專利名稱：：源自蛋的骨強化組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及含有具有骨生長和骨強化作用的蛋黃蛋白質水解物的組合物。另外，本發(fā)明還涉及配合有該蛋黃蛋白質水解物組合物的飲食品、醫(yī)藥品、或飼料等。本發(fā)明的蛋黃蛋白質水解物具有使成骨細胞增殖、促進骨生長端的軟骨細胞增殖的作用。所以，可以預防或治療因骨代謝平衡的破壞而引起的骨疾病，對小孩等年輕一代生長期的骨強化也很有用。
背景技術：
：近年來，骨質疏松癥的增加或年輕一代的骨折率的增加等各種骨疾病的增加，正成為社會問題。據推算，在日本的骨質疏松癥的患者大概已有1，000萬人，而且隨著高齡化的發(fā)展，估計患者數在2010年將達到1，600萬人。就骨質疏松癥而言，主要在絕經后的女性由于女性激素減少打亂骨形成和骨破壞的平衡而導致的疾病，而引人注目。不過伴隨著老齡化，男性中也發(fā)現骨鹽量減少，據推算50歲以上的骨質疏松癥患者大概有200萬人。而且，最近20年里中小學生的骨折率增加到2倍以上，所以，從預防骨質疏松癥的觀點來講，提高年輕一代的骨鹽量從而提高最大骨量是非常重要的。如上所述，不論性別或年齡，保持骨的健康是全社會所關心的大事。歷來預防或者治療骨疾病的方法有食療補鈣法，做輕運動，日光浴，藥物治療等。食療補鈣法主要使用碳酸鈣，磷酸鈣等鈣鹽或牛骨粉，蛋殼，魚骨粉等天然鈣制劑。但是，從溶解性或吸收性，呈味性等觀點來講，不能說是適合于口服攝取的原材料。適當的運動可以增加骨量和強化骨，所以散步或步行有益于骨的健康。但是，身體虛弱時就連做點輕運動也很麻煩，更何況臥病在床的老人基本上不能運動。日光浴雖然在補充活性維生素D方面來講有好處，但是僅這一點是不夠的。說到藥物治療，二磷酸或降鈣素制劑等被使用，而且據說對骨質疏松癥的治療很有效。但是這些物質屬于藥物，有耳鳴，頭痛，食欲不振等副作用的危險性，所以服用時必須特別注意，而且不能使用作持續(xù)性的食品原材料。所以，作為使用了天然原材料的骨強化劑，已開發(fā)出強化了維生素類的雞蛋(專利文件l)或強化了鋅的牡蠣提取物(專利文件2)，使用了源自奶的堿性蛋白質(專利文件3、4)等。專利文件1:特開平10-56978號公報.專利文件2:特開2002-80380號公報專利文件3:專利2974604號公報專利文件4:專利3112637號公報
發(fā)明內容本發(fā)明的課題在于，作為在日常生活中也可以持續(xù)攝取的骨強化劑，提供具有骨強化作用、而且安全便宜、可以廣泛應用于飲食品中的新型食品原材料。蛋在37度下孵化3周就可變成幼雛，它富含有生命體誕生所需的所有材料，是產生下一代的生物寶箱(bioc印sule)，所以，可能還未發(fā)現的生理活性也很多。而且，從古時候開始就有吃蛋的歷史，它的營養(yǎng)價值又高又安全，作為食品原材料的利用價值非常高。本發(fā)明人等對蛋黃的各種組分進行了促進骨生長，骨強化的成分的探索，結果首次發(fā)現了蛋黃蛋白質水解物有成骨細胞增殖及鈣化促進作用。而且，也發(fā)現了口服該成分可以促進骨生長、改善骨代謝，就此完成了本發(fā)明。本發(fā)明的骨強化組合物是蛋黃蛋白質水解物，其特征在于，在用凝膠滲透色譜法分析分子量分布時，含有相對于蛋白質肽氨基酸的總的面積比，分子量為500以上20,000以下的部分面積比占50%以上的物質為有效成分。尚且，在本發(fā)明中使用的蛋黃蛋白質水解物，優(yōu)選把經脫脂處理后的蛋黃用蛋白質分解酶水解后得到的物質。蛋黃的脫脂處理優(yōu)選使可以用于食品加工的有機溶劑(例如乙醇，異丙醇，己烷等)的至少一種作用于蛋黃來實施。