專(zhuān)利名稱(chēng)：抗體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備抗體的方法和用該方法制備的抗體。
背景技術(shù)：
抗體是一類(lèi)應(yīng)用于許多不同領(lǐng)域的治療性分子，應(yīng)用領(lǐng)域包括移 植、心血管疾病、感染性疾病、癌癥和自身免疫性疾病。雜交瘤技術(shù)
的發(fā)展可將單克隆抗體(亦稱(chēng)為MAb)分離，用作候選的治療性分子。 現(xiàn)在，單克隆抗體構(gòu)成了快速增長(zhǎng)的一類(lèi)治療方法，部分原因是由于 其可預(yù)見(jiàn)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性，其在臨床上成功率高，以及其拮抗 大蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用的能力。
趨化因子(chemoattractant)受體是一類(lèi)促進(jìn)細(xì)胞遷移的G蛋白偶 聯(lián)受體(Gerard & Gerard (1994a和b) ; Murphy (1994))。這些受體 引起眾多制藥公司的興趣，是因?yàn)樗鼈兺ǔＤ軌虮挥袡C(jī)小分子抑制， 阻斷這些受體或其配體能改善各種炎癥狀態(tài)，至少在動(dòng)物模型中是這 樣(Mackay (2001) ; von Andrian & Mackay (2000);以及Luster等人 (2005))。在許多炎癥條件下發(fā)揮關(guān)鍵作用的一個(gè)受體是C5a受體 (C5aR) (Gerard & Gerard (1994b) ; Guo & Ward (2005) ; Riedemann 等人(2003) ; Ji等人(2002))。對(duì)于C5aR拮抗劑的開(kāi)發(fā)付出相當(dāng)大 的努力，包括有機(jī)小分子和肽類(lèi)拮抗劑(Sumichika (2004) ;Allegretti 等人(2005))。盡管如此，開(kāi)發(fā)C5aR和其他趨化因子受體的適合的小 分子拮抗劑尚存疑問(wèn)。
最近，已證明單克隆抗體(mAb)可用作有用試劑以拮抗趨化因 子受體，以及鑒定趨化因子(chemokine) /配體結(jié)合或HIV-1結(jié)合的 重要區(qū)域(Heath等人(1997))。然而，過(guò)去己經(jīng)證明很難產(chǎn)生趨化因 子受體的高親和力的拮抗性單克隆抗體。因此，有必要改進(jìn)抗多肽如G 蛋白偶聯(lián)受體和趨化因子受體的高親和力抗體的制備方法。發(fā)明概要
本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將源自轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞為野生型 小鼠進(jìn)行免疫接種，表達(dá)人類(lèi)多肽的轉(zhuǎn)基因小鼠能用于開(kāi)發(fā)抗人多肽 的高親和力拮抗性單克隆抗體。
因此，本發(fā)明提供了制備針對(duì)第一物種多肽的方法，該方法包括
用第二物種哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為第二物種哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫 接種，其中第一物種多肽通過(guò)源自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的細(xì)胞表達(dá)。
在優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，第一物種多肽在源自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的 細(xì)胞表面表達(dá)。
在更優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，該方法包括從免疫的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞， 優(yōu)選脾細(xì)胞中制備雜交瘤細(xì)胞的額外的步驟。優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步 包括篩選雜交瘤細(xì)胞以得到與第一物種多肽結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，抗體是單克隆抗體。本發(fā)明還 包括源自本發(fā)明制備的抗體的重組或人源化抗體。
在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，第一物種是馴化動(dòng)物、家畜或 人。更優(yōu)選地，第一物種是人。
在進(jìn)一步優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，第二物種選自牛、豬、山羊、 綿羊、駱駝、馬、貓、狗、猴、狒狒、兔、豚鼠、大鼠、倉(cāng)鼠和小鼠。 嚙齒動(dòng)物，如大鼠、小鼠和倉(cāng)鼠是優(yōu)選的的第二物種哺乳動(dòng)物。更優(yōu) 選地，第二物種是小鼠。
應(yīng)該意識(shí)到，第一物種多肽可以是任何治療或診斷的靶標(biāo)。例如， 多肽可以是G蛋白偶聯(lián)受體。在優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，G蛋白偶聯(lián)受 體是趨化因子受體。趨化因子受體優(yōu)選是C5aR。
在另一具體實(shí)施方式
中，已經(jīng)將編碼多肽的核酸分子進(jìn)行遺傳修 飾以使轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多肽表達(dá)增強(qiáng)。
在進(jìn)一步優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，源自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的細(xì)胞是 那些高水平表達(dá)第一物種多肽的細(xì)胞。因此優(yōu)選的細(xì)胞類(lèi)型取決于多 肽的性質(zhì)。例如，如果多肽在肝臟中天然高表達(dá)，源自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng) 物的細(xì)胞優(yōu)選是肝細(xì)胞。另外，如果多肽影響免疫調(diào)節(jié)或炎癥應(yīng)答， 則細(xì)胞類(lèi)型優(yōu)選是免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，如抗原呈遞細(xì)胞。合適的抗原呈 遞細(xì)胞的例子包括樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、
5嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞和B 細(xì)胞。
在另一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，源自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的 細(xì)胞是那些已進(jìn)行遺傳修飾以高水平表達(dá)第 一物種多肽的細(xì)胞。 本發(fā)明還提供了通過(guò)本發(fā)明的方法制備的抗體。
在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，"包含(comprise)"，或其變體形式如"包含 (comprises)"或"包含(comprising)"，應(yīng)被理解為含有指明的要素、 整體或步驟，或成組的要素、整體或步驟，但不排除任何其他要素、 整體或步驟，或成組的要素、整體或步驟。


圖l.以L(fǎng)1.2/hC5aR免疫小鼠而產(chǎn)生的抗人C5aR單克隆抗體在不 同程度上抑制125I-C5a與人中性粒細(xì)胞的結(jié)合。誤差條表示SD。
圖2.野生型小鼠的C5aR的基因座位圖和用于構(gòu)建hC5aR基因敲 入小鼠的靶載體。在靶載體上小鼠C5aR基因外顯子3 CDS用人C5aR 基因外顯子3 CDS精確置換。小鼠C5aR基因兩翼序列允許同源重組。 將選擇標(biāo)記PGKneo (兩翼有l(wèi)oxP位點(diǎn))用Cre從首次基因敲入小鼠 中去除。用3，和5'探針證實(shí)靶載體已正確重組進(jìn)入小鼠C5aR基因座 位。X,XbaI酶；V,EcoRV酶。
圖3.雜合hC5aR基因敲入小鼠(/7C5i /+A)之間雜交小鼠鼠尾基 因組DNA的Southern雜交印跡圖(以EcoRV消化)。用能夠分辨小鼠 C5aR等位基因(10.0kb)和hC5aR敲入等位基因(8.1 kb)的3'探針 來(lái)探測(cè)雜交印跡圖。
圖4. /2C5i ,+、/;C5i ,-和野生型小鼠中性粒細(xì)胞上C5aR的表達(dá)。 中性粒細(xì)胞用FITC偶聯(lián)的抗人C5aR單克隆抗體(7F3)或抗小鼠C5aR 單克隆抗體20/70染色處理。
圖5.由/705"7 +/+小鼠中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的抗體顯示出廣譜的1251 -C5a結(jié)合抑制作用，從完全抑制到部分抑制或幾乎無(wú)抑制作用不等， 這取決于單克隆抗體克隆。結(jié)果是每種抗體至少兩個(gè)獨(dú)立性實(shí)驗(yàn)的代 表；誤差條表示s.e.m.。
圖6.抗C5aR單克隆抗體具有亞納摩爾IC5o值。用/7C5i 7"小鼠中性粒細(xì)胞(3C5、 7H3和8G7)產(chǎn)生的抗體顯示比用L1.2/hC5aR轉(zhuǎn) 染子(7F3)產(chǎn)生的最好的單克隆抗體的ICso低5-10倍。ICso值用3或 4個(gè)獨(dú)立的競(jìng)爭(zhēng)性125I-C5a配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)確定。
圖7.人白細(xì)胞C5aR的表達(dá)。直方圖分析證明的C5aR的表達(dá)(深 灰色)與對(duì)照染色(淺灰色)的對(duì)比。用單克隆抗體7F3 (深灰色)， 同種對(duì)照(淺灰色)和FITC偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG進(jìn)行間接免疫熒光 染色。
圖8.抗hC5aR單克隆抗體的治療效果比較。于炎癥形成5天后為 /2C5i ,+小鼠一次性腹腔內(nèi)注射7F3、 3C5或8G7 (溶于PBS中，注射 劑量1 mg/kg或3 mg/kg)。對(duì)照組注射PBS。圖形顯示從0天起爪(踝) 大小的變化。組間平均值(每組n-5 7)。
圖9.抗hC5aR單克隆抗體的治療效果比較。于炎癥形成5天后為 /2C5i^+A小鼠一次性腹腔內(nèi)注射7F3、 3C5或8G7 (溶于PBS中，注射 劑量lmg/kg或3mg/kg)。對(duì)照組注射PBS。圖形顯示臨床評(píng)分。組 間平均值(每組!1=5 7)。

發(fā)明內(nèi)容
一般技術(shù)
除非另有明確規(guī)定，應(yīng)認(rèn)為此處所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有 的含義與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員(例如細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、 免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物化學(xué))所普遍理解的含義相同。
