專(zhuān)利名稱(chēng)：一種誘發(fā)細(xì)胞粘附生長(zhǎng)因子rgd抗體免疫原的化學(xué)合成方法
所屬技術(shù)領(lǐng)域本研究屬誘發(fā)細(xì)胞粘附生長(zhǎng)因子RGD抗體免疫原的化學(xué)合成法。這種RGD免疫原的化學(xué)合成物，可以在動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)出細(xì)胞粘附生長(zhǎng)因子RGD抗體，而這種抗體是小分子RGD不能靠自身在動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)出的。RGD是人工合成小肽，氨基酸序列為GLY-ARG-GLY-ASP-SER-PRO-LYS)，通過(guò)這種化學(xué)合成RGD免疫原，在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)RGD抗體，這在國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。
背景技術(shù)：
RGD是許多粘附蛋白共有的細(xì)胞最小識(shí)別序列，這一序列會(huì)促進(jìn)識(shí)別細(xì)胞的粘附，遷移和生長(zhǎng)。目前，RGD細(xì)胞粘附生長(zhǎng)因子是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，它主要用于固定RGD在生物材料上，促進(jìn)細(xì)胞在其上的生長(zhǎng)和粘附作用，目的在于提高生物材料植入體內(nèi)的生物材料的組織相容性。目前定量定性分析固定在生物材料上的RGD，多采用光電子能譜(XPS)，傅立葉紅外氨基酸分析(FTIR)等測(cè)定其結(jié)合的氨基酸數(shù)量及活性確定RGD，這些分析方法費(fèi)工費(fèi)時(shí)。如果研制出RGD抗體，就可以應(yīng)用簡(jiǎn)便、靈敏、快速的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA，來(lái)對(duì)固定在生物材料上的RGD，準(zhǔn)確度進(jìn)行定性和定量測(cè)定。因?yàn)镋LISA法是免疫酶技術(shù)的一種，免疫酶技術(shù)是將酶標(biāo)記在抗體/抗原分子上，形成酶標(biāo)抗體/酶標(biāo)抗原，稱(chēng)為酶結(jié)合物。該酶結(jié)合物的酶在免疫反應(yīng)后，作用于底物使之呈色，根據(jù)顏色的有無(wú)和深淺，用光電比色測(cè)定性定量抗原。所以研制出RGD抗體能為固定在生物材料上的RGD檢測(cè)，提供簡(jiǎn)便、靈敏、快速的ELISA方法。
目前普遍應(yīng)用的人工合成小肽RGD，分子量為715.8，小于1000，屬于小分子，實(shí)驗(yàn)證實(shí)是一種半抗原，它只具有免疫反應(yīng)性，沒(méi)有免疫活性，在動(dòng)物體內(nèi)不具有誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的功能。
通常產(chǎn)生小分子抗體的方法是將半抗原和載體用聯(lián)結(jié)劑或縮合劑共價(jià)連在一起制成免疫原，然后免疫動(dòng)物誘發(fā)抗體。半抗原與蛋白載體共價(jià)聯(lián)結(jié)常需要聯(lián)結(jié)劑和縮合劑，常用聯(lián)結(jié)劑和縮合劑的有碳化二亞胺類(lèi)(EDC，DDC等)混合酸酐、異丁基氯甲酸酯，二異氰酸化合物或EDC、雙功能偶聯(lián)劑間苯二甲基二異氰酸(m-xylylen-diisocyanate，簡(jiǎn)稱(chēng)XDI)等等。一般用于半抗原產(chǎn)生抗體的主要的蛋白載體有牛血清清蛋白BSA、γ-球蛋白、雞蛋清蛋白(簡(jiǎn)稱(chēng)OVA)、聚-賴(lài)氨酸、聚-谷氨酰胺、甲狀腺球蛋白、血藍(lán)蛋白、纖維蛋白原、破傷風(fēng)毒素等等。
另外，對(duì)于小肽來(lái)說(shuō)，產(chǎn)生抗體的一個(gè)規(guī)律是沒(méi)有出現(xiàn)4個(gè)以上連續(xù)相鄰的疏水性殘基，序列中帶電氨基酸較多(因?yàn)檫@樣會(huì)使可供肽序列免疫原性可能的氨基酸就高)，易溶于水。