另外，作為蛋白質水解酶，可以使用胃蛋白酶、胰蛋白酶、凝乳酶(rermin)、含有凝乳酶且用于干酪用途的粗制凝乳酶、羧肽酶A、源自芽孢桿菌屬細菌的蛋白酶以及源自曲霉菌屬菌的蛋白酶的任意一種或者它們的組合。上述本發(fā)明的骨強化組合物是使用天然物的安全的物質，所以可以作為在日常生活中可攝取的骨強化原材料，飲食品，醫(yī)藥品或飼料而廣泛使用。在本發(fā)明中使用的蛋黃蛋白質水解物，在用凝膠滲透色譜法分析的分子量分布中，只要是含有相對于蛋白質，肽*氨基酸的總的面積比，分子量為500以上20，000以下的部分的面積比占50%以上的物質就可以，但更優(yōu)選上述面積比占55%以上的物質，特別是優(yōu)選上述面積比占65%以上的物質。上述蛋黃蛋白質水解物具有如下所述的活性，即1)促進成骨細胞增殖(促進合成骨的細胞的增殖)，2)促進成骨細胞分化(提高合成骨的細胞的功能，促進膠原蛋白的產生，促進鈣化)，3)抑制破骨細胞的分化增殖(抑制溶骨后使其代謝的細胞的功能和增殖)，4)促進骨生長，也有促進軟骨細胞增殖而促進骨的生長的活性。以上述蛋黃蛋白質水解物為主要成分的骨強化組合物，可以口服，所以可以添加到干酪、黃油、發(fā)酵乳等含乳食品，飲料乳、酸牛奶、咖啡飲料、果汁等的飲料，果凍、布丁、小甜餅干、餅干、維夫餅干等糕點，冷凍食品等各種形態(tài)的飲食品中，可以作為具有骨強化作用的飲食品。并且，也可以以膠囊、片劑等形態(tài)用于補充劑。所以，作為以預防骨質疏松癥、改善癥狀為目的的飲食品，醫(yī)藥品或者飼料的原材料是很有用的。圖1是表示在實施例1中所得到的蛋黃蛋白質水解物用凝膠滲透色譜法分析分子量的結果的圖。斜線部分表示分子量500以上20,000以下的部分。圖2是表示實施例1中的蛋黃蛋白質水解物和在B中所得到的蛋黃水溶性組分的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分析結果的圖。M道表示圖中左面所述的分子量標記，l道表示蛋黃蛋白質水解物的電泳結果，2道表示在B中所得到的蛋黃水溶性成份的電泳結果。圖3是對大鼠經口給實施例1的蛋黃蛋白質水解物時或不給時的脛骨骨端的伸長進行比較的圖。圖4是表示在實施例2中所得到的蛋黃蛋白質水解物用凝膠滲透色譜法分析分子量的結果的圖。斜線部分表示分子量500以上20,000以下的部分。圖5是表示使用在實施例2中得到的蛋黃蛋白質水解物測定骨生長促進效果的結果的圖。圖6是表示使用在實施例2中得到的蛋黃蛋白質水解物測定鈣化促進效果的結果的圖。圖7是表示使用利用不同的酶所得到的蛋黃蛋白質水解物來測定成骨細胞增殖促進活性的結果的圖。具體實施例方式本發(fā)明中所使用的蛋黃，可以舉出雞、鴨、鵪鶉等的蛋的蛋黃，可是從生產率的觀點來講，優(yōu)選使用雞蛋的蛋黃。而且，在使用雞蛋的情況下，可以使用蛋黃液、蛋黃粉末、或者脫脂蛋黃粉末，其中優(yōu)選使用蛋黃粉末、或者脫脂蛋黃粉末。本發(fā)明的骨強化組合物，使用可以用于食品加工的有機溶劑把蛋黃粉末脫脂而得到粉末，再用蛋白質水解酶將其水解而得到。作為用于脫脂的有機溶劑，可以使用乙醇、異丙醇、己烷等一般可用于食品加工的有機溶劑，但是從簡便性和安全性的觀點來講，優(yōu)選使用乙醇。另外，當從蛋黃中制造蛋黃油或蛋黃卵磷脂時，可以將作為副產物所產生的脫脂蛋黃用于水解的原料。