除非另外指明，本發(fā)明中所用的重組蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫學(xué) 技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)流程。這些技術(shù)在諸如J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984) , J. Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press ( 1989) ， T.A. Brown (editor) , Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press
(1991 )， D.M. Glover和B.D. Hames(editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995禾fl 1996),和F.M. Ausubel等人
(editors ) , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Intersdence ( 1988, including all updates until
7present) , Ed Harlow禾口 David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988),禾口 J.E. Coligan等人 (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (including
all updates until present)的許多文獻(xiàn)來(lái)源中都有描述和解釋?zhuān)@里引入
作為參考。
產(chǎn)生抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明人現(xiàn)在己經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)用基因敲入小鼠來(lái)源的細(xì)胞免疫接 種野生型小鼠，表達(dá)人多肽的基因敲入小鼠能用于開(kāi)發(fā)抗人多肽的高 親合力拮抗性單克隆抗體。
因此，本發(fā)明提供了制備抗第一物種多肽的抗體的方法，該方法
包括
用第二物種哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為第二物種哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫 接種，其中第一物種多肽通過(guò)源自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的細(xì)胞表達(dá)。
在優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，第一物種多肽在源自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的 細(xì)胞表面表達(dá)。
應(yīng)理解本發(fā)明的方法能夠用于產(chǎn)生抗一系列不同多肽的抗體。優(yōu) 選地，多肽是治療或診斷目的的多肽。例如，多肽可以是G-蛋白偶聯(lián)
受體。在優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，G-蛋白偶聯(lián)受體是趨化因子受體。優(yōu) 選趨化因子受體是C5aR。
多肽源自可以是任意感興趣物種的第一物種。優(yōu)選地，第一物種 是選作治療性或預(yù)防性治療的物種。例如，第一物種可以是馴養(yǎng)的動(dòng) 物、家畜或人。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，第一物種是人。
優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物是非人的哺乳動(dòng)物，如牛、豬、山羊、 綿羊、駱鴕、馬、貓、犬、猴、狒狒、兔、豚鼠、大鼠、倉(cāng)鼠和小鼠。 嚙齒類(lèi)如大鼠、倉(cāng)鼠和小鼠是優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。
源自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的任意細(xì)胞能夠用于免疫接種。然而，從轉(zhuǎn) 基因哺乳動(dòng)物獲得的細(xì)胞在其表面以相對(duì)高的密度表達(dá)該多肽是優(yōu)選 的。優(yōu)選是每個(gè)細(xì)胞大于100,000或200,000多肽分子的表達(dá)水平。
應(yīng)該理解，因此優(yōu)選的細(xì)胞類(lèi)型取決于多肽的性質(zhì)。例如，如果 多肽在肝臟是天然高表達(dá)的，優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞可以 是肝臟細(xì)胞。另外，如果多肽影響免疫調(diào)節(jié)和炎癥應(yīng)答，優(yōu)選的細(xì)胞類(lèi)型可以是免疫系統(tǒng)細(xì)胞，如抗原呈遞細(xì)胞。合適的抗原呈遞細(xì)胞的 例子包括樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì) 胞、嗜堿性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞。
接受免疫接種的哺乳動(dòng)物與(用來(lái)獲取用于免疫接種的細(xì)胞的) 轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物是同一物種。免疫接種哺乳動(dòng)物能是任何適合產(chǎn)生抗 體的哺乳動(dòng)物。而且，嚙齒動(dòng)物，如大鼠，小鼠和倉(cāng)鼠是免疫接種的 優(yōu)選的哺乳動(dòng)物。
免疫接種技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中， 例如，哺乳動(dòng)物以源自取自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的細(xì)胞每?jī)芍荛g隔進(jìn)行多 次免疫接種。
在優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，這種方法還包括末次免疫接種之后從免 疫接種過(guò)的哺乳動(dòng)物獲得的脾細(xì)胞制備雜交瘤細(xì)胞。優(yōu)選地，該方法 還包括篩選雜交瘤細(xì)胞以得到與第一物種多肽結(jié)合的抗體。
然后通過(guò)這個(gè)方法制備的抗體能用于制備重組抗體或人源化抗 體，下文將詳細(xì)描述。例如，可將通過(guò)本發(fā)明的方法制備的抗體的重 鏈和/或輕鏈的CDR區(qū)移植到源自不同的人抗體的骨架區(qū)之上以制備 與通過(guò)本發(fā)明的方法制備的抗體具有相似結(jié)合特性的人源化抗體。本 發(fā)明還包括以這種方式制備的人源化抗體或重組抗體。 第一物種多肽
本發(fā)明涉及產(chǎn)生抗第一物種多肽的抗體的方法。在優(yōu)選具體實(shí)施 方式中，產(chǎn)生的抗多肽的抗體適于用作治療或診斷劑以治療或診斷第 一物種的個(gè)體。
技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明的方法能用于制備抗多種生物活性多肽 的抗體。合適的多肽的例子包括那些已經(jīng)成為制備治療性或診斷性抗 體的靶標(biāo)的多肽。
在一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，多肽影響免疫調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)針對(duì)損傷、
移植排斥反應(yīng)或感染的急性期炎癥反應(yīng)。例如，多肽可以是G蛋白偶 聯(lián)受體。在優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，是G蛋白偶聯(lián)受體是趨化因子受體。 優(yōu)選地，趨化因子受體是C5aR。另夕卜，多肽可以是C5a、 CD18、 CD147、 CD40L、 CD25、 CD3、 TNF-a、 CD4和IgGl或CD64 (FcR)。
本發(fā)明所用的更多多肽的非限制的例子包括IL-8、 gpl20、 VLA-4、DClla、 VEGF、 ICAM-1、 CD2、 EGFR、 E-選擇素、VIII因子、卩2-整合素和EpCAM。
"第一物種多肽"是指具有與源自第一物種個(gè)體的天然序列的全部 或部分序列同源或優(yōu)選相同序列的多肽。具有與天然序列的全部或部 分序列同源的序列的多肽是指，與全長(zhǎng)的天然序列的多肽、缺乏信號(hào) 肽的天然序列的多肽、多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或全長(zhǎng)的天然序列多肽的 任何其他片段的多肽具有優(yōu)選至少約80%序列同一性，更優(yōu)選至少約 95%氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約96%的氨基酸序列同一性，更 優(yōu)選至少約97%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約98%的氨基酸序 列同一性，最優(yōu)選至少約99%的氨基酸序列同一性的生物活性多肽。
在本發(fā)明上下文中，第一物種多肽由轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物表達(dá)。轉(zhuǎn)基 因哺乳動(dòng)物可通過(guò)將第一物種基因的天然編碼區(qū)引入到轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng) 物的基因組中而制備。但是，沒(méi)有必要將完整的天然編碼區(qū)引入到轉(zhuǎn) 基因哺乳動(dòng)物的基因組中。相反，有可能以第一物種多肽的相應(yīng)結(jié)構(gòu) 域置換轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物多肽(或其實(shí)質(zhì)部分)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的編 碼區(qū)。例如，如果第一物種多肽是人C5aR，轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可通過(guò)以 相應(yīng)的人C5aR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域置換內(nèi)源性C5aR的至少一個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域來(lái)制備。轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物表達(dá)的人類(lèi)C5aR可能因此僅包括人C5aR 的一個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物表達(dá)的人 類(lèi)C5aR可能包括內(nèi)源性C5aR的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和人C5aR的細(xì)胞外結(jié) 構(gòu)域。
可對(duì)編碼多肽的核酸分子進(jìn)行修飾，以增強(qiáng)多肽的表達(dá)或提高其 穩(wěn)定性。例如，可使用以下一個(gè)或多個(gè)策略?xún)?yōu)化核酸特性以提高表達(dá) 產(chǎn)量1)置換不完善的Kozak序列，2)降低5'GC含量和減少RNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，3)優(yōu)化密碼子使用，4)使用替代的引導(dǎo)序列，5)包括 嵌合內(nèi)含子，或6)在message的C-末端加上優(yōu)化的poly-A尾。也可