現(xiàn)分析RGD，從GLY-ARG-GLY-ASP-SER-PRO-LYS序列觀察，沒(méi)有出現(xiàn)4個(gè)以上連續(xù)相鄰的疏水性殘基，只有兩個(gè)中性GLY氨基酸，也不連在一起。序列中其余5個(gè)氨基酸ARG、ASP、SER、PRO、LYS是在水中全部是帶電荷的氨基酸，所以RGD帶電荷的氨基酸較多，并且5個(gè)氨基酸帶電荷的氨基酸全部為親水性氨基酸，所以RGD易溶于水溶劑。從這一分析看，RGD與載體蛋白偶聯(lián)，具備了產(chǎn)生抗體的可能性。
本發(fā)明的目的是為了RGD能在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體，研究用具有20個(gè)自由氨基的OVA作為誘發(fā)RGD產(chǎn)生抗體的載體，選用雙功能試劑XDI作為聯(lián)結(jié)劑，是因?yàn)槠渖暇哂斜江h(huán)，它有助于抗體的產(chǎn)生和連接后產(chǎn)物的光學(xué)測(cè)定。用XDI將OVA上的氨基和RGD的氨基偶聯(lián)在一起。用偶聯(lián)有多個(gè)RGD的OVA卵清蛋白免疫動(dòng)物體，誘發(fā)動(dòng)物體產(chǎn)生RGD抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是要想誘發(fā)半抗原RGD抗體，從目前技術(shù)來(lái)看，必須將小分子RGD連接到一定的載體上，而且連接到載體上的半抗原數(shù)目在10個(gè)左右時(shí)，在動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)半抗原抗體可能性最大。另外，在動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)半抗原抗體的成功，還于半抗原連接載體和偶聯(lián)劑選擇有關(guān)，所以半抗原RGD在動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)抗體成功，解決技術(shù)的關(guān)鍵在于選擇好連接載體和偶聯(lián)劑以及偶聯(lián)效果。RGD抗體在動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)成功，就可以應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA，對(duì)固定在生物材料上的RGD，準(zhǔn)確地進(jìn)行定性和定量測(cè)定分析。避免了應(yīng)用光電子能譜(XPS)，傅立葉紅外(FTIR)等測(cè)定材料表面的RGD費(fèi)工費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)。同時(shí)這一創(chuàng)新性研制RGD，在生物學(xué)上的意義也很大，RGD存在于纖維連接蛋白、玻璃連接蛋白、纖維蛋白原、膠原蛋白等糖蛋白中，這些糖蛋白與機(jī)體細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)密切相關(guān)。
RGD抗體研制的成功，對(duì)于這些帶有RGD糖蛋白檢測(cè)和其相關(guān)細(xì)胞生長(zhǎng)分析帶來(lái)一定的幫助。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)因?yàn)镽GD是一種半抗原，不具有誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的功能，需要連接到載體上。產(chǎn)生小分子RGD抗體免疫原化學(xué)合成的方法是將RGD半抗原和卵清蛋白VOA載體用雙功能偶聯(lián)劑間苯二甲基二異氰酸XDI共價(jià)連在一起制成免疫原。連接載體和RGD使用的雙功能偶聯(lián)劑是間苯二甲基二異氰酸，RGD的氨基酸序列為GLY-ARG-GLY-ASP-SER-PRO-LYS，選用具有20個(gè)自由氨基的卵清蛋白OVA作為誘發(fā)RGD產(chǎn)生抗體的載體。RGD通過(guò)雙功能試劑XDI二異氰酸間二甲苯與VOA連接，XDI有2個(gè)異氰酸鹽的化合物，它的2個(gè)異氰酸鹽分別與RGD和OVA的游離氨基結(jié)合，所以RGD和OVA等價(jià)結(jié)合于兩側(cè)。并且1分子OVA上交聯(lián)有11分子的RGD。