作為本發(fā)明中所用的上述蛋白質水解酶，可以使用具有蛋白酶活性或者羧肽酶活性且可以用于食品制造的胃蛋白酶(EC.3.4.23.1)、胰蛋白酶(EC.3.4.21.4)、凝乳酶(EC.3.4.23.15)、含有凝乳酶且有干酪用途的粗制凝乳酶、羧肽酶A(EC.3.4.17.1)、源自芽孢桿菌屬細菌的蛋白酶(商品名"諾維信水解蛋白酶(7VP力，一f)"諾維信投資有限公司制造，商品名"0rientase(才!J工y夕一f)22BF"HBI株式會社制，商品名"nucleicin(5夕^一^>0"腿株式會社制，商品名"proteaseS『amano』G"AmanoEnzymesInc.制造，商品名"Te扁ase⑧PC10(f"乇7—ifPC10)"大和化成株式會社制造)、源自曲霉菌屬菌的蛋白酶(商品名"0rientase0NS"HBI株式會社制造，商品名"Orientase20A"HBI株式會社制造，商品名"proteaseP『amano』3G，，AmanoEnzymesInc.制造，商品名"Flavourzyme(7P—^一1fV厶)"諾維信投資有限公司制造等)等的任意一種或者它們的組合。對于本發(fā)明，在上述的酶當中，特別優(yōu)選使用源自芽孢桿屬細菌的蛋白酶以及/或者胃蛋白酶。蛋白質水解酶的濃度隨著使用的酶的不同而適當改變，但是酶和脫脂蛋黃的質量比優(yōu)選從l:20到1:1,000。還有，酶的反應溫度或反應時間也隨著使用的酶的不同而不同，不過優(yōu)選在2575'C下進行水解反應l24小時。即使反應時間過長或過短，得到的水解產物不能充分得出成骨細胞增殖促進作用、骨生長以及骨強化作用。以上述方法所得到的蛋黃蛋白質水解物在適當脫鹽后，可以直接用作本發(fā)明的骨強化組合物的原材料。而且，也可以用超過濾膜、凝膠過濾法或各種柱色譜法、膜濾器、利用等電點放入方法等來純化或分離。以上述方法得到的蛋黃蛋白質水解物，用凝膠滲透色譜法分析分子量分布，相對于蛋白質*肽*氨基酸的總和的面積比，分子量在500以上20，000以下的部分的面積比占50%以上很重要，更優(yōu)選上述面積比占55%以上，特別優(yōu)選上述面積比占65%以上。如果分子量分布在上述范圍之外，容易產生效果的降低或消失，也可因加熱而引起變性或凝聚等等。不過，只要分布能滿足上述范圍，即使尚未分解的蛋黃蛋白質殘留有1020質量Q/^也沒關系。本發(fā)明的骨強化組合物中的蛋黃蛋白質水解物，優(yōu)選成骨細胞增殖促進活性相對于未添加蛋黃蛋白質水解物相對照組有1.2倍以上的活性，進而優(yōu)選即便在65t:9(TC下進行3分鐘6分鐘的加熱處理，成骨細胞增殖促進活性與上述對照相比仍維持1.2倍以上。上述成骨細胞增殖促進活性的測定，可以通過使用小鼠成骨細胞的MC3T3-T1細胞或源自人的成骨細胞樣細胞U20S細胞的定法來進行。對本發(fā)明的骨強化組合物中蛋黃蛋白質水解物的含量沒有特別限制，但優(yōu)選含有0.0550質量°/。的蛋黃蛋白質水解物，更優(yōu)選含有0.125質如果蛋黃蛋白質水解物的含量不到0.05質量％，得在食品中以高濃度添加本骨強化組合物，所以不優(yōu)選。如果為50質量％以上，對溶解性有影響，所以不優(yōu)選。本發(fā)明的骨強化組合物適用于骨質疏松癥或者各種骨疾病的預防或改善，它的有效攝取量以蛋黃蛋白質水解物來換算的話，成人每天50mg至5g。而且，本發(fā)明的骨強化組合物未呈現大鼠的急性毒性。如此制備出來的骨強化組合物，通常是粉末化后使用。粉末化可以通過凍干、或者噴霧干燥來進行，通常以飲食品經口服用。本發(fā)明的骨強化組合物除了上述成分以外，也可以含有賦形劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、甜調味品、pH調節(jié)劑、增稠劑、蛋白質、肽、氨基酸、類脂物、多糖類、寡糖等通?？