專利名稱：將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇的嗜熱生物體的制作方法
將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇的嗜熱生物體相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2006年10月31日提交的PCT/US06/042442的優(yōu)先權(quán)，而PCT/ US06/042442要求了 2006年5月1日提交的美國申請(qǐng)第60/796380號(hào)的優(yōu)先權(quán)。所有這些 申請(qǐng)通過引用并入本文。政府利益由于美國國家標(biāo)準(zhǔn)局(NIST)的合同第60NANB1D0064號(hào)資助了與其開發(fā)相關(guān)的研 究，因而美國政府可享有本發(fā)明的某些權(quán)利。背景1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于用于產(chǎn)生乙醇的生物質(zhì)加工領(lǐng)域。特別是，公開了消耗多種生物質(zhì)衍 生的底物并高產(chǎn)乙醇的新型嗜熱生物體，以及產(chǎn)生方法和所述生物體的用途。2.相關(guān)技術(shù)的描述生物質(zhì)代表了廉價(jià)且容易獲得的纖維素水解底物，糖類可由其產(chǎn)生。這些糖類可 以被單獨(dú)地使用或者被發(fā)酵產(chǎn)生乙醇和其他產(chǎn)品。由于乙醇可以用作可再生民用燃料，因 而在生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)品中對(duì)乙醇的興趣很高。在反應(yīng)器設(shè)計(jì)、預(yù)處理操作和分離技術(shù)領(lǐng)域已進(jìn)行了重要的研究，以至于生物 轉(zhuǎn)化方法正在變得在經(jīng)濟(jì)上對(duì)石油燃料技術(shù)有競(jìng)爭(zhēng)力。然而，據(jù)估計(jì)如果將兩個(gè)或者多 個(gè)方法步驟組合，那么可以最大地節(jié)約費(fèi)用。例如，同步糖化發(fā)酵(SSF)和同步糖化共 發(fā)酵(SSCF)方法在單個(gè)反應(yīng)器或者連續(xù)過程設(shè)備中結(jié)合了酶法糖化步驟和發(fā)酵。在 SSF方法中，由于可溶性糖被連續(xù)地發(fā)酵成乙醇，因而消除了終產(chǎn)物抑制(end-product inhibition) 0在使用多種生物體提供多種水解產(chǎn)物時(shí)，SSF方法一般被稱為同步糖化共發(fā) 酵(SSCF)方法。除了和更短的反應(yīng)時(shí)間以及減少的投資費(fèi)用相關(guān)的節(jié)約，共發(fā)酵方法還可 以提供改進(jìn)的產(chǎn)物產(chǎn)率，這是因?yàn)槟承┗衔飼?huì)另外積累至抑制代謝或水解的水平，而共 發(fā)酵生物體消耗了它們。在一個(gè)這樣的實(shí)例中，3_葡萄糖苷酶在葡萄糖存在下停止水解 纖維二糖而且反過來，纖維二糖的積累阻止了纖維素的降解。通過將葡萄糖轉(zhuǎn)化為不抑制 3 -葡萄糖苷酶水解活性的一種或者多種產(chǎn)物，涉及纖維素和半纖維素水解產(chǎn)物共發(fā)酵的 SSCF方法可以緩解這個(gè)問題。聯(lián)合生物加工(CBP)涉及四個(gè)生物介導(dǎo)的事件(1)酶的產(chǎn)生，⑵底物水解，(3) 己糖發(fā)酵和(4)戊糖發(fā)酵。這些事件可在單一的步驟中進(jìn)行。這個(gè)策略需要利用纖維素和 半纖維素的微生物體。相比在專門的方法步驟中產(chǎn)生糖分解酶的更常規(guī)的方法，CBP生物 體的開發(fā)可以潛在地導(dǎo)致很大的成本降低。使用多于一種的生物體完成該四個(gè)生物介導(dǎo)事 件的CBP方法被稱為聯(lián)合生物加工共培養(yǎng)發(fā)酵。一些細(xì)菌能夠?qū)⑽焯寝D(zhuǎn)化為己糖，并通過糖酵解將己糖發(fā)酵成有機(jī)酸和其他產(chǎn)物 的混合物。糖酵解途徑起始自六碳葡萄糖分子至兩個(gè)丙酮酸三碳分子的轉(zhuǎn)化。然后丙酮 酸可以通過乳酸脫氫酶(“l(fā)dh")的作用被轉(zhuǎn)化為乳酸，或者通過丙酮酸脫氫酶或丙酮 酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶的作用被轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A("乙酰-CoA")。乙酰輔酶A進(jìn)一步地被磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶和乙酸激酶轉(zhuǎn)化為乙酸，或者被乙醛脫氫酶(“AcDH")和乙醇脫氫 酶(“adh")還原為乙醇。綜合來看，連累產(chǎn)乙醇生物體的表現(xiàn)的是非乙醇的有機(jī)產(chǎn)物的 產(chǎn)生，特別是ldh介導(dǎo)的丙酮酸到乳酸的轉(zhuǎn)化，和通過磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶和乙酸激酶的乙酰輔 酶A到乙酸的轉(zhuǎn)化。細(xì)菌代謝工程近來已在嗜熱厭氧革蘭氏陽性菌解糖熱厭氧桿菌 (T. saccharolyticum)中產(chǎn)生乳酸脫氫酶敲除。參見，Desai，S. G. ；Guerinot, M. L.； Lynd, L. R. "Cloning of L-lactate dehydrogenase and elimination oflactic acid production via gene knockout in Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum Jff/ SL-YS485” ( "L-乳酸脫氫酶克隆及通過在解糖熱厭氧桿菌JW/SL-YS485中的基因敲除消 除乳酸產(chǎn)生”)Appl. Microbiol. Biotechnol. 65 :600_605，2004。雖然敲除ldh構(gòu)成了本領(lǐng)域的進(jìn)步，但是該生物體的一些用途是有問題的，因?yàn)?該解糖熱厭氧桿菌菌株繼續(xù)產(chǎn)生有機(jī)酸一特別是乙酸。概述本裝置通過提供消耗多種生物質(zhì)衍生的底物并以近于理論產(chǎn)率產(chǎn)生乙醇的嗜熱 厭氧細(xì)菌促進(jìn)了本領(lǐng)域技術(shù)進(jìn)步并克服了上文概括的問題。本文還公開了使用該生物體產(chǎn) 生乙醇的方法。