使用以下一個(gè)或多個(gè)策略?xún)?yōu)化多肽性能以提高表達(dá)產(chǎn)量1)優(yōu)化信號(hào) 序列，2)優(yōu)化蛋白水解處理位點(diǎn)，3)置換一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基， 以最大限度地減少不適當(dāng)?shù)亩蜴I的形成，4)提高蛋白質(zhì)折疊的比率 或效率，或5)增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，尤其是蛋白質(zhì)水解的穩(wěn)定性。 此外，可對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行修飾以提高多肽的表達(dá)水平。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，天然啟動(dòng)子序列被啟動(dòng)子序列置換，該啟動(dòng)子序列 在用于免疫接種第二物種哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞中表達(dá)該多 肽。
也可對(duì)多肽進(jìn)行修飾以將表達(dá)的多肽靶向遞送至轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的表 面。幾乎所有的細(xì)胞表面和分泌蛋白以其前體形式表達(dá)，該前體含有 氨基端延伸區(qū)，稱(chēng)為信號(hào)肽，長(zhǎng)5至30個(gè)氨基酸殘基不等。認(rèn)為啟動(dòng) 分泌過(guò)程所需的信息存在于短信號(hào)肽延伸區(qū)內(nèi)。信號(hào)肽在蛋白質(zhì)跨膜 轉(zhuǎn)運(yùn)后從該蛋白上被剪切掉。此外，蛋白質(zhì)內(nèi)的其他疏水區(qū)域，稱(chēng)為 跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域，將細(xì)胞表面蛋白錨定到細(xì)胞膜上。
許多信號(hào)肽的氨基酸序列是已知的。雖然信號(hào)肽之間很少有直接 同源的氨基酸序列，信號(hào)肽的總體結(jié)構(gòu)高度保守。負(fù)責(zé)真核細(xì)胞信號(hào) 肽誘導(dǎo)的分泌途徑的細(xì)胞內(nèi)因素已明確界定并促進(jìn)蛋白質(zhì)跨越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)
(ER)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。
與此相反，某些蛋白質(zhì)有不被剪切的信號(hào)序列，"信號(hào)錨定序列"，
該序列是跨膜區(qū)段。信號(hào)錨定i型蛋白的c-末端位于細(xì)胞質(zhì)中，這一
點(diǎn)類(lèi)似于I型膜蛋白，而信號(hào)錨定II型蛋白的N-端位于細(xì)胞質(zhì)中。
因此，可通過(guò)制備融合蛋白(其含有目的多肽和天然分布于細(xì)胞 表面的另一種蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域)而使轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表達(dá)的多肽分布 于細(xì)胞表面。另外，可對(duì)通常負(fù)責(zé)多肽分泌的信號(hào)肽進(jìn)行修飾，以使 其不再包含蛋白質(zhì)水解位點(diǎn)。對(duì)信號(hào)序列的修飾將導(dǎo)致多肽在細(xì)胞表
面表達(dá)而不是被分泌。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
制備"敲入"的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知。關(guān)于該技術(shù)的
可用的一般孝l禾斗書(shū)是Houdebine, Transgenic animals - Generation and Use (Harwood Academic, 1997)—可用于制備魚(yú)類(lèi)、小鼠和牛的轉(zhuǎn)基 因動(dòng)物技術(shù)的內(nèi)容廣泛的綜述。本發(fā)明的上下文的特別目的是轉(zhuǎn)基因 的非人哺乳動(dòng)物如牛、豬、山羊、馬等，特別是嚙齒動(dòng)物如大鼠、小 鼠、倉(cāng)鼠等。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物優(yōu)選是小鼠。
胚胎顯微操作技術(shù)的進(jìn)步現(xiàn)在允許將外源DNA引入到細(xì)胞中，例 如，引入哺乳動(dòng)物受精卵中。例如，全能和多能性干細(xì)胞可通過(guò)顯微 注射、磷酸鈣共沉淀，脂質(zhì)體融合、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染或其他手段而轉(zhuǎn)
li化，然后將轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞引入胚胎中，胚胎然后發(fā)展成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 在優(yōu)選方法中，發(fā)育中的胚胎通過(guò)電穿孔法轉(zhuǎn)染目的DNA，而后從感 染的胚胎制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在另一個(gè)優(yōu)選方法中，然而，優(yōu)選在單細(xì)
胞階段時(shí)將適量的DNA片段注射到胚胎原核或細(xì)胞質(zhì)中，胚胎可以發(fā) 育成成熟的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這些技術(shù)是熟知的。參見(jiàn)將外源DNA片段顯 微注射到哺乳動(dòng)物受精卵中的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室程序的綜述，包括Hogan等 人,Manipulating the Mouse Embryo, Krimpenfort等人,Bio/Technology 9:844(1991); Palmiter等人，Cell, 41: 343 (1985); Kraemer等人，Genetic manipulation of the Mammalian Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1985) ; Hammer等人,Nature, 315: 680 (1985) ; U.S. Pat. No. 5,175,385; U.S. Pat. No. 5,175,384。這些內(nèi)容在此引入作為參考。
另一種制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法包括根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法將核酸顯微注射 到前核階段的卵中。然后將經(jīng)注射的卵培育直到將其轉(zhuǎn)移入假孕受體 的輸卵管中。
也可通過(guò)核轉(zhuǎn)移技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如Schnieke等人，1997, Science, 278: 2130和Cibelli等人，998, Science, 280: 1256所描述。用 這種方法，可將含有編碼感興趣的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合半體序列的質(zhì)粒 在調(diào)控條件下穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入來(lái)自供體動(dòng)物的成纖維細(xì)胞中。然后就將穩(wěn) 定的轉(zhuǎn)染子融合至去核的卵母細(xì)胞，培育并轉(zhuǎn)移至雌性受體。
通常通過(guò)下列標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行PCR或Southern雜交對(duì)可含有轉(zhuǎn)基因 序列的動(dòng)物進(jìn)行分析。
作為轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物構(gòu)建的特定實(shí)施例子，如牛，可使用例如美 國(guó)專(zhuān)利號(hào)No. 4,873,191中記述的技術(shù)將包含編碼與GFP融合的結(jié)合結(jié) 構(gòu)域序列的核苷酸構(gòu)建體顯微注射到從哺乳細(xì)胞體內(nèi)新鮮摘取的卵巢 的卵母細(xì)胞內(nèi)。卵母細(xì)胞從濾泡上吸取下來(lái)，并使其在與解凍的冰凍 精子受精之前安置下來(lái)，所述精子以肝素受精并通過(guò)Percoll梯度預(yù)分 離以得到游動(dòng)組分。
將受精的卵母細(xì)胞離心，例如，以15,000 g離心8分鐘以看到用 于注射的原核，然后在輸卵管組織條件培養(yǎng)液中將其從受精卵培養(yǎng)至 桑椹胚或胚泡期。這個(gè)培養(yǎng)液使用從輸卵管上刮下的腔內(nèi)組織用培養(yǎng) 液稀釋而制成。必須將受精卵在顯微注射后兩個(gè)小時(shí)內(nèi)放入培養(yǎng)液中。然后通過(guò)使用糞醇使目的受體哺乳動(dòng)物如牛同步發(fā)情。兩天之內(nèi) 發(fā)生發(fā)情，在發(fā)情后5-7天將胚胎轉(zhuǎn)移到受體動(dòng)物體內(nèi)?？赏ㄟ^(guò)其后代
的Southern雜交來(lái)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)移的成功與否。
另外，還可將目的構(gòu)建體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)并培養(yǎng)細(xì)胞 以確保轉(zhuǎn)基因的修飾。然后將修飾細(xì)胞注入到囊胚期的細(xì)胞中并將該 囊胚置入假孕的宿主內(nèi)。所得后代是ES和宿主細(xì)胞的嵌合體，并且通 過(guò)傳統(tǒng)的雜交育種能得到完全只包含ES后代的非嵌合株。該技術(shù)記述 在，如WO91/10741中。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包含外源核酸序列，其以染色體外因子或穩(wěn)定整合在 全部或部分細(xì)胞內(nèi)(尤其是生殖細(xì)胞)內(nèi)的形式存在。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基 因動(dòng)物包含種系序列的穩(wěn)定變化。通常將DNA導(dǎo)入細(xì)胞基因組中來(lái)獲 得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。用于穩(wěn)定整合的載體包括質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和其它動(dòng)物 病毒，YAC等。在動(dòng)物構(gòu)建的起始，產(chǎn)生的是"嵌合體"或"嵌合動(dòng)物"， 這個(gè)階段中只有一部分細(xì)胞的基因組發(fā)生了改變。嵌合體主要用于育 種以產(chǎn)生目的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。具有雜合改變的動(dòng)物由嵌合體育種而產(chǎn)生。 雄性或雌性雜合體可典型地繁殖產(chǎn)生純合動(dòng)物。因此，在優(yōu)選的具體 實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是敲入基因的純合體。
