專(zhuān)利名稱(chēng)：：基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種由厭氧性微生物構(gòu)成的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體可用作實(shí)體瘤治療劑，所述厭氧性微生物能夠在處于厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)生長(zhǎng)，并且能夠表達(dá)(A)具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)、或(B)具有將抗肺瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗胂瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明還涉及含有根據(jù)該方法制備的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的藥物組合物，以及含有該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的實(shí)體瘤治療劑。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，對(duì)使用基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體治療惡性肺瘤的方法進(jìn)行了各種研究，例如，對(duì)于厭氧菌梭菌(Clostridium),公開(kāi)了使用了轉(zhuǎn)化菌的針對(duì)腫瘤部位的基因轉(zhuǎn)運(yùn)方法(例如，參照專(zhuān)利文獻(xiàn)l、2)。同樣的，對(duì)于厭氧菌雙歧桿菌(Bifidobacterium),期待將該菌的轉(zhuǎn)化子作為益生菌(Probiotics)或感染性疾病口服疫苗的載體的應(yīng)用(例如，參照專(zhuān)利文獻(xiàn)3)，另外，對(duì)于長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum),由于該菌在全身給藥后蓄積在缺氧的實(shí)體瘤內(nèi)，因而提示其可以用于治療實(shí)體瘤(例如，參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)l、2)。另外，本發(fā)明人確認(rèn)通過(guò)使用重組質(zhì)粒pBLES100-S-eCD進(jìn)行轉(zhuǎn)化，能夠在重組微生物中表達(dá)胞嘧啶脫氨酶(EC3.5.4.1;以下稱(chēng)為"CD"),所述重組質(zhì)粒pBLES100-S-eCD具有與來(lái)源于長(zhǎng)雙歧桿菌的組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白的啟動(dòng)子融合的大腸桿菌codA，所述胞嘧啶脫氨酶是將具有抗腫瘤活性的5-氟尿嘧啶(以下稱(chēng)為"5-FU，，)的前藥(前體)5-氟胞嘧啶(以下稱(chēng)為"5-FC，，)轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶的酶，并報(bào)道了可以期待該重組微生物，例如重組長(zhǎng)雙歧桿菌，在酶-前藥療法中的應(yīng)用(例如，參照專(zhuān)利文獻(xiàn)4和非專(zhuān)利文獻(xiàn)3、4)。并且，為了將該CD表達(dá)基因重組微生物應(yīng)用到酶-前藥療法中，要求所述重組微生物對(duì)由CD從5-FC轉(zhuǎn)化的、至少是抗腫瘤活性有效濃度的5-FU有耐受性，因此，開(kāi)發(fā)了表達(dá)CD的5-FU耐受菌的制備方法，并進(jìn)行報(bào)道(例如，參照專(zhuān)利文獻(xiàn)5)。另一方面，對(duì)于這種CD,非專(zhuān)利文獻(xiàn)5報(bào)道了在大腸桿菌中，編碼CD的DNA內(nèi)，引入將該CD的第314位(對(duì)應(yīng)本發(fā)明的序列號(hào)28中的第315位)氨基酸從天冬氨酸替換為丙氨酸的突變之后，與突變前的野生型CD相比，突變的CD將5-FC轉(zhuǎn)化為5-FU的CD活性增強(qiáng)至約2.2倍(50/23)(參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)5Tablel.的中間部分)。針對(duì)在治療惡性腫瘤中使用的重組菌的轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了各種報(bào)道，在上述文獻(xiàn)中也報(bào)道了各種各樣的轉(zhuǎn)化菌的制備方法。例如，在專(zhuān)利文獻(xiàn)3中報(bào)道了一種轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括下列步驟利用來(lái)源于雙歧桿菌的質(zhì)粒和來(lái)源于大腸桿菌的質(zhì)粒制備在雙歧桿菌和大腸桿菌中被相互復(fù)制的穿梭質(zhì)粒的步驟、以及將編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的目標(biāo)基因連接到所述穿梭質(zhì)粒進(jìn)而制備重組載體的步驟；并且將制備所述穿梭質(zhì)粒時(shí)使用的雙歧桿菌用作被所述制備出的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。此外，例如，對(duì)于在構(gòu)建所述重組質(zhì)粒pBLES100-S-eCD時(shí)使用的穿梭質(zhì)粒pBLES100的制備方法，報(bào)道了由長(zhǎng)雙歧桿菌BK51的pTB6和大腸桿菌的pBR322構(gòu)建的制備方法(例如，參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)6)。并且，公開(kāi)了能夠以與該穿梭質(zhì)粒pBLES100相比超過(guò)100倍的高效率來(lái)轉(zhuǎn)化長(zhǎng)雙歧桿菌的質(zhì)粒pAVOOl和pBRASTA101的制備方法(例如，參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)7)。像這樣，雖然對(duì)可用于治療惡性腫瘤的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法進(jìn)行了各種報(bào)道，但是所有報(bào)道都是限定了在轉(zhuǎn)化中使用的微生物和質(zhì)粒等的方法，而轉(zhuǎn)化方法本身則使用普通的轉(zhuǎn)化技術(shù)，另外，這些方法也是以制備能夠在目標(biāo)患部表達(dá)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化微生物本身為目的的方法，例如制備能夠在目標(biāo)患部表達(dá)基因的轉(zhuǎn)化微生物的方法，所述基因?yàn)榫哂锌鼓[瘤活性的蛋白質(zhì)或具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的基因，至今還沒(méi)有報(bào)道以提高由目標(biāo)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)本身的活性或表達(dá)效率為目的的制備方法。專(zhuān)利文獻(xiàn)1:美國(guó)專(zhuān)利第6416754號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2:美國(guó)專(zhuān)利第6652849號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)3:日本專(zhuān)利特表2004-519236號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)4:日本專(zhuān)利特開(kāi)2002-97144號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)5:國(guó)際>布2006/109619號(hào)^St艮非專(zhuān)利文獻(xiàn)1:Yazawaetal.CancerGeneTher"7,269-274(2000)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2:Yazawaetal.BreastCancerRes.Treat,66,165-170(2001)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3:Nakamuraetal.,Biosci.Biotechnol.Biochem.,66，2362-2366(2002)非專(zhuān)利文獻(xiàn)4:Fujimorietal.,CumOpin.DrugDiscov.Devel.,5,200-203(2002)非專(zhuān)利文獻(xiàn)5:Sherietal.,ProteinEngineering,DesignandSelection,17(8):625畫(huà)633(2004)非專(zhuān)利文獻(xiàn)6:Matsumuraetal.,Biosci.Biotechnol.Biochem.，61,1211-1212(1997)非專(zhuān)利文獻(xiàn)7:Tanakaetal.,Biosci.Biotechnol.Biochem.,69(2):422-425(2005)
發(fā)明內(nèi)容迄今為止報(bào)道的可用于治療惡性肺瘤的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，均是以制備能夠在目標(biāo)患部表達(dá)目標(biāo)基因的重組菌本身為目的的方法，例如制備能夠在目標(biāo)患部表達(dá)基因的重組菌的方法，所述基因?yàn)榫哂锌鼓[瘤活性的蛋白質(zhì)或具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的基因，至今還沒(méi)有報(bào)道以提高由目標(biāo)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)本身的活性或表達(dá)效率為目的的制備方法。然而，在使用基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的治療方法中，由導(dǎo)入到轉(zhuǎn)化微生物中的基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的活性和表達(dá)效率都是重要的問(wèn)題，當(dāng)然需要由該轉(zhuǎn)化微生物的基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)具有與由原來(lái)的野生型微生物具有的基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)相同的活性，并且，與原來(lái)的微生物具有的基因相比，能夠同等地或更好地進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明的課題在于提供一種有效地制備基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的方法，該方法中，經(jīng)由轉(zhuǎn)化而導(dǎo)入的基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)活性和表達(dá)效率均良好。另夕卜，本發(fā)明的課題在于提供含有該制備方法制備的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的藥物組合物，以及含有該耐受菌的實(shí)體瘤治療劑。本發(fā)明人報(bào)道了制備轉(zhuǎn)化微生物的下列方法首先，選擇表達(dá)CD的基因作為目標(biāo)基因，所述CD在具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)中；作為整合該目標(biāo)基因的質(zhì)粒，將具有表達(dá)該CD的基因的大腸桿菌的質(zhì)粒與來(lái)源于長(zhǎng)雙歧桿菌的質(zhì)粒融合，制備質(zhì)粒pBLES100-S-eCD;發(fā)現(xiàn)可期待將使用該質(zhì)粒重組長(zhǎng)雙歧桿菌105A形成的長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pBLES100-S-eCD用作治療惡性腫瘤的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體；作為該制備方法，在通過(guò)整合目標(biāo)基因來(lái)制備該基因表達(dá)載體的工序中，使用與基因的表達(dá)有關(guān)的啟動(dòng)子，所述基因?yàn)榫幋a來(lái)源于長(zhǎng)雙歧桿菌的組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白質(zhì)(以下也稱(chēng)為"HU蛋白質(zhì)")的基因，通過(guò)將目標(biāo)基因整合在該啟動(dòng)子下游，進(jìn)而能表達(dá)目標(biāo)基因(專(zhuān)利文獻(xiàn)4)。本發(fā)明人對(duì)上述方法進(jìn)行了認(rèn)真研究，發(fā)現(xiàn)作為整合目標(biāo)基因的融合質(zhì)粒，將含有復(fù)制該質(zhì)粒時(shí)的必要部分、并且不包含在宿主范圍擴(kuò)大方面不理想的部分的片段進(jìn)行融合來(lái)制備質(zhì)粒，通過(guò)使用該質(zhì)?？商岣咿D(zhuǎn)化率，所述質(zhì)粒來(lái)源于大腸桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌的各種質(zhì)粒。另外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在與基因的表達(dá)有關(guān)的啟動(dòng)子下游整合目標(biāo)基因時(shí)，所述基因?yàn)榫幋a該宿主微生物的組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白的基因，該目標(biāo)基因必須在該基因的5'末端側(cè)具有編碼所述組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白N末端區(qū)域的DNA片段，并且，該DNA片^:必須含有編碼至少4個(gè)氨基酸的DNA片段。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在與編碼組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白的基因的表達(dá)有關(guān)的啟動(dòng)子下游整合目標(biāo)基因時(shí)，通過(guò)在該目標(biāo)基因DNA的5'末端側(cè)整合含有堿基序列的DNA片段，所述堿基序列編碼所述組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白N末端的第1位到至少第4位氨基酸序列，可以制備出與作為該目標(biāo)基因標(biāo)本來(lái)源的微生物相比，能夠同等地或更好地表達(dá)具有活性的蛋白質(zhì)的微生物，所述活性與作為該目標(biāo)基因標(biāo)本來(lái)源的微生物中的該基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))活性相同。并且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)載體的制備工序中，通過(guò)使被整合的目標(biāo)基因的DNA發(fā)生部分突變，可以產(chǎn)生具有更高活性的蛋白質(zhì)，另外進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，尤其是當(dāng)該目標(biāo)基因?yàn)楸磉_(dá)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)中的CD的基因時(shí)，通過(guò)使用5-氟尿嘧啶耐藥菌作為宿主厭氧性微生物，所述5-氟尿嘧啶耐藥菌至少具有抗腫瘤活性有效濃度的5-氟尿嘧啶耐藥性能，可以制備質(zhì)粒保持率高的基因重組微生物，從而完成了本發(fā)明。