本文報(bào)道的裝置導(dǎo)致多種基因單獨(dú)地或組合地被敲除，其中天然生物體中的這些 基因會(huì)另外導(dǎo)致有機(jī)酸的形成。例如，可以敲除解糖熱厭氧桿菌JW/SL-YS485的(a)乙 酸激酶和/或磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶，以及(b)乳酸脫氫酶(ldh)、乙酸激酶(ack)和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶 (pta)。雖然本文報(bào)道的結(jié)果針對(duì)解糖熱厭氧桿菌，但是所述方法和材料也應(yīng)用于熱厭氧菌 (Thermoanaerobacter)屬的胃員，^ ^^^tS^Mft (Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes)、Thermoanaerobacteriumaotearoense、Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum、Thermo-anaerobacterium zeae、熱角軍糖熱厭氧菌(Thermoanaero bacteriumthermosaccharolyticum)禾口角軍木聚糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter-ium xylanolyticum)。所述方法和物質(zhì)通常用于代謝工程化嗜熱革蘭氏陽性細(xì)菌領(lǐng)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，不表達(dá)丙酮酸脫羧酶的分離的生物體將纖維素水解底物發(fā) 酵，從而以理論產(chǎn)率的至少90%的濃度產(chǎn)生乙醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化天然狀態(tài)含有至少一個(gè)賦予革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn) 物乙酸能力的基因的革蘭氏陽性細(xì)菌，從而消除所述至少一個(gè)基因的表達(dá)。所述細(xì)菌可以 為諸如解糖熱厭氧桿菌的熱厭氧菌。該賦予所述革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物乙酸的能力 的基因可以編碼表達(dá)乙酸激酶和/或磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該革蘭氏陽性細(xì)菌可以進(jìn)一步地經(jīng)轉(zhuǎn)化，而消除一個(gè)或多 個(gè)賦予所述革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物乳酸的能力的基因的表達(dá)。例如，該賦予產(chǎn)生乳 酸的能力的基因可以是乳酸脫氫酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生乙醇的方法包括轉(zhuǎn)化天然生物體，從而產(chǎn)生革蘭氏陽性 細(xì)菌，所述革蘭氏陽性細(xì)菌已經(jīng)轉(zhuǎn)化消除了賦予所述革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物有機(jī)酸 的能力的所有基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主；并在適宜條件下，將所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的 細(xì)菌宿主在培養(yǎng)基中培養(yǎng)足以允許底物糖化和發(fā)酵的時(shí)段，所述培養(yǎng)基含有底物，所述底 物包括選自葡萄糖、木糖、纖維二糖、蔗糖、木聚糖、淀粉及其組合的物質(zhì)。
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在一個(gè)實(shí)施方案中，描述了命名為ALK1且保藏于ATCC并具有專利保藏命名第 PTA-7206號(hào)的微生物的生物學(xué)純培養(yǎng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的多聚核苷酸包括(a)序列SEQ ID NO 10或(b)序列 SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10或(c)與序列(a)或(b)具有至少約90%序列一致性的序 列。描述了含有所述分離的多聚核苷酸(a)、(b)或(c)的載體，以及經(jīng)遺傳工程化而表達(dá) 多聚核苷酸(a)、(b)或(c)的互補(bǔ)體的宿主細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，分離的多聚核苷酸 包括與序列(a)或(b)具有至少約95%序列一致性的序列。在又一實(shí)施方案中，分離的多 聚核苷酸包括與序列(a)或(b)具有至少約98%或至少約99%序列一致性的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生乙醇的方法包括在適宜條件下，將表達(dá)分離的多聚核苷 酸(a)、(b)或(c)的互補(bǔ)體的突變細(xì)菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)足以允許底物發(fā)酵成乙醇的時(shí)段， 所述培養(yǎng)基含有底物，所述底物包括選自葡萄糖、木糖、纖維二糖、蔗糖、木聚糖、淀粉及其 組合的物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生乙醇的方法包括在反應(yīng)器中提供包含木質(zhì)纖維素底物、 纖維素酶和發(fā)酵劑的反應(yīng)混合物。所述發(fā)酵劑包括革蘭氏陽性細(xì)菌，其已經(jīng)轉(zhuǎn)化而消除了 至少一個(gè)賦予天然狀態(tài)的革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物乙酸的能力的基因的表達(dá)。使所述 反應(yīng)混合物在適當(dāng)條件下，反應(yīng)足以允許木質(zhì)纖維素底物糖化和發(fā)酵的時(shí)段。附圖簡(jiǎn)述

