堿基序列的基因，可以例舉與序列編號1或2的DNA片段在嚴(yán)格條件下雜交的基因。在這里，嚴(yán)格條件可以例舉在含有O.1XSDS的0.2XSSC中5(TC、含有O.1XSDS的1XSSC中6(TC等條件。具有缺失、置換或添加了l個或數(shù)個堿基的堿基序列的基因包括與序列編號l或序列編號2的堿基序列具有85%以上、更好是90%以上、特別好是95%以上的同源性的基因。這樣的基因例如可以通過以將序列編號1和序列編號2各自的兩端部分的合成DNA作為引物、將嗜熱脂肪地芽孢桿菌染色體DNA作為模板的PCR法擴(kuò)增目標(biāo)基因的方法來獲得。分離了的各基因可以通過連接于載體麗A來保持于各種宿主一載體體系中。作為宿主，可以使用微生物、昆蟲細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞等各種宿主。對于微生物，例如使用大腸桿菌的情況下，可以使用EK1類，使用酵母的情況下，可以使用SC1類。使用微生物作為宿主的情況下，只要可以穩(wěn)定地保持在菌體內(nèi)，作為載體可以使用市售的任一種質(zhì)粒。例如，使用大腸桿菌作為宿主的情況下，較好是使用pTrc99A(Amersham)等質(zhì)粒。通過將克隆了的基因(DNA片段)連接于特定的啟動子序列的下游，可以大量地生產(chǎn)本發(fā)明的ATPS和APSK。例如，pTrc99A具有可表達(dá)誘導(dǎo)的trc啟動子，通過在培養(yǎng)的中途將異丙基-e-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)添加入培養(yǎng)基，可以生產(chǎn)作為目標(biāo)的ATPS和APSK。轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)通過通常的方法實施。即，若以屬于芽孢桿菌屬或大腸桿菌類的細(xì)菌為例進(jìn)行說明，則培養(yǎng)基可以使用肉湯培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基(1X胰胨、0.5%酵母提取物、lX食鹽)或2xYT培養(yǎng)基(1.6X胰胨、1%酵母提取物、0.5%食鹽)等，可以在該培養(yǎng)基中接種種菌后，在305(TC下根據(jù)需要一邊攪拌一邊培養(yǎng)1050小時，將得到的培養(yǎng)液離心分離，回收微生物菌體。可以將上述微生物菌體通過機(jī)械破壞(采用旋轉(zhuǎn)攪拌機(jī)、弗氏壓碎器、勻漿器、研缽等)、凍結(jié)溶解、自我消化、干燥(采用冷凍干燥、風(fēng)干等)、酶處理(采用溶菌酶等)、超聲波處理、化學(xué)處理(采用酸、堿處理等)等公知的方法進(jìn)行破碎，把得到的菌體的破碎物或者菌體的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的變性物等菌體處理物用作本發(fā)明的ATPS和APSK的粗酶液。這樣得到的ATPS和APSK通過對上述粗酶液實施加熱處理，可以提高PAPS合成活性。加熱處理可以通過在45'C65。C的溫度下保溫5分鐘1小時左右來實施，較好是在55。C下處理30分鐘左右，這樣比較有效果。(B)來源于綠膿桿菌的PNDK本發(fā)明中使用的DNA片段為由以序列編號9表示的堿基序列中的1011171構(gòu)成的編碼PNDK的多核苷酸中缺失至少N末端側(cè)的相當(dāng)于72個氨基酸殘基的堿基序列、較好是相當(dāng)于73個氨基酸殘基的堿基序列的DNA片段。這樣的DNA片段中，可以示例缺失相當(dāng)于72個以上、87個以下的氨基酸殘基的量的堿基序列的DNA片段，較好是缺失相當(dāng)于73個以上、83個以下的氨基酸殘基的量的堿基序列的DNA片段，更具體地可例舉后述實施例中所示的缺失相當(dāng)于73、77、80或83個的氨基酸殘基的量的堿基序列的DNA片段。如后述實施例中所詳述地，通過使用對應(yīng)于編碼PNDK的ppk2結(jié)構(gòu)基因的使相當(dāng)于作為目標(biāo)的氨基酸的部分缺失后的5'末端的合成DNA以及ppk2結(jié)構(gòu)基因的3'末端部分的合成DNA這2種引物，以綠膿桿菌染色體DNA作為模板，以PCR法擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段，從而可以獲得這樣的DNA片段。分離了的各DNA片段可以通過連接于載體DNA來構(gòu)筑各種宿主一載體體系，通過選擇的宿主一載體體系中廣泛使用的方法可以制造作為目標(biāo)的本發(fā)明的P墜。制造本發(fā)明的PNDK時，作為宿主，可以使用微生物、昆蟲細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞等各種宿主。例如，使用大腸桿菌的情況下，可以使用EK1類，使用酵母的情況下，可以使用SC1類。使用微生物作為宿主的情況下，只要可以穩(wěn)定地保持在菌體內(nèi)，作為載體可以使用市售的任一種質(zhì)粒。例如，使用大腸桿菌作為宿主的情況下，較好是使用pTrc99A(Amersham)等質(zhì)粒。通過將克隆了的基因(麗A片段)連接于特定的啟動子序列的下游，可以大量地生產(chǎn)本發(fā)明的PNDK。例如，pTrc99A具有可表達(dá)誘導(dǎo)的trc啟動子，通過在培養(yǎng)的中途將異丙基-e-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)添加入培養(yǎng)基，可以生產(chǎn)作為目標(biāo)的PNDK。轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)通過常規(guī)方法實施。即，若以屬于芽孢桿菌屬或大腸桿菌類的細(xì)菌為例進(jìn)行說明，則培養(yǎng)基可以使用肉湯培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基(1X胰胨、0.5%酵母提取物、lX食鹽)或2xYT培養(yǎng)基(1.6X胰胨、1%酵母提取物、0.5%食鹽)等，可以在該培養(yǎng)基中接種種菌后，在305(TC下根據(jù)需要一邊攪拌一邊培養(yǎng)1050小時，將得到的培養(yǎng)液離心分離，回收微生物菌體。可以將上述微生物菌體通過機(jī)械破壞(采用旋轉(zhuǎn)攪拌機(jī)、弗氏壓碎器、勻漿器、研缽等)、凍結(jié)溶解、自我消化、干燥(采用冷凍干燥、風(fēng)干等)、酶處理(采用溶菌酶等)、超聲波處理、化學(xué)處理(采用酸、堿處理等)等公知的方法進(jìn)行破碎，把得到的菌體的破碎物或者菌體的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的變性物等菌體處理物用作本發(fā)明的P腸K的粗酶液。此外，也可以根據(jù)情況從上述菌體處理物中通過通常的酶純化方法(鹽析處理、等電點(diǎn)沉淀處理、有機(jī)溶劑沉淀處理、透析處理、各種層析法處理等)純化具有PNDK活性的組分，制成部分純化酶或純化酶使用。這樣調(diào)制的本發(fā)明的PNDK為具有對應(yīng)于使用的DNA片段缺失了序列編號IO的N末端側(cè)的相當(dāng)于至少72個氨基酸殘基的部分的氨基酸序列的PNDK。(C)ATP供給再生體系作為本發(fā)明的ATP供給再生體系，包括(i)由AMP、多磷酸、PNDK和PAP構(gòu)成的ATP的供給再生體系以及(ii)由AMP、多磷酸、PNDK和ADK構(gòu)成的ATP的供給*再生體系。在這里，本發(fā)明的ATP供給再生體系包含構(gòu)成ATP供給再生體系的試劑。PAP、ADK和PNDK都是公知的酶，并不限定于動物來源、植物來源、微生物來源等特定的來源。從酶調(diào)制的簡便程度來看，較好是使用微生物來源的酶。此外，也可以利用近年來的基因重組技術(shù)克隆該基因，以大腸桿菌等為宿主大量生產(chǎn)，由得到的重組菌調(diào)制該酶。其中，較好是PNDK使用來源于屬于假單胞菌屬的微生物的酶，PAP使用來源于屬于不動桿菌屬的微生物的酶，ADK使用來源于大腸桿菌或酵母的酶。添加于反應(yīng)體系中的上述各酶只要具有所需的活性，可以是任意的形態(tài)，具體可以示例微生物的菌體(包括轉(zhuǎn)化體)、該菌體的處理物或由該處理物得到的酶等。微生物的菌體的調(diào)制可以通過使用該微生物可生長的培養(yǎng)基，以通常的方法培養(yǎng)后以離心分離等收集菌體的方法來實施。若具體以屬于芽孢桿菌屬或大腸桿菌類的細(xì)菌為例進(jìn)行說明，則培養(yǎng)基可以使用肉湯培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基(1%胰胨、0.5%酵母提取物、lX食鹽)或2xYT培養(yǎng)基(1.6X胰胨、1%酵母提取物、0.5%食鹽)等，可以在該培養(yǎng)基中接種種菌后，在305(TC下根據(jù)需要一邊攪拌一邊培養(yǎng)1050小時，將得到的培養(yǎng)液離心分離，回收微生物菌體。作為微生物的菌體處理物，可以示例將上述微生物菌體通過機(jī)械破壞(采用旋轉(zhuǎn)攪拌機(jī)、弗氏壓碎器、勻漿器、研缽等)、凍結(jié)溶解、自我消化、干燥(采用冷凍干燥、風(fēng)干等)、酶處理(采用溶菌酶等)、超聲波處理、化學(xué)處理(采用酸、堿處理等)等一般的處理方法進(jìn)行處理而得到的菌體的破碎物或者菌體的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的變性物。作為酶，可以示例由上述菌體處理物對具有所需的酶活性的組分實施通常的酶純化方法(鹽析處理、等電點(diǎn)沉淀處理、有機(jī)溶劑沉淀處理、透析處理、各種層析法處理等)而得到的粗酶或純化酶。本發(fā)明的ATP供給再生體系中添加的AMP(市售品)、多磷酸(市售品)、各種酶(PAP、PNDK和ADK)的濃度雖然根據(jù)應(yīng)用ATP供給再生體系的有用物質(zhì)的不同而不同，但AMP可以在例如l200mM、較好是10100mM的范圍內(nèi)適當(dāng)設(shè)定，多磷酸可以在換算為無機(jī)磷酸時在l1000mM、較好是50500raM的范圍內(nèi)適當(dāng)設(shè)定，酶濃度可以在O.001單位/mL以上、較好是在O.00110單位/mL的范圍內(nèi)適當(dāng)設(shè)定。作為可應(yīng)用這樣的ATP供給再生體系的有用物質(zhì)，只要是通過將ATP作為能量源和/或底物進(jìn)行消耗的酶反應(yīng)生成的有用物質(zhì)即可，具體可以示例PAPS、糖核苷酸、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)等。(D)PAPS的酶合成PAPS的酶合成反應(yīng)為，由ATP和硫酸離子通過ATPS的催化作用將ATP的5'-磷酸硫酸化(式l)，以ATP為磷酸供體通過APSK的催化作用將生成的腺苷-5'-磷酸硫酸的3'-羥基磷酸化(式2)。