在更優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物通過(guò)將 人的轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨藙?dòng)物的種系中而產(chǎn)生。胚胎干細(xì)胞(ES)是用于 將人的轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨藙?dòng)物以獲得純合重組體的主要類(lèi)型的靶細(xì)胞。 ES細(xì)胞可從體外培養(yǎng)的預(yù)植入的胚胎獲得和胚胎融合而獲得(Evans 等人(1981) Nature 292, 154-156; Bradley等人(1984) Nature 309, 255-258; Gossler等人(1986) Pro" Natl. Acad. Sci U.S.A. 83， 9065-9069; 和Robertson等人(1986) Nature 322, 445-448)。通過(guò)DNA轉(zhuǎn)染或逆 轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)可將轉(zhuǎn)基因有效地導(dǎo)入ES細(xì)胞內(nèi)。因此這種轉(zhuǎn)化 的ES細(xì)胞能可與來(lái)自非人動(dòng)物的胚泡融合。因此ES細(xì)胞移植入胚胎 中并對(duì)所得嵌合動(dòng)物的種系發(fā)生作用。見(jiàn)綜述Jaenisch (1988) Science 240, 1468-1474。轉(zhuǎn)染的胚胎細(xì)胞可在體外培養(yǎng)不同時(shí)間或再植入代理 宿主動(dòng)物體內(nèi)，或兩者皆可。
可通過(guò)任何合適的方法篩選代理動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因后代以確定轉(zhuǎn)基因 的存在和/或表達(dá)。通常可使用與轉(zhuǎn)基因的至少一部分互補(bǔ)的探針通過(guò)Southern雜交或Northern雜交進(jìn)行。可使用抗轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)的 抗體的Western雜交分析用做篩選轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的替代性或附加的方法。 通常，在轉(zhuǎn)基因小鼠中，DNA從鼠尾組織提取并用Southern雜交或PCR 分析轉(zhuǎn)基因。此外，可使用Southern雜交或PCR來(lái)測(cè)定認(rèn)為是以最高 水平表達(dá)轉(zhuǎn)基因的組織或細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的存在和表達(dá)，盡管任何組織 或細(xì)胞類(lèi)型可用于進(jìn)行此類(lèi)分析。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的子代可通過(guò)使轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物與合適的伴侶交配而獲得，或通過(guò)從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物獲得的卵和/或精 子體外受精而獲得。
Hanks等人記述了通過(guò)內(nèi)源基因和轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體之間的同源重組 制備轉(zhuǎn)基因小鼠的方法(Science 269: 679-682， 1995)，本文特別引入作 為參考。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，這可通過(guò)例如將編碼人多肽的多核苷酸構(gòu)建體 通過(guò)定向整合入哺乳動(dòng)物的基因組而導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的基因組中。
盡管對(duì)于本發(fā)明的操作而言無(wú)必要，本文記述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可包 括上述基因變體以外內(nèi)源基因的變體。相應(yīng)地，宿主動(dòng)物既可以是編 碼目的多肽基因的"敲除"動(dòng)物也可以是上述基因的"敲入"動(dòng)物。 敲除使目的內(nèi)源基因的單或雙等位基因功能全部或部分喪失。例如， 如果目的多肽是C5aR，那么宿主動(dòng)物的內(nèi)源C5aR可被"敲除"，并且 源自不同物種的C5aR"敲入"。在該例中，編碼人C5aR全長(zhǎng)或片段的 多核酸構(gòu)建體可被整合入內(nèi)源C5aR序列中，這樣整合之后，內(nèi)源C5aR 位點(diǎn)包含編碼人C5aR的多核苷酸。
關(guān)于"敲除"，優(yōu)選地，靶基因表達(dá)是無(wú)法檢測(cè)或無(wú)關(guān)緊要的。例 如，C5aR基因的敲除意味著內(nèi)源C5aR基因的功能實(shí)質(zhì)性下降以致于 檢測(cè)不到表達(dá)或僅存在無(wú)關(guān)緊要的水平的表達(dá)。這可通過(guò)各種機(jī)制達(dá) 到，包括導(dǎo)入打亂的編碼序列，例如一個(gè)或多個(gè)終止密碼子的插入， DNA片段等的插入，編碼序列的刪除，編碼序列終止密碼子的取代等。 也可通過(guò)導(dǎo)入阻斷原生基因表達(dá)的反義構(gòu)建體達(dá)到功能性的"敲除" (例如見(jiàn)Li和Cohen (1996) Cell 85:319-329)。"敲除"還包括條件性 敲除，例如在動(dòng)物接觸促進(jìn)靶基因改變的物質(zhì)后耙基因發(fā)生改變，在 靶基因位點(diǎn)導(dǎo)入促進(jìn)重組的酶(如Cre-lox系統(tǒng)的Cre位點(diǎn))或其它指 導(dǎo)靶基因出生后改變的方法。 抗體本發(fā)明包含上述方法制備的抗體。示例性抗體包括多克隆、單克 隆、人源化、雙特異的和異源結(jié)合抗體。
本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)"抗體"包括完整分子及其能夠與抗原決定簇結(jié)
合的片段，如Fab、 F (ab') 2和Fv。這些抗體片段保持能夠與其抗原
或受體選擇性結(jié)合的能力，并如以下定義
(1) Fab，含有抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段的片段，可通過(guò)木 瓜蛋白酶消化整個(gè)抗體而產(chǎn)生完整輕鏈和一條重鏈的部分而制備。
(2) Fab'，可通過(guò)胃蛋白酶處理整個(gè)抗體，接著進(jìn)行還原以產(chǎn)生 完整輕鏈和重鏈的一部分而獲得的抗體分子片段；每個(gè)抗體分子可產(chǎn) 生兩條Fab'片段；
(3) (Fab') 2，可通過(guò)以胃蛋白酶處理整個(gè)抗體，不進(jìn)行后續(xù)還 原而獲得的抗體分子片段；F (ab) 2是兩條Fab'片段通過(guò)兩個(gè)二硫鍵 結(jié)合的二聚體；
(4) Fv，定義為包含以?xún)蓷l鏈表達(dá)的遺傳工程化片段，其包括輕 鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)；
(5) 單鏈抗體("SCA")，定義為遺傳融合單鏈分子，其包含輕鏈 可變區(qū)和重鏈可變區(qū)并以合適的多肽連接子連接；和
(6) 單域抗體，通常是缺乏輕鏈的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。 敘麟,
根據(jù)本發(fā)明的方法制備的抗體可以是多克隆抗體。制備多克隆抗 體的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。多克隆抗體能在哺乳動(dòng)物體 內(nèi)產(chǎn)生，例如，通過(guò)一次或多次注射表達(dá)源自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的、表 達(dá)第一物種多肽的細(xì)胞和佐劑(如果需要)。通常，通過(guò)多次皮下或腹 腔內(nèi)注射將細(xì)胞和/或佐劑注射到哺乳動(dòng)物體內(nèi)。用到的佐劑的例子包 括Freimd's完全佐劑或MPL-TDM佐劑(單磷酰脂質(zhì)A，合成的海藻 糖二霉菌酸脂(trehalose dicorynomycolate))。免疫接種程序可由本領(lǐng) 域技術(shù)人員無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)即可選擇。
根據(jù)本發(fā)明的方法制備的抗體也可以是單克隆抗體。單克隆抗體 可通過(guò)雜交瘤方法制備，如Kohler和Milstein, Nature, 256:495 (1975 ) 所述。在雜交瘤方法中，通常，將小鼠、倉(cāng)鼠或其它適合的宿主動(dòng)物用源自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的、表達(dá)第一物種多肽的細(xì)胞進(jìn)行免疫以引發(fā) 產(chǎn)生淋巴細(xì)胞，該淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生與第一物種多肽特異性結(jié)合的抗 體。
一般來(lái)講，如果期望得到人源化細(xì)胞，就用外周血淋巴細(xì)胞(PBL)， 或者如果期望得到非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞源就用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。然 后用適當(dāng)?shù)娜诤蟿┤缇垡叶紝⒘馨图?xì)胞與永生細(xì)胞系融合形成雜交
瘤細(xì)胞 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103)。永生細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng) 物細(xì)胞，特別是嚙齒目動(dòng)物、牛和人源化的骨髓瘤細(xì)胞。通常使用大 鼠或小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系。可將雜交瘤細(xì)胞在合適的優(yōu)選包含一種或 多種抑制未融合的永生細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。例如， 如果親代細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或 HPRT)，那么雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液中通常將包括抑制HGPRT-缺失細(xì)胞 生長(zhǎng)的次黃嘌呤、氨喋呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脫氧核苷
(thymidine ) (HAT培養(yǎng)液)。
優(yōu)選的永生細(xì)胞系是那些有效融合的、支持通過(guò)選擇的抗體產(chǎn)生 細(xì)胞而穩(wěn)定高水平表達(dá)抗體，并對(duì)培養(yǎng)液例如HAT培養(yǎng)液敏感的細(xì)胞 系。更優(yōu)選的永生細(xì)胞系是小鼠的骨髓瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系能從例如 從Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif.和美國(guó)豐示7隹培 養(yǎng)物中心Manassas, Va.獲得。也描述了用于制備人單克隆抗體的人骨 髓瘤和鼠-人雜合骨髓瘤細(xì)胞系(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur 等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987 ) pp. 51 -63 )。