也就是說(shuō)，本發(fā)明涉及10[l]基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體由厭氧性微生物構(gòu)成，所述厭氧性微生物可以在處于厭氧環(huán)境下的肺瘤組織內(nèi)生長(zhǎng)，并且能夠表達(dá)(A)具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)、或(B)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗肺瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)，其特征在于，該方法包括制備融合質(zhì)粒的工序(1)，所述融合質(zhì)粒具有雙歧桿菌屬的質(zhì)粒片段和大腸桿菌的質(zhì)粒片段，在所述融合質(zhì)粒上整合含有啟動(dòng)子和終止子的DNA片段的工序(2)，所述啟動(dòng)子和終止子為來(lái)源于雙歧桿菌屬細(xì)菌的、編碼組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白的基因的啟動(dòng)子和終止子，在上述啟動(dòng)子和終止子之間整合DNA制備表達(dá)載體的工序(3)，所述DNA為(a)編碼具有抗胂瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA,以及使用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化厭氧性微生物的工序(4),在所述工序(3)的表達(dá)載體制備工序中被整合的、(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA是，在該DNA的5'末端側(cè)，進(jìn)一步具有含有堿基序列的DNA片段，所述堿基序列編碼由所述組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白N末端的第1位到至少第4位氨基酸序列構(gòu)成的肽；根據(jù)上述[1]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其中，組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白N末端的第1位到至少第4位氨基酸序列構(gòu)成的肽是，由序列號(hào)29的第1位到第4~18位中任意一位的氨基酸序列構(gòu)成的肽；根據(jù)上述[1]或[2]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其中，在工序(4)之前，還有使(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA發(fā)生突變的工序(5);根據(jù)上述[3]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其中，使(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA發(fā)生突變的工序(5)是使對(duì)工序(3)中制備的表達(dá)載體上整合的(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA發(fā)生突變的工序(5，)；根據(jù)上述[1][4]中任意一項(xiàng)記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是由厭氧性微生物構(gòu)成的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，所述厭氧性微生物可以在處于厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)生長(zhǎng)，并且能夠表達(dá)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)；根據(jù)上述[1卜[5]中任意一項(xiàng)記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其中，具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)是胞嘧啶脫氨酶；根據(jù)上述[6]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其中，由厭氧性微生物構(gòu)成的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是至少具有抗胂瘤活性有效濃度的5-氟尿嘧啶耐藥性能的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶/5-氟尿嘧啶耐藥菌；根據(jù)上述[7]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于，至少具有抗腫瘤活性有效濃度的5-氟尿嘧啶耐藥性能的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶/5-氟尿。密啶耐藥菌是，將至少具有抗胂瘤活性有效濃度的5-氟尿嘧啶耐藥性能的5-氟尿嘧啶耐藥菌用作宿主從而制備的；根據(jù)上述[1][8]中任意一項(xiàng)記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其中，含有編碼由組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白N末端的第l位到至少第4位氨基酸序列構(gòu)成的肽的堿基序列的DNA片段是，含有序列號(hào)14或15的從第1482位到至少第1493位的堿基序列的DNA片段；根據(jù)上述[9]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其中，含有序列號(hào)14或15的從第1482位到至少第1493位的堿基序列的DNA片段是，含有序列號(hào)15的從第1482位到第1493-1535中任意一位的堿基序列的DNA片段；根據(jù)上述[1][10]中任意一項(xiàng)記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其中，厭氧性微生物是細(xì)菌；根據(jù)上述[11]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其中，細(xì)菌是腸道細(xì)菌；根據(jù)上述[12]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其中，腸道細(xì)菌是雙歧桿菌屬細(xì)菌；根據(jù)上述[13]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其中，雙歧桿菌屬細(xì)菌選自下列雙歧桿菌屬細(xì)菌中的任意一種青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)、嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacteriumthermophilum)、卡支長(zhǎng)只又歧斥干菌(Bifidobacteriumpseudolongum)、兩歧只又歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)、以及長(zhǎng)雙歧才干菌(Bifidobacteriumlongum);根據(jù)上述[13]或[14]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于雙歧桿菌屬細(xì)菌是長(zhǎng)雙歧桿菌；中任意一項(xiàng)記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其中，在工序(4)的轉(zhuǎn)化中使用的表達(dá)載體是質(zhì)粒pAV001-HU-eCD的單堿基突變導(dǎo)入質(zhì)粒；根據(jù)上述[16]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其中，質(zhì)粒pAV001-HU-eCD的單堿基突變導(dǎo)入質(zhì)粒中編碼CD的堿基序列是，編碼氨基酸序列的堿基序列，所述氨基酸序列是序列號(hào)28中記錄的大腸桿菌CD的氨基酸序列中與第315位相對(duì)應(yīng)的氨基酸天冬氨酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列；根據(jù)上述[17]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其中，其他氨基酸是丙氨酸；根據(jù)上述[18]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其中，質(zhì)粒pAV001-HU-eCD的單石威基突變導(dǎo)入質(zhì)粒是質(zhì)粒pAV001-HU-eCD-M968。另外，本發(fā)明涉及由表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的厭氧性微生物構(gòu)成的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中，所述表達(dá)載體具有雙歧桿菌屬細(xì)菌的質(zhì)粒的片段、大腸桿菌的質(zhì)粒的片段、以及來(lái)源于雙歧桿菌屬細(xì)菌且含有編碼組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白的基因的啟動(dòng)子和終止子的DNA片段，在所述啟動(dòng)子和終止子之間具有(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA,并且在(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA的5'末端側(cè)，進(jìn)一步具有含有堿基序列的DNA片段，所述堿基序列編碼由所述組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白N末端的第1位到至少第4位氨基酸序列構(gòu)成的肽；通過(guò)上述[1][19]中任意一項(xiàng)的制備方法制備的厭氧性微生物的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，所述厭氧性微生物可以在處于厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)生長(zhǎng)，并且具有(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA;根據(jù)上述[20]或[21]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中，厭氧性微生物是雙歧桿菌屬細(xì)菌；根據(jù)上述[22]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)栽體，其中，雙歧桿菌屬細(xì)菌選自下列雙歧桿菌屬細(xì)菌中的任意一種青春雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌、假長(zhǎng)雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、以及長(zhǎng)雙歧桿菌；根據(jù)上述[22]或[23]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中，雙歧桿菌屬細(xì)菌是長(zhǎng)雙歧桿菌；根據(jù)上述[20][24]中任意一項(xiàng)記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體可以在處于厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)生長(zhǎng)，并且可以表達(dá)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗胂瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)；根據(jù)上述[25]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中，具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)是胞嘧啶脫氨酶；根據(jù)上述[26]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是至少具有抗腫瘤活性有效濃度的5-氟尿嘧啶耐藥性能的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶/5-氟尿嘧啶耐藥菌；根據(jù)上述[26]或[27]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是長(zhǎng)雙歧桿菌105-A/pAV001-HU-eCD的質(zhì)粒單石威基突變體；根據(jù)上述[28]記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中，長(zhǎng)雙歧桿菌105-A/pAV001-HU-eCD的質(zhì)粒單堿基突變體是長(zhǎng)雙歧桿菌105-A/pAVOO1-HU-eCD-M968。并且，本發(fā)明涉及藥物組合物，其含有根據(jù)上述[20][29]中任意一項(xiàng)記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體；藥物組合物，其組合有根據(jù)上述[25][29]中任意一項(xiàng)記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體、以及被該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體能夠表達(dá)的上述蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的抗胂瘤物質(zhì)前體；根據(jù)上述[31]記載的藥物組合物，其中，所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是根據(jù)上述[25][29]中任意一項(xiàng)記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，抗腫瘤物質(zhì)前體是5-氟胞嘧咬。并且進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及實(shí)體瘤治療劑，其含有用于表達(dá)具有有效治療量的抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的、足夠量的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是上述[20][24]中任意一項(xiàng)記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。實(shí)體瘤治療劑，其組合有用于表達(dá)能夠從抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為有效治療量的抗腫瘤物質(zhì)的量的所述蛋白質(zhì)的、足夠量的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，和被該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體能夠表達(dá)的所述蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化、且能夠轉(zhuǎn)化為有效治療量的抗腫瘤物質(zhì)的量的抗腫瘤物質(zhì)前體，所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是上述[29]中任意一項(xiàng)記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體；根據(jù)上述[34]記載的實(shí)體瘤治療劑，其中，所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是根據(jù)上述[25][29]中任意一項(xiàng)記載的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，抗腫瘤物質(zhì)前體是5-氟胞嘧啶。并且，在本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)中，(a)編碼具有抗肺瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗肺瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA,在以下有時(shí)也稱(chēng)為"編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA"。根據(jù)本發(fā)明，可以高效地制備蛋白質(zhì)活性和表達(dá)效率均良好的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，所迷蛋白質(zhì)是經(jīng)由轉(zhuǎn)化而導(dǎo)入的基因所表達(dá)的，該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體可用作實(shí)體瘤治療劑，由厭氧性微生物構(gòu)成，所述厭氧性微生物能夠在處于厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)生長(zhǎng)，并且能夠表達(dá)具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)、或具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)。