ATP+S042—扁>APS+PPi(式l)APS+ATP厘>PAPS+ADP(式2)反應(yīng)中添加的ATP可以使用市售的產(chǎn)品。作為使用濃度，在例如l200mM、較好是l20mM的范圍內(nèi)適當(dāng)設(shè)定即可。此外，作為反應(yīng)中添加的硫酸根供體，只要是在反應(yīng)液中生成硫酸離子的物質(zhì)即可，可以使用市售的硫酸鈉或硫酸鎂等硫酸鹽。作為使用濃度，在例如l200mM、較好是10100mM的范圍內(nèi)適當(dāng)設(shè)定即可?？梢酝ㄟ^在pH49的范圍內(nèi)的適當(dāng)?shù)木彌_液中添加ATP和硫酸鹽，再添加0.OOl單位以上、較好是O.0011.O單位的ATPS以及O.OOl單位以上、較好是0.0011.0單位的APSK，在20。C以上、較好是3050。C的溫度下根據(jù)需要一邊攪拌一邊反應(yīng)150小時左右，從而實施PAPS的合成。此外，也可以不使用ATP而并用前述的ATP供給再生體系。艮P，可以通過在pH49的范圍內(nèi)的適當(dāng)?shù)木彌_液中添加認(rèn)P、硫酸根供體和多磷酸，再添加O.001單位/mL以上、較好是O.00110單位/mL的PAP，0.001單位/mL以上、較好是O.00110單位/mL以上的PNDK，O.OOl單位以上、較好是0.00110單位的ATPS以及0.OOl單位以上、較好是O.00110單位的APSK，在2(TC以上、較好是305(TC的溫度下根據(jù)需要一邊攪拌一邊反應(yīng)1100小時左右，從而實施應(yīng)用由AMP、多磷酸、PNDK和PAP構(gòu)成的ATP供給.再生體系的PAPS的合成。此外，可以通過在pH49的范圍內(nèi)的適當(dāng)?shù)木彌_液中添加AMP、硫酸根供體和多磷酸，再添加O.001單位/mL以上、較好是O.00110單位/mL的ADK，0.001單位/mL以上、較好是O.00110單位/mL以上的PNDK，0.OOl單位以上、較好是0.00110單位的ATPS以及0.OOl單位以上、較好是O.00110單位的APSK，在20。C以上、較好是3050。C的溫度下根據(jù)需要一邊攪拌一邊反應(yīng)1100小時左右，從而實施應(yīng)用由AMP、多磷酸、PNDK和ADK構(gòu)成的ATP供給.再生體系的PAPS的合成。另外，在上述任一種反應(yīng)中，因為由ATPS反應(yīng)生成的焦磷酸可能會引起生成物抑制，所以通過添加O.001單位/mL以上、較好是O.00110單位/mL的無機(jī)焦磷酸酶(I匿ganicPyrophosphatase),可以使合成效率提高。反應(yīng)后，反應(yīng)液中生成的PAPS可以通過使用活性炭或離子交換樹脂等的常規(guī)的層析處理方法進(jìn)行分離純化。實施例以下，示例實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)且具體的說明，但應(yīng)理解本發(fā)明并不限定于以下的例子。此外，實施例中的DNA的調(diào)制、采用限制性酶的剪切、采用T4DNA連接酶的DNA連接以及大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方法全部按照《分子克隆實驗室手冊》第二版("MolecularCloning,aLaboratoryManual,SecondEdition，，)(Maniatis等編，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork(1989))實施。此外，反應(yīng)液中的核苷酸類的定量通過HPLC法實施。具體來說，分離使用YMC公司制的0DS-AQ312柱，洗脫液使用O.5M磷酸二氫鉀溶液。實施例l(1)ATPS基因和APSK基因的鑒定雖然來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的ATPS基因和APSK基因未經(jīng)鑒定，但該菌菌株10的基因組DNA的部分堿基序列已被公開(登錄號NCJ)02926)。因此，利用網(wǎng)絡(luò)月艮務(wù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/geblast.cgigi=5025&tax=272567)，在已公開的該株基因組DNA的部分序列中用tBLASTn程序檢索是否存在可編碼與來源于枯草桿菌的公知的ATPS(登錄號CAA04411)類似的氨基酸序列的開放閱讀框(以下簡稱ORF)的DNA區(qū)域。其結(jié)果為，判明該株染色體中存在可編碼氨基酸序列與來源于枯草桿菌的ATPS類似的0RF的DNA區(qū)域。另外，在該基因的下游發(fā)現(xiàn)可編碼氨基酸序列與來源于枯草桿菌的APSK(登錄號CAA04412)類似的0RF的DNA區(qū)域。它們分別被期待是該菌中的ATPS基因和APSK基因。因此，通過以下所示的PCR法擴(kuò)增被期待為該菌ATPS基因的DNA片段。艮卩，使用下述(A)和(B)的引物，使用Perkin-ElmerCetusInstrument公司制DNA熱循環(huán)儀，對O.lmL反應(yīng)液(50raM氯化鉀、10mMTris-HCl(pH8.3)、1.5mM氯化鎂、0.001%明膠、嗜熱脂肪地芽孢桿菌TH6-2株(FERMBP-2758)的染色體DNAO.1ug、2種引物DNA各0.2uM、ExTaqDNA聚合酶2.5單位)重復(fù)熱變性(94°C、l分鐘)、退火(55"、l分鐘)、聚合(72。