然后可以分析培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液以確定直接抗第一物種多 肽的單克隆抗體的存在與否。優(yōu)選地，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體 的結(jié)合特異性通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合試驗(yàn)，例如放射免疫分析
(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定。這些技術(shù)和方法為本領(lǐng) 域技術(shù)人員所知。單克隆抗體的結(jié)合能力可通過(guò)例如Scatdiard分析
(Mu謂n禾口 Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980))來(lái)測(cè)定。
鑒定出所需要的雜交瘤細(xì)胞之后，可將該克隆通過(guò)有限稀釋法亞 克隆，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)。為了這個(gè)目的的合適的培養(yǎng)液包括，例
16如，Dulbecco's Modified Eagle's Medium和RPMI-1640培養(yǎng)液?；蛘?，
雜交瘤細(xì)胞可在哺乳動(dòng)物體內(nèi)作為腹水進(jìn)行培養(yǎng)。
亞克隆分泌的單克隆抗體可從培養(yǎng)液或腹水中通過(guò)常規(guī)免疫球蛋 白純化流程分離或純化，例如通過(guò)蛋白質(zhì)-A瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石 層析法、凝膠電泳、透析或親和層析分離或純化。
單克隆抗體也可通過(guò)重組DNA方法制備，如美國(guó)專(zhuān)利 No.4,816,567所述。本發(fā)明的編碼單克隆抗體的DNA可用常規(guī)方法輕 易地分離和測(cè)序(如，通過(guò)使用可與編碼小鼠抗體的重鏈和輕鏈的基 因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞作為這種DNA 的優(yōu)選來(lái)源。 一經(jīng)分離，可將DNA置于表達(dá)載體內(nèi)，隨后將該載體轉(zhuǎn) 染進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，如猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞卵巢細(xì)胞(CHO) 或不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞以使單克隆抗體在重組的宿主 細(xì)胞內(nèi)合成。也可將DNA修飾，例如，通過(guò)以同源的小鼠序列取代人 重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列(美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567)或通過(guò)共價(jià)結(jié) 合到免疫球蛋白編碼序列，非免疫球蛋白多肽的所有或部分編碼序列 上。這種非免疫球蛋白多肽能被本發(fā)明抗體的恒定區(qū)取代，或能被本 發(fā)明抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)取代以產(chǎn)生嵌合的二價(jià)抗體。
抗體可以是單價(jià)抗體。制備單價(jià)抗體的方法被本領(lǐng)域人員所熟知。 例如， 一種方法包含免疫球蛋白輕鏈和修飾的重鏈的重組表達(dá)。重鏈 通?？稍贔c區(qū)任何位點(diǎn)截短以阻止重鏈的交聯(lián)。可選地，以另一個(gè)氨 基酸殘基取代相關(guān)的半胱氨酸殘基，或?qū)腚装彼釟埢鶆h除以防止交 聯(lián)。
體外方法也適合制備單價(jià)抗體?？贵w經(jīng)消化產(chǎn)生抗體片段，特別 是Fab片段，能用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)技術(shù)做到。 義拔沐*義象眾貧,
本發(fā)明的抗體可以是人源化抗體或人抗體。非人(如小鼠)抗體 的人源化形式是包含最小的源自非人免疫球蛋白的嵌合免疫球蛋白、 免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv, Fab, Fab', F (ab') 2或抗體的其它抗原 結(jié)合序列)。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，在人免疫球 蛋白上，受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基被非人物種(供體抗體)的 CDR殘基取代，這些非人物種(如小鼠、大鼠或家兔)的CDR殘基具
17有期望的特異性、親和力和結(jié)合容量。 一些例子中，人免疫球蛋白的 Fv骨架殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。人源化抗體也可包含既未在受體 抗體也未在導(dǎo)入CDR或骨架序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。 一般而言，人源化抗 體實(shí)質(zhì)上包含全部的至少一個(gè)， 一般兩個(gè)可變區(qū)，在該可變區(qū)中，全
部或?qū)嵸|(zhì)上全部的CDR區(qū)對(duì)應(yīng)于那些非人免疫球蛋白的CDR區(qū)并且 全部或?qū)嵸|(zhì)上全部的FR區(qū)是那些人免疫球蛋白共有序列。人源化抗體 最佳也可包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)， 一般是人免疫球蛋白 的免疫球蛋白恒定區(qū)(Jones等人，Nature, 321:522-525 ( 1986); Riechmann等人，Nature, 332:323-329 (1988);禾卩Presta, Curr. Op. Struct Biol.， 2:593-596 (1992))。
人源化非人抗體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。 一般來(lái)講，人 源化抗體有一個(gè)或多個(gè)從非人來(lái)源導(dǎo)入其中的氨基酸殘基。這些非人 的氨基酸殘基經(jīng)常被稱(chēng)作"導(dǎo)入"殘基，這些導(dǎo)入殘基一般取自"導(dǎo)入" 可變區(qū)。人源化過(guò)程實(shí)質(zhì)上可根據(jù)下列Winter及其合作者的方法進(jìn)行
(Jones等人，Nature, 321:522-525 (1986) ; Riechmann等人，Nature, 332:323-327 (1988) ; Verhoeyen等人，Science, 239:1534-1536 (1988))， 通過(guò)將嚙齒目動(dòng)物CDR或CDR序列用相應(yīng)的人抗體序列取代。因此， 這種"人源化的"抗體是嵌合抗體(美國(guó)專(zhuān)利No. 4,816,567)，其中實(shí)質(zhì) 上少于完整的人可變區(qū)被非人物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)際上，人源化 的抗體一般是人抗體，其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基被來(lái) 自嚙齒目動(dòng)物抗體的同源位點(diǎn)的殘基取代。
人抗體也可用本領(lǐng)域已知技術(shù)制備，包括噬菌體展示文庫(kù)
(Hoogenboom和Winter, J. Mol. Biol" 227:381 (1991 ) ; Marks等人，J. Mol.Biol., 222:581 (1991))。 Cole等人和Boemer等人的技術(shù)也可用于 制備人單克隆抗體(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boemer等人,J. Immunol" 147
(1) :86-95 (1991)。同樣地，可通過(guò)將人免疫球蛋白基因座位導(dǎo)入轉(zhuǎn) 基因動(dòng)物(例如小鼠)體內(nèi)而制備，其中內(nèi)源性免疫球蛋白基因全部 或部分失活。經(jīng)免疫激發(fā)，能觀(guān)察到人抗體的產(chǎn)生，與在人身上看到 的抗體的全部方面非常相似，包括基因重排、組裝和抗體譜。該方法 見(jiàn)于例如在美國(guó)專(zhuān)利No.5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126;
185,633,425; 5,661,016和下列科學(xué)出版物中Marks等人，Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等人，Nature 368 856-859(1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994) ; Fishwild等人，Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826( 1996); Lonberg 禾口 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)。
抗體可用本領(lǐng)域所知的選擇和/或突變方法使其親和力成熟。優(yōu)選 親和力成熟的抗體其親和力比源自制備成熟抗體的起始抗體(一般是 鼠、人源化或人抗體)高5倍，更優(yōu)選10倍，甚至更優(yōu)選20或30倍。 及錄雜縱
雙特異性抗體是能與至少兩種不同抗原特異性結(jié)合的單克隆，優(yōu) 選為人或人源化抗體。例如，其中之一是與C5aR特異性結(jié)合，另一個(gè) 特異性結(jié)合的抗原可以是任何其它抗原，并優(yōu)選細(xì)胞表面蛋白質(zhì)或受 體或受體亞單位。
雙特異性抗體的方法為本領(lǐng)域所知。按照慣例，雙特異性抗體的 重組產(chǎn)物基于兩對(duì)免疫球蛋白的重鏈/輕鏈共表達(dá)，其中兩條重鏈特異 性不同(Milstein和Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。由于免疫球 蛋白重鏈和輕鏈分類(lèi)的隨意性，雜交瘤(quadromas)產(chǎn)生10種不同 抗體分子生物潛在混合物，其中僅有一個(gè)分子具有正確的雙特異性結(jié) 構(gòu)。通常通過(guò)親和層析步驟使正確分子純化。相似的流程見(jiàn)于公布于 1993年5月13日的專(zhuān)利申請(qǐng)WO 93/08829和Traunecker等人的論文 EMBO J" 10:3655-3659 (1991)。
具有期望的結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)能與 免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。融合優(yōu)選與包含至少部分絞鏈區(qū)、CH2 和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選在至少一個(gè)融合子上存 在第一重鏈恒定區(qū)(CHI)(其包含對(duì)于輕鏈的結(jié)合來(lái)說(shuō)必要的位點(diǎn))。 將編碼免疫球蛋白重鏈融合子和，如期望，免疫球蛋白輕鏈的DNA插 入分別的表達(dá)載體中，并且將其共轉(zhuǎn)染進(jìn)入合適的宿主生物體內(nèi)。制 備雙特異性抗體的詳細(xì)內(nèi)容見(jiàn)，例如，Suresh等人，Methods in Enzymology, 121:210 (1986)。