圖1表明了糖酵解途徑的反應(yīng)。圖2表明了相對(duì)于解糖熱厭氧桿菌的多種敲除菌株，野生型解糖熱厭氧桿菌的氫產(chǎn)生。圖3表明了整合到解糖熱厭氧桿菌基因組中的自殺載體pS⑶9(SEQ ID NO 9)的 ldh區(qū)域的實(shí)驗(yàn)多聚核苷酸序列和預(yù)期多聚核苷酸序列的比較。圖4表明了整合到解糖熱厭氧桿菌基因組中的自殺載體pS⑶8-Erm(SEQ ID NO 10)的pta/ack區(qū)域的實(shí)驗(yàn)多聚核苷酸序列和預(yù)期多聚核苷酸序列的比較。圖5-圖7表明了在ALK1生長期間，各種時(shí)間間隔的發(fā)酵液的高效液相色譜 (HPLC)痕跡。圖8表明了 ALK1菌株發(fā)酵期間的木糖、有機(jī)酸和乙醇的濃度。圖9表明了野生型解糖熱厭氧桿菌發(fā)酵期間木糖、有機(jī)酸和乙醇的濃度。圖10表明了 ALK1連續(xù)培養(yǎng)刺激(continuous culture challenge)期間木糖、有 機(jī)酸和乙醇的濃度。圖11表明了 ALK2菌株發(fā)酵期間木糖、有機(jī)酸和乙醇的濃度。圖12表明了 50°C下涉及ALK2和纖維素酶的嗜熱SSF反應(yīng)期間，在各種微晶纖維 素(Avicel)濃度下的乙醇產(chǎn)生。圖13表明了圖12所示的嗜熱SSF反應(yīng)的乙醇產(chǎn)率。詳細(xì)描述現(xiàn)在表明和描述的是在生物質(zhì)至乙醇的轉(zhuǎn)化中工程化和利用嗜熱厭氧革蘭氏陽 性細(xì)菌的方法。如本文所使用，如果生物體沒有經(jīng)遺傳工程化或者另外地以有意地改變生物體遺 傳構(gòu)成和/或表型構(gòu)成的方式經(jīng)人工操作，則是“天然狀態(tài)”的。例如，可認(rèn)為野生型生物
6體是天然狀態(tài)的。通過兩位點(diǎn)定向DNA同源重組事件完全消除了天然狀態(tài)解糖熱厭氧桿菌的有機(jī) 酸產(chǎn)生。以低底物加料，在約30°C _66°C的溫度范圍和約3. 85-6. 5的pH范圍下分批培養(yǎng)， 所述突變菌株解糖熱厭氧桿菌JW/SL-YS485 ALK1(〃 ALK1")產(chǎn)生近于理論量的乙醇。在 一個(gè)實(shí)施方案中，乙醇產(chǎn)率是理論最大值的至少約90%。ALK1及其子代存在有助于在木質(zhì) 纖維素生物質(zhì)至乙醇的轉(zhuǎn)化中顯著地節(jié)約的潛力，這歸因于對(duì)于SSF和SSCF方法中的纖維 素酶活性基本上最適的其生長條件。例如，纖維素酶活性最適參數(shù)包括4至5的pH和40°C 至50°C的溫度。另外，在使用缺乏產(chǎn)生有機(jī)酸的能力的敲除生物體時(shí)，沒有必要調(diào)整發(fā)酵液 的pH。ALK1以及類似生物體也可以適合于聯(lián)合生物加工共培養(yǎng)發(fā)酵，其中敲除生物體會(huì)將 戊糖轉(zhuǎn)化為乙醇，而且纖維素會(huì)被諸如熱纖梭菌(C.thermocellum)的纖維素水解生物體 所降解。相比30°C -37°C的常規(guī)嗜溫發(fā)酵溫度，在嗜熱溫度下操作SSF、SSCF或者CBP方法 提供數(shù)種重要益處。特別是，由于嗜熱溫度下更高的酶活性，因而可以降低實(shí)現(xiàn)給定轉(zhuǎn)化量 所必需的酶濃度。結(jié)果，致力于纖維素酶產(chǎn)生的方法步驟的成本在嗜熱SSF和SSCF中基本 上降低了(例如，2倍或者更多)，而在CBP中消除了。對(duì)于嗜熱SSF、SSCF和CBP，與發(fā)酵 罐冷卻以及發(fā)酵前后的熱交換相關(guān)的費(fèi)用預(yù)期也會(huì)降低。最后，相對(duì)于以常規(guī)嗜溫生物催 化劑為特征的方法，以嗜熱生物催化劑為特征的方法可以對(duì)微生物污染較不易感。與諸如天然存在的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌 (Zymomonas mobilis)，以及大腸桿菌(Escherchia coli)和產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的重組菌株的已知“單乙醇發(fā)酵(homoethanol-fermenting) ”微生物相反，本發(fā) 明公開的生物體不依賴于通過丙酮酸脫羧酶作用的丙酮酸至乙醛的轉(zhuǎn)化。事實(shí)上，天然狀 態(tài)的屬于熱厭氧菌屬的細(xì)菌不表達(dá)丙酮酸脫羧酶。從圖1所示的糖酵解途徑的反應(yīng)中可以 看到，丙酮酸可被酶丙酮酸_鐵氧還蛋白氧化還原酶2代謝為乙酰輔酶A、二氧化碳和還原 態(tài)鐵氧還蛋白。然而，為了產(chǎn)生唯一的發(fā)酵產(chǎn)物乙醇，還原態(tài)鐵氧還蛋白所攜帶的電子必須 通過NAD 鐵氧還蛋白氧化還原酶3被全部傳遞給NAD以形成NADH。隨后，在乙酰輔酶A至 乙醇的兩步還原過程中，NADH被乙醛脫氫酶7和乙醇脫氫酶8氧化回NAD。在圖2中可以 看到NADH被有效利用的證據(jù)不能表達(dá)ack和pta的乙酸敲除生物體以及不能夠表達(dá)ack， pta和ldh的雙敲除生物體(ALK1)兩者的氫氣產(chǎn)生均減少。這些生物體提供了從還原態(tài)鐵 氧還蛋白到NAD再到乙醇的化學(xué)計(jì)量電子傳遞的首個(gè)例證。在不能夠表達(dá)PDC的生物體中產(chǎn)生化學(xué)計(jì)量的乙醇產(chǎn)率的上述途徑與先前所述 的所有單乙醇發(fā)酵菌株所使用的途徑形成了對(duì)比。先前所述的菌株使用內(nèi)源的丙酮酸脫 羧酶(PDC)，或者經(jīng)工程化表達(dá)外源的PDC。因?yàn)镻DC的表達(dá)在微生物世界中很罕見，因 而憑借對(duì)碳流的修飾來重定向電子流的能力具有廣泛的意義。例如，可以使用該方法在 解糖熱厭氧桿菌以外的菌株產(chǎn)生高乙醇產(chǎn)率和/或產(chǎn)生乙醇以外的溶劑。特別是，諸如 熱厭氧菌屬成員、熱纖梭菌及其他嗜熱和嗜溫的梭菌(Clostridia)、嗜熱和嗜溫的芽孢 桿菌(Bacillus)種的革蘭氏陽性細(xì)菌；諸如大腸桿菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀 木干胃(Fibrobacter succinogenes)禾口會(huì)千會(huì)Hff胃(Fibrobacter) ^ftkfKfrH^^W^Ifi 菌(Thermoga neopolitana)和棲熱袍菌(Thermotoga)其他種的革蘭氏陰性細(xì)菌；包括 Neocallimatix和Piromyces種的厭氧真菌缺乏表達(dá)PDC的能力，并可得益于本公開的方法。應(yīng)當(dāng)理解，經(jīng)糖化產(chǎn)生葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、纖維二糖、 蔗糖、麥芽糖、木聚糖，甘露聚糖和淀粉中的一種或多種的木質(zhì)纖維素材料可以被所公開的 生物體利用。