C、2分鐘)的步驟30次。另外，該TH6-2株以嗜熱脂肪芽孢桿菌T服-2的名稱在1989年2月4日作為FE歴BP-2758保藏于〒305-8566日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6、獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心。另外，由于嗜熱脂肪芽孢桿菌現(xiàn)在更名為嗜熱脂肪地芽孢桿菌，因此為以防萬一，將同一株以嗜熱脂肪地芽孢桿菌TH6-2的名稱在2005年12月7日作為FERMBP-10466保藏于前述的專利生物保藏中心。(A)5TTGAATTCCTTGCCTCATGAACATGGCAGC-3'(序列編號5)(B)5'-TACTGCAGGCTCATCGCGATCCTCCTTTAG-3'(序列編號6)此外，通過使用(C)和(D)這2種引物DNA的與上述同樣的PCR法擴(kuò)增被期待為該菌APSK基因的DNA片段。(C)5'-TTGAATTCCGCTAAAGGAGGATCGCGATGA-3'(序列編號7)(D)5TTCTGCAGCGACCTTGTCAAATGACCTCCC-3'(序列編號8)各基因擴(kuò)增后，以苯酚/氯仿(l:l)混合液處理反應(yīng)液，在水溶性部分中添加2倍容積的乙醇，使DNA沉淀。將沉淀回收的DNA按照文獻(xiàn)(《分子克隆實驗室手冊》第二版，前述)通過瓊脂糖凝膠電泳分離，純化各DNA片段。將該DNA分別用限制性酶EcoRI和PstI切斷，使用同樣用限制性酶EcoRI和PstI消化了的質(zhì)粒pTrc99A(從PharmaciaBiotech公司購得)和T4DNA連接酶連接。使用各自的連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌，從得到的氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒pTrc-ylnB禾卩pTrc-ylnC。質(zhì)粒pTrc-ylnB為承載來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌TH6-2株的含ATPS基因的麗A片段的質(zhì)粒，質(zhì)粒pTrc-ylnC為承載來源于同株的含APSK基因的麗A片段的質(zhì)粒。分析克隆的兩基因的堿基序列的結(jié)果為，該菌ATPS基因是序列編號1中所示的DNA堿基序列，該菌APSK基因是序列編號2中所示的DNA堿基序列。將這些DNA堿基序列翻譯成氨基酸序列的結(jié)果為，該菌ATPS是序列編號3中所示的氨基酸序列，該菌APSK是序列編號4中所示的氨基酸序列。該菌ATPS顯示與來源于枯草桿菌的同種酶有68%的氨基酸序列同源性，該菌APSK顯示與來源于枯草桿菌的同種酶有63%的氨基酸序列同源性。(2)ATPS和APSK粗酶液的調(diào)制將大腸桿菌JM109株分別以pTrc99A載體、pTrc-ylnB和pTrc-ylnC轉(zhuǎn)化，將得到的轉(zhuǎn)化體接種到100mL含有100ug/mL的氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中，在30。C下振蕩培養(yǎng)。達(dá)到4X108個菌/mL時，在培養(yǎng)液中添加IPTG至0.4mM的最終濃度，再繼續(xù)在3(TC下振蕩培養(yǎng)一晚。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離(10000Xg，IO分鐘)回收菌體，懸浮于10mL的緩沖液(50mMTris-HCl(pH8.0)、0.5mMEDTA、lmM2-巰基乙醇)中后，進(jìn)行超聲波處理，破碎菌體，再通過離心分離(IOOOOXg，IO分鐘)除去菌體殘渣。將這樣得到的上清部分作為粗酶液。如下所述測定各粗酶液中的ATPS活性。S卩，在最終濃度分別達(dá)到Tris-HCl緩沖液(pH8)50mM、硫酸鎂20mM、ATPlmM的反應(yīng)混合液中添加l單位/mL的焦磷酸酶(RocheDiagnostics公司)、l單位/mL的APSK(Calbiochem公司)和酶液，在37'C下保溫10分鐘后，通過加入經(jīng)冰冷的0.5M磷酸二氫鈉溶液停止反應(yīng)。通過HPLC測定生成的PAPS的量，將l分鐘生成lUmol的PAPS的ATPS的量作為l單位。此外，如下所述測定APSK活性。g卩，在最終濃度分別達(dá)到Tris-HC1緩沖液(pH8)50mM、硫酸鎂20福、ATPlmM的反應(yīng)混合液中添加l單位/raL的焦磷酸酶(RocheDiagnostics公司)、l單位/mL的ATPS(Calbiochem公司)和酶液，在37"C下保溫10分鐘后，通過加入經(jīng)冰冷的O.5M磷酸二氫鈉溶液停止反應(yīng)。通過HPLC測定生成的PAPS的量，將l分鐘生成llimol的PAPS的APSK的量作為l單位。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>(3)使用ATPS粗酶液和APSK粗酶液的PAPS的合成在最終濃度分別達(dá)到H印es緩沖液(pH8)50mM、氯化鎂25mM、硫酸鈉100mM、ATP50mM的反應(yīng)混合液中添加5單位/mL的焦磷酸酶(Roche公司制)、0.2%容量的ATPS粗酶液、0.5X容量的APSK粗酶液，在37。C下保溫。