根據(jù)WO 96/27011所述的另一方法，將一對(duì)抗體分子之間的界面 設(shè)計(jì)成可使從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的異源二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含至少部分抗體恒定區(qū)的CH3區(qū)。在該方法中，第一抗 體分子界面的一條或多條小氨基酸側(cè)鏈用大的側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨 酸)被取代。通過(guò)用較小的氨基酸側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代大 的氨基酸側(cè)鏈而在第二抗體分子界面制造出與大的氨基酸側(cè)鏈相同或 相似大小的互補(bǔ)的"洞"。這樣就產(chǎn)生了可使異源二聚體與其它不必要 的終產(chǎn)物如同源二聚體相比產(chǎn)量增加的機(jī)制。
能將雙特異性抗體制成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(如F (ab') 2雙特異
性抗體)。文獻(xiàn)已經(jīng)記述了從抗體片段制備雙特異性抗體的技術(shù)。例如，
能用化學(xué)連接法制備雙特異性抗體。Brennan等人，Science 229:81 (1985)記述了完整抗體被蛋白水解作用剪切產(chǎn)生F (ab') 2片段的流 程。這些片段在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉(其穩(wěn)定臨近二硫醇和預(yù)防分 子間二硫鍵形成)存在時(shí)被還原。產(chǎn)生的Fab'片段然后轉(zhuǎn)化成為硫代 硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后Fab'-TNB衍生物之一通過(guò)巰乙胺 還原再轉(zhuǎn)化為Fab'-硫醇并與另一種Fab'-TNB衍生物等摩爾數(shù)混合形 成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體能用作酶的選擇性固定化試劑。 Fab'片段可直接從大腸桿菌中回收并化學(xué)配對(duì)形成雙特異性抗體。 Shalaby等人，J.Exp.Med. 175:217-225 (1992)記述了完全人源化的雙 特異性抗體F (ab') .sub.2分子的制備。每個(gè)Fab'片段分別從大腸桿菌 分泌并在體外直接進(jìn)行化學(xué)偶合形成雙特異性抗體。因此這樣形成的 雙特異性抗體能結(jié)合到過(guò)表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞上和正常人T細(xì)胞上， 并啟動(dòng)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的抗人胸部腫瘤耙細(xì)胞的溶解活性。
各種直接從重組的細(xì)胞培養(yǎng)物中制備和分離雙特異性抗體片段的 技術(shù)也己記述。例如，用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體(Kostelny等人, J. Immunol. 148 (5) :1547-1553 (1992))。將來(lái)自Fos和Jim蛋白質(zhì)的 亮氨酸拉鏈肽段通過(guò)基因融合連接到兩個(gè)不同的抗體分子的Fab'部分。 抗體的同源二聚體在絞鏈區(qū)被還原以形成單體，隨后再氧化形成異源 二聚體抗體。這個(gè)方法也可用于產(chǎn)生同源二聚體抗體。Hollinger等人 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448 (1993))記述的"微型雙功能 抗體diabody)技術(shù)"(提供了制備雙特異性抗體片段的另一種機(jī)制。 片段包含通過(guò)太短而不能使同一鏈上兩個(gè)區(qū)之間配對(duì)的接頭連接到輕 鏈可變區(qū)(Vl)上的重鏈可變區(qū)(VH)。因此， 一個(gè)片段的Vh和Vl區(qū)被迫與另一個(gè)片段上互補(bǔ)的Vl和Vh區(qū)配対，因此形成兩個(gè)抗原結(jié) 合位點(diǎn)。通過(guò)使用單鏈Fv (sFv) 二聚體制備雙特異性抗體片段的另一 個(gè)策略也已報(bào)道，見(jiàn)Gruber等人，J. Immunol. 152:5368 (1994)。
考慮了具有兩種以上效價(jià)的抗體，例如能制備三特異性抗體，見(jiàn) 于Tutt等人，J. Immunol. 147:60 (1991 )。 ^,錄凝叛謬
異源結(jié)合抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。異源結(jié)合抗體由兩個(gè)共價(jià)連 接的抗體組成。提議將這種抗體，例如用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不必 要的細(xì)胞(U.S. Pat. No. 4,676,980)，并用于HIV感染的治療(WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089)?？紤]到抗體可用人工蛋白質(zhì)化學(xué) 的已知方法體外制備，包括那些包含交聯(lián)試劑的方法。例如，可用二 硫化物互換反應(yīng)或通過(guò)形成硫醚鍵構(gòu)建免疫毒素。用于此目的的合適 的試劑的例子包括亞氨基硫醇鹽和甲基-4-巰基butyrimidate (methyl-4-mercaptobutyrimidate)和那些例如在No. 4,676,980的美國(guó) 專(zhuān)利中公開(kāi)的例子。 艦好勸虔游工微
可對(duì)本發(fā)明的抗體的有關(guān)效應(yīng)分子功能進(jìn)行有目的的修飾，以致 使例如抗體治療癌癥的有效性增強(qiáng)。例如，可將半胱氨酸殘基導(dǎo)入Fc 區(qū)，因此使得在該區(qū)內(nèi)得以形成鏈間二硫鍵。這樣產(chǎn)生的同源二聚體 抗體可具有改善的細(xì)胞內(nèi)在化能力和/或增加的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作 用和抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒性作用(ADCC)。見(jiàn)Caron等人，J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992)禾卩Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)?？?腫瘤活性增強(qiáng)的同源二聚體抗體也可用Wolff等人(Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993))所述的異源雙功能交聯(lián)試劑制備?？蛇x擇地，可將 抗體設(shè)計(jì)成具有雙Fc區(qū)并可因此具有增強(qiáng)的補(bǔ)體水解和ADCC能力， 見(jiàn)Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)。
本發(fā)明還涉及包含偶聯(lián)到細(xì)胞毒性試劑如化療試劑、毒素(如細(xì) 菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素 (即放射偶聯(lián)物)上的抗體的免疫偶聯(lián)物。
上文已記述了用于制備這種免疫偶聯(lián)劑化療試劑。能用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈，白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒 素A鏈(來(lái)自假單胞菌屬)、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮 根毒素A鏈、Ct-八疊球菌毒素、油桐屬福地明蛋白、石竹素蛋白、美
洲商陸蛋白(PAPI、 PAPII和PAP-S)、苦瓜甾抑制劑、瀉果素、巴豆 毒素、石堿草抑制劑、白樹(shù)毒素、絲林霉素、局限曲菌素、酚霉素、 依諾霉素和tricothecene類(lèi)。有多種可用于制備放射偶聯(lián)抗體產(chǎn)物的放 射性核素。其例子包括.sup.212Bi、 .sup.1311、 .sup.l31In、 .sup.90Y 和.sup.l86Re?？贵w和細(xì)胞毒性試劑的偶聯(lián)物的制備可使用多種雙功能 蛋白偶聯(lián)試劑，如N-琥珀酰亞胺基-3- (2-吡啶基雙硫醇)丙酸酯 (SPDP)、亞氨基硫醇鹽(iminothiolane) (IT)、亞氨酸酯的雙功能衍 生物(如二甲基己二酰亞胺酯HCL)、活性酯類(lèi)(如雙琥珀酰亞胺辛二 酸酯)、醛(如glutarddehyde)、 二疊氮基化合物(如二- (p-疊氮基苯 甲酰)己二酸酯)、二-重氮基衍生物(如二- (p-二重氮基苯甲酰)-氨 茶堿)、二異氰酸鹽(如甲代亞苯基(tolyene) 2,6-二異氰酸鹽)和生 物活性氟化合物(如1,5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，能制備篦麻毒素 免疫毒素的方法見(jiàn)于Vitetta等人，Science, 238: 1098 (1987)。碳-14-標(biāo) 記的l-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是將 放射性核酸偶聯(lián)到抗體上的示例性的螯合劑。見(jiàn)于WO94/11026。
在另一個(gè)實(shí)施例中，可將抗體偶聯(lián)到"受體"(如抗生物素蛋白鏈 菌素)用于腫瘤靶向前治療，其中可將抗體-受體偶聯(lián)物為個(gè)體給藥， 然后通過(guò)使用清除試劑從循環(huán)中移除未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后將偶聯(lián)到 細(xì)胞毒性試劑(如放射性核酸)上的"配體"(如抗生物素蛋白)給藥。 貧鄉(xiāng)
在某些情況下，在診斷和治療的有效性上， 一種抗體型的單克隆 抗體可比另一種抗體型的更優(yōu)選。例如，在來(lái)自抗體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解 作用的研究中，已知Y-2a和Y-3型的未修飾的小鼠單克隆抗體的溶解 靶細(xì)胞的作用一般比Y-l型更有效。有效性的差別被認(rèn)為是由于？2a 和？3型能夠更加活躍地參與到靶細(xì)胞的溶解性毀壞中?？赏ㄟ^(guò)使用 sib選擇技術(shù)分離類(lèi)別轉(zhuǎn)換變體而從分泌不同抗體型的單克隆抗體的親 代雜交瘤細(xì)胞中進(jìn)行特殊抗體型單克隆抗體的二級(jí)制備(Steplewski, 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:8653, 1985; Spira,等人，J. Immunol.Methods, 74:307, 1984)。
實(shí)施例
實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)
乂 C5"i 基麟 嵐游虔條
采用基因敲除/敲入策略構(gòu)建在小鼠C5aR基因啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)人C5aR基因而不是小鼠C5aR基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。靶載體包含小鼠C5aR基因外顯子3上游的小鼠C57BL/6基因組DNA的3.5 kb區(qū)、人C5aR基因外顯子3編碼序列、小鼠C5aR基因3，非翻譯區(qū)、磷酸葡糖激酶啟動(dòng)子和側(cè)翼是loxP位點(diǎn)的新霉素抗性基因以及pLOz載體(Ozgene, Perth, Australia )上小鼠C5aR基因下游的小鼠基因組DNA的3 kb區(qū)。用PCR擴(kuò)增制備基因組DNA片段。將載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入C57BL/6胚胎干細(xì)胞，并用Southern雜交篩選G418抗性克隆的DNA。使Xba I和EcoR V酶切消化的DNA與5'和3'探針雜交，分別鑒定5'和3'末端發(fā)生正確同源重組的克隆。將產(chǎn)生于注射了正確的耙ES克隆的胚泡的嵌合體與雌性C57BL/6小鼠交配。人C5aR基因的種系傳遞用小鼠鼠尾基因組DNA Southern雜交證實(shí)。產(chǎn)生具有人C5aR基因的小鼠純合子(ZzC5i 廣A)，并用PCR、 Southern雜交和FACS染色證實(shí)不存在mC5aR基因。W做潘蕭分,