在各種實(shí)施方案中，木質(zhì)纖維素生物質(zhì)包括木頭、玉米秸與葉、鋸屑、樹皮、樹 葉、木業(yè)和林業(yè)殘余物、諸如柳枝稷的草類、反芻動(dòng)物消化產(chǎn)物、城市垃圾、造紙廢液、報(bào)紙、 紙板或其組合。實(shí)施例1ALK1菌株的產(chǎn)生材料和方法解糖熱厭氧桿菌菌株JW/SL_YS485(DSM 8691)是從懷俄明黃石國家公園西拇 指(West Thumb)池分離出的嗜熱厭氧細(xì)菌(Lui，S. Y ；Gherardini, F. C ；Matuschek, M.； Bahl, H. ；ffiegel, J. “ Cloning, sequencing, and expression of the gene encoding a largeS-layer-associated endoxylanase from T hermoanaerobacterium sp strainJff/ SL-YS485in Escherichia coli"( “在大腸桿菌中克隆、測(cè)序和表達(dá)編碼來自熱厭氧菌 菌株JW/SL-YS485的大S層相關(guān)內(nèi)切木聚糖酶的基因”)J. Bacteriol. 178 1539-1547， 1996 ；Mai, V；ffiegel, J. “ Advances indevelopment of a genetic system for Thermoanaerobacterium spp -Expression of genes encoding hydrolytic enzymes, development of asecond shuttle vector, and integration of genes into the chromosome"( “熱厭氧菌遺傳系統(tǒng)開發(fā)進(jìn)展編碼水解酶的基因的表達(dá)，另一穿梭載體的 開發(fā)以及基因至染色體的整合”)Appl. Environ. Microbiol. 66 :4817_4821，2000)。它在 30°C _66°C的溫度范圍和3. 85-6. 5的pH范圍生長。它消耗多種生物質(zhì)衍生的底物，包括單 糖葡萄糖和木糖、二糖纖維二糖和蔗糖以及多糖木聚糖和淀粉，但不包括纖維素。該生物體 產(chǎn)生乙醇以及有機(jī)酸乳酸和乙酸作為初級(jí)發(fā)酵產(chǎn)物。克隆和測(cè)序如先前對(duì)乳酸脫氫酶(L-ldh)的報(bào)道(DeSai，2004)，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定并測(cè) 序L-ldh、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(pta)和乙酸激酶(ack)基因。利用C0DE-H0P算法制備簡(jiǎn)并引 物(Rose, T. ；Schultz, E. ；Henikoff, J. ；Pietrokovski, S. ；McCallum, C. ；Henikoff, S. " Consensus-degeneratehybrid oligonucleotide primers for amplification of distantly-relatedsequences "( “用于遠(yuǎn)親緣序列擴(kuò)增的共同-簡(jiǎn)并混合寡核苷酸引 物，，)Nucleic Acids Research, 26 (7) 1628-1635，1 Apr 1998)并進(jìn)行 PCR 反應(yīng)以獲得保 守區(qū)之間的 DNA 序列。用 ThermoFidelas 酶(Fidelity Systems, Gaithersburg, MD)和 BigDye Terminator試劑盒v3. 1 (ABI，F(xiàn)oster CityCA)直接從基因組DNA中測(cè)序該保守區(qū) 外的基因片段。自殺載體的構(gòu)建乙酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶敲除載體，pS⑶9遵循標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)(Sambrook)。6.2 kb自殺載體pSGD9基于pBLUESCRIPT II SK(+) (Stratagene)，其使用與較早前報(bào)道(DeSai，2004 ；Mai, 2000)類似的設(shè)計(jì)方法。使用 引物對(duì)SEQ ID N0S 1-2和SEQID N0S :3_4從基因組DNA中擴(kuò)增pta/ack序列的基因片段 pta-up (約1. 2kb)和ack-down (約0. 6kb)。用pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。從1 %電泳
8凝膠中提取所述片段。然后用Taq聚合酶使片段pta-up和ack-down A_加尾，并將其克隆 到 T0P0 pCR2. 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)。從 pIKMl 的 Pstl/Xbal 消化物中獲得含有卡 那霉素標(biāo)志物的1. 5kb片段，并將其亞克隆到pBLUESCRIPT II SK(+)。將含有pta-up的 T0P0 用 XhoI/BsiHKAI 消化，并將其亞克隆到 XhoI/PstI 消化的 pBLUESCRIPT II SK (+)，且 位于先前亞克隆的卡那霉素標(biāo)志物的上游。將含有ack-down的T0P0用Xbal/SphI消化， 并亞克隆到pUC19 (Invitrogen)中。將含有ack-down的Xbal/Afllll片段消化并克隆到 卡那霉素標(biāo)志物下游以獲得最終的構(gòu)建體PSGD9。帶有紅霉素抗性的乳酸脫氫酶敲除載體，pS⑶8-Erm5. 5kb自殺載體pSGD8-Erm基于pSGD8質(zhì)粒，其如Desai et al. 2004所產(chǎn)生。基 于來自pIKMl質(zhì)粒的aph啟動(dòng)子和來自pCTCl質(zhì)粒的賦予紅霉素抗性的腺嘌呤甲基化酶基 因的融合基因代替了 aph卡那霉素抗生素標(biāo)志物(Klapatch，T. R. ；Guerinot, MX. ；Lynd, L. R. " Electrotransformation of Clostridium thermosaccharolyticum“(“熱角軍糖 梭菌的電轉(zhuǎn)化法”)J. Ind. Microbiol. 16(6) :342_7，June 1996)而被用于選擇。使用pfu 聚合酶(Stategene)針對(duì)aph啟動(dòng)子的引物SEQ ID N0S :5_6和針對(duì)腺嘌呤甲基化酶開放 閱讀框的引物SEQ ID N0S 7-8產(chǎn)生PCR基因片段。