對(duì)惡性肺瘤等的患者給予本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體時(shí)，作為本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的厭氧性^f敫生物在腫瘤內(nèi)增殖，從而表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)。當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)為具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)時(shí)直接發(fā)揮抗腫瘤效果，另一方面，當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)為具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)時(shí)，如果使基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體和抗腫瘤物質(zhì)前體在肺瘤部位共存，那么被該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)就將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)，從而發(fā)揮抗胂瘤效果。當(dāng)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)為CD時(shí)，作為抗腫瘤物質(zhì)前體優(yōu)選使用5-FC。由CD將5-FC轉(zhuǎn)化為5-FU,5-FU進(jìn)而發(fā)揮優(yōu)異的抗腫瘤效果。通過(guò)全身給藥的途徑全身性地給予能得到充分抗腫瘤效果的量的5-FU時(shí)，會(huì)產(chǎn)生全身性副作用，但是如果使用本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，可以將幾乎不產(chǎn)生副作用的5-FC腫瘤部位特異性地轉(zhuǎn)化為5-FU，因此與直接給藥5-FU的情況相比，可以在腫瘤內(nèi)實(shí)現(xiàn)非常高的5-FU濃度，其結(jié)果為可以得到極其優(yōu)異的抗腫瘤效果。但是，并不是只要利用表達(dá)CD的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體在腫瘤部位將5-FC轉(zhuǎn)化為5-FU,就能立刻得到可實(shí)用化水平的腫瘤治療劑。這樣的腫瘤治療劑的抗腫瘤效果和實(shí)用性很大程度地受3個(gè)要素的影響。即，作為基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的厭氧性微生物的菌體量、該厭氧性微生物發(fā)揮的CD活性的程度、腫瘤部位5-FC的濃度。雖然5-FC和厭氧性微生物的給藥量越多，就應(yīng)該得到越強(qiáng)的抗腫瘤效果，但是從盡量降低副作用的觀(guān)點(diǎn)出發(fā)，最好在得到必要的抗腫瘤效果的范圍內(nèi)盡量減少5-FC的給藥量，至少需要少于臨床確認(rèn)的用量。另夕卜，對(duì)于厭氧性微生物，從將對(duì)人體的影響降低到最小限度的觀(guān)點(diǎn)出發(fā)，無(wú)論使用毒性多么低的厭氧性微生物，最好在能夠得到必要的抗腫瘤效果的范圍內(nèi)盡量減少用量。根據(jù)這些情況，現(xiàn)有技術(shù)的抗腫瘤劑采用利用表達(dá)CD的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體在腫瘤部位將5-FC轉(zhuǎn)化為5-FU的方法，因此臨床水平上的實(shí)用性全都不夠。例如，在專(zhuān)利文獻(xiàn)4的實(shí)施例4中，小鼠的治療實(shí)驗(yàn)使用的5-FC的濃度為500mg/kg,在該濃度下能得到有效且足夠的抗腫瘤效果。但是，從共和藥品工業(yè)4朱式會(huì);^土的深部真菌病治療劑r:x3fvkancotil(含有曰本藥典氟胞嘧啶(Flucytosine)500mg)的用法和用量的記載"在真菌血癥、真菌性腦膜炎、真菌性呼吸系統(tǒng)感染癥、黑色真菌病中，通常作為氟胞嘧啶(Fluorocytosine)，1日100~200mg/kg分4次口服給藥。在尿路真菌病、消化道真菌病中，通常作為氟胞嘧啶，1日50100mg/kg分4次口服給藥。"中也得知，臨床試驗(yàn)中能實(shí)際確認(rèn)的5-FC的最大用量為200mg/kg。因此，為了利用專(zhuān)利文獻(xiàn)4實(shí)施例中使用的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)以5-FC的臨床用量(200mg/kg)來(lái)得到足夠的抗腫瘤效果，酶活性至少需要增強(qiáng)至2.5倍(—500/200)。另一方面，非專(zhuān)利文獻(xiàn)5雖然報(bào)道了大腸桿菌中，在編碼CD的DNA內(nèi)，引入將該CD的第314位(對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的序列號(hào)28中的第315位)氨基酸從天冬氨酸替換為丙氨酸的突變之后，與突變前的野生型CD相比，突變的CD將5-FC轉(zhuǎn)化為5-FU的CD活性(kcat/Km值)增強(qiáng)至約2.2倍(50/23),但是這種增強(qiáng)效果用于解決上述課題仍然是不夠的。但是，本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體中，使編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)CD的DNA的5'末端側(cè)進(jìn)一步具有含有堿基序列的DNA片段，所述堿基序列編碼由上述組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白N末端的第l位到至少第4位氨基酸序列構(gòu)成的肽，并且，使該CD的上述序列號(hào)28中第315位的天冬氨酸被丙氨酸替換后，完全出乎意料，該CD活性增強(qiáng)至約12倍。如果以上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)計(jì)算該CD活性12倍的增強(qiáng)，那么5-FC給藥量就為約42mg/kg，也就是說(shuō)在最小臨床用量(50mg/kg)以下即可，因此可以期待極高的實(shí)用性。因此，在本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體中，使編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)CD的DNA的5'末端側(cè)進(jìn)一步具有含有石威基序列的DNA片段，所述堿基序列編碼由上述組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白N末端的第1位到至少第4位氨基酸序列構(gòu)成的肽，并且，該CD的上述序列號(hào)28中第315位的天冬氨酸被丙氨酸替換的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體(例如長(zhǎng)雙歧桿菌105-A/pAV001-HU-eCD-M968)，期待其具有特別優(yōu)異的實(shí)用性。實(shí)際上，在人乳腺癌細(xì)胞林(KPL-1)移植棵鼠的治療系統(tǒng)中使用專(zhuān)利文獻(xiàn)4中使用的具有未發(fā)生突變的CD的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體(重組雙歧桿菌)時(shí)，能夠確認(rèn)為了在腫瘤內(nèi)從5-FC轉(zhuǎn)化為有效濃度的5-FU，必要的菌濃度為10CFU/g以上，但本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體中，進(jìn)一步通過(guò)本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)可以確認(rèn)，把該CD的上述序列號(hào)28中第315位的天冬氨酸被丙氨酸替換的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體用于相同的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中時(shí)，以上述菌濃度的百分之一的濃度105CFU/g,就可以得到相同的腫瘤內(nèi)5-FU濃度。圖l是表示長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU-eCD的制備過(guò)程的示意圖。圖2是表示長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU-eCD中CD活性(從5-FC轉(zhuǎn)化的5-FU的濃度)的示意圖。圖3是表示HU蛋白N末端添加2氨基酸的質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程的示意圖。圖4是表示2種作為5-FU耐受菌的長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU-eCD-M968的質(zhì)粒保持率的結(jié)果示意圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法是指由厭氧性微生物構(gòu)成的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，所述厭氧性微生物可以在處于厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)生長(zhǎng)，并且能夠表達(dá)(A)具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)、或(B)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)，其特征在于，該方法包括制備融合質(zhì)粒的工序(1),所述融合質(zhì)粒具有雙歧桿菌屬細(xì)菌的質(zhì)粒片段和大腸桿菌的質(zhì)粒片段，在所述融合質(zhì)粒上整合含有啟動(dòng)子和終止子的DNA片段的工序(2)，所述啟動(dòng)子和終止子為來(lái)源于雙歧桿菌屬細(xì)菌的、編碼組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白的基因的啟動(dòng)子和終止子，在上述啟動(dòng)子和終止子之間整合DNA制備表達(dá)載體的工序(3),所述DNA為(a)編碼具有抗肺瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗肺瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA，以及使用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化厭氧性微生物的工序(4),在所述工序(3)的表達(dá)載體制備工序中被整合的、(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗胂瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA是，在該DNA的5'末端側(cè)，進(jìn)一步具有含有堿基序列的DNA片段，所述堿基序列編碼由所述組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白N末端的第l位到至少第4位氨基酸序列構(gòu)成的肽。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法只要是下述方法，就沒(méi)有特別限制該方法包括制備融合質(zhì)粒的工序(1),所述融合質(zhì)粒具有雙歧桿菌屬細(xì)菌的質(zhì)粒片段和大腸桿菌的質(zhì)粒片段；在所述融合質(zhì)粒上整合含有啟動(dòng)子和終止子的DNA片段的工序(2)，所述啟動(dòng)子和終止子為來(lái)源于雙歧桿菌屬細(xì)菌的、編碼組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白的基因的啟動(dòng)子和終止子；在上述啟動(dòng)子和終止子之間整合DNA制備表達(dá)載體的工序(3),所述DNA為(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA;以及使用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化厭氧性微生物的工序(4);并且，該方法在所述工序(3)的表達(dá)載體制備工序中被整合的、U)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA是，在該DNA的5'末端側(cè)，進(jìn)一步具有含有堿基序列的DNA片段，所述堿基序列編碼由所述組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白N末端的第l位到至少第4位氨基酸序列構(gòu)成的肽。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法如果包括上述工序(1)工序(4)就沒(méi)有特別限制，只要不損害本發(fā)明的效果，也可以具有其他的任意工序。另外，在本發(fā)明基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法中，工序(2)和工序(3)的先后順序不受限制，可以按照(1)、(2)、(3)、(4)的順序具有這些工序，也可以按照(1)、(3)、(2)、(4)的順序具有這些工序。為方便起見(jiàn)，本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法中包含這兩種方式。特別是，在工序(3)的表達(dá)載體制備工序中，當(dāng)整合編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA時(shí)，作為使編碼該目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA的5'末端側(cè)具有編碼HU蛋白質(zhì)N末端區(qū)域的DNA片段的方式可為任意方式，例如，可以是下列方式在編碼該目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA的5'末端側(cè)添加整合編碼所述HU蛋白質(zhì)N末端區(qū)域的DNA片段，也可以是下列方式在編碼所述HU蛋白質(zhì)的DNA的中間位置整合編碼該目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA,再在編碼HU蛋白質(zhì)N末端區(qū)域的DNA和編碼HU蛋白質(zhì)C末端區(qū)i或的DNA之間插入編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA。并且，在工序(3)的表達(dá)載體制備工序中，使編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA5'末端側(cè)具有編碼HU蛋白質(zhì)N末端區(qū)域的DNA片段時(shí)的順序，只要能得到在編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA的5'末端側(cè)具有編碼HU蛋白質(zhì)N末端區(qū)域的DNA片段的表達(dá)載體，就沒(méi)有特別限制，例如，可以在使編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA的5'末端側(cè)具有編碼HU蛋白質(zhì)N末端區(qū)域的DNA片段之后，再將該DNA整合到融合質(zhì)粒上，也可以在融合質(zhì)粒上整合編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA之后，再將編碼HU蛋白質(zhì)N末端區(qū)域的DNA片段整合到編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA的5'末端側(cè)，還可以在融合質(zhì)粒上整合編碼HU蛋白質(zhì)N末端區(qū)域的DNA片段之后，再將編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA整合到編碼HU蛋白質(zhì)N末端區(qū)域的DNA片段的3'末端側(cè)。另夕卜，只要能得到本發(fā)明的效果，編碼HU蛋白質(zhì)N末端區(qū)域的DNA片段的3'末端側(cè)和編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA的5'末端側(cè)可以不直接結(jié)合在本發(fā)明的表達(dá)載體上，但優(yōu)選直接結(jié)合的方式。