用如前所述(Haslett等人，(1985))的修正方法從健康志愿者外周靜脈血中分離人中性粒細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，將用EDTA包被的真空采血管采集的血液樣品于400 x g離心15分鐘，然后將血漿和棕黃色上層去除。接著用1%右旋糖酐沉降30分鐘，于300 x g離心5分鐘將白細(xì)胞沉淀并用PBS洗滌。然后將在65% percoll液(密度為1.093 g/ml,Amersham Bioscience)的細(xì)胞于500 x g離心30分鐘。離心后，中性粒細(xì)胞用PBS重新懸浮。從兩條后腿股部將含有10%胎牛血清的5 mlDMEM (GIBCO)培養(yǎng)液用注射器注入骨中以分離小鼠中性粒細(xì)胞。中性粒細(xì)胞用Ficoll-Paque (Amersham Bioscience)密度離心分離。紅細(xì)胞用低滲緩沖液(155 mMNH4Cl、 10 mM KHC03、 1 mM EDTA)裂解。細(xì)胞存活性用臺(tái)盼藍(lán)排除法測(cè)定，中性粒細(xì)胞沉淀用PBS重懸。賴(lài)蘑微游產(chǎn)4
用表達(dá)高水平hC5aR的L1.2轉(zhuǎn)染子(Campbell等人(1996))( 2 x107)免疫接種C57BL/6小鼠，腹腔內(nèi)注射每?jī)芍芤淮喂?次，然后 靜脈內(nèi)注射一次。靜脈內(nèi)注射免疫接種后4天，摘除脾臟，并用標(biāo)準(zhǔn) 流程使細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞系融合。用~1 x 107分離自/zC5i 廣'+小鼠腿骨 的中性粒細(xì)胞以相似的方式免疫接種C57BL/6小鼠靜脈內(nèi)注射兩次、 腹腔內(nèi)注射一次，最后是靜脈內(nèi)注射免疫接種。雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)在含 有10% Fetalclone禾n HAT補(bǔ)充物(SIGMA)的DMEM (GIBCO)培 養(yǎng)液中，吸取培養(yǎng)上清液用于初歩篩選。選定抗體的制備按比例擴(kuò)大， 并將單克隆抗體用蛋白A或G層析法純化、濃縮、轉(zhuǎn)換緩沖液和去除 內(nèi)毒素。單克隆抗體濃度用小鼠IgGELSA試劑盒(Roche)測(cè)定。 魔式潘應(yīng),
使用間接免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)單克隆抗體抗轉(zhuǎn)染細(xì)胞 或白細(xì)胞的反應(yīng)性。將細(xì)胞用PBS洗滌一次，然后將其在100pl含有 2%人血清和0.1%疊氮鈉(染色緩沖液)、純化抗體或50 ^雜交瘤培養(yǎng) 上清液的PBS中重懸。于4°C放置20分鐘后，將細(xì)胞用染色緩沖液洗 滌兩次，并在50 )il用染色緩沖液稀釋的1:200 FITC-偶聯(lián)的親和力純化 的F(ab')2山羊抗小鼠IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories) 重懸。于4°C溫育20分鐘后，細(xì)胞用染色緩沖液洗滌兩次，并在 FACSCalibur (Becton-Dickinson)儀上分析以確定表面表達(dá)的水平。用 碘化丙啶染色排除死細(xì)胞。 微微
人中性粒細(xì)胞用結(jié)合緩沖液(50 mM HEPES、 pH7.5、 1 mM CaCl2、 5mMMgCl2、禾n0.5。/。BSA)洗滌，并重懸成1 x 107/ml。對(duì)于每種結(jié) 合反應(yīng)(終體積是120(^1)而言，40|11細(xì)胞懸浮液(4xl()S個(gè)細(xì)胞) 與適量的抗hC5aR單克隆抗體，同型配對(duì)的對(duì)照單克隆抗體或未標(biāo)記 的人C5a (SIGMA)于室溫溫育15分鐘。將1251-標(biāo)記的人C5a (Perkin Elmer)以終濃度0.4nM加入，并且將反應(yīng)體系于室溫溫育60分鐘。 然后將細(xì)胞收集起來(lái)并用含有150 mM NaCl的結(jié)合緩沖液洗滌3遍。 然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有MicroScint 20閃爍液的Opti板(Perkin Elmer) 內(nèi)并在TopCount (Packard)上放射性計(jì)數(shù)。每個(gè)樣品分析三次。
24微分橋
按照以前描述過(guò)的方法(Ponath等人(1996))將新鮮分離的人中 性粒細(xì)胞于37°C裝載Fluo-3AM (Molecular Probes)。樣品在 FACSCalibur流式細(xì)胞儀上運(yùn)行，測(cè)定其因時(shí)間的線(xiàn)性熒光強(qiáng)度。 遭眾絲分叛
將懸浮于趨化緩沖液(含有50。/c)M199 (SIGMA)和2%胎牛血清 (HyClone)的RPMI 1640培養(yǎng)液)的人或小鼠中性粒細(xì)胞(每孔1-2 xl()5個(gè)細(xì)胞)置于12-孔的transwell板(Coming Costar Co.)的上部的 孔內(nèi)，并使其能夠跨3 pm濾器向含人或小鼠C5a的下部孔遷移30分 鐘。在FACSCalibur儀上計(jì)數(shù)60秒，計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)。設(shè)置緊靠角 落的和邊緣散在的細(xì)胞以排除細(xì)胞碎片或無(wú)關(guān)細(xì)胞。 游表纖謬機(jī)A ".2鄉(xiāng)
小鼠L1.2細(xì)胞生長(zhǎng)于補(bǔ)充了 10%胎牛血清(HyClone)的RPMI 1640 (GIBCO)，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)根據(jù)生產(chǎn)商的 指示進(jìn)行轉(zhuǎn)染。歸類(lèi)雜關(guān)
按照以前描述的方法(Korganow等人(1999))從K/BxN關(guān)節(jié)炎 小鼠收集血清。將150 ]il血清于當(dāng)天或第二天通過(guò)腹腔內(nèi)注射注入受 體小鼠體內(nèi)而誘導(dǎo)受體小鼠發(fā)生實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎，按照以前描述的方法
(Lee等人(2002))監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)程。每日測(cè)定踝關(guān)節(jié)增厚程度和臨床 評(píng)分。匯總每只小鼠四只爪的評(píng)分計(jì)算臨床評(píng)分0-正常，l-輕度發(fā)紅， 2-紅并有些腫脹，3-紅并明顯腫脹。于第-1天和1天(預(yù)防性治療)或 第5天(療愈性治療)腹腔內(nèi)注射抗hC5aR或同型對(duì)照單克隆抗體(l-10 mg/kg溶于PBS)。于第10天時(shí)，處死小鼠，將其爪收集進(jìn)行組織學(xué)處 理。爪在固定液(10%磷酸鹽緩沖的甲醛溶液)中固定48小時(shí)，并用 含10%甲酸的固定液處理5天以脫鈣。然后將樣品用PBS洗滌并用石 蠟包埋。切成5]um厚切片并用H&E染色。 鋭俯
KxB/N模型的獨(dú)立對(duì)照組和處理組之間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性用 Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，隨后用Dunn's多重比較檢驗(yàn)的post hoc分析來(lái)確定。實(shí)施例1:用轉(zhuǎn)染的L1.2細(xì)胞產(chǎn)生抗C5aR的單克隆抗體(比較性實(shí) 施例)
首先通過(guò)已知的趨化因子受體(Heath等人(1997) ;Qin等人 (1998) ;Wu等人(1997) ; Qin,等人(1996))產(chǎn)生抗hC5aR的單克 隆抗體。為小鼠免疫接種非常高水平表達(dá)hC5aR(每個(gè)細(xì)胞表達(dá) 80，000 個(gè)受體分子)的L1.2細(xì)胞(小鼠B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系)。進(jìn)行5次融 合，鑒定出超過(guò)40種與hC5aR轉(zhuǎn)染子發(fā)生特異性反應(yīng)而不與表達(dá)其它 緊密相關(guān)的趨化因子受體，如CXCR1、 CXCR2或另一種C5a結(jié)合受 體C5L2 (Gerard等人(2005))的轉(zhuǎn)染子發(fā)生特異性反應(yīng)的不同單克 隆抗體。許多這種單克隆抗體抑制1251-標(biāo)記的人C5a與hC5aR轉(zhuǎn)染子 的結(jié)合。最早鑒定的單克隆抗體，7F3，顯示出對(duì)C5a結(jié)合有力的抑制 作用(圖l)，在趨化性分析中抑制人中性粒細(xì)胞向C5a的趨化作用并 阻斷人中性粒細(xì)胞中C5a誘導(dǎo)的鈣流動(dòng)(數(shù)據(jù)未顯示)。 實(shí)施例2:使用來(lái)自hC5aR基因敲入小鼠的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生抗C5aR 的單克隆抗體
在制備有力的抗C5aR的單克隆抗體的第二個(gè)方法中，通過(guò)在小鼠 C5aR基因(C5i 7)上定向同源重組制備人C5aR基因敲入小鼠。通過(guò) 用靶向構(gòu)建體(圖2)轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細(xì)胞(ES)來(lái)刪除內(nèi)源C5aR編 碼序列并用hC5aR編碼序列置換小鼠內(nèi)源C5aR編碼序列。從672個(gè) 中篩選出的兩個(gè)ES克隆被鑒定出含有正確的定向的hC5aR序列。達(dá) 到hC5aR轉(zhuǎn)基因的種系傳送，并從這些ES細(xì)胞產(chǎn)生5只嵌合體小鼠， 因此建立了 hC5aR基因敲入種系。將側(cè)翼帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)的PGK-neo 基因用BL/6 Cre deleter株從敲入基因座位中刪除。通過(guò)Southern雜交 鑒定具有人C5aR轉(zhuǎn)基因的小鼠純合子(/2C5i^+/+)(圖3)。根據(jù)用抗 hC5aR的單克隆抗體FACS染色法判斷，這些小鼠的中性粒細(xì)胞顯示 表達(dá)非常高水平的hC5aR (圖4)。來(lái)自野生型小鼠的中性粒細(xì)胞沒(méi)有 用抗人C5aR單克隆抗體7F3染色，但是用抗小鼠C5aR單克隆抗體 20/70 (Soruri等人(2003))進(jìn)行深度染色(圖4)。人和小鼠C5aR僅 有65%的同源性，但是對(duì)于hC5aR基因敲入小鼠的發(fā)育重要的是，小 鼠和人C5a以相似的親和力結(jié)合到人C5aR上(Gerard等人(1992)) (和我們尚未公開(kāi)的觀(guān)察結(jié)果)。ZzC5i 廣A小鼠中性粒細(xì)胞以相似的方
26式遷移至人和小鼠C5a處。