用雙功能偶聯(lián)劑間苯二甲基二異氰酸鹽XDI，將半抗原RGD與具有20個(gè)自由氨基的雞卵清蛋白OVA蛋白載體共價(jià)相聯(lián)，制得OVA上連接11個(gè)RGD的合成物，用這一合成物質(zhì)當(dāng)作免疫原，免疫兔子，誘發(fā)抗RGD抗體IgG的產(chǎn)生。RGD抗體研制的成功，就可以應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA，對(duì)固定在生物材料上的RGD，準(zhǔn)確地進(jìn)行定性和定量測(cè)定分析。避免了應(yīng)用光電子能譜(XPS)，傅立葉紅外(FTIR)等測(cè)定材料表面的RGD費(fèi)工費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)。
用XDI的結(jié)合方法合成RGD免疫抗原，制備合成肽RGD與OVA的偶聯(lián)物，即RGD免疫原，RGD通過(guò)雙功能試劑XDI(m-xylylen-diisocyanate，二異氰酸間二甲苯)與VOA，它有2個(gè)異氰酸鹽的化合物，它的2個(gè)異氰酸鹽分別與RGD和OVA的游離氨基結(jié)合。所以RGD和OVA等價(jià)結(jié)合于兩側(cè)。如圖1所示，結(jié)合反應(yīng)分2步進(jìn)行，即首先與RGD結(jié)合，然后用其復(fù)合物再與OVA反應(yīng)。
1 RGD與OVA的偶聯(lián)物合成


圖1a-OVA-RGD結(jié)合物電泳圖，圖1b-紫外掃瞄圖，圖2-IgG DEAE-52柱層析洗脫圖曲線(xiàn)圖，是制備血清與RGD免疫擴(kuò)散的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖3是制備血清與RGD免疫擴(kuò)散的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，其中圖3中a-RGD免疫的血清無(wú)免疫沉淀反應(yīng)；b-VOA-RGD免疫的血清有免疫沉淀反應(yīng)。
下面結(jié)合RGD抗體誘發(fā)的具體實(shí)施方式
及附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明1.RGD抗體誘發(fā)的步驟(1)RGD免疫原合成RGD與OVA的偶聯(lián)物合成，即RGD免疫原合成，具體步驟如下RGD用PBS溶解，使其濃度為75mg/ml。將上液以1∶2比例與硼酸緩沖液混合，使RGD的終濃度為25mg/ml。按100mgRGD加0.1ml XDI的比例，加入XDI溶液。置攪拌器上在4℃劇烈攪拌45min，然后以1500rpm離心20min，棕色的上清液立即用于結(jié)合，不必在4℃保存。加入OVA蛋白溶液，與RGD的重量比是1∶1，并加入新的硼酸緩沖液，硼酸的克分子濃度應(yīng)保持在0.1M。反應(yīng)混合物在4-6℃輕輕攪拌4h。反應(yīng)結(jié)束后，用(NH4)2CO3，溶液冷透析過(guò)夜，然后用PBS透析4-5h。以100,00rpm離心5h(不中斷)，將沉淀物溶解在PBS中并再離心如此重復(fù)2次。每次離心后，必須立即取出上清液。得到的沉淀物溶解在少量PBS中，用微孔濾器除菌，保存。
(2)利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳定性確定RGD與OVA的交聯(lián)配制10％凝膠，吸取膠液加入到玻璃板框中，膠液加到距玻璃板頂端約1cm處，將樣品槽模，聚合30min，小心取下模板，于電極槽中加滿(mǎn)電極緩沖液，用微量注射器加樣40ul，陰極在上端陽(yáng)極在下端，電壓150v，進(jìn)行電泳，待染料遷移到離底部1cm時(shí)，停止電泳取下凝膠板框，用裝有長(zhǎng)針頭的注射器將水注入凝膠和玻璃板間，小心使凝膠脫落，置磁盤(pán)中，用考馬斯亮蘭R250染色2hr。多次換液直至蛋白區(qū)帶清晰為止。觀察OVA與RGD-OVA泳動(dòng)情況。