捎糜谑称分械某煞帧１景l(fā)明的骨強化組合物不但可以添加到飲食品中，而且，由給藥方法的不同而調制成不同形式，可以以粉末(或顆粒)、飲用劑、片劑、膠囊等形式被使用。另外，蛋是從古時候開始具有食用經驗的安全原材料，所以作為即使持續(xù)使用也不會產生副作用的原材料，還可以用于醫(yī)藥或飼料。實施例下面舉出實施例來詳細說明本發(fā)明，但并不是限制本發(fā)明只能應用該實施例。A.脫脂蛋黃的制備在蛋黃粉末lkg中加入5L乙醇，用混合機攪拌30分鐘后，回收固形物質。把該操作重復3次并對蛋黃進行脫脂，風干，得出568g脫脂蛋黃。B.蛋黃的水溶性組分的制備在A得到的脫脂蛋黃284g中加入37。C的溫水3L，一邊保持溫度一邊用攪拌器充分攪拌后，在8，OOOrpm下進行30分鐘的離心分離，得到上清。然后，得到的上清用凍干而粉末化，得到13.4g蛋黃的水溶性組分。實施例l(蛋黃蛋白質水解物的制造)在A得到的脫脂蛋黃粉末300g中加入3L水，用鹽酸把pH調成3.5。然后，添加3g胃蛋白酶(Sigma-Aldrich公司制造)，在37。C下進行3個小時的酶反應。此后，用氫氧化鈉把pH中和成7讓酶失活，加入30g過濾助劑(硅藻土制品)，用布氏漏斗過濾，把濾液凍干而得到蛋黃蛋白質水解物44.8g。在實施例1中得到的蛋黃蛋白質水解物，用以下條件的凝膠滲透色譜法進行分子量分析。柱Diol60(6.0X300腿)(商品名，YMC公司制造)洗脫液0.2M磷酸鉀緩沖液，0.2M氯化鈉(pH6.9)/乙腈(70:30)流速0.7ml/分檢測波長280nm把這個結果顯示在圖1中。由圖1可以清楚地知道，實施例1的蛋黃蛋白質水解物相對于顯示蛋白質，肽，氨基酸的合計的總面積，分子量在500以上20，000以下的部分的面積比(斜線部分)大約占57%。其次，用實施例1的蛋黃蛋白質水解物和在B中得到的蛋黃水溶性組分，以常規(guī)方法進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。其結果顯示在圖2中。從圖2中可以清楚地知道，大量發(fā)現比蛋黃水溶性組分的帶還小的、分子量在20，000以下的帶。試驗l(成骨細胞增殖活性的測定)從實施例1中所得到的蛋黃蛋白質水解物的成骨細胞增殖活性用以下方法測定。即，使用含有10%FBS的a-MEM培養(yǎng)液，在37°C、5%C02-95%air下培養(yǎng)小鼠成骨細胞的MC3T3-E1細胞直到匯合，然后通過胰蛋白酶處理收集細胞。使收集的細胞在上述a-MEM培養(yǎng)液中懸浮來制備細胞懸浮液(1Xl(T個/mL)。把每0.5mL該細胞懸浮液接種于24孔板，在37°C、5%C02-95%air下培養(yǎng)。第二天，把蛋黃蛋白質水解物溶解于50(v/v)%DMS0，向細胞中添加蛋黃蛋白質水解物(使添加的DMSO為培養(yǎng)液的1(v/v)%)并使?jié)舛葹镮OO、25、12.5yg/mL，另外添加作為鈣化促進劑的a-甘油磷酸鹽(2mmol/L)。培養(yǎng)液每隔一天更換一次，20天后使用MTT(3-(4，5—Dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyltetrazoliumBromide:3，(4，5—二甲基一2—噻唑基)一2，5—二苯基四唑鑰溴化物)并利用常規(guī)方法來測定成骨細胞的個數(MTT法)。蛋黃蛋白質水解物(100Pg/mL)對成骨細胞的增殖促進活性，如果用以對照的增殖數為100時的相對值來表示，為150±11。