編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA的5'末端側(cè)具有的、編碼HU蛋白質(zhì)N末端區(qū)域的DNA片段如果太長(zhǎng)，那么表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)的性質(zhì)就有發(fā)生變化的可能性，因此從這個(gè)觀(guān)點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選盡量短的編碼HU蛋白質(zhì)N末端區(qū)域的DNA片段，但是如果太短又會(huì)降低蛋白質(zhì)的表達(dá)率，因此從這兩方面的觀(guān)點(diǎn)出發(fā)優(yōu)選采用平衡較好的適當(dāng)長(zhǎng)度。具體來(lái)說(shuō)，如果是含有堿基序列的DNA片段，所述堿基序列編碼所述HU蛋白質(zhì)N末端的第l位到至少第4位氨基酸序列構(gòu)成的肽，就沒(méi)有特別限制，但優(yōu)選為含有編碼所述HU蛋白質(zhì)N末端的第1位到第418位中任意一位的氨基酸序列所構(gòu)成的肽的堿基序列的DNA片段。在序列號(hào)29中記載了HU蛋白質(zhì)N末端的第1位到第18位的氨基酸序列。序列號(hào)29的氨基酸序列為序列號(hào)15的第1482位到1535位的堿基序列編碼的氨基酸序列。作為具有含有堿基序列的DNA片段的質(zhì)粒，所述堿基序列編碼HU蛋白質(zhì)N末端的第1位到第4位氨基酸序列構(gòu)成的肽，例如可以列舉pAV001-HU4aa-eCD(序列號(hào)14),作為具有含有堿基序列的DNA片段的質(zhì)粒，所述堿基序列編碼HU蛋白質(zhì)N末端的第l位到第9位氨基酸序列構(gòu)成的肽，可以列舉pAV001-HU-eCD(pAV001-HU9aa-eCD)，作為具有含有堿基序列的DNA片段的質(zhì)粒，所述堿基序列編碼HU蛋白質(zhì)N末端的第l位到第18位氨基酸序列構(gòu)成的肽，可以列舉pAV001-HU18aa-eCD(序列號(hào)15)。對(duì)使HU蛋白質(zhì)N末端區(qū)域的長(zhǎng)度變化的方法沒(méi)有特別限制，如后述的實(shí)施例中所采用的方法所示，根據(jù)HU蛋白質(zhì)N末端區(qū)域的序列設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊铮ㄟ^(guò)使用這些引物進(jìn)行PCR等方式，可以容易地得到所需氨基酸數(shù)量的N末端區(qū)域的序列。另外，本發(fā)明的制備方法具有下列特征在工序(1)中，使用具有雙歧桿菌屬細(xì)菌的質(zhì)粒的片段和大腸桿菌的質(zhì)粒的片段的融合質(zhì)粒，作為本發(fā)明中使用的雙歧桿菌屬細(xì)菌的質(zhì)粒的片段，優(yōu)選來(lái)源于長(zhǎng)雙歧桿菌的質(zhì)粒的片段，例如，可以列舉下列來(lái)源于pTB6的區(qū)域部分其含有pTB6的復(fù)制起點(diǎn)(oriV)(序列號(hào)14的堿基號(hào)3419-3778)-repB部分(序列號(hào)14的堿基號(hào)3983~4676),且不含有MembB、MobA、Orifl和oriT區(qū)域。另外，作為本發(fā)明使用的大腸桿菌質(zhì)粒的片段，可以列舉下列質(zhì)粒片段其含有大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)(ori)區(qū)域(序列號(hào)14的堿基號(hào)6356-6999),且不含有氨節(jié)西林抗性基因(ampR)、或缺失編碼作為氨芐西林抗性基因表達(dá)產(chǎn)物的P-內(nèi)酰胺酶區(qū)域的DNA。本發(fā)明的制備方法的工序(2)中使用的、來(lái)源于雙歧桿菌屬細(xì)菌的、編碼HU蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子和終止子，可以使用公知的方法得到。更具體地，可以根據(jù)雙歧桿菌屬細(xì)菌的公知HU蛋白質(zhì)的序列，通過(guò)克隆編碼該雙歧桿菌屬細(xì)菌的HU蛋白質(zhì)的基因，可以得到該基因的啟動(dòng)子和終止子。例如，作為含有來(lái)源于長(zhǎng)雙歧桿菌的、編碼HU蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子和終止子的序列，優(yōu)選地，可以分別列舉以序列號(hào)14或15的石威基號(hào)234~1481表示的DNA、以序列號(hào)14的堿基號(hào)2979~3098(序列號(hào)15的堿基號(hào)3021~3140)表示的DNA。制備作為本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的厭氧性微生物時(shí)，作為用本發(fā)明中的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的厭氧性微生物，只要能用于本發(fā)明就沒(méi)有特別限制，優(yōu)選為厭氧性細(xì)菌、更優(yōu)選為腸道細(xì)菌、進(jìn)一步優(yōu)選為雙歧桿菌屬細(xì)菌。作為雙歧桿菌屬細(xì)菌，例如可以列舉青春雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌、假長(zhǎng)雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌，最優(yōu)選長(zhǎng)雙歧桿菌。這些菌均為市售產(chǎn)品、或可以容易地從保藏機(jī)構(gòu)得到。例如，長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC-15707、兩歧雙歧桿菌ACTT-11863、嬰兒雙歧桿菌ATCC-15697等，可以容易地從ATCC(TheAmericanTypeCultureCollection)得到。另外，對(duì)于各種菌株沒(méi)有特別限制，例如對(duì)于長(zhǎng)雙歧桿菌的菌株可以列舉長(zhǎng)雙歧桿菌105-A抹、長(zhǎng)雙歧桿菌aE-194b林、長(zhǎng)雙歧桿菌bs-601抹、長(zhǎng)雙歧4干菌M101-2抹，其中優(yōu)選長(zhǎng)雙歧桿菌105-A才朱。對(duì)于短雙歧桿菌的菌纟朱，例如可以列舉短雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)才朱(JCM1192)、短雙歧桿菌aS-l抹和短雙歧桿菌I-53-8W林，其中優(yōu)選短雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)林、短雙歧桿菌aS-l4朱和短雙歧桿菌I-53-8W抹。對(duì)于嬰兒雙歧桿菌的菌抹，例如可以列舉嬰兒雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)抹(JCM1222)、嬰兒雙歧桿菌1-10-5抹，其中優(yōu)選嬰兒雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)抹和嬰兒雙歧桿菌I-10-5抹。另外，對(duì)于乳雙歧桿菌的菌林，例如可以列舉乳雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)林(JCM1220)。作為本發(fā)明中的具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)，例如可以列舉細(xì)胞因子，作為具體的細(xì)胞因子，例如可以列舉干擾素(IFN)-a、卩、y、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素(IL)-la、l卩、2、3、4、6、7、10、12、13、15、18、腫瘤壞死因子(TNF)-a、淋巴毒素(LT)-卩、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T細(xì)胞活化共刺激因子B7(CD80)和B7國(guó)2(CD86)、Kit-配體(Kit-ligand)、制瘤素M等。另外，還可以列舉內(nèi)皮抑制素、血管抑素(Angiostatin)、半胱氨酸巻曲區(qū)-1、2、3、4、5等血管生成抑制物質(zhì)。從各種各樣的生物中知道了這些蛋白質(zhì)的序列，根據(jù)其序列信息通過(guò)利用PCR法等爿A知方法，可以得到本發(fā)明中使用的、編碼具有抗胂瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA。另外，本發(fā)明中作為具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)，可以列舉將5-FC轉(zhuǎn)化為抗腫瘤活性物質(zhì)5-FU的酶CD。作為本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的工序(3)中被整合的DNA,可以是(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、和(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗肺瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA中的任意DNA,優(yōu)選為(b)編碼具有將抗肺瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗肺瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA，其中，特別優(yōu)選編碼將抗腫瘤物質(zhì)前體5-FC轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)5-FU的酶CD的DNA。這種編碼CD的DNA，例如，可以使用從下列質(zhì)粒中分離的DNA:含有編碼來(lái)源于大腸桿菌的CD的DNA的質(zhì)粒pAdex1CSCD(理化學(xué)研究所GeneBankRDBNo.1591)、或含有編碼同樣來(lái)源于大腸桿菌的CD的DNA的質(zhì)粒pMK116(D.A.Meadetal.，ProteinEngineering1:67-74(1986))。作為編碼來(lái)源于大腸桿菌的CD的DNA，例如對(duì)應(yīng)于序列號(hào)14的第1494位到第2774位的堿基序列(序列號(hào)15的第1536~2816位的堿基序列)，另外，作為該氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于從序列號(hào)28的氨基酸序列中除去起始蛋氨酸的氨基酸序列。本發(fā)明中的CD的來(lái)源沒(méi)有特別限制，可以使用編碼下列氨基酸序列的DNA:與序列號(hào)28的氨基酸序列具有例如卯％以上的同源性，更優(yōu)選為具有95%以上的同源性，并且具有CD活性的氨基酸序列。本發(fā)明中的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法雖然可以沒(méi)有使(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA發(fā)生突變的工序(5),但是從得到更優(yōu)異的抗肺瘤活性或?qū)⒖鼓[瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的觀(guān)點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選在工序(4)之前進(jìn)一步包含上述工序(5)。也就是說(shuō)，例如，可以在使編碼目標(biāo)基因的DNA發(fā)生突變后，在工序(3)中將該突變DNA整合到表達(dá)載體上，也可以在工序(3)中制備表達(dá)載體后，再使該編碼目標(biāo)基因的DNA部分發(fā)生突變。在工序(3)中制備表達(dá)載體后，使該編碼目標(biāo)基因的DNA部分發(fā)生突變的工序更具體來(lái)說(shuō)，是使整合在工序(3)中制備的表達(dá)載體上的、(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA發(fā)生突變的工序(5')。對(duì)突變的方法沒(méi)有特別限制，可以使用利用PCR的部位特異性突變法等公知的方法。發(fā)生突變時(shí)優(yōu)選的部位，由于目標(biāo)蛋白質(zhì)的差別故不能一概而論，但是當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)是大腸桿菌的CD時(shí)，優(yōu)選將序列號(hào)14中第24332435位的堿基序列(序列號(hào)15中的第24752477位的堿基序列)編碼的天冬氨酸替換成其他氨基酸，更優(yōu)選將序列號(hào)14中的第2433~2435位的石威基序列(序列號(hào)15中第2475~2477位的堿基序列)編碼的天冬氨酸替換成丙氨酸。序列號(hào)14中的第2433~2435位的石威基序列(序列號(hào)15中第24752477位的堿基序列)編碼的天冬氨酸對(duì)應(yīng)于序列號(hào)28的氨基酸序列的第315位的天冬氨酸。與沒(méi)有替換的情況相比，通過(guò)所述替換能夠發(fā)揮非常優(yōu)異的CD活性。作為本發(fā)明中的表達(dá)載體，例如，可以列舉整合有編碼CD的DNA的雙歧桿菌屬細(xì)菌用的CD表達(dá)載體，具體來(lái)說(shuō)，例如可以列舉具有插入長(zhǎng)雙歧桿菌hup啟動(dòng)子的下游的大腸斥干菌codA的重組質(zhì)粒pBLES100-S-eCD(參照專(zhuān)利文獻(xiàn)4和非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)、或改良該pBLES100-S-eCD得到的、能轉(zhuǎn)化長(zhǎng)雙歧桿菌或短雙歧桿菌的pAV001-HU-eCD(pAV001-HU9aa-eCD)或這些質(zhì)粒的突變體。這里，質(zhì)粒的突變體是指使整合到質(zhì)粒中的DNA,例如編碼CD的DNA發(fā)生突變的載體，與沒(méi)有發(fā)生突變的原載體相比能夠同樣或更加適合于使用。例如，pBLES100-S-eCD的突變體是指來(lái)源于pBLES100-S-eCD的質(zhì)粒DNA的突變體，并在本發(fā)明中與pBLES100-S-eCD相比能夠同樣或更加適合使用的質(zhì)粒。另外，pAV001-HU-eCD的突變體是指來(lái)源于pAV001-HU-eCD的質(zhì)粒DNA的突變體，并在本發(fā)明中與pAV001-HU-eCD相比能夠同樣或更加適合使用的質(zhì)粒。因此，作為質(zhì)粒的突變體，可以適當(dāng)列舉在質(zhì)粒pAV001-HU-eCD的CD編碼區(qū)域中引入單堿基突變的質(zhì)粒，即質(zhì)粒pAV001-HU-eCD-M968(序列號(hào)27)。質(zhì)粒pAV001-HU-eCD-M968中序列號(hào)14中的第2433~2435位堿基序列編碼的天冬氨酸被替換成丙氨酸，其結(jié)果為，CD活性顯著提高。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體如果是下列基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體就沒(méi)有特別限制其是由表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的厭氧性微生物構(gòu)成的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其中，所述表達(dá)載體具有雙歧桿菌屬細(xì)菌的質(zhì)粒的片段、大腸桿菌的質(zhì)粒的片段、以及含有來(lái)源于雙歧桿菌屬細(xì)菌且編碼組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白的基因的啟動(dòng)子和終止子的DNA片段，在所述啟動(dòng)子和終止子之間具有(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA,并且在(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA的5'末端側(cè)進(jìn)一步具有含有堿基序列的DNA片段，所述堿基序列編碼由所述組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白N末端的第l位到至少第4位氨基酸序列構(gòu)成的肽。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體可以通過(guò)例如本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法制備。并且，本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，當(dāng)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA沒(méi)有發(fā)生突變時(shí)，編碼該蛋白質(zhì)的DNA在其5'末端側(cè)具有的、編碼由HU蛋白質(zhì)N末端的氨基酸序列構(gòu)成的肽的DNA,可以除去編碼由HU蛋白質(zhì)N末端的第1位到第9位的氨基酸序列構(gòu)成的肽的DNA。