此外，調(diào)制代替兩種粗酶液添加了與上述相同容量的同種的加熱處理粗酶液(將各粗酶液在調(diào)溫至55t:的水槽中浸30分鐘后，在室溫下靜置30分鐘，通過離心分離而得到的上清)的反應(yīng)混合液，同樣地保溫。另外，調(diào)制代替兩種粗酶液添加了與上述相同容量的通過保持pTrc99A的大腸桿菌JM109株調(diào)制的粗酶液的反應(yīng)混合液，同樣地保溫。這些反應(yīng)中的PAPS的生成量的經(jīng)時變化示于圖1。其結(jié)果為，除對照以外的所有反應(yīng)中，都確認(rèn)了PAPS的經(jīng)時生成，但使用ATPS和APSK加熱處理粗酶液的反應(yīng)中，與使用未加熱處理的同種粗酶液的情況相比，PAPS合成效率明顯較高，在各時間點(diǎn)顯示出23倍的PAPS生成量。反應(yīng)開始10小時后的限定于1/2ATP的轉(zhuǎn)化率在使用兩種加熱處理粗酶液的反應(yīng)的情況下為75X，而使用未加熱處理的同種粗酶液的情況下僅為38%。實施例2(l)編碼N末端區(qū)域的氨基酸殘基缺失的PNDK的基因的克隆通過齊藤和三浦的方法(Biochem.Biophys.Acta.,72，619(1963))調(diào)制綠膿桿菌PA01株(ATCCBAA-47)的染色體麗A。接著，按照常規(guī)方法合成表3所示的12種引物DNA，通過以表4所示的111的組合使用2種引物DNA、將上述染色體DNA作為模板的PCR法，擴(kuò)增編碼N末端區(qū)域的氨基酸殘基以各種程度缺失的PNDK的基因。另外，綠膿桿菌PA01株可從ATCC獲得。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>[表4]<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>采用PCR的編碼N末端區(qū)域缺失PNDK的基因的擴(kuò)增如下實施。即，使用Perkin-ElmerCetusInstr聽nt公司制DNA熱循環(huán)儀，對100mL反應(yīng)液(50mM氯化鉀、10mMTris-HC1(pH8.3)、1.5mM氯化鎂、0.001%明膠、模板DNAO.1ug、表4中表示的組合111的2種引物DNA各0.M、ExTaqDNA聚合酶2.5單位)重復(fù)熱變性(94。C、l分鐘)、退火(55。C、1.5分鐘)、聚合(72。C、1.5分鐘)的步驟30次。各基因擴(kuò)增后，以苯酚/氯仿(l:l)混合液處理反應(yīng)液，在水溶性部分中添加2倍容積的乙醇，使DNA沉淀。將沉淀回收的DNA按照文獻(xiàn)(《分子克隆實驗室手冊》第二版，前述)的方法通過瓊脂糖凝膠電泳分離，純化0.91.3kb左右的各DNA片段。將該DNA分別用限制性酶NcoI和BamHI切斷，使用同樣用限制性酶NcoI和BamHI消化了的質(zhì)粒pTrc99A(從PharmaciaBiotech公司購得)和T4麗A連接酶連接。使用各自的連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌，從得到的氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體分離各質(zhì)粒(pTrc-卯k2、pTrc-卯k2N3、pTrc-卯k2N60、pTrc-卯k2N72、pTrc-ppk2N74、pTrc-ppk2訓(xùn)、pTrc-ppk2N80、pTrc-ppk2皿、pTrc-ppk2N84、pTrc-ppk2N89、pTrc-ppk2N94禾口pTrc-ppk2脂9)。質(zhì)粒pTrc-ppk2為含有編碼全長的PNDK的基因的NcoI-BaraHIDNA片段插入于pTrc99A的trc啟動子下游的NcoI-BamHI剪切位點(diǎn)的質(zhì)粒，pTrc-卯k2N3為插入的DNA片段所含的基因編碼缺失N末端側(cè)2個氨基酸殘基的PNDK(以下稱為PNDKN3)的質(zhì)粒，pTrc-ppk2N60為插入的DNA片段所含的基因編碼缺失N末端側(cè)59個氨基酸殘基的PNDK(以下稱為PNDKN60)的質(zhì)粒，pTrc-ppk2N72為插入的DNA片段所含的基因編碼缺失N末端側(cè)71個氨基酸殘基的PNDK(以下稱為PND認(rèn)72)的質(zhì)粒，pTrc-ppk2N74為插入的DNA片段所含的基因編碼缺失N末端側(cè)73個氨基酸殘基的PNDK(以下稱為PNDKN74)的質(zhì)粒，pTrc-ppk2N78為插入的DNA片段所含的基因編碼缺失N末端側(cè)77個氨基酸殘基的PNDK(以下稱為PNDKN78)的質(zhì)粒，pTrc-ppk2N81為插入的DNA片段所含的基因編碼缺失N末端側(cè)80個氨基酸殘基的PNDK(以下稱為P腸KN81)的質(zhì)粒，pTrc-ppk2N84為插入的DNA片段所含的基因編碼缺失N末端側(cè)83個氨基酸殘基的PNDK(以下稱為PNDKN84)的質(zhì)粒，pTrc-ppk2N89為插入的DNA片段所含的基因編碼缺失N末端側(cè)88個氨基酸殘基的PNDK(以下稱為PND認(rèn)89)的質(zhì)粒，pTrc-ppk2N94為插入的DNA片段所含的基因編碼缺失N末端側(cè)93個氨基酸殘基的PNDK(以下稱為PNDKN94)的質(zhì)粒，pTrc-ppk2N104為插入的DNA片段所含的基因編碼缺失N末端側(cè)103個氨基酸殘基的PNDK(以下稱為PNDKN104)的質(zhì)粒。(2)各種N末端區(qū)域缺失PNDK的粗酶液的調(diào)制將保持上述的各質(zhì)粒的大腸桿菌接種到300mL含有100ug/mL的氨節(jié)青霉素的2xYT培養(yǎng)基中，在37"C下振蕩培養(yǎng)。