(3)半抗原RGD與載體OVA的交聯(lián)分離純化和交聯(lián)比的確定所得RGD-OVA混合物，在4℃下用蒸餾水透析濃縮過(guò)夜，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，在電泳結(jié)束時(shí)，泳動(dòng)速度慢于OVA的是純RGD-OVA。將其部位凝膠切下，切成小塊，放進(jìn)DF-17電泳槽，用凝膠電泳緩沖液洗脫回收，直至膠塊上的考馬斯亮藍(lán)R250為無(wú)色，經(jīng)過(guò)多次電泳合并收集得到的洗脫液蛋白質(zhì)，即可得純的RGD-OVA，所得清液在RT-100型冷凍濃縮干燥機(jī)中冷凍干燥，稱(chēng)取OVA蛋白1mg溶于3ml蒸餾水中，稱(chēng)取RGD-OVA 1mg溶于3ml蒸餾水中，分別配制濃度為1mg/3ml的OVA溶液和RGD-OVA溶液，以UVikon810型紫外分光光度計(jì)進(jìn)行200nm-300nm波段間的紫外吸收?qǐng)D譜掃描，觀察OVA和RGD-OVA吸收峰間的差異。并測(cè)定濃度為0.1mM的RGD溶液在280nm處的吸收光密度值，然后計(jì)算摻入載體中的半抗原克分子數(shù)。
(4)免疫途徑按照王世中的方法，取油脂混合液，在微火上融化后取1.73ml加入無(wú)菌研缽中，再緩緩加入0.23ml活卡介苗(濃度為75mg/ml)，邊滴加邊研磨，待完全相容后，然后再緩慢滴加1.5ml抗原溶液。(濃度為4mg/ml，0.85％生理鹽水配制)每加1滴應(yīng)研磨數(shù)轉(zhuǎn)，全部抗原加入后應(yīng)成為白色糊的油包水乳劑。然后免疫，免疫時(shí)，選4～5斤左右健康雄性大耳白純種兔8只，從耳靜脈抽取健兔血10ml左右以作對(duì)照，檢驗(yàn)和OVA，RGD-OVA有無(wú)免疫反應(yīng)，然后取抗原和完全福氏佐劑混合形成的乳劑，按每只1～1.5mg抗原的量，進(jìn)行兔子背部多點(diǎn)小劑量皮內(nèi)注射，每次注射10點(diǎn)左右，每點(diǎn)0.1ml左右，以15天為間隔，注射4次，第四次注射后一周測(cè)試效價(jià)，觀察是否形成抗體。第五次開(kāi)始進(jìn)行耳靜脈注射，以0.85％生理鹽水配制抗原，按每只1mg的量，固定一耳進(jìn)行注射，以一星期為間隔，共進(jìn)行4次耳靜脈注射。以未偶聯(lián)OVA的RDG作為對(duì)照。
(5)RGD抗血清的獲取動(dòng)物在放血前停食12hr，放血方法為二種，一種是耳靜脈滴血，將耳緣靜脈切-長(zhǎng)0.5cm的縱切口，用清毒試管受血，另一種是頸部動(dòng)脈放血，將動(dòng)物兔子仰臥固定四肢，須部剪毛消毒，切開(kāi)皮膚，剝離肌肉，找到搏動(dòng)的頸動(dòng)脈，用無(wú)菌剪刀剪斷頸動(dòng)脈，用清毒三角瓶受血。將收集到的動(dòng)物血液成斜面37℃放置2hr，然后4℃冰箱過(guò)夜，次日用無(wú)菌滴管吸取抗血清，4000rpm離心20min，去沉淀，存抗血清，分裝置在-18℃下保存。
(6)抗血清特異性檢測(cè)最后一次注射一周后，從耳靜脈少量采血，以無(wú)菌試管受血，成斜面37℃放置2hr，然后在4℃下過(guò)夜，分離血清。用0.1M pH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液配制瓊脂糖凝膠，水浴上熱溶解到透明，澆制凝膠板，冷卻后打孔，挖槽。膠厚度為1.5mm，孔徑為3mm，進(jìn)行免疫雙擴(kuò)散中心孔加抗原(1mg/ml)，邊緣孔加倍比稀釋的抗血清，在室溫下保濕擴(kuò)散過(guò)夜，觀察白色沉淀線(xiàn)出現(xiàn)情況，37℃保濕擴(kuò)散1～3hr，觀察白色沉淀線(xiàn)出觀情況，依據(jù)免疫雙擴(kuò)散，確定抗血清效價(jià)及特異性是否符合要求。