另外，本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體中的(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA，可以是沒(méi)有發(fā)生突變的DNA，但是優(yōu)選與突變前的DNA編碼的蛋白質(zhì)的活性相比，發(fā)生了突變的DNA編碼的蛋白質(zhì)的抗腫瘤活性或?qū)⒖鼓[瘤前體轉(zhuǎn)化為抗胂瘤物質(zhì)的活性提高的突變DNA。作為使用具有發(fā)生了突變的編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA的表達(dá)載體得到的本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，可以列舉長(zhǎng)雙歧桿菌105-A/pAV001-HU-eCD的質(zhì)粒單堿基突變體，其中特別地，可以適當(dāng)列舉長(zhǎng)雙歧桿菌105-A/pAV001-HU-eCD-M968。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法包括使用整合有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA的表達(dá)載體來(lái)轉(zhuǎn)化厭氧性微生物的工序。轉(zhuǎn)化微生物的制備方法可按照市售的實(shí)驗(yàn)書(shū)籍記載的方法進(jìn)行，例如基因手冊(cè)(講談社)、高木康敬編基因操作實(shí)驗(yàn)法(講談社)、MolecularCloning(ColdSpringHarborLaboratory)(1982)、MolecularCloning,2nded.(ColdSpringHarborLaboratory)(1989)、MethodsinEnzymol.，194(1991)等。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體中(b)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)為CD時(shí)，把該CD表達(dá)基因重組微生物應(yīng)用于酶-前藥療法時(shí)，需要對(duì)被CD從5-FC轉(zhuǎn)化的5-FU,至少是對(duì)抗胂瘤活性有效濃度的5-FU具有耐受性。然而，使用表達(dá)CD的基因重組微生物，根據(jù)專(zhuān)利文獻(xiàn)5的實(shí)施例1記載的馴化培養(yǎng)方法制備5-FU耐受菌時(shí)，質(zhì)粒保持率有下降的趨勢(shì)。但是，在本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體制備方法中，根據(jù)專(zhuān)利文獻(xiàn)5的實(shí)施例2記載的馴化培養(yǎng)方法，首先對(duì)于作為宿主的厭氧性微生物，制備至少具有抗腫瘤活性有效濃度的5-FU耐受菌，并將其用作宿主，通過(guò)這樣可以制備質(zhì)粒保持率高的基因重組微生物。本發(fā)明的藥物組合物如果含有本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體就沒(méi)有特別限制。另外，本發(fā)明的實(shí)體瘤治療藥物如果含有本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體就沒(méi)有特別限制。本發(fā)明的藥物組合物或?qū)嶓w瘤治療劑也可以含有1種或2種以上的本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。另外，本發(fā)明的藥物組合物或?qū)嶓w瘤治療劑的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的給藥量，只要是對(duì)于表達(dá)能夠在腫瘤部位生長(zhǎng)、且具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)具有足夠給藥量，或?qū)τ诒磉_(dá)能將抗肺瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的量的蛋白質(zhì)具有足夠給藥量，就沒(méi)有特別限制，但從經(jīng)濟(jì)上的觀(guān)點(diǎn)和盡可能避免副作用的觀(guān)點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選在可以得到必要的抗腫瘤活性的范圍內(nèi)采用盡量少的給藥量。另外，還可根據(jù)疾病的程度、患者的體重、年齡、性別來(lái)適當(dāng)選擇本發(fā)明的藥物組合物或?qū)嶓w瘤治療劑的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的給藥量，并根據(jù)改善的程度適當(dāng)增減給藥量。并且，本發(fā)明的藥物組合物或?qū)嶓w瘤治療劑只要不影響本發(fā)明的效果，也可以含有除本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體之外的任意成分。作為這樣的任意成分，例如可以列舉藥理學(xué)允許的載體、賦形劑、稀釋劑等。當(dāng)本發(fā)明的基因運(yùn)送載體或?qū)嶓w瘤治療劑為整合了基因的厭氧性細(xì)菌，所述基因能夠表達(dá)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)時(shí)，含有作為活性成分的該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的本發(fā)明的藥物組合物或?qū)嶓w瘤治療劑可以與抗肺瘤物質(zhì)前體組合使用，所述抗腫瘤物質(zhì)前體的量是能通過(guò)被該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為有效量的抗腫瘤物質(zhì)的量。含有作為活性成分的本發(fā)明的基因運(yùn)送載體的藥物組合物或?qū)嶓w瘤治療劑中雖然也可以含有該抗腫瘤物質(zhì)前體，但是作為含有該抗腫瘤物質(zhì)前體的藥物組合物，優(yōu)選與含有作為活性成分的本發(fā)明的基因運(yùn)送載體的藥物組合物或?qū)嶓w瘤治療劑組合^f吏用?？鼓[瘤物質(zhì)前體的給藥量可以根據(jù)組合使用的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體在腫瘤組織內(nèi)的生長(zhǎng)率和從抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率進(jìn)行適當(dāng)選擇。另外，與基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的給藥量同樣，也可以根據(jù)疾病的程度、患者的體重、年齡、性別來(lái)適當(dāng)選擇抗腫瘤物質(zhì)前體的給藥量，并根據(jù)改善的程度適當(dāng)增減給藥量。因此，當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物或?qū)嶓w瘤治療劑與抗肺瘤物質(zhì)前體組合使用時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物或?qū)嶓w瘤治療劑的給藥方法與含有抗腫瘤物質(zhì)前體的藥物組合物的給藥方法可以相同也可以不同，另外，可以同時(shí)給藥也可以間隔給藥，但是優(yōu)選在本發(fā)明的藥物組合物或?qū)嶓w瘤治療劑給藥后、在經(jīng)過(guò)本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)充分生長(zhǎng)的時(shí)間后，給予含有抗肺瘤物質(zhì)前體的藥物組合物。本發(fā)明中"使X和Y組合"可以包含以不同的形態(tài)組合X和Y的情況，也可以包含以相同的形態(tài)組合X和Y(例如含有X和Y的形態(tài))的情況。另外，以不同的形態(tài)組合X和Y的情況還可以包含X、Y的任意一方進(jìn)一步含有其他成分的情況。本發(fā)明的藥物組合物或?qū)嶓w瘤治療劑的劑型沒(méi)有特別限制，例如可以列舉含有本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的液體制劑或固體制劑。液體制劑可以采用下列方法制備精制本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體厭氧性菌的培養(yǎng)液，根據(jù)需要在該培養(yǎng)液中加入適當(dāng)?shù)纳睇}水、補(bǔ)液或藥物添加物并填充到安瓿或管瓶(Vial)中。另外，固體制劑可以采用下列方法制備在液體制劑中添加適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑并填充到安瓿或管瓶中，之后進(jìn)行冷凍干燥或L干燥，或者在液體制劑中添加適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑，經(jīng)冷凍干燥或L干燥之后填充到安瓿或管瓶中。作為本發(fā)明的藥物組合物或?qū)嶓w瘤治療劑的給藥方法，優(yōu)選為非口服給藥，例如可以進(jìn)行皮下注射、靜脈注射、局部注射、腦室內(nèi)給藥等，最優(yōu)選為靜脈注射。本發(fā)明的藥物組合物或?qū)嶓w瘤治療劑可以適用于厭氧性環(huán)境下的腫瘤，優(yōu)選適用于各種實(shí)體瘤。作為實(shí)體瘤，例如可以列舉大腸癌、腦瘤、頭頸部癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽嚢癌、膽管癌、胰腺癌、胰島細(xì)胞癌、絨毛膜癌、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、腎上腺皮質(zhì)癌、膀胱癌、睪丸癌、前列腺癌、睪丸瘤、卵巢癌、子宮癌、絨毛膜癌、曱狀腺癌、惡性類(lèi)癌瘤(Malignantcarcinoidtumor)、皮膚癌、惡性黑色素瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、維姆氏瘤(Wilms'stumor)、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、黑色素瘤、鱗狀上皮癌等。以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并非僅限于這些示例。長(zhǎng)雙歧桿菌105-A/pAV001-HU-eCD的制備(1)穿梭質(zhì)粒pAVOOl的構(gòu)建(質(zhì)粒的構(gòu)建)從長(zhǎng)雙歧桿菌和大腸桿菌的穿梭質(zhì)粒pBLES100(參照專(zhuān)利文獻(xiàn)4和非專(zhuān)利文獻(xiàn)7)通過(guò)PCR擴(kuò)增含有來(lái)自糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)的大觀(guān)霉素腺苦酸轉(zhuǎn)移酶(AAD盒)的序列，并亞克隆到PCR-BluntII-TOPO載體(Invitrogen株式會(huì)社制)中，制備PCRTOPO-Scal-AAD-Eam11051。并且，分別向正向引物中添加Scal、向反向引物中添加Eaml1051限制性酶切位點(diǎn)。如圖1所示，從Invitrogen公司購(gòu)入的克隆載體pGFPuv(DEFINITION:CloningvectorpGFPuv.ACCESSION:U62636VERSION:U62636.1GI:1490582)由GFPuv基因及其兩端的多克隆位點(diǎn)(MCSs)、氨節(jié)西林抗性基因、大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)構(gòu)成。將該pGFPuv的氨千西林抗性基因部位用限制性酶Eaml1051和Seal切割，制備切除的長(zhǎng)片段。同樣地使用限制性酶Eaml1051和Seal,制備含有切割了PCRTOPO-ScaI-AAD-Eaml1051的AAD盒的片段(約1100bp)。制備使用T4DNA連接酶連接了上述2個(gè)片段的pGFPuv-SpR。并且，在大腸桿菌中分別確認(rèn)制備的質(zhì)粒pGFPuv-SpR賦予了大觀(guān)霉素耐受性性質(zhì)、并且同時(shí)缺失了氨千西林抗性性質(zhì)。將pGFPuv-SpR用限制性酶Sail(存在于GFPuv基因上游的多克隆位點(diǎn)內(nèi))和Spel(存在于GFPuv基因下游的多克隆位點(diǎn)內(nèi))進(jìn)行消化，制備去除了GFPuv基因的質(zhì)粒pAVN。然后，根據(jù)來(lái)自長(zhǎng)雙歧桿菌的質(zhì)粒pTB6的完整堿基序列信息，將含有RepB、SDO、DDO、AT-richrepeats、DnaA-bindingmotifs的約1900bp的序列作為長(zhǎng)雙歧桿菌的質(zhì)粒復(fù)制單位進(jìn)行鑒定。從pTB6通過(guò)PCR擴(kuò)增含有長(zhǎng)雙歧桿菌的質(zhì)粒復(fù)制單位的約1900bp,制備亞克隆到PCR-BluntII-TOPO載體的PCRTOPO-Apal-1900-Scal。并且，分別向正向引物中添加Apal位點(diǎn)、向反向引物中添加Seal限制性酶切位點(diǎn)。使用T4DNA連接酶連接用限制性酶Apal和Seal消化pAVN后得到的長(zhǎng)片段(約2400bp)和同樣地用限制性酶Apal和Seal消化PCRTOPO-Apal-1900-Scal后得到的短片段(約1900bp),制備長(zhǎng)雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pAVOOl(約4300bp)。(2)CD基因表達(dá)載體pAVOO1-HU-eCD(表達(dá)載體的構(gòu)建)接著，用限制性酶HindIII和Spel切割pBLES100-S-eCD,提出含有HU基因啟動(dòng)子、來(lái)自大腸桿菌的CD基因和HU基因終止子的約2卯0bp片段。同樣地，在多克隆位點(diǎn)內(nèi)的限制性酶切割位點(diǎn)用HindIII和Spel切割穿梭質(zhì)粒pAVOOl得到的長(zhǎng)片段上，使用T4DNA連接酶連接上述約2900bp片段制備pAVOOl-HU-eCD(約7100bp)。(3)將CD基因表達(dá)載體pAVOOl-HU-eCD導(dǎo)入雙歧桿菌屬?gòu)脑贛RS培養(yǎng)基中于37。C厭氧條件下培養(yǎng)野生型長(zhǎng)雙歧桿菌得到的培養(yǎng)液中通過(guò)離心分離分離菌體，制備懸浮在適當(dāng)緩沖液中的菌體懸濁液。然后，使用非專(zhuān)利文獻(xiàn)2和3中記載的電穿孔法，將CD基因表達(dá)載體pAV001-HU-eCD導(dǎo)入上述菌體懸濁液中。以導(dǎo)入的重組長(zhǎng)雙歧桿菌(長(zhǎng)雙歧桿菌/pAVOO1-HU-eCD)在含有抗生素大觀(guān)霉素的瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形成為基礎(chǔ)進(jìn)4亍篩選。(4)長(zhǎng)雙歧桿菌/pAVOOl-HU-eCD中胞嘧啶脫氨酶酶活性；5-FC—5-FU的轉(zhuǎn)化活性的測(cè)定)將長(zhǎng)雙歧桿菌/pAV001-HU-eCD接種到含有抗生素大觀(guān)霉素的MRS培養(yǎng)基中，在37。C厭氧條件下傳代培養(yǎng)2天以上，從得到的培養(yǎng)液中通過(guò)離心分離分離菌體(2xl09CFU),在4.5mL的MRS培養(yǎng)基中再次懸浮。然后，添加0.5mL的5-FC(20mg/mL)使其最終濃度為2mg/mL，并在37。C厭氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在第0、4、8、18、24小時(shí)的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從培養(yǎng)液分別回收通過(guò)離心分離將菌體去除的上清部分，通過(guò)氣相色譜分析(5-FUGC-MS法，BML)測(cè)定轉(zhuǎn)化了的5-FU的濃度。測(cè)定結(jié)果如圖2所示。分析結(jié)果表明長(zhǎng)雙歧桿菌/pAV001-HU-eCD中，在第4小時(shí)后檢測(cè)出72.5嗎/mL的5-FU、在第24小時(shí)后檢測(cè)出165.4嗎/mL的5-FU。實(shí)施例1構(gòu)建將融合在eCDN末端區(qū)域的HU蛋白質(zhì)N末端區(qū)域的長(zhǎng)度改變?yōu)?個(gè)氨基酸、3個(gè)氨基酸、4個(gè)氨基酸的質(zhì)粒(圖3)。以同樣的方法構(gòu)建除去HU蛋白質(zhì)N末端的質(zhì)粒。此時(shí)，制備兩種翻譯起始密碼子來(lái)源于大腸桿菌JM101林的CD的翻譯起始密碼子ATG、來(lái)源于大腸桿菌K12林的CD的翻譯起始密碼子GTG。另夕卜，也構(gòu)建將融合在eCDN末端區(qū)域的HU蛋白質(zhì)N末端區(qū)域的長(zhǎng)度改變?yōu)?8個(gè)氨基酸的質(zhì)粒。