我們從一種融合物中制備多數(shù)hC5aR特異性單克隆抗體。配體結(jié) 合試驗(yàn)揭示了許多這種抗體顯示出對(duì)1251 -標(biāo)記C5a結(jié)合到人中性粒細(xì) 胞的抑制作用比單克隆抗體7F3更強(qiáng)。自1^5&尺+/+小鼠中性粒細(xì)胞產(chǎn) 生的抗體顯示出廣譜的^I-C5a結(jié)合抑制作用，從實(shí)質(zhì)上完全抑制(如 3C5、 8G7、 7H3)到部分抑制或幾乎無(wú)抑制作用，這取決于單克隆抗 體的克隆(圖5)。最有效的抑制劑，單克隆抗體3C5，其ICs。為171 pM， 而與之形成對(duì)比的是，單克隆抗體7F3的ICs。為503 pM (圖6)。用 /2C^廣z+小鼠中性粒細(xì)胞免疫接種野生型小鼠而制備的抗C5aR單克隆 抗體完全不同，在于重鏈可變區(qū)的氨基酸序列完全不同，提示它們來(lái) 自不同的克隆。多數(shù)高品質(zhì)和高親和力的抗C5aR單克隆抗體的產(chǎn)生使 我們得以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)人白細(xì)胞上C5aR的表達(dá)。C5aR在中性粒細(xì)胞、嗜 酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上以高水平表達(dá)，但在初始、 記憶或效應(yīng)T細(xì)胞的所有亞群以及多數(shù)B細(xì)胞上不表達(dá)(圖7)。 實(shí)施例3:小鼠類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型抗hC5aR單克隆抗體試驗(yàn)
表達(dá)人的分子的轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)展是一種方便的方法，其可用于 在動(dòng)物模型中測(cè)定新的為人類(lèi)使用而設(shè)計(jì)的治療方法。C5aR在小鼠炎 癥性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮首要的作用。例如，C5aR缺失小鼠免于 罹患抗葡萄糖6磷酸同功酶的自身抗體(Ji等人(2002))或II型膠原 單克隆抗體(Grant等人(2002))誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。測(cè)定了抗hC5aR單 克隆抗體的保護(hù)或逆轉(zhuǎn)/2C5i^+z+小鼠實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展的能力。將 關(guān)節(jié)炎K/BxN小鼠的血清輸至健康小鼠體內(nèi)，誘導(dǎo)模擬K/BxN病的關(guān) 節(jié)特異性炎癥反應(yīng)(Kouskoff等人(1996) ; Korganow等人(1999))。 將/ C5/ 7+A小鼠用抗hC5aR單克隆抗體或同型匹配的對(duì)照組單克隆抗 體于第-1和1天預(yù)處理，并將K/BxN血清于第0天或2天注射入腹腔 內(nèi)(腹腔內(nèi)注射)。輸完血清之后，對(duì)照抗體處理的小鼠顯示出典型的 臨床關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，伴有關(guān)節(jié)腫脹和炎性浸潤(rùn)，而用抗hC5aR單克隆抗 體處理的小鼠則表現(xiàn)出完全沒(méi)有關(guān)節(jié)炎的炎癥、臨床或組織學(xué)表現(xiàn)。 /zC5i 廣z+小鼠和對(duì)照同胞仔之間在疾病的發(fā)展上無(wú)可觀(guān)察到的差異(數(shù) 據(jù)未顯示)，提示人C5aR是完全功能性的，由于KxB/N模型的該病取 決于C5aR (]i等人(2002) ; Grant等人(2002))。更重要的是，當(dāng)誘
27導(dǎo)出該病5天后給予抗體，我們觀(guān)察到已形成的炎癥反應(yīng)發(fā)生了顯著
的逆轉(zhuǎn)。從表達(dá)抗hC5aR的小鼠中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體(3C5 和8G7)的這些效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間超過(guò)單克隆抗體7F3。少至1 mg/kg 的單克隆抗體3C5能夠逆轉(zhuǎn)炎癥反應(yīng)并能持久抑制炎癥反應(yīng)。 討論
能夠獲得hC5aR基因敲入小鼠使得我們能夠制備非常高的親和力 的抗hC5aR單克隆抗體。這就大概涉及/;C5i 7+/+小鼠中性粒細(xì)胞上 針對(duì)高密度表達(dá)的人C5aR非常集中的免疫反應(yīng)。中性粒細(xì)胞表達(dá)非常 高水平的C5aR，高達(dá)每個(gè)細(xì)胞上表達(dá)200,000個(gè)受體分子(Gerard & Gerard (1994a))，而L1.2 C5aR轉(zhuǎn)染子表達(dá) 80,000受體，并超過(guò)中性 粒細(xì)胞2-3倍。因此，C5aR在原代小鼠中性粒細(xì)胞上的表達(dá)可達(dá)到高 得多的密度是關(guān)鍵因素。也可以想象在中性粒細(xì)胞上表達(dá)的抗原因 為中性粒細(xì)胞的抗原呈遞功能或其細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用或遷移的能力 而引起較好的應(yīng)答。表達(dá)十分有效的人分子的轉(zhuǎn)基因小鼠的開(kāi)發(fā)被證 明是試驗(yàn)新型治療方法(最終設(shè)計(jì)用于人)的方便的手段。在我們的 研究中，抗-hC5aR單克隆抗體是安全的，并對(duì)于治療炎癥性關(guān)節(jié)炎令 人驚訝的有力和有效。構(gòu)建基因敲入小鼠的相對(duì)低的成本，和其在安 全性和有效性研究中的潛在應(yīng)用提示這種小鼠成為臨床前開(kāi)發(fā)的標(biāo)準(zhǔn) 工具。本研究的另一個(gè)重要的結(jié)果是能夠完全逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)炎炎癥進(jìn)展的 單克隆抗體的開(kāi)發(fā)。的確，我們不知曉任何其它能將這些模型的關(guān)節(jié) 炎如此完全預(yù)防或逆轉(zhuǎn)到我們用抗C5aR單克隆抗體治療所看到的程 度的治療方法。此外，抗C5aR單克隆抗體以相對(duì)低的劑量(lmg/kg) 顯示出該效應(yīng)，該劑量大大低于抑制小鼠關(guān)節(jié)炎所用的抗C5抗體的劑 量(每只小鼠40 mg/kg或lmg) (Ji等人(2002) ; Wang等人(1995))。 之所以如此的一個(gè)原因可涉及高濃度( 180ug/ml)的C5通常出現(xiàn)在 血細(xì)胞上或組織液中。此外，我們的單克隆抗體識(shí)別C5aR但不識(shí)別與 C5a結(jié)合后產(chǎn)生抑制性信號(hào)的第二 C5a結(jié)合受體C5L2 (Gerard等人 (2005))。這樣，抗-C5aR單克隆抗體抑制炎癥反應(yīng)的程度可由于未 打斷C5a與C5L2的結(jié)合?？傊琱C5aR敲入小鼠對(duì)于制備與人C5aR 以高親和力結(jié)合的單克隆抗體，對(duì)于在開(kāi)發(fā)人類(lèi)治療性用途之前確定 這些抗體對(duì)小鼠的疾病模型的有效性是非常有效的手段。此處描述的對(duì)于C5aR方法一般應(yīng)可應(yīng)用于其它重要的治療耙標(biāo)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解，可在不脫離廣義描述的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)或 范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明作出如在具體實(shí)施方式
中所示的許多變化和/或修改。 因此應(yīng)該認(rèn)為本發(fā)明的具體實(shí)施方式
在所有方面是示例性而非限制性 的。
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權(quán)利要求
1、一種制備與第一物種多肽結(jié)合的抗體的方法，該方法包括用源自第二物種轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的細(xì)胞免疫接種第二物種哺乳動(dòng)物，其中第一物種多肽在源自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的細(xì)胞表面表達(dá)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括從免疫接種的哺乳動(dòng)物得到的脾細(xì)胞制備雜交瘤細(xì)胞。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其進(jìn)一步包括篩選雜交瘤細(xì)胞以得到與第一物種多肽結(jié)合的抗體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其中抗體是單克隆抗體。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的方法，其中第一物種是人。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其中第二物種選自牛、豬、山羊、綿羊、駱駝、馬、貓、狗、猴、狒狒、兔、豚鼠、大鼠、倉(cāng)鼠或小鼠。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中第二物種是小鼠。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的方法，其中第一物種多肽是G蛋白偶聯(lián)受體。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中G蛋白偶聯(lián)受體是趨化因子受體。
10、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中趨化因子受體是C5aR。
11、 根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的方法，其中源自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的細(xì)胞是免疫系統(tǒng)細(xì)胞。
12、 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的方法，其中源自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞。
13、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中抗原呈遞細(xì)胞是中性粒細(xì)胞。
14、 一種根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述方法制備的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備抗體的方法和由該方法制備的抗體。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及制備與第一物種多肽結(jié)合的抗體的方法，該方法包含用源自第二物種轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的細(xì)胞免疫接種第二物種哺乳動(dòng)物，其中第一物種多肽在源自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的細(xì)胞表面表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101501073SQ200780029714
公開(kāi)日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2007年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月22日
發(fā)明者C·R·麥肯 申請(qǐng)人:G2英弗勒美欣私人有限公司