用Xbal/BamHI (aph片段)和BamHI/ EcoRI (腺嘌呤甲基化酶)消化片段，并將其連接到pIKMl的多克隆位點(diǎn)。然后用BseRI/ EcoRI將該融合基因切離并連接到類似消化的pS⑶8中。解糖熱厭氧桿菌的轉(zhuǎn)化可交替地使用兩種方法進(jìn)行解糖熱厭氧桿菌的轉(zhuǎn)化，第一種方法如先前所描述 (Mai,V. ；Lorenz,W. ；Weigel,J. “ Transformation ofThermoanaerobacterium sp. strain JW/SL-YS485 with plasmid PIKMlconf erring kanamycin resistance"( “用賦予卡 那霉素抗性的質(zhì)粒PIKMl轉(zhuǎn)化熱厭氧菌菌株JW/SL-YS485”)FEMS Microbiol. Lett. 148 163-167，1997)，第二種方法帶有在收獲細(xì)胞后的數(shù)種修改并基于為熱纖梭菌所幵發(fā)的方 法(Tyurin, M. V. ；Desai, S. G. ；Lynd, L. R. “ Electrotrans-formation of Clostridium thermocellum "("熱纖梭菌的電轉(zhuǎn)化法”)Appl. Environ. Microbiol. 70 (2) :883_890， 2004)。用預(yù)先還原的培養(yǎng)基DSMZ122，在保持在55°C的培養(yǎng)箱的厭氧室中讓細(xì)胞在無 菌一次性培養(yǎng)管中過夜生長。此后，用初始延滯期之后加入到培養(yǎng)基中的4 yg/ml細(xì)胞 壁弱化劑異煙酰胼(isoniacin)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)(Hermans，J. ；Boschloo, J. G.； de Bont, J. A. M. " Transformation of M. aurum byelectroporation :the use of glycine, lysozyme and isonicotinic acidhydrazide in enhancing transformation efficiency"( “用電穿孔法轉(zhuǎn)化金色分支桿菌甘氨酸、溶菌酶和異煙酰胼在增強(qiáng)轉(zhuǎn)化效 率中的用途”)FEMS Microbiol. Lett. 72，221-224，1990)。收獲指數(shù)期的細(xì)胞并用預(yù)先還原 的無菌冷200mM纖維二糖溶液洗滌，用同樣的溶液重懸并存于冰上。收獲細(xì)胞后應(yīng)特別注 意隨時(shí)保持冷卻(約4°C )，包括離心期間。將由90 ill細(xì)胞懸浮液和就在脈沖應(yīng)用前加入的2 ill至6 ii IpS⑶9或 pS⑶8-Erm(l ugM3ug)構(gòu)成的樣品放置于用作電轉(zhuǎn)杯的無菌一次性2ml聚丙烯微離心管 中。使用定制的脈沖生成器/鈦電極系統(tǒng)，采用設(shè)置在10ms脈沖寬度的方波。當(dāng)脈沖電壓 以200V的增量線性增加時(shí)，將對(duì)應(yīng)于細(xì)胞樣品電穿孔形成的電壓閾值計(jì)算成非線性電流 變化。使用提供在給定DNA濃度下，轉(zhuǎn)化產(chǎn)率對(duì)細(xì)胞存活率的最佳比的特定電壓，其在該特
9定情況是25kV/cm。經(jīng)脈沖的細(xì)胞先被500 u 1 DSM122培養(yǎng)基稀釋，保持在冰上10分鐘，然 后在55°C下復(fù)性4-6小時(shí)。復(fù)性后，將經(jīng)pS⑶9轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與含有75ii g/ml卡那霉素的 2%瓊脂培養(yǎng)基混合，并傾入皮氏培養(yǎng)皿，并在厭氧罐中孵育4天。使經(jīng)pS⑶8-Erm轉(zhuǎn)化的 細(xì)胞在48°C復(fù)性4-6小時(shí)，接種于pH6. 0的含有5 u g/ml紅霉素的2%瓊脂培養(yǎng)基或者類 似的液體培養(yǎng)基，并在厭氧罐中于48°C下孵育6天?？蔁o需進(jìn)一步操作而使用所述轉(zhuǎn)化細(xì) 胞系的任一一種。然而，通過進(jìn)行第二(順序的)轉(zhuǎn)化獲得了被消除了賦予產(chǎn)生有機(jī)酸的 能力的所有基因表達(dá)的生物體。使用第一轉(zhuǎn)化體代替未轉(zhuǎn)化細(xì)胞懸浮液，如上所述進(jìn)行了 第二次轉(zhuǎn)化。在同時(shí)含有卡那霉素和紅霉素的培養(yǎng)基中使第二轉(zhuǎn)化體ALK1生長。敲除區(qū)的測(cè)序用Taq聚合酶(New England Biolabs)和基因組與自殺載體間的同源重疊區(qū)外 的引物，通過基因組DNA的PCR完成位點(diǎn)定向敲除區(qū)域的測(cè)序。PCR產(chǎn)物內(nèi)的引物被用于 使用 BigDye Terminator 試劑盒 v3. 1 (ABI，F(xiàn)oster City, CA)的測(cè)序。用 CAP3 軟件程序 排列區(qū)域(Huang, X. “ An improved sequence assembly program"( “改良序列組合禾呈 序”)Genomics 33 =21-31,1996)并用CLUSTALW算法與所預(yù)期的DNA序列相比較(Higgins， D. G. ；Bleasby,A. J. ；Fuchs,R. " CLUSTAL V :improvedsoftware for multiple sequence alignment" ( "CLUSTAL V 改良的多序列排列軟件”)Computer Applications in the Biosciences (CABI0S), 8 (2) : 189-191，1992)。在實(shí)驗(yàn)所得序列和基于已知野生型和自殺載 體序列的預(yù)期序列之間存在著高度同源性(百分比一致性)?！耙恢滦浴笔侵负怂岱肿訉?duì)或者氨基酸分子對(duì)之間的比較。已知確定序列一致性 的方法。見，例如，為此目的經(jīng)常采用的諸如Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package (威斯康星序列分析包)，Version8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wisconsin)的計(jì)算機(jī)禾呈序，其使用 Smith and Waterman, 1981，Adv. Appl. Math. 2 :482_489 所述的算法。