表1中顯示了質(zhì)粒的構(gòu)建部分的序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>粗體字部分為添加到CD的N末端的添加序列。(1)構(gòu)建HU蛋白質(zhì)N末端添加2個(gè)氨基酸的質(zhì)粒以pAVOOl-HU-eCD50pg為模板，用PrimeSTARHSDNA聚合酶(夕力，,'4才林式會(huì)社制)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR片段A(約1.3kbp)和PCR片段B(約1.3kbp)。在PCR片段A的擴(kuò)增中使用以序列號(hào)1表示的外引物和以序列號(hào)2表示的內(nèi)引物，所述內(nèi)引物在5'末端具有與PCR片斷B末端重復(fù)的序列并含有與pAV001-HU-eCD互補(bǔ)的序列。PCR片段A在DNA末端含有來(lái)源于模板的HindIII位點(diǎn)。在PCR片段B的擴(kuò)增中使用以序列號(hào)3表示的外引物和以序列號(hào)4表示的內(nèi)引物，所述外引物在5'末端具有KspAI識(shí)別位點(diǎn)并含有與pAV001-HU-eCD互補(bǔ)的序列，所述內(nèi)引物在5'末端具有與PCR片斷A末端重復(fù)的序列且含有與pAV001-HU-eCD互補(bǔ)的序列。來(lái)源于HU蛋白質(zhì)的氨基酸序列的改變是通過(guò)內(nèi)引物進(jìn)行的。溫度條件是以98。C下10秒、55。C下5秒、72。C下1分20秒為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，在72。C下保溫30秒。用QIAquickPCRPurificationKit(林式會(huì)社*7y>制)純化PCR片段A和B后，等摩爾混合純化的PCR片段A和B。以純化PCR片段A和B的混合物lng為模板，在lxPrimeSTARbuffer、200|aMdNTPsmix、2.5uPrimeSTARHSDNA聚合酶混合液中，在不加入引物的狀態(tài)下，以98。C下10秒、72。C下1分30秒為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)反應(yīng)以連接PCR片段A和B。然后，添加外引物(序列號(hào)l和3)使最終濃度分別達(dá)到0.5^M，以98。C下10秒、55。C下5秒、72°C下2分40秒為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)反應(yīng)后，在72。C下保溫30秒得到連接PCR產(chǎn)物(約2.6kbp)。用l%SeaPlaque(R)GTG(R)瓊脂糖凝膠(lxTAEbuffer、0.5昭/ml溴化乙錠)分離連接PCR產(chǎn)物，切割2.6kbp的DNA片段。用QIAquick(R)GelExtractionKit從凝膠中提取連接PCR產(chǎn)物，用HindIII(FermentasUAB公司制)和KspAI(FermentasUAB公司制)進(jìn)行消化。用l%SeaPlaque(R)GTG(R)瓊脂糖凝膠(lxTAEbuffer、0.5嗎/ml溴化乙錠)分離，切割2.6kbp的DNA帶。用QIAquick(R)GelExtractionKit從凝膠中提取連接PCR產(chǎn)物。用HindIII(FermentasUAB公司制)和KspAI(FermentasUAB公司制)消化pAV001-HU-eCD載體后，用1。/。SeaPlaque(R)GTG(R)瓊脂糖凝膠(lxTAEbuffer、0.5嗎/ml溴化乙錠)分離，切割4.6kbp的DNA片段。然后，用QIAquick(R)GelExtractionKit從凝膠中提取載體DNA。混合之前的連接PCR產(chǎn)物，使載體和連接PCR產(chǎn)物的摩爾比為1:3，用RapidDNALigationKit(FermentasUAB公司制)進(jìn)行連接。使用連接產(chǎn)物進(jìn)行大腸桿菌JM109的轉(zhuǎn)化，并涂布到含有30|ig/ml大觀(guān)霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，在37。C下培養(yǎng)一晚，得到轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子在含有30嗎/ml大觀(guān)霉素的2xLB液體培養(yǎng)基中在37。C下培養(yǎng)一晚，用QIAprep(R)SpinMiniprepKit提取質(zhì)粒DNA(pAV001-HU2aa-eCD)。(2)構(gòu)建HU蛋白質(zhì)N末端添加3個(gè)氨基酸的質(zhì)粒除分別使用序列號(hào)5和4表示的引物作為PCR片段A和PCR片段B擴(kuò)增用內(nèi)引物以外，使用與構(gòu)建HU蛋白質(zhì)N末端添加2個(gè)氨基酸的質(zhì)粒相同的方法，構(gòu)建HU蛋白質(zhì)N末端添加3個(gè)氨基酸的質(zhì)粒(pAV001畫(huà)HU3aa國(guó)eCD)。(3)構(gòu)建HU蛋白質(zhì)N末端添加4個(gè)氨基酸的質(zhì)粒除分別使用序列號(hào)6和7表示的引物作為PCR片段A和PCR片段B擴(kuò)增用內(nèi)引物以外，使用與構(gòu)建HU蛋白質(zhì)N末端添加2個(gè)氨基酸的質(zhì)粒相同的方法，構(gòu)建HU蛋白質(zhì)N末端添加4個(gè)氨基酸的質(zhì)粒(pAVOO1-HU4aa-eCD)。pAVOO1-HU4aa-eCD的序列如序列號(hào)14所示。(4)構(gòu)建不含有HU蛋白質(zhì)N末端、且以ATG作為翻譯起始密碼子的質(zhì)粒除分別使用序列號(hào)8和9表示的引物作為PCR片段A和PCR片段B擴(kuò)增用內(nèi)引物以外，使用與構(gòu)建HU蛋白質(zhì)N末端添加2個(gè)氨基酸的質(zhì)粒相同的方法，構(gòu)建不含有HU蛋白質(zhì)N末端、且以ATG作為翻譯起始密碼子的質(zhì)粒(pAVOOl-HUOaaATG-eCD)。(5)構(gòu)建不含有HU蛋白質(zhì)N末端、且以GTG作為翻譯起始密碼子的質(zhì)粒除分別使用序列號(hào)10和11表示的引物作為PCR片段A和PCR片段B擴(kuò)增用內(nèi)引物以外，使用與構(gòu)建HU蛋白質(zhì)N末端添加2個(gè)氨基酸質(zhì)粒相同的方法，構(gòu)建不含有HU蛋白質(zhì)N末端、且以GTG作為翻譯起始密碼子的質(zhì)粒(pAV001-HU0aaGTG-eCD)。(6)構(gòu)建HU蛋白質(zhì)N末端18氨基酸的質(zhì)粒等摩爾混合具有互補(bǔ)序列、且5'末端被磷酸化的2種合成低聚DNA(序列號(hào)12、13),在0.1MNaCl存在下，通過(guò)65。C下5分鐘、45。C下5分鐘、37。C下IO分鐘、25。C下IO分鐘的梯度降溫使其退火以制作適配子。適配子的末端為Bspll9I位點(diǎn)。用Bspl191(FermentasUAB公司制)消化pAVOO1-HU-eCD載體，用CIAP(FermentasUAB公司制)進(jìn)行DNA末端的去磷酸化處理后，用RapidDNALigationKit(FermentasUAB公司制)與適配子進(jìn)行連接。使用連接產(chǎn)物進(jìn)行大腸桿菌JM109的轉(zhuǎn)化，并涂布到含有30嗎/ml大觀(guān)霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，在37。c下培養(yǎng)一晚，得到轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子在含有30|ig/ml大觀(guān)霉素的2xLB液體培養(yǎng)基中在37。C培養(yǎng)一晚，用QIAprep(R)SpinMiniprepKit提取質(zhì)粒DNA(pAV001-HU18aa-eCD)。pAV001-HU18aa-eCD的序列如序列號(hào)15所示。(長(zhǎng)雙歧桿菌105A的轉(zhuǎn)化)將80^1長(zhǎng)雙歧桿菌105A感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒DNA5pd(500-1000ng)混合，用基因脈沖儀II電穿孔系統(tǒng)(GenePulserIIelectroporationsystem)(曰本Z才，yK，水，卜y—乂林式會(huì)社制)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。涂布到含有15。/。D-棉籽糖、30|xg/ml大觀(guān)霉素的IWATA瓊脂培養(yǎng)基上后，在37°C厭氧條件下培養(yǎng)2晚，得到轉(zhuǎn)化子。(從長(zhǎng)雙歧桿菌105A轉(zhuǎn)化子中提取蛋白質(zhì))在5mlMRS液體培養(yǎng)基(含有30|ag/ml大觀(guān)霉素、半胱氨酸-維生素C混合液)上接種轉(zhuǎn)化子，在37。C厭氧條件下培養(yǎng)一晚。將1%的培養(yǎng)液繼續(xù)接種到相同培養(yǎng)基上，在37。C厭氧條件下培養(yǎng)一晚，重復(fù)2次操作。將1%的該培養(yǎng)液添加到相同培養(yǎng)基中，使用培養(yǎng)約18小時(shí)后的培養(yǎng)物進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。在l~4ml培養(yǎng)液中添加4mlTris緩沖液(0.5MTris-HCl,0.5%TritonX100，pH8.4)并混合后，在13000xg、室溫條件下進(jìn)行15分鐘離心分離，除去上清液。在菌體中添加5ml相同的Tris緩沖液混懸后在13000xg、室溫條件下進(jìn)行15分鐘離心分離，并除去上清液，重復(fù)進(jìn)行該操作2次，以進(jìn)行菌體的洗滌。將洗凈菌體混懸在含有5(Hd蛋白酶抑制劑(、〉/77V^K卩7f)的Tris緩沖液lml中，在冰冷卻條件下進(jìn)行5分鐘超聲破碎。在13000xg、4。C條件下進(jìn)行20分鐘離心分離，將上清液作為總蛋白質(zhì)提耳又液用于CD活性的測(cè)定。(CD活性的測(cè)定)用Lowry法改良法測(cè)定總蛋白量，在相當(dāng)于總蛋白量50嗎的總蛋白質(zhì)提取液中添加緩沖液至250)il，與250|il40mM5-FC混合后在60。C條件下反應(yīng)20分鐘。添加250(J0.5M三氯乙酸使反應(yīng)停止，放置在冰中。在20000xg、4。C條件下進(jìn)行離心分離20分鐘，在450pl上清液中加入150|il0.3MNaOH以中和溶液。用HPLC的流動(dòng)相將中和后的樣品稀釋10倍，用HPLC測(cè)定5-FU和5-FC的含量。以5-FC的消耗％作為CD活性?；钚詼y(cè)定結(jié)果如表2所示。[表2]來(lái)源于HU蛋白質(zhì)N末端的氨基酸添加到CD中的效果轉(zhuǎn)化子名稱(chēng)CD活性5-FC消耗(°/0)/50昭總蛋白質(zhì)長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU0aaATG1.89長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU0aaGTG1.08長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU2aa-eCD0.64長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU3aa-eCD2.80長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU4aa-eCD6.35長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU-eCD(對(duì)照)5.50長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU18aa-eCD6.48明確了來(lái)源于HU蛋白質(zhì)N末端的氨基酸添加到eCD中會(huì)提高CD活性。添加的氨基酸數(shù)量在2個(gè)以下則沒(méi)有效果，3個(gè)則略有效果，4個(gè)以上則大幅增加、4個(gè)18個(gè)之間活性沒(méi)有差異。實(shí)施例2在質(zhì)粒pAV001-HU-eCD上的5個(gè)位置進(jìn)行突變引入。突變引入的類(lèi)型分為3個(gè)堿基的缺失和1個(gè)堿基的替換2種，缺失類(lèi)型的突變質(zhì)粒為pAV001-HU-eCD-D37和pAV001-HU-eCD-D55，堿基替換類(lèi)型的突變質(zhì)粒為pAV001-HU-eCD-M450、pAV001-HU-eCD-M968和pAV001-HU-eCD-M1277。突變質(zhì)粒的制備方法如下所示。(1)突變質(zhì)粒(pAV001-HU-eCD-D37)的構(gòu)建以pAVOOl-HU-eCD50pg為模板，用PrimeSTARHSDNA聚合酶(夕力，^]才抹式會(huì)社制)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR片段A(約1.3kbp)和PCR片段B(約1.3kbp)。在PCR片段A的擴(kuò)增中使用以序列號(hào)l表示的外引物和以序列號(hào)16表示的內(nèi)引物，所述內(nèi)引物在5'末端具有與PCR片斷B末端重復(fù)的序列，且含有與pAV001-HU-eCD互補(bǔ)的序列。PCR片段A在DNA末端含有來(lái)源于模板的HindIII位點(diǎn)。在PCR片段B的擴(kuò)增中使用以序列號(hào)3表示的外引物和以序列號(hào)17表示的內(nèi)引物，所述外引物在5'末端具有KspAI識(shí)別位點(diǎn)，且含有與pAVOOl-HU-eCD互補(bǔ)的序列，33所述內(nèi)引物在5'末端具有與PCR片斷A末端重復(fù)的序列且含有與pAV001-HU-eCD互補(bǔ)的序列。向質(zhì)粒引入突變是通過(guò)內(nèi)質(zhì)粒進(jìn)行的。溫度條件是以98。C下10秒、55。C下5秒、72。C下1分20秒為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，在72。C下保溫30秒。用QIAquickPCRPurificationKit(抹式會(huì)社矢7y》制)純化PCR片段A和PCR片段B后，等摩爾混合純化PCR片段A和片段B。以純化PCR片段A和PCR片段B的混合物lng為模板，在lxPrimeSTARbuffer、200|aMdNTPsmix、2.5uPrimeSTARHSDNA聚合酶混合液中，在不加入引物的狀態(tài)下，以98。C下10秒、72。C下1分30秒為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)反應(yīng)以連接PCR片段A和片段B。之后，添加外引物(序列號(hào)1和3)使最終濃度分別達(dá)到0.5pM,以98。C下10秒、55。C下5秒、72°C下2分40秒為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)反應(yīng)后，在72°C下保溫30秒得到連4妄PCR產(chǎn)物(約2.6kbp)。用l%SeaPlaque(R)GTG(R)瓊脂糖凝膠(lxTAEbuffer、0.5嗎/ml溴化乙錠)分離連接PCR產(chǎn)物，切割2.6kbp的DNA帶。用QIAquick(R)GelExtractionKit從凝膠中提取連接PCR產(chǎn)物，用HindIII(FermentasUAB公司制)和KspAI(FermentasUAB公司制)進(jìn)行消化。用l%SeaPlaque(R)GTG(R)瓊脂糖凝膠(lxTAEbuffer、0.5嗎/ml溴化乙錠)分離，切割2.6kbp的DNA帶。用QIAquick(R)GelExtractionKit從凝膠中提取連接PCR產(chǎn)物。用HindIII(FermentasUAB公司制)和KspAI(FermentasUAB公司制)消化pAV001-HU-eCD載體后，用l%SeaPlaque(R)GTG(R)瓊脂糖凝膠(lxTAEbuffer、0.5昭/ml溴化乙錠)分離，切割4.6kbp的DNA帶。然后，用QIAquick(R)GelExtractionKit從凝膠中提取載體DNA?；旌现暗倪B接PCR產(chǎn)物，使載體和連接PCR產(chǎn)物的摩爾比為1:3，用RapidDNALigationKit(FermentasUAB公司制)進(jìn)行連接。使用連接產(chǎn)物進(jìn)行大腸桿菌JM109的轉(zhuǎn)化，并涂布到含有30嗎/ml大觀(guān)霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，然后在37。C條件下培養(yǎng)一晚，得到轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子在含有30嗎/ml大觀(guān)霉素的2xLB液體培養(yǎng)基中在37。C條件下培養(yǎng)一晚，用QIAprep(R)SpinMiniprepKit提取質(zhì)粒DNA(pAV001-HU-eCD-D37)。pAV001-HU-eCD-D37是具有序列號(hào)14中第1503~1505位(序列號(hào)15中第1545-1547位)的堿基序列(編碼序列號(hào)28第5位的丙氨酸的堿基序列)缺失的CD的質(zhì)粒。