達(dá)到4X108個菌/mL時，在培養(yǎng)液中添加IPTG至lmM的最終濃度，再繼續(xù)在37。C下振蕩培養(yǎng)5小時。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離(10000Xg，IO分鐘)回收菌體，懸浮于30mL的緩沖液(50mMTris-HCl(pH7.5)、0.5mMEDTA、lmM2-巰基乙醇)中后，進(jìn)行超聲波處理，破碎菌體，再通過離心分離(10000Xg，IO分鐘)除去菌體殘渣。將這樣得到的上清部分作為粗酶液。(3)各種N末端區(qū)域缺失PNDK的粗酶液的活性測定將上述的粗酶液中的PNDK活性的單位以如下的方法測定，算出。S卩，分別在含10mM氯化鎂、80mM硫酸銨、10mMADP和多磷酸(以無機(jī)磷酸計為30mM)的50mMTris-HCl緩沖液(pH8.O)中添加上述的粗酶液，通過在37。C下保溫進(jìn)行反應(yīng)，通過10(TC、l分鐘的熱處理停止反應(yīng)。使用高效液相色譜(HPLC)對反應(yīng)液中的ATP進(jìn)行定量，將在37。C下l分鐘生成lnmol的ATP的活性作為l單位。上述的各種N末端區(qū)域缺失PNDK的粗酶液中的PNDK活性示于表5。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>因為各PNDK的比活性不會有特別大的變化，所以由上述表5可知，通過使用缺失相當(dāng)于73個以上、83個以下的氨基酸殘基的部分的堿基序列的DNA片段，可以大量地調(diào)制PNDK。實施例3(1)PNDK的調(diào)制來源于綠膿桿菌的PNDK的調(diào)制如實施例2所述。(2)PPK的調(diào)制以文獻(xiàn)(J.Biosci.Bioeng.，91，557-563(2001))中記載的方法調(diào)制大腸桿菌PPK。PPK的活性單位以如下的方法算出。即，在含10mM氯化鎂、80mM硫酸銨、10mMADP和多磷酸(以無機(jī)磷酸計為30mM)的50mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)中添加酶試樣液，在37'C下保溫10分鐘后，通過在沸騰水浴中處理l分鐘停止反應(yīng)。使用高效液相色譜(HPLC)對反應(yīng)液中的ATP進(jìn)行定量，將l分鐘生成lixmol的ATP的活性作為1單位。(3)PAP的調(diào)制以文獻(xiàn)(W003/100056)中記載的方法調(diào)制來源于約氏不動桿菌C4c^eto/^cterj-o/wso"的PAP。PAP的活性單位以如下的方法算出。即，在含10mM氯化鎂、80mM硫酸銨、10mMAMP和多磷酸(以無機(jī)磷酸計為30mM)的50mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)中添加酶試樣液，在37'C下保溫10分鐘后，通過在沸騰水浴中處理l分鐘停止反應(yīng)。使用高效液相色譜(HPLC)對反應(yīng)液中的ATP進(jìn)行定量，將l分鐘生成lumol的ADP的活性作為1單位。(4)ADK的調(diào)制以文獻(xiàn)(Proc.Natl.Acad.Sci.美國，97，14168-14171(2000))中記載的方法調(diào)制大腸桿菌ADK。ADK的活性單位以如下的方法算出。即，在含10mM氯化鎂、lOmMAMP和lOmMATP的50mMTris-HC1緩沖液(p朋.0)中添加酶試樣液，在37。C下保溫10分鐘后，通過在沸騰水浴中處理l分鐘停止反應(yīng)。使用高效液相色譜(HPLC)對反應(yīng)液中的ATP進(jìn)行定量，將l分鐘生成2umol的ADP的活性作為l單位。(5)無機(jī)焦磷酸酶的調(diào)制無機(jī)焦磷酸酶使用RocheDiagnostics公司的產(chǎn)品。無機(jī)焦磷酸酶的活性單位以如下的方法算出。即，在含10mM氯化鎂和10mM無機(jī)焦磷酸的50mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)中添加酶試樣液，在37。C下保溫10分鐘后，通過在沸騰水浴中處理l分鐘停止反應(yīng)。通過鉬藍(lán)(molybdenumblue)法(《分析化學(xué)大全(TreatiseonAnalyticalChemistry)》，I.M.Kolthoff和P.J.Elving編，第5巻，317402頁，Interscience，紐約(1961))對生成的無機(jī)磷酸的量進(jìn)行定量，將l分鐘生成2umol的無機(jī)磷酸的無機(jī)焦磷酸酶的量作為1單位。(6)ATPS和APSK的調(diào)制來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的ATPS和APSK的調(diào)制如實施例1中所述。(7)同時使用利用ADK和PNDK的本發(fā)明的ATP供給再生體系的PAPS合成在含25mM氯化鎂、20mMAMP、lOOraM硫酸鈉、多磷酸(以無機(jī)磷酸計為100mM)的50mMH印es-K0H緩沖液(pH8.0)中添加ADK(O.l單位/mL)、PNDK(O.l單位/mL)、ATPS(O.25單位/mL)、APSK(O.25單位/mL)和無機(jī)焦磷酸酶(1.0單位/mL)，在37'C保溫。反應(yīng)液組成的經(jīng)時變化示于圖2。