突變菌株的驗(yàn)證通過DNA測(cè)序，突變菌株解糖熱厭氧桿菌JW/SL-YS485ALK1 (“ ALK1 “)的基因組 DNA顯示了在L-ldh和pta/ack基因座的預(yù)期的位點(diǎn)定向同源重組。兩次整合事件都是雙 整合，其是在遺傳上更穩(wěn)定的基因型。實(shí)施例2表明ALK1和野生型解糖熱厭氧桿菌的乙醇產(chǎn)生的比較性數(shù)據(jù)使解糖熱厭氧桿菌在含有2. 5g/L酵母提取物的成分部分確定的MTC培養(yǎng) 基中生長(Zhang, Y. ；Lynd, L. R. “ Quantification of cell andcellulase mass concentrations during anaerobic cellulose fermentation :development of an enzyme-linked immunosorbent assay-based methodwith application to Clostridium thermocellum batch cultures"(“纖維素厭氧發(fā)酵期間細(xì)胞和纖維素酶質(zhì)量濃度的 定量應(yīng)用于熱纖梭菌分批培養(yǎng)的基于酶聯(lián)免疫吸收劑的方法的開發(fā)”)Anal. Chem. 75 219-222，2003)。通過 HPLC 在 Aminex 87H 柱(BioRad Laboratories, Hercules, CA)上 于55°C下分析葡萄糖、木糖、乙酸、乳酸和乙醇。流動(dòng)相由0. 7ml/min流速下的5mM硫酸構(gòu) 成。用Waters 410折射計(jì)(Milford，MA)通過折射率進(jìn)行檢測(cè)。乙酸鹽的最低檢測(cè)水平是 1. OmM。圖5表明了含有5g/L木糖、5g/L乳酸、5g/L乙酸和5g/L乙醇的標(biāo)準(zhǔn)痕跡。
用高達(dá)17g/L的木糖，或者用5g/L的木糖和5g/L的葡萄糖，ALK1菌株只產(chǎn)生了 乙醇，并無可被HPLC檢測(cè)到的有機(jī)酸或其他產(chǎn)物。圖6表明了在0小時(shí)時(shí)間的ALK1菌株 發(fā)酵，而圖7表明了在72小時(shí)的同一發(fā)酵。ALK1和野生型菌株在用8g/L MES緩沖的木糖 培養(yǎng)基上、6. 0的初始pH值、55°C和lOOrpm下的時(shí)間進(jìn)程發(fā)酵圖顯示，ALK1菌株能夠?qū)⒊?過99%的木糖轉(zhuǎn)化為乙醇(圖8)，而相似條件下野生型由于有機(jī)酸的產(chǎn)生而受pH限制，并 且不能消耗所有存在的木糖(圖9)。野生型生物體產(chǎn)出0. 15mM乙醇，而ALK1產(chǎn)出0. 46mM 乙醇。實(shí)施例3ALK1 的進(jìn)化如圖10所示，用加料底物濃度隨時(shí)間升高的連續(xù)培養(yǎng)來刺激ALK1。圖10表明了 連續(xù)培養(yǎng)期間木糖、木酮糖和乙醇的濃度。在暴露于這種壓力進(jìn)化周期(stress-evolution cycle)超過1000小時(shí)之后，從發(fā)酵液分離出經(jīng)改進(jìn)的菌株ALK2。在分批培養(yǎng)中，ALK2能夠 在50g/L木糖下開始生長。圖11表明了 ALK2菌株發(fā)酵期間木糖、有機(jī)酸、光密度(0D)和 乙醇濃度。實(shí)施例4嗜熱同步糖化發(fā)酵通過40°C _45°C溫度下的SSF測(cè)試了一些耐熱酵母菌株的乙醇產(chǎn)生，在高于此溫 iSW/^^T^ (Banat, I. M. ；Nigam, P. ；Singh, D. ；Marchant, R. ；McHale, A. P. " Review Ethanol production at elevatedtemperatures and alcohol concentrations :Part I-Yeasts in general.“( “綜述在升高的溫度和乙醇濃度下的乙醇產(chǎn)生第一部分-酵 母總論，，)World Journal of Microbiology and Biotechnology 14:809-821,1998)。此 外，Patel等證實(shí)了利用芽孢桿菌菌株產(chǎn)生乳酸的50°C下SSF(Patel，M.A. ；0u, M. S.； Ingram, L. 0. ；Shanmugam, K. T. “ Simultaneoussaccharification and co-fermentation of crystalline cellulose and sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate to lactate by a thermoto 1 erantacidophi 1 ic Bacillus sp. " (ifiiiit^BW|if 從結(jié)晶纖維素和糖甘蔗渣半纖維素水解產(chǎn)物至乳酸鹽的同步糖化共發(fā)酵)Biotechnol. Prog. 21 1453-1460，2005)。然而，先前并未證實(shí)50°C下的嗜熱SSF在減少的酶需求下產(chǎn) 生乙醇。如上所述，如本公開所述的轉(zhuǎn)化的嗜熱生物體由于其對(duì)SSF方法中纖維素酶活性 基本上最適的生長條件，而具有有助于顯著地節(jié)約木質(zhì)纖維素生物質(zhì)至乙醇轉(zhuǎn)化的成本的 潛力。例如，ALK1和ALK2是可以在50°C和pH5. 0下生長的厭氧嗜熱菌，而對(duì)纖維素酶活性 最適的參數(shù)包括4至5的pH值和40°C至50°C的溫度。在50°C下于分批反應(yīng)器以1.5L級(jí)進(jìn)行的嗜熱同步糖化發(fā)酵(tSSF)反應(yīng)中，使 用4FPU/g里氏木霉(T. reesei)纖維素酶(Genencor, Palo Alto, CA)和ALK2從固體底物 Avicel (20g/L, 50g/L和80g/L)產(chǎn)生乙醇。16小時(shí)發(fā)酵后未測(cè)到可溶性糖，并且在任一試 驗(yàn)中產(chǎn)生的乳酸都低于0. 5g/L。圖12表明，用80g/L Avicel進(jìn)行tSSF反應(yīng)時(shí)，在140小 時(shí)內(nèi)產(chǎn)生了 30g/L乙醇，且在第一個(gè)50小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生了 30g/L乙醇中的25g/L。圖13表明了 圖12所示反應(yīng)的乙醇產(chǎn)率。產(chǎn)率的計(jì)算基于每克葡萄糖等價(jià)物0. 51g乙醇的理論最大值。 用20g/L Avicel，在140小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)了約90%的轉(zhuǎn)化。