(2)突變質(zhì)粒(pAV001-HU-eCD-D55)的構(gòu)建除分別使用序列號(hào)18和19表示的引物作為PCR片段A和PCR片段B擴(kuò)增用內(nèi)引物以外，使用與構(gòu)建pAV001-HU-eCD-D37的質(zhì)粒相同的方法，構(gòu)建pAVOO1-HU-eCD-D55。pAV001-HU-eCD-D55是具有序列號(hào)14中第15211523位(序列號(hào)15中第1563-1565位)的堿基序列(編碼序列號(hào)28第11位的天冬酰胺的堿基序列)缺失的CD的質(zhì)粒。(3)突變質(zhì)粒(pAV001-HU-eCD-M450)的構(gòu)建除分別使用序列號(hào)20和21表示的引物作為PCR片段A和PCR片段B擴(kuò)增用內(nèi)引物、以及PCR的反應(yīng)條件以外，使用與構(gòu)建pAV001-HU-eCD-D37的質(zhì)粒相同的方法，構(gòu)建pAV001-HU-eCD-M450。作為PCR的反應(yīng)條件，PCR片段A擴(kuò)增的反應(yīng)溫度條件為，以98°C下10秒、55'C下5秒、72匸下l分45秒為l個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，在72。C保溫30秒。PCR片段B擴(kuò)增的反應(yīng)溫度條件為，以98。C下10秒、55。C下5秒、72。C下1分鐘為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，在72。C保溫30秒。另外，PCR產(chǎn)物連接時(shí)的反應(yīng)溫度是以98。C下IO秒、72。C下l分45秒為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)反應(yīng)。pAV001-HU-eCD-M450是具有序列號(hào)14中第1914~1916位(序列號(hào)15中第1956~1958位)的堿基序列(編碼序列號(hào)28第142位的谷氨酰胺的堿基序列)被替換為組氨酸的CD的質(zhì)粒。(4)突變質(zhì)粒(pAV001-HU-eCD-M968)的構(gòu)建除分別使用序列號(hào)22和23表示的引物作為PCR片段A和PCR片段B擴(kuò)增用內(nèi)引物、使用序列號(hào)24表示的引物作為PCR片段B擴(kuò)增用外引物、以及PCR的反應(yīng)條件以外，使用與構(gòu)建pAV001-HU-eCD-D37的質(zhì)粒相同的方法，構(gòu)建pAV001-HU-eCD-M968。作為PCR的反應(yīng)條件，PCR片段A擴(kuò)增的反應(yīng)溫度條件為，以98°C下10秒、55。C下5秒、72。C下2分IO秒為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，在72。C保溫30秒。PCR片段B擴(kuò)增的反應(yīng)溫度條件為，以98。C下10秒、55。C下5秒、72。C下45秒為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，在72。C保溫30秒。另外，PCR產(chǎn)物連接時(shí)的反應(yīng)溫度以98。C下IO秒、72。C下2分10秒為l個(gè)循環(huán)，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)反應(yīng)。在連接PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增中，使用序列號(hào)1和24表示的引物，以98。C下10秒、55。C下5秒、72。C下3分鐘為l個(gè)循環(huán)，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)反應(yīng)后，在72。C保溫30秒得到連接PCR產(chǎn)物(約2.9kbp)。在連接PCR產(chǎn)物的載體中，用HindIII(夕力，六4才抹式會(huì)社制)和SpeI(夕力，W4才抹式會(huì)社制)消化pAV001-HU-eCD載體，使用從瓊脂糖凝膠中切割出的片段(約4.3kbp)。得到的pAVOOl-HU-eCD-M968的序列如序列號(hào)27所示。pAV001-HU-eCD-M968是具有序列號(hào)14中第2433~2435位(序列號(hào)15中第2475~2477位)的堿基序列(編碼序列號(hào)28第315位的天冬氨酸的堿基序列)被替換為丙氨酸的CD的質(zhì)粒。(5)突變質(zhì)粒(pAV001-HU-eCD-M1277)的構(gòu)建除分別使用序列號(hào)25和26表示的引物作為PCR片段A和PCR片段B擴(kuò)增用內(nèi)引物和PCR的反應(yīng)條件以外，使用與構(gòu)建pAV001-HU-eCD-M968的質(zhì)粒相同的方法，構(gòu)建pAVOO1-HU-eCD-M1277。作為PCR的反應(yīng)條件，PCR片段A擴(kuò)增的反應(yīng)溫度條件為，以98°C下10秒、55。C下5秒、72。C下2分30秒為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，在72。C保溫30秒。PCR片段B擴(kuò)增的反應(yīng)溫度條件為，以98。C下10秒、55。C下5秒、72。C下30秒為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，在72。C保溫30秒。另夕卜，PCR產(chǎn)物連接時(shí)的反應(yīng)溫度以98。C下10秒、72。C下2分30秒為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)反應(yīng)。pAVOOl-HU-eCD-M1277是具有序列號(hào)14中第2742~2744位(序列號(hào)15中第27842786位)的堿基序列(編碼序列號(hào)28第418位的谷氨酸的堿基序列)被替換為甘氨酸的CD的質(zhì)粒。(長(zhǎng)雙歧桿菌105A的轉(zhuǎn)化)采用與實(shí)施例i相同的方法，用得到的突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化長(zhǎng)雙歧桿菌105A，得到其轉(zhuǎn)化子。(從長(zhǎng)雙歧桿菌105A轉(zhuǎn)化子中提取蛋白質(zhì))采用與實(shí)施例l相同的方法，從用突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的長(zhǎng)雙歧桿菌105A中得到蛋白質(zhì)提取液，并將其用于CD活性的測(cè)定。(CD活性的測(cè)定)采用與實(shí)施例l相同的方法，用得到的蛋白質(zhì)提取液測(cè)定CD活性。測(cè)定結(jié)果如表3所示。[表3]對(duì)pAV001-HU-eCD引入突變所導(dǎo)致的CD活性變化<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>用發(fā)生了突變的pAVOO1-HU-eCD-M968轉(zhuǎn)化得到的長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU-eCD-M968與用沒(méi)有發(fā)生突變的pAV001-HU-eCD轉(zhuǎn)化得到的長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU-eCD(對(duì)照)相比，CD活性提高到約12倍。另一方面，用發(fā)生了突變的pAV001-HU-eCD-M450或pAV001-HU-eCD-M1277轉(zhuǎn)化得到的長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU-eCD-M450和長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU-eCD-M1277中，未發(fā)現(xiàn)引入突變所導(dǎo)致的活性上升。實(shí)施例3(長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU-eCD-M968的5-FU耐受性化)根據(jù)專(zhuān)利文獻(xiàn)5的實(shí)施例1記載的方法，將實(shí)施例2中得到的長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU-eCD-M968制備成5-FU耐受性突變體。即，將實(shí)施例2中得到的長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU-eCD-M968接種到MRS培養(yǎng)基中，在37。C厭氧條件下傳代培養(yǎng)2日以上。用厭氧性稀釋液稀釋這些培養(yǎng)液后，涂布到含有500嗎/mL5-FU的BL瓊脂培養(yǎng)基上，選擇在37。C厭氧條件下培養(yǎng)2-3日后得到的生長(zhǎng)菌，制備5-FU耐受性的長(zhǎng)雙歧桿菌105A/pAV001-HU-eCD-M968(長(zhǎng)雙歧桿菌105A-Rl/pAV001國(guó)HU-eCD-M968)。(5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌105A通過(guò)質(zhì)粒pAV001-HU-eCD-M968的轉(zhuǎn)化)根據(jù)專(zhuān)利文獻(xiàn)5的實(shí)施例2記載的方法，使用實(shí)施例2中得到的突變質(zhì)粒pAV001-HU-eCD-M968制備5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌105A,采用與實(shí)施例l相同的方法轉(zhuǎn)化5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌105A，得到其轉(zhuǎn)化子。即，將長(zhǎng)雙歧桿菌105A接種到含有100嗎/mL5-FU的5mLMRS培養(yǎng)基中，在37。C厭氧條件下培養(yǎng)1~5日，測(cè)定其濁度(OD=600nm),觀(guān)察有無(wú)生長(zhǎng)，將確認(rèn)增殖培養(yǎng)后的培養(yǎng)基取出lmL，分別接種到含有相同濃度的5-FU的9mLMRS培養(yǎng)基中，在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24小時(shí)。通過(guò)將該接種操作重復(fù)3次，制備5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌105A。然后，將該5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌105A接種到MRS培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)后的菌液分別接種到含有250昭/mL5-FU的培養(yǎng)基中，通過(guò)其濁度(OD=600nm)測(cè)定24小時(shí)后有無(wú)增殖，將用含有100嗎/mL5-FU的培養(yǎng)基制備的5-FU耐受性長(zhǎng)雙歧桿菌105A(長(zhǎng)雙歧桿菌105A-R2)用作轉(zhuǎn)化宿主。釆用與實(shí)施例1相同的方法，用實(shí)施例2中得到的突變質(zhì)粒pAV001-HU-eCD-M968轉(zhuǎn)化長(zhǎng)雙歧桿菌105A-R2，制備其轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)雙歧桿菌105A-R2/pAV001-HU-eCD-M968。實(shí)施例4(從長(zhǎng)雙歧桿菌105A-R2/pAV001-HU-eCD-M968中提取蛋白質(zhì))采用與實(shí)施例1相同的方法，從上述得到的長(zhǎng)雙歧桿菌105A-R2/pAV001-HU-eCD-M968中得到蛋白質(zhì)提取液，并將其用于CD活性的測(cè)定。(CD活性的測(cè)定)釆用與實(shí)施例l相同的方法，用得到的蛋白質(zhì)提取液測(cè)定CD活性，結(jié)果如表4所示，長(zhǎng)雙歧桿菌105A-R2/pAVOO1-HU-eCD-M968也表現(xiàn)出與實(shí)施例2的轉(zhuǎn)化長(zhǎng)雙歧桿菌105A相同的CD活性。[表4]<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>實(shí)施例5(質(zhì)粒保持穩(wěn)定性的測(cè)定)對(duì)于實(shí)施例3中得到的、長(zhǎng)雙歧桿菌105A-R2/pAV001-HU-eCD-M968(R2抹)和長(zhǎng)雙歧桿菌105A-Rl/pAV001-HU-eCD-M968(Rl抹)，采用以下方法測(cè)定質(zhì)粒保持穩(wěn)定性，結(jié)果如圖4所示，R2抹與R1林相比表現(xiàn)出極其良好的質(zhì)粒保持穩(wěn)定性。(質(zhì)粒保持穩(wěn)定性測(cè)定試驗(yàn))通過(guò)以下的試驗(yàn)方法進(jìn)行上述質(zhì)粒保持穩(wěn)定性的測(cè)定。使用R2抹和Rl林，在添加了作為導(dǎo)入質(zhì)粒的選擇標(biāo)記的抗生素(大觀(guān)霉素)的液體培養(yǎng)基中，充分活化培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化雙歧桿菌R2抹和R1株。以該菌液作為傳代培養(yǎng)第0日菌液。然后，取出第0日菌液的一部分，接種到不含大觀(guān)霉素的液體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。以該菌液作為傳代培養(yǎng)第1日菌液。同樣地，取出第1日菌液的一部分，接種到不含大觀(guān)霉素的液體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，將該菌液作為傳代培養(yǎng)第2日菌液。以下采用同樣方法連續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)至第5日，制作傳代培養(yǎng)第5日菌液。將第0日菌液、第1日菌液、第3日菌液和第5日菌液涂布到不含抗生素的平板培養(yǎng)基(BL瓊脂培養(yǎng)基)上，形成菌落。隨機(jī)選擇100個(gè)生長(zhǎng)菌落，用滅菌的牙簽等以復(fù)型法(Replicamethod)接種到含有大觀(guān)霉素的BL瓊脂培養(yǎng)基和不含大觀(guān)霉素的BL瓊脂培養(yǎng)基中，用下列公式計(jì)算第0日菌液、第1日菌液、第3曰菌液和第5日菌液的質(zhì)粒保持率。結(jié)果如圖4所示。通過(guò)以下公式計(jì)算質(zhì)粒保持率。^,w化古，、含有大觀(guān)霉素的BL瓊脂培養(yǎng)基的菌落數(shù)質(zhì)粒保持率(％)=-、^丄、-x100BL環(huán)脂培養(yǎng)基的菌落數(shù)工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明，可以高效地制備經(jīng)由轉(zhuǎn)化而導(dǎo)入的基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)活性和表達(dá)效率均良好的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體可用作實(shí)體瘤治療劑，并由厭氧性微生物構(gòu)成，所述厭氧微生物能夠在處于厭氧環(huán)境下的肺瘤組織內(nèi)生長(zhǎng)，并且能夠表達(dá)具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)、或具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)。權(quán)利要求1.基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體由厭氧性微生物構(gòu)成，所述厭氧性微生物可以在處于厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)生長(zhǎng)，并且能夠表達(dá)(A)具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)、或(B)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)，其特征在于，該方法包括制備融合質(zhì)粒的工序(1)，所述融合質(zhì)粒具有雙歧桿菌屬細(xì)菌的質(zhì)粒片段和大腸桿菌的質(zhì)粒片段；在所述融合質(zhì)粒上整合含有啟動(dòng)子和終止子的DNA片段的工序(2)，所述啟動(dòng)子和終止子為來(lái)源于雙歧桿菌屬細(xì)菌的、編碼組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子和終止子；在上述啟動(dòng)子和終止子之間整合DNA制備表達(dá)載體的工序(3)，所述DNA為(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA；以及使用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化厭氧性微生物的工序(4)，在所述工序(3)的表達(dá)載體制備工序中被整合的、(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA是，在該DNA的5′末端側(cè)，進(jìn)一步具有含有堿基序列的DNA片段，所述堿基序列編碼由所述組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白N末端的第1位到至少第4位氨基酸序列構(gòu)成的肽。