該反應(yīng)中，生成的ATP濃度相對于ADP和AMP升高，48小時后的PAPS生成量為12.0mM(相對于AMP的轉(zhuǎn)化率為60X)。(8)同時使用利用PAP和PNDK的本發(fā)明的ATP供給再生體系的PAPS合成在含25mM氯化鎂、20mMAMP、100mM硫酸鈉、多磷酸(以無機(jī)磷酸計為100mM)的50mMH印es-K0H緩沖液(pH8.0)中添加PAP(O.l單位/mL)、PNDK(O,l單位/mL)、ATPS(O.25單位/mL)、APSK(0.25單位/mL)和無機(jī)焦磷酸酶(1.0單位/mL)，在37"C保溫。反應(yīng)液組成的經(jīng)時變化示于圖3。該反應(yīng)中，生成的ATP濃度也相對于ADP和AMP升高，48小時后的PAPS生成量為12.3mM(相對于AMP的轉(zhuǎn)化率為62X)。(9)同時使用利用PAP和PNDK的本發(fā)明的ATP供給，再生體系的PAPS合成(大量制造)在容量2L的恒溫反應(yīng)槽中調(diào)制含25mM氯化鎂、40mMAMP、lOOmM硫酸鈉、多磷酸(以無機(jī)磷酸計為100raM)的lL的水溶液，用氫氧化鈉將pH調(diào)制8.0后，調(diào)溫至37。C。在其中添加500單位PAP、500單位PNDK、250單位ATPS、250單位APSK和10000單位無機(jī)焦磷酸酶，開始反應(yīng)。反應(yīng)開始6小時后，再添加多磷酸(以無機(jī)磷酸計為100mM)。另外，反應(yīng)中使用氫氧化鈉將反應(yīng)液的pH維持于8.0。其結(jié)果為，反應(yīng)開始30小時后的PAPS的生成量達(dá)到29.3mM(相對于AMP的轉(zhuǎn)化率為73%)。比較例1:同時使用利用PPK和ADK的協(xié)調(diào)作用的以往的ATP供給再生體系的PAPS合成在含25mM氯化鎂、20mMAMP、100mM硫酸鈉、多磷酸(以無機(jī)磷酸計為100mM)的50mMH印es-K0H緩沖液(pH8.0)中添加PPK(O.l單位/mL)、ADK(O,l單位/mL)、ATPS(O.25單位/mL)、APSK(O.25單位/mL)和無機(jī)焦磷酸酶(1.0單位/mL)，在37。C保溫。反應(yīng)液組成的經(jīng)時變化示于圖4。該反應(yīng)中，生成的ATP濃度相對于ADP和AMP降低，48小時后的PAPS生成量僅為2.3mM(相對于AMP的轉(zhuǎn)化率為12X)。比較例2:同時使用利用PAP和ADK的以往的ATP供給再生體系的PAPS合成在含25mM氯化鎂、20raMAMP、lOOmM硫酸鈉、多磷酸(以無機(jī)磷酸計為100mM)的50mMH印es-K0H緩沖液(pH8.0)中添加PAP(O.l單位/mL)、ADK(0.l單位/mL)、ATPS(O.25單位/mL)、APSK(0.25單位/mL)和無機(jī)焦磷酸酶(1.0單位/mL)，在37"C保溫。反應(yīng)液組成的經(jīng)時變化示于圖5。該反應(yīng)中，生成的ATP濃度也相對于ADP和AMP降低，48小時后的PAPS生成量停留在8.2mM(相對于AMP的轉(zhuǎn)化率為41%)。權(quán)利要求1.DNA片段，其特征在于，由以序列編號1表示的堿基序列構(gòu)成，編碼來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的腺苷5′-三磷酸硫酸化酶(ATPS)。2.DNA片段，其特征在于，由以序列編號l表示的堿基序列中缺失、置換、插入或添加了l個或數(shù)個堿基的堿基序列構(gòu)成，編碼具有ATPS活性的酶。3.DNA片段，其特征在于，與權(quán)利要求1所述的DNA片段在嚴(yán)格條件下雜交，編碼具有ATPS活性的酶。4.ATPS或具有ATPS活性的酶的調(diào)制方法，其特征在于，使用權(quán)利要求13中任一項所述的DNA片段，通過重組DNA方法調(diào)制具有ATPS活性的粗酶，對得到的粗酶進(jìn)行加熱處理。5.如權(quán)利要求4所述的調(diào)制方法，其特征在于，在4565'C下進(jìn)行加熱處理。6.DNA片段，其特征在于，由以序列編號2表示的堿基序列構(gòu)成，編碼來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的腺苷5'-磷酸硫酸激酶(APSK)。7.DNA片段，其特征在于，由以序列編號2表示的堿基序列中缺失、置換、插入或添加了l個或數(shù)個堿基的堿基序列構(gòu)成，編碼具有APSK活性的酶。8.DNA片段，其特征在于，與權(quán)利要求6所述的DNA片段在嚴(yán)格條件下雜交，編碼具有APSK活性的酶。9.APSK或具有APSK活性的酶的調(diào)制方法，其特征在于，使用權(quán)利要求68中任一項所述的麗A片段，通過重組DNA方法調(diào)制具有APSK活性的粗酶，對得到的粗酶進(jìn)行加熱處理。10.如權(quán)利要求9所述的調(diào)制方法，其特征在于，在4565"C下進(jìn)行加熱處理。11.PAPS的制造方法，其特征在于，使用通過權(quán)利要求4所述的方法調(diào)制的ATPS和通過權(quán)利要求9所述的方法調(diào)制的APSK，由硫酸離子和腺苷5'-三磷酸(ATP)以酶法合成3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS)。