另一方面，從上述B得到的蛋黃水溶液組分的成骨細胞增殖促進活性，如果用同樣的相對值表示為128±18。另外，對在實施例1中得到的蛋黃蛋白質水解物在8(TC下進行5分鐘熱處理，同樣測定成骨細胞的增殖促進活性，如果用以對照組的增殖數為100時的相對值來表示則為130±10。一方面，對上述B中得出的蛋黃水溶性組分進行同樣的熱處理時，成骨細胞的增殖促進活性用同樣的相對值來表示的話為105±11。即，蛋黃蛋白質水解物相對于熱處理，雖然減少若干活性，但是保持充分高的成骨細胞增殖促進活性，顯示出熱穩(wěn)定性。試驗2(骨生長促進效果)用Sprague-Dawley系大鼠來評價在實施例1中得到的蛋黃蛋白質水解物的骨生長促進效果。具體來講，給予作為熒光物質的四環(huán)素，利用四環(huán)素和鈣形成螯合物沉積成骨的現象，觀察被形成骨的熒光帶，由此來測定脛骨的生長。艮P，試驗期間(l周)把溶解于精制水的濃度為20mg/mL的試料，用胃探針使大鼠經口服用(100mg/kg體重/1天)。然后，在試驗期間中的第3天和第5天以注射的方式給四環(huán)素。還有，在試驗期間中的大鼠的飲用水和飼料(商品名"MF"，OrientalYeastCo,.Ltd.制)采取了自由攝取方式。在第7天時把脛骨摘出，在熒光顯微鏡下觀察由于給予了四環(huán)素而在脛骨生長板的下部(骨新生部)形成的各熒光帶的間隔(從給四環(huán)素的第3天到第5天的2天間的脛骨骨端的伸長)并進行測定。把沒有給蛋黃蛋白質水解物時(對照)的骨的伸長率設為100%，求出給蛋黃蛋白質水解物時的骨的伸長率，將結果顯示在圖3中。在圖3中，與對照相比，在給蛋黃蛋白質水解物時，2條熒光帶的間隔寬出31%，確認了具有骨生長促進效果。實施例2(蛋黃蛋白質水解物的制造)在和A用同樣的方法得到的脫脂蛋黃粉末500kg中，加入2.5噸水以及諾維信投資有限公司制造的諾維信@水解蛋白酶(商品名，芽孢桿菌屬細菌(bacilluslicheniformis)由來的蛋白酶)25kg,在pH7，55。C下進行3個小時酶反應，此后，在8(TC下用15分鐘的熱處理使酶失活，在離心力3，000g下離心分離20分鐘，除去沉淀，過濾后，把濾液噴霧干燥，得到蛋黃蛋白質水解物大約140kg。和實施例1用同樣的方法，對在實施例2中得到的蛋黃蛋白質水解物實施分子量分析。其結果顯示在圖4。從圖4可以明顯地知道，所得到的蛋黃蛋白質水解物相對于顯示蛋白質，肽，氨基酸的合計的全面積，分子量在500以上20，000以下的部分的面積比(斜線部分)大約占85%。其次，對實施例2的蛋黃蛋白質水解物實施了以下的試驗。把未使用蛋黃蛋白質水解物的示為各試驗的對照。試驗l(骨生長促進效果)和實施例1的試驗2用同樣的方法，調查了實施例2中所得到的蛋黃蛋白質水解物的骨生長促進效果。即，用胃探針(sonde)使Sprague-Dawley系大鼠經口服用(每天，每lkg體重給10mg，20mg或者50mg)溶解于精制水而得到的試料(濃度20mg/mL)。然后，在試驗期間中的第3天和第5天以注射的方式給熒光物質(四環(huán)素10mg/kg)，第7天摘出脛骨，測定在熒光顯微鏡下觀察到的2條熒光帶的間隔(從給四環(huán)素的第3天到第5天的2天間的脛骨骨端的伸長)。其結果顯示在圖5。從圖5中得知了投與量依賴性的骨生長促進效果。