2.如權(quán)利要求1所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白N末端的第l位到至少第4位氨基酸序列構(gòu)成的肽是，由序列號(hào)29的第1位到第418位中任意一位的氨基酸序列構(gòu)成的肽。3.如權(quán)利要求1或2所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于在工序(4)之前，還有使(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗肺瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA發(fā)生突變的工序(5)。4.如權(quán)利要求3所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于使(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA發(fā)生突變的工序(5)是，使工序(3)中制備的表達(dá)載體上整合的(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA發(fā)生突變的工序(5，)。5.如權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是由厭氧性微生物構(gòu)成的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，所述厭氧性微生物可以在處于厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)生長(zhǎng)，并且能夠表達(dá)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)。6.如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)是胞嘧啶脫氨酶。7.如權(quán)利要求6所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于由厭氧性微生物構(gòu)成的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是至少具有抗肺瘤活性有效濃度的5-氟尿嘧啶耐受性能的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶/5-氟尿嘧啶耐受菌。8.如權(quán)利要求7所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于至少具有抗肺瘤活性有效濃度的5-氟尿嘧啶耐受性能的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶/5-氟尿嘧啶耐受菌是，將至少具有抗胂瘤活性有效濃度的5-氟尿嘧啶耐受性能的5-氟尿嘧啶耐受菌用作宿主制備的。9.如權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于含有編碼由組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白N末端的第l位到至少第4位氨基酸序列構(gòu)成的肽的堿基序列的DNA片段是，含有序列號(hào)14或15的從第1482位到至少第1493位的堿基序列的DNA片段。10.如權(quán)利要求9所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于含有序列號(hào)14或15的從第1482位到至少第1493位的堿基序列的DNA片段是，含有序列號(hào)15的從第1482位到第1493~1535中任意一位的堿基序列的DNA片段。11.如權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于所述厭氧性微生物是細(xì)菌。12.如權(quán)利要求11所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于所述細(xì)菌是腸道細(xì)菌。13.如權(quán)利要求12所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于所述腸道細(xì)菌是雙歧桿菌屬細(xì)菌。14.如權(quán)利要求13所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于，雙歧桿菌屬細(xì)菌選自下列雙歧桿菌屬細(xì)菌中的任意一種青春雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌、假長(zhǎng)雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧斥f菌、以及長(zhǎng)雙歧桿菌。15.如權(quán)利要求13或14所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于雙歧桿菌屬細(xì)菌是長(zhǎng)雙歧桿菌。16.如權(quán)利要求1至15中任意一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于在工序(4)的轉(zhuǎn)化中使用的表達(dá)載體是質(zhì)粒pAV001-HU-eCD的單堿基突變導(dǎo)入質(zhì)粒。17.如權(quán)利要求16所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于質(zhì)粒pAV001-HU-eCD的單堿基突變導(dǎo)入質(zhì)粒中編碼CD的堿基序列是，編碼序列號(hào)28中記錄的大腸桿菌CD的氨基酸序列中與第315位相對(duì)應(yīng)的氨基酸天冬氨酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列的堿基序列。18.如權(quán)利要求17所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于其他氨基酸是丙氨酸。19.如權(quán)利要求18所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備方法，其特征在于質(zhì)粒pAV001-HU-eCD的單堿基突變導(dǎo)入質(zhì)粒是質(zhì)粒pAVOO1-HU-eCD-M968。20.由表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的厭氧性微生物構(gòu)成的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其特征在于所述表達(dá)載體具有雙歧桿菌屬細(xì)菌的質(zhì)粒的片段、大腸桿菌的質(zhì)粒的片段、以及含有來(lái)源于雙歧桿菌屬細(xì)菌且編碼組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白的基因的啟動(dòng)子和終止子的DNA片段，在所述啟動(dòng)子和終止子之間具有(a)編碼具有抗肺瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA,并且在(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA的5'末端側(cè)進(jìn)一步具有含有堿基序列的DNA片段，所述堿基序列編碼由所述組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白N末端的第1位到至少第4位氨基酸序列構(gòu)成的肽。21.通過(guò)權(quán)利要求1至19中任意一項(xiàng)所述的制備方法制備的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其是厭氧性微生物的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，所述厭氧性微生物可以在處于厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)生長(zhǎng)，并且具有(a)編碼具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的DNA、或(b)編碼具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)的DNA。22.如權(quán)利要求20或21所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其特征在于厭氧性微生物是雙歧桿菌屬細(xì)菌。23.如權(quán)利要求22所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其特征在于，雙歧桿菌屬細(xì)菌選自下列雙歧桿菌屬細(xì)菌中的任意一種青春雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌、假長(zhǎng)雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、以及長(zhǎng)雙歧桿菌。24.如權(quán)利要求22或23所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其特征在于雙歧桿菌屬細(xì)菌是長(zhǎng)雙歧桿菌。25.如權(quán)利要求20至24中任意一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其特征在于基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體可以在處于厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)生長(zhǎng)，并且可以表達(dá)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)。26.如權(quán)利要求25所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其特征在于具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)是胞嘧啶脫氨酶。27.如權(quán)利要求26所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其特征在于該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是至少具有抗腫瘤活性有效濃度的5-氟尿嘧啶耐受性能的表達(dá)胞嘧啶脫氨酶/5-氟尿嘧啶耐受菌。28.如權(quán)利要求26或27所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其特征在于該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是長(zhǎng)雙歧桿菌105-A/pAV001-HU-eCD的質(zhì)粒單堿基突變體。29.如權(quán)利要求28所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其特征在于所述長(zhǎng)雙歧桿菌105-A/pAV001-HU-eCD的質(zhì)粒單堿基突變體是長(zhǎng)雙歧桿菌105-A/pAV001-HU-eCD-M968。30.藥物組合物，其特征在于含有如斥又利要求20-29中任意一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。31.藥物組合物，其特征在于組合有如權(quán)利要求2529中任意一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體、以及被該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體能夠表達(dá)的所述蛋白轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的抗腫瘤物質(zhì)前體。32.如權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其特征在于所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是如權(quán)利要求25至29中任意一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，抗腫瘤物質(zhì)前體是5-氟胞嘧啶。33.實(shí)體瘤治療劑，其特征在于含有用于表達(dá)具有有效治療量的抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)的、足夠量的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是權(quán)利要求20至24中任意一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。34.實(shí)體瘤治療劑，其特征在于組合有用于表達(dá)能夠從抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為有效治療量的抗腫瘤物質(zhì)的量的所述蛋白質(zhì)的、足夠量的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，和被該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體能夠表達(dá)的所述蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化、且能夠轉(zhuǎn)化為有效治療量的抗腫瘤物質(zhì)的量的抗腫瘤物質(zhì)前體，所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是權(quán)利要求25至29中任意一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。35.如權(quán)利要求34所述的實(shí)體瘤治療劑，其特征在于所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是如權(quán)利要求25至29中任意一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，抗腫瘤物質(zhì)前體是5-氟胞嘧啶。全文摘要本發(fā)明的目的在于提供一種有效地制備基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的方法，該方法中，經(jīng)由轉(zhuǎn)化而導(dǎo)入的基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)活性和表達(dá)效率均良好。此外，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有該制備方法制備的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的藥物組合物，以及含有該耐受菌的實(shí)體瘤治療劑。本發(fā)明通過(guò)以下方案來(lái)解決本發(fā)明的課題在由厭氧性微生物形成的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體中，使編碼前述目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA5′末端側(cè)，進(jìn)一步具有含有堿基序列的DNA片段，所述堿基序列編碼由組蛋白樣DNA結(jié)合蛋白N末端的第1位到至少第4位氨基酸序列構(gòu)成的肽，所述厭氧性微生物可以在處于厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)生長(zhǎng)，并且能夠表達(dá)(A)具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)、或(B)具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)化為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)。文檔編號(hào)C12N15/09GK101448940SQ20078001845公開(kāi)日2009年6月3日申請(qǐng)日期2007年5月24日優(yōu)先權(quán)日2006年5月24日發(fā)明者天野純,嶋谷裕子,松橋瞳,浜地芳典,藤森実,谷口俊一郎申請(qǐng)人:阿內(nèi)羅藥物科學(xué)株式會(huì)社