(7)抗血清制備純化(a)飽和硫酸銨沉淀法粗提純?nèi)?ml抗血清，加入6ml0.02MpH7.4PBS，邊攪拌邊滴加100％硫酸銨，使它占總體積的35％，加完后繼續(xù)攪拌30min，然后在4℃冰箱靜置1hr以4000rpm離心20min，去上清液，白色沉淀中加入3mlPBS，再邊攪拌邊滴加100％硫酸銨，仗它占總體積的35％，攪拌30min，然后在4℃冰箱靜置1hr，4000rpm離心20min，去上清液，用3mlPBS溶解白色沉淀，裝入透析袋對(duì)PBS透析3天，每天換液3次，以奈氏試劑檢查有無(wú)NH4+，BaCl2試劑檢查有無(wú)SO42-，NH4+，SO42-徹底去除干凈后得到IgG粗液。
(b)DEAE柱層析進(jìn)一步提純IgG取10g陰離子交換劑DEAE-52浸泡于無(wú)離子水中過(guò)夜，以充分溶脹，第二天傾去上層細(xì)粒和液體，反復(fù)多次，加入0.5NNaOH浸泡30min，在布氏漏斗上抽濾，水洗到中性，加入0.05N HCl浸泡30min，抽濾水洗到中性，再加入0.5NNaoH浸泡30min，再抽濾，水洗到中性，選長(zhǎng)20cm，直徑1.5cm柱，進(jìn)行裝柱，以0.02MPBS平衡，緩慢加樣3ml IgG液，以每分鐘1毫升的速度洗脫，收集在280nm有吸收的第一吸收峰部分。然后在紫外分光光度計(jì)上分別測(cè)定280nm-260nm處的及收光密度值，計(jì)算IgG溶液中蛋白的濃度，分裝置-18℃保存。
2.誘發(fā)RGD抗體實(shí)驗(yàn)步驟結(jié)果(1)RGD與蛋白OVA交聯(lián)比的純化和確定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖顯示出RGD與RGD-OVA電泳遷移率不同，由于聚丙烯酰胺凝膠具有三度空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，分子通過(guò)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的能力，將取決于分子的大小和形狀，引入十二烷基磺酸鈉(SDS)后，使電泳蛋白的電荷呈現(xiàn)一致的強(qiáng)負(fù)電性，使所有蛋白在電泳時(shí)按其分子大小而分開(kāi)。圖1(a)可見(jiàn)不同蛋白按分子量大小分開(kāi)，泳道3在43KD處是OVA，泳道2在52.6KD處為偶聯(lián)物OVA-RGD，泳動(dòng)快的是未反應(yīng)OVA，偶聯(lián)物后面的條帶是副反應(yīng)，為兩個(gè)OVA的結(jié)合，泳道1為RGD，已走出凝膠。
圖1(b)所示分別為RGD-OVA和OVA的紫外掃描曲線(xiàn)，兩者紫外吸收值差值較大，說(shuō)明OVA交聯(lián)了RGD。OVA交聯(lián)RGD的比計(jì)算如下OVA吸收光密度值OD280nm＝0.148濃度1mg/3mlRGD-OVA吸收光密度值OD280nm＝0.691濃度1mg/3ml已測(cè)得0.1毫摩爾濃度在pH7.0波長(zhǎng)280nm處的吸收光密度值為0.608，RGD分子量為715.8，0.691-0.148＝0.543 即RGD-OVA中近似RGD的吸收光密度值，0.608∶71.58＝0.543∶XX＝63.93毫克/升又1毫克/3毫升＝333.3毫克/升333.3×715.8/63.93＝43000/Yy＝11.4即1分子OVA上交聯(lián)有11分子的RGD，通過(guò)紫外吸收光密度值計(jì)算的RGD和OVA偶聯(lián)近似比為11∶1。
圖1(a)OVA-RGD結(jié)合物電泳圖Lane1，RGD，Lane2，OVA-RGD，Lane3，OVA，Lane4，標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量蛋白圖1(b)紫外掃描圖(2)抗體免疫球蛋白的IgG提取抗血清飽和硫酸銨沉淀粗提純后，經(jīng)DEAE-52柱層析進(jìn)一步提純IgG，洗脫曲線(xiàn)如圖2TI2從圖可見(jiàn)，得到了抗體純化的典型洗脫曲線(xiàn)，說(shuō)明第一吸收峰部分抗血清中有效成分與其它成分分開(kāi)，收集合并，經(jīng)紫外測(cè)試根據(jù)公式計(jì)算IgG提純液中蛋白濃度。