試驗2(鈣化促進效果)把6X105個MC3T3-E1細胞接種于(a-MEM培養(yǎng)基，腦FCS，2畫1/L甘油磷酸)3.5cm的培養(yǎng)皿中，加入濃度為lOOug/mL的實施例2中得到的蛋黃蛋白質水解物，每隔兩天更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)4周，用PBS(磷酸緩沖液)沖洗細胞，加入5(v/v)%高氯酸，用超音波處理，把沉積在細胞中的鈣洗脫，測定洗脫的鈣量「CalciumE-TestWako」(商品名，和光純藥工業(yè)株式會社制造)作為鈣化活性。其結果顯示在圖6中。由圖6可知，通過添加蛋黃蛋白質水解物，鈣化活性顯著上升(p<0.001)。試驗3(破骨細胞的分化以及增殖抑制效果)從小鼠的骨髓中分離出骨髓細胞，測定向破骨細胞的分化以及增殖。首先，把小鼠大腿骨的骨髓細胞，用含有作為分化誘導因子的RANKL(rec印toractivatorofNF-kBligand:NF-kB活化受體配體)的a-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后，用樣品處理，再培養(yǎng)4天。然后，用固定液把細胞固定，應用TRAP染色試劑盒(商品名，"387-AAcidPhosphatase,Leukocyte"SIGMA-AldrichJapan公司制造)進行TRAP染色，在顯微鏡下觀察染成紅色的破骨細胞的個數。對于添加實施例2的蛋黃蛋白質水解物50ug/mL、lOOug/mL以及200ug/mL而培養(yǎng)的細胞和未添加來培養(yǎng)的細胞，測定破骨細胞的產生頻度，將結果顯示在下表。蛋黃蛋白質水解物破骨細胞(被染成紅色的細胞)添加量(yg/mL)發(fā)生頻度(％)022.550161002.52000從上表中可知，破骨細胞的發(fā)生頻度的受抑制依賴于蛋黃蛋白質水解物的濃度。實施例3(蛋黃蛋白質水解物)在A得到的脫脂蛋黃粉末300g中加入3L水，在表1中所顯示的酶-條件下進行酶反應，此后，在沸騰水浴中達到8(TC后進行IO分鐘加熱使酶失活，加入30g過濾助劑(硅藻土制品)，用布氏漏斗過濾，對得到的濾液進行凍干，得到7種蛋黃蛋白質水解物。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注「所定分子量的面積比j是指用凝膠滲透色譜儀分析蛋黃蛋白質加水分解物的分子量分布時，在蛋白質"肽"氨基酸合計的面積比中，分子量在500以上20,000以下的部分的面積比。試驗l(成骨細胞增殖促進活性)使用含有10%FBS的a-MEM培養(yǎng)液，在37。C，5%C02-95%air下培養(yǎng)小鼠成骨細胞MC3T3-El細胞直到匯合后，用胰蛋白酶處理來收集細胞。使收集的細胞在上述的a-MEM培養(yǎng)液中懸浮而制備細胞懸浮液(2X104個/mL)。把該細胞懸浮液接種于96孔板中且各接種0.lmL，另外添加作為鈣化促進劑的a-甘油磷酸鹽(2mmol/L)，在37。C，5%C02-95%air下進行培養(yǎng)。24小時后，把在實施例3中所得到的各樣品溶解于50(V/V)%DMSO中并添加到細胞，使樣品的濃度成為lOOug/mL(使添加的DMSO成為培養(yǎng)液的1(v/v)%)。此外，在培養(yǎng)24小時后，和實施例1的試驗1同樣，用MTT法測定了細胞增殖活性。用將對照(未添加蛋黃蛋白質水解物)的增殖數設為ioo時的相對值來表示各蛋黃蛋白質水解物(100iig/mL)的成骨細胞增殖促進活性，結果顯示在圖7中。由圖7中可知，使用源自芽孢桿菌屬細菌的蛋白酶、胃蛋白酶、源自曲霉菌屬菌的蛋白酶來水解而得到的蛋黃蛋白質水解物，具有較高的成骨細胞增殖促進活性(關于使用芽孢桿菌屬細菌由來的蛋白酶和胃蛋白酶來水解而得到的蛋黃蛋白質水解物，與對照相比具有顯著差異(p〈0.005))。