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應(yīng)當(dāng)理解，解糖熱厭氧桿菌能將戊糖和己糖兩者發(fā)酵。因此，本文公開的生物體可 用于同步糖化共發(fā)酵(SSCF)反應(yīng)，其中將半纖維素轉(zhuǎn)化為戊糖的酶(例如，木聚糖酶)可 以和纖維素酶聯(lián)用。ALK1 的保藏ALK1已保藏于弗吉尼亞州馬納薩斯的美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas, VA 20110-2209)。2005 年 11 月 1 日提交保藏并獲得了專 利保藏命名第PTA-7206號(hào)。本保藏的提交符合布達(dá)佩斯協(xié)議的要求保藏應(yīng)當(dāng)持續(xù)至自保 藏日起三十(30)年或者向保藏處最后一次請(qǐng)求之后五(5)年或者至源自本申請(qǐng)的美國專 利的可實(shí)施期，以較長者為準(zhǔn)。保藏處的ALK1 —旦失去存活力，便重新提供ALK1。具體實(shí)施方案的描述表明了一般性概念，即他人可以修改和/或調(diào)整不偏離一般 性概念的各種應(yīng)用或用途。因此，該調(diào)整和修改應(yīng)當(dāng)并且意在被理解成在本文公開的實(shí)施 方案的等價(jià)物的含義和范圍之內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解，本文采用的措辭或術(shù)語是用于描述而非限制 的目的。前述的實(shí)施例可經(jīng)適當(dāng)修改用于任何革蘭氏陽性細(xì)菌，并且特別用于包括 ^ fti S ^ M ft Thermoanaerobacterium aotearoense> Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum、Thermoanaerobacteriumzeae、熱角軍糖熱厭氧菌禾口角軍木聚糖熱厭氧 桿菌的熱厭氧菌屬成員。在本申請(qǐng)中提及的所有文獻(xiàn)均通過與仿佛在本文完整復(fù)制相同的程度的引用而 并入本文。
權(quán)利要求
發(fā)酵纖維素水解底物的糖化產(chǎn)物從而以理論產(chǎn)率的至少90％的濃度產(chǎn)生乙醇的分離的生物體，其中所述生物體不表達(dá)丙酮酸脫羧酶。
2.產(chǎn)生乙醇的方法，所述方法包括轉(zhuǎn)化天然生物體以產(chǎn)生如權(quán)利要求1所述的分離的生物體，從而提供轉(zhuǎn)化的宿主；以及在適當(dāng)條件下，將所述轉(zhuǎn)化的宿主在培養(yǎng)基中培養(yǎng)足以允許底物的糖化和發(fā)酵的時(shí) 段，所述培養(yǎng)基含有所述底物，所述底物包括選自葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、 果糖、纖維二糖、蔗糖、麥芽糖、木聚糖、甘露聚糖、淀粉及其組合的物質(zhì)。
3.經(jīng)轉(zhuǎn)化的生物體，包括革蘭氏陽性細(xì)菌，所述革蘭氏陽性細(xì)菌在天然狀態(tài)含有至少 一個(gè)賦予所述革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物乙酸的能力的基因，所述革蘭氏陽性細(xì)菌經(jīng)轉(zhuǎn) 化消除了所述的至少一個(gè)基因的表達(dá)。
4.如權(quán)利要求3所述的革蘭氏陽性細(xì)菌，其中所述革蘭氏陽性細(xì)菌是熱厭氧菌 (Thermoanaerobacter)屬成員。
5.如權(quán)利要求3所述的革蘭氏陽性細(xì)菌，其中所述革蘭氏陽性細(xì)菌是解糖熱厭氧桿菌 (Thermoanaerobacterium saccharo1yticum)0
6.如權(quán)利要求3所述的革蘭氏陽性細(xì)菌，其中所述的至少一個(gè)基因編碼表達(dá)乙酸激酶。
7.如權(quán)利要求3所述的革蘭氏陽性細(xì)菌，其中所述的至少一個(gè)基因編碼表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶。
8.如權(quán)利要求3所述的革蘭氏陽性細(xì)菌，其中所述的至少一個(gè)基因包括多個(gè)基因。
9.如權(quán)利要求8所述的革蘭氏陽性細(xì)菌，其中所述多個(gè)基因表達(dá)編碼乙酸激酶和磷酸 轉(zhuǎn)乙酰酶。
10.如權(quán)利要求9所述的革蘭氏陽性細(xì)菌，其經(jīng)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化以消除一個(gè)或多個(gè)賦予所 述革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物乳酸的能力的基因的表達(dá)。
11.如權(quán)利要求3所述的革蘭氏陽性細(xì)菌，其經(jīng)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化以消除一個(gè)或者多個(gè)賦予 所述革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物乳酸的能力的基因的表達(dá)。
12.如權(quán)利要求11所述的革蘭氏陽性細(xì)菌，其中所述的至少一個(gè)基因編碼表達(dá)乳酸脫 氫酶。
13.產(chǎn)生乙醇的方法，所述方法包括轉(zhuǎn)化天然生物體以產(chǎn)生如權(quán)利要求11所述的革蘭氏陽性細(xì)菌，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細(xì)菌 宿主；以及在適當(dāng)條件下，將所述轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主在培養(yǎng)基中培養(yǎng)足以允許底物的糖化和發(fā)酵的 時(shí)段，所述培養(yǎng)基含有所述底物，所述底物包括選自葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳 糖、果糖、纖維二糖、蔗糖、麥芽糖、木聚糖、甘露聚糖、淀粉及其組合的物質(zhì)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述細(xì)菌宿主是解糖熱厭氧桿菌。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述基因編碼表達(dá)乳酸脫氫酶、乙酸激酶和磷酸 轉(zhuǎn)乙酰酶。
16.命名為ALK1且經(jīng)保藏而具有專利保藏命名第PTA-7206號(hào)的微生物的生物學(xué)純培養(yǎng)物。