12.DNA片段，其特征在于，由以序列編號9表示的堿基序列中的1011171構(gòu)成的編碼多磷酸依賴性核苷5'-二磷酸激酶(PNDK)的多核苷酸中，缺失N末端側(cè)的相當(dāng)于至少72個氨基酸殘基的堿基序列。13.如權(quán)利要求12所述的DNA片段，其特征在于，缺失相當(dāng)于至少73個氨基酸殘基的量的堿基序列。14.如權(quán)利要求12所述的DNA片段，其特征在于，缺失相當(dāng)于72個以上、87個以下的氨基酸殘基的量的堿基序列。15.如權(quán)利要求12所述的DNA片段，其特征在于，缺失相當(dāng)于73個以上、83個以下的氨基酸殘基的量的堿基序列。16.如權(quán)利要求12所述的DNA片段，其特征在于，缺失相當(dāng)于73、77、80或83個的氨基酸殘基的量的堿基序列。17.DNA片段，其特征在于，由權(quán)利要求1216中任一項所述的堿基序列中缺失、置換、插入或添加了l個或數(shù)個堿基的堿基序列構(gòu)成，編碼具有PNDK活性的酶。18.DNA片段，其特征在于，與權(quán)利要求1216中任一項所述的DNA片段在嚴(yán)格條件下雜交，編碼具有PNDK活性的酶。19.PNDK的制造方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1218中所述的任一種DNA片段，通過重組DNA方法調(diào)制PNDK。20.PNDK，其特征在于，通過權(quán)利要求19所述的方法調(diào)制，具有序列編號10的缺失N末端側(cè)的至少72個氨基酸的氨基酸序列。21.腺苷5'-三磷酸(ATP)的供給*再生體系，其特征在于，由腺苷5'-單磷酸(AMP)、多磷酸、多磷酸依賴性核苷5'-二磷酸激酶(PNDK)和多磷酸AMP磷酸轉(zhuǎn)移酶(PAP)構(gòu)成。22.腺苷5'-三磷酸(ATP)的供給*再生體系，其特征在于，由腺苷5'-單磷酸(AMP)、多磷酸、多磷酸依賴性核苷5'-二磷酸激酶(PNDK)和腺苷酸激酶(ADK)構(gòu)成。23.如權(quán)利要求21或22所述的ATP的供給再生體系，其特征在于，PNDK來源于屬于假單胞菌屬的微生物。24.如權(quán)利要求21或22所述的ATP的供給再生體系，其特征在于，PNDK為權(quán)利要求20所述的P固K。25.如權(quán)利要求21或22所述的ATP的供給再生體系，其特征在于，PAP來源于屬于不動桿菌屬的微生物。26.如權(quán)利要求21或22所述的ATP的供給再生體系，其特征在于，ADK來源于大腸桿菌或酵母。27.如權(quán)利要求21或22所述的ATP的供給再生體系，其特征在于，使用通過重組DNA方法轉(zhuǎn)化了的轉(zhuǎn)化體、該轉(zhuǎn)化體的處理物或由該處理物得到的酶作為酶源。28.有用物質(zhì)的制造方法，它是低成本且高效地制造通過將ATP作為能量源和/或底物進(jìn)行消耗的酶反應(yīng)生成的有用物質(zhì)的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求2126中任一項所述的ATP的供給再生體系替代ATP。29.如權(quán)利要求28所述的有用物質(zhì)的制造方法，其特征在于，通過將ATP作為能量源和/或底物進(jìn)行消耗的酶反應(yīng)生成的有用物質(zhì)為3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS)、糖核苷酸、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)中的任一種。30.PAPS的制造方法，它是使用腺苷5'-三磷酸硫酸化酶"15)和腺苷5'-磷酸硫酸激酶(APSK)將ATP硫酸化和磷酸化而制造3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS)的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求2127中任一項所述的ATP的供給再生體系替代ATP。31.如權(quán)利要求30所述的PAPS的制造方法，其特征在于，ATPS和APSK來源于屬于地芽孢桿菌屬的微生物。32.如權(quán)利要求30所述的PAPS的制造方法，其特征在于，使用通過權(quán)利要求4所述的方法調(diào)制的ATPS和通過權(quán)利要求9所述的方法調(diào)制的APSK。33.如權(quán)利要求30所述的PAPS的制造方法，其特征在于，在305(TC的反應(yīng)溫度下進(jìn)行PAPS的酶合成。全文摘要本發(fā)明涉及PAPS的制造方法，它是使用腺苷5′-三磷酸硫酸化酶(ATPS)和腺苷5′-磷酸硫酸激酶(APSK)將ATP硫酸化和磷酸化而制造3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)的方法，其特征在于，利用由腺苷5′-單磷酸(AMP)、多磷酸、多磷酸依賴性核苷5′-二磷酸激酶(PNDK)和多磷酸AMP磷酸轉(zhuǎn)移酶(PAP)構(gòu)成的腺苷5′-三磷酸(ATP)的供給·再生體系或者由腺苷5′-單磷酸(AMP)、多磷酸、多磷酸依賴性核苷5′-二磷酸激酶(PNDK)和腺苷酸激酶(ADK)構(gòu)成的腺苷5′-三磷酸(ATP)的供給·再生體系代替ATP。文檔編號C12N15/09GK101107356SQ20068000289公開日2008年1月16日申請日期2006年1月24日優(yōu)先權(quán)日2005年1月25日發(fā)明者石毛和也,野口利忠申請人:雅瑪山醬油株式會社