對于以下的實施例，如果沒有特別的要求，"％"則表示"質量％"。實施例4(清涼飲料水)制備含有在實施例1中得到的蛋黃蛋白質水解物的清涼飲料水。艮口，將組成為混合異構糖15.0%、果汁10%、蛋黃蛋白質水解物2.0%、香料0.1%、豐丐O.1%、水72.8%的原料混合，利用板式殺菌機在9(TC下進行15秒的殺菌，制造具有骨強化作用的清涼飲料水。實施例5(酸奶)制備含有在實施例1中得到的蛋黃蛋白質水解物的酸奶。即，將組成為蛋黃蛋白質水解物3.0%、蔗糖7%、香料0.1%、酸奶89.9%的原料混合并充填到容器中，制造了具有骨強化作用的酸奶。實施例6(奶酪)職別含有在實施例1中得到的蛋黃蛋白質水解物的加工奶酪。即，配合各原料使得含有古烏達干酪(Goudacheese)35%、賽達干酪(Cheddarcheese)35%、巴馬干酪(Parmesancheese)20%、蛋黃蛋白質水解物2.0%、磷酸鈣1.0%、水7.0%，然后在乳化溫度為85'C下進行乳化，制造了具有骨強化作用的加工奶酪。實施例7(膠囊)配合各原料使得含有在實施例1中得到的蛋黃蛋白質水解物60%、玉米淀粉30%、乳糖10%，充填到凝膠膠囊中(每個膠囊含200mg)，制造了具有骨強化作用的膠囊。實施例8(片劑)配合各原料使得含有在實施例1中得到的蛋黃蛋白質水解物60%、還原麥芽糖18%、結晶纖維素18%、蔗糖酯4%，然后做成片劑(每片300mg)，制造了具有骨強化作用的片劑。'工業(yè)上的可利用性本發(fā)明的骨強化組合物以及含有它的飲食品，是以安全便宜的蛋黃或者制造蛋黃油時所產生的副產物脫脂蛋黃為原料，而且具有成骨細胞增殖促進、骨生長以及骨強化作用。所以，可以用作以預防骨質疏松癥、或者骨的生長促進以及骨的強化的健康食品。權利要求1.一種骨強化組合物，其特征在于，其是蛋黃蛋白質水解物，在通過凝膠滲透色譜法分析分子量分布時，含有相對于蛋白質·肽·氨基酸的總和的面積比，分子量為500以上20,000以下的部分面積比占50％以上的物質為有效成分而成。2.如權利要求1所述的骨強化組合物，其特征在于，所述蛋黃蛋白質水解物是通過可以用于食品加工的有機溶劑的至少一種對蛋黃進行脫脂處理后，再用蛋白質水解酶來水解而得到的物質。3.如權利要求1或者2所述的骨強化組合物，其特征在于，所述蛋黃蛋白質加水分解酶是從胃蛋白酶、胰蛋白酶、凝乳酶、含有凝乳酶且有干酪用途的粗制凝乳酶、羧肽酶A、源自芽孢桿菌屬細菌的蛋白酶以及源自曲霉菌屬菌的蛋白酶所組成的組中選擇的至少一種。4.配合有權利要求13中任意一項所述的骨強化組合物的飲食品、醫(yī)藥品或者飼料。全文摘要本發(fā)明提供一種骨強化組合物，其是蛋黃蛋白質加水分解物，在通過凝膠滲透色譜儀分析分子量分布時，含有相對于蛋白質·肽·氨基酸的總和的面積比，分子量為500以上20,000以下的部分的面積比占50％以上的物質作為有效成分。該組合物具有成骨細胞增殖促進、骨生長以及骨強化作用，對以骨質疏松癥為代表的各種骨疾病的預防以及治療有效，可以廣泛用于飲食品、醫(yī)藥品、或者飼料中，日常生活中可以持續(xù)攝取，作為安全且便宜的制品很有用。蛋黃蛋白質水解物優(yōu)選在用有機溶劑對蛋黃進行脫脂后得到粉末，用蛋白質水解酶來水解該粉末得到的物質。文檔編號A23L1/305GK101188949SQ20068000209公開日2008年5月28日申請日期2006年1月6日優(yōu)先權日2005年1月11日發(fā)明者大井康之,林康鉉,池旻映,源伸介,趙祥祐,金惠京,金武祚申請人:富爾瑪株式會社;金惠京;林康鉉;株式會社斗山