17.分離的多聚核苷酸，包括(a)序列SEQ ID NO 10 ；(b)序列SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 10 ；或者(c)與所述序列(a)或(b)具有至少約90%序列一致性的序列。
18.如權(quán)利要求17所述的多聚核苷酸，其與所述序列(a)或(b)具有至少95%的序列 一致性。
19.包括如權(quán)利要求18所述的分離的多聚核苷酸的載體。
20.經(jīng)遺傳工程化而表達(dá)如權(quán)利要求18所述的多聚核苷酸的互補(bǔ)體的宿主細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求20所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
22.產(chǎn)生乙醇的方法，包括下列步驟在適當(dāng)條件下，將如權(quán)利要求21所述的突變細(xì)菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)足以允許底物發(fā)酵 成乙醇的時(shí)段，所述培養(yǎng)基含有所述底物，所述底物選自葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、 半乳糖、果糖、纖維二糖、蔗糖、麥芽糖、木聚糖、甘露聚糖、淀粉及其組合。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述突變細(xì)菌是解糖熱厭氧桿菌。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述突變細(xì)菌是解糖熱厭氧桿菌ALK1(JW/ SL-YS485 ALK1)。
25.包括可操作地連接到可在細(xì)菌中表達(dá)的啟動(dòng)子的SEQID NO :10的遺傳構(gòu)建體。
26.包括如權(quán)利要求25所述的遺傳構(gòu)建體的重組細(xì)菌。
27.如權(quán)利要求26所述的重組細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是解糖熱厭氧桿菌。
28.產(chǎn)生乙醇的方法，所述方法包括在反應(yīng)器中提供包含木質(zhì)纖維素底物、纖維素酶和發(fā)酵劑的反應(yīng)混合物，所述發(fā)酵劑 包括革蘭氏陽性細(xì)菌，其經(jīng)轉(zhuǎn)化而消除了至少一個(gè)賦予天然狀態(tài)的所述革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn) 生發(fā)酵產(chǎn)物乙酸的能力的基因的表達(dá)，其中使所述反應(yīng)混合物在適當(dāng)條件下反應(yīng)足以允許 所述木質(zhì)纖維素底物糖化和發(fā)酵的時(shí)段。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述適當(dāng)條件包括至少50°C的溫度。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述革蘭氏陽性細(xì)菌是熱厭氧菌屬成員。
31.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述革蘭氏陽性細(xì)菌是解糖熱厭氧桿菌。
32.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的至少一個(gè)基因編碼乙酸激酶的表達(dá)。
33.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的至少一個(gè)基因編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的表達(dá)。
34.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的至少一個(gè)基因包括多個(gè)基因。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述多個(gè)基因編碼表達(dá)乙酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，還包括轉(zhuǎn)化所述革蘭氏陽性細(xì)菌而消除一個(gè)或者多個(gè) 賦予所述革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物乳酸的能力的基因的表達(dá)。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的至少一個(gè)基因編碼表達(dá)乳酸脫氫酶。
38.如權(quán)利要求28所述的方法，還包括轉(zhuǎn)化所述革蘭氏陽性細(xì)菌而消除一個(gè)或者多個(gè) 賦予所述革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物乳酸的能力的基因的表達(dá)。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述的至少一個(gè)基因編碼表達(dá)乳酸脫氫酶。
全文摘要
本文公開了消耗多種生物質(zhì)衍生的底物的嗜熱突變生物體。本文公開了消除乙酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶表達(dá)的解糖熱厭氧桿菌菌株。此外，ALK1菌株經(jīng)位點(diǎn)定向同源重組被工程化而敲除了乙酸和乳酸兩者的產(chǎn)生。涉及底物濃度刺激的連續(xù)培養(yǎng)導(dǎo)致了ALK1的進(jìn)化，并形成了命名為ALK2的更為強(qiáng)力的菌株。所述生物體可以用于，例如，在對(duì)纖維素酶活性最適的溫度下進(jìn)行的嗜熱SSF和SSCF反應(yīng)，以產(chǎn)生近于理論的乙醇產(chǎn)率，而不表達(dá)丙酮酸脫羧酶。
文檔編號(hào)C12P7/06GK101868548SQ200780019959
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2007年5月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月1日
發(fā)明者亞瑟·約瑟夫斯·肖, 卡拉·波德卡米納, 大衛(wèi)·安東尼·霍格賽特, 李·R·林德, 米哈伊爾·V·秋林, 約翰·巴德斯利, 蘇尼爾·G·德賽 申請(qǐng)人:達(dá)特默斯大學(xué)托管會(huì);麥斯科瑪公司