OD260nm＝1.012OD280nm＝1.825根據(jù)公式蛋白濃度(mg/ml)＝1.45 OD280nm-0.74 OD260nm＝1.897(mg/ml)即IgG溶液中抗體蛋白濃度為1.897mg/ml。
(3)RGD抗體特異性檢驗(yàn)將提純后得到的IgG是進(jìn)行免疫擴(kuò)散檢測(cè)，從圖3(b)TI3可見(jiàn)連接到VOA的RGD，所制備的抗體IgG與RGD具有專(zhuān)一性免疫沉淀反應(yīng)，說(shuō)明免疫后提取的抗血清有RGD抗體產(chǎn)生，而對(duì)照未偶聯(lián)VOA的RGD制備的抗血清無(wú)免疫沉淀反應(yīng)，說(shuō)明免疫后其沒(méi)有產(chǎn)生抗體。
圖3中的a-RGD免疫的血清無(wú)免疫沉淀反應(yīng)；圖3中的b-VOA-RGD免疫的血清有免疫沉淀反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種誘發(fā)細(xì)胞粘附生長(zhǎng)因子RGD抗體免疫原的化學(xué)合成法，其特征在于將RGD半抗原和卵清蛋白VOA載體用雙功能偶聯(lián)劑間苯二甲基二異氰酸XDI共價(jià)連在一起制成化學(xué)合成免疫原。
2.權(quán)利要求書(shū)1所述的一種誘發(fā)細(xì)胞粘附生長(zhǎng)因子RGD抗體免疫原的化學(xué)合成方法，其特征在于用化學(xué)反應(yīng)連接OVA載體和細(xì)胞粘附生長(zhǎng)因子RGD的化合物是雙功能偶聯(lián)劑間苯二甲基二異氰酸。細(xì)胞粘附生長(zhǎng)因子RGD的氨基酸序列為GLY-ARG-GLY-ASP-SER-PRO-LYS，選用的載體OVA，是具有20個(gè)自由氨基的卵清蛋白。
3.權(quán)利要求書(shū)1所述的一種誘發(fā)細(xì)胞粘附生長(zhǎng)因子RGD抗體免疫原的化學(xué)合成方法，RGD是通過(guò)雙功能試劑XDI二異氰酸間二甲苯與VOA連接，其特征在于XDI有2個(gè)異氰酸鹽的化合物，它通過(guò)2個(gè)異氰酸鹽分別與RGD和OVA的游離氨基結(jié)合，所以RGD和OVA等價(jià)結(jié)合于兩側(cè)，并且1分子OVA上交聯(lián)有11分子的RGD。
全文摘要
一種誘發(fā)細(xì)胞粘附生長(zhǎng)因子RGD抗體免疫原的化學(xué)合成方法是應(yīng)用雙功能偶聯(lián)劑小分子間苯二甲基二異氰酸鹽(m－xylylen－diisocyanate，簡(jiǎn)稱(chēng)XDI)作橋梁，將短肽RGD(GLY－ARG－GLY－ASP－SER－PRO－LYS)粘附生長(zhǎng)因子偶聯(lián)到卵清白蛋白Ovalbumin(簡(jiǎn)稱(chēng)OVA)載體上，對(duì)偶聯(lián)物RGD－OVA經(jīng)SDS－聚丙烯酰胺凝膠純化和紫外光譜測(cè)定，確定RGD與OVA偶聯(lián)比為11∶1，用偶聯(lián)物對(duì)兔子進(jìn)行背部小劑量多點(diǎn)免疫注射，誘發(fā)出抗RGD抗體，誘導(dǎo)抗體RGD免疫原的化學(xué)物成功的合成，就可以應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA，對(duì)固定在生物材料上的RGD，準(zhǔn)確地進(jìn)行定性和定量測(cè)定分析。避免了應(yīng)用光電子能譜(XPS)，傅立葉紅外(FTIR)等測(cè)定材料表面的RGD費(fèi)工費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)。同時(shí)對(duì)于這些帶有RGD糖蛋白檢測(cè)和其相關(guān)細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系分析也帶來(lái)一定的幫助。
文檔編號(hào)C07K7/00GK1603337SQ20031011711
公開(kāi)日2005年4月6日 申請(qǐng)日期2003年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月3日
發(fā)明者李茂林, 朱鶴孫, 楊新林, 曹傳寶, 王松 申請(qǐng)人:北京理工大學(xué)