專利名稱：培養(yǎng)肌腱細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)肌腱細(xì)胞的方法。特別地，本發(fā)明涉及一種使用選 擇性的培養(yǎng)基培養(yǎng)肌腱細(xì)胞以生成充分純的肌腱細(xì)胞培養(yǎng)物的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞培養(yǎng)是具有許多應(yīng)用的技術(shù)，但是，有些細(xì)胞(例如肌腱細(xì)胞、肝 細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞)很難培養(yǎng)和/或培養(yǎng)很慢和/或在培 養(yǎng)中易于表現(xiàn)出不穩(wěn)定的表型和去分化。培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞尤其可以用于修復(fù) 損傷的肌腱和韌帶。
肌腱損傷的一個(gè)常見的例子是肩袖撕裂(tear in the rotator cuff tendon)。
這通常由過頭的行動(dòng)引起的，并且表現(xiàn)出高的臨床發(fā)病率。旋轉(zhuǎn)帶肌腱 (rotator cuff tendon)完整性的喪失導(dǎo)致強(qiáng)度測量減弱，運(yùn)動(dòng)和功能范圍降 低。盡管肩袖撕裂的外科修復(fù)實(shí)現(xiàn)了高水平的功能改善，并且患者的滿意度 也很高，但是，有些肌腱修復(fù)，特別是大的肌腱或收縮肌腱撕裂，不能治愈 或者在外科手術(shù)后再被撕裂。和初次治療相比，對旋轉(zhuǎn)帶修復(fù)失敗后的再修 復(fù)外科手術(shù)的成功率極低。
肌腱修復(fù)的基本原理是防止肌腱細(xì)胞的凋亡和在受損的肌腱內(nèi)再生正 常的肌腱細(xì)胞，但是這需要發(fā)展體外培養(yǎng)的表型穩(wěn)定的肌腱細(xì)胞。但是肌腱 或韌帶的再生需要大量的肌腱細(xì)胞。此外，該肌腱細(xì)胞的表型應(yīng)該與機(jī)體內(nèi) 的肌腱細(xì)胞的表型盡可能接近。理想情況下，培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞與需要肌腱修 復(fù)的受試者的肌腱細(xì)胞是自體同源的。
目前，沒有適當(dāng)方法來培養(yǎng)一致性程度足夠用于修復(fù)肌腱或韌帶損傷的 肌腱細(xì)胞。文獻(xiàn)中描述的許多方法包括在生長因子(例如類胰島素生長因子I或II，即IGF-I或IGF-II)的存在下，培養(yǎng)完整的肌腱或者極細(xì)碎的肌腱(例 如，參見Dahlgren，等2001, A/KR, 62(10): 1557-1562; Kang和Kang, 1999， 1b似e/^fed J.， 40(1): 26-29; Abrahamsson, 1996, 乂 OAa i e&， 15: 256-262; Abrahamsson禾卩Lohmander， 1996， J. 7 e、 14: 370-376; Abrahamsson
等，1991，歸o. L 6bc， 9: 495-502和503-515;以及Anitua等，2005， J. W"， 23: 281-286)。雖然這些方法顯示出促進(jìn)了 "類肌腱"或"衍生自肌腱" 細(xì)胞的生長，但是已經(jīng)充分確定的是，肌腱不僅僅含有肌腱細(xì)胞。實(shí)際上， 肌腱中的大多數(shù)細(xì)胞為與內(nèi)皮細(xì)胞在一起的成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和一些軟 骨細(xì)胞。因此，已知的用于培養(yǎng)肌腱細(xì)胞的方法不能產(chǎn)生純的肌腱細(xì)胞培養(yǎng) 物，而是產(chǎn)生含有纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和少量肌腱細(xì)胞的混合細(xì)胞群。眾所 周知，肌腱細(xì)胞是生長很慢的細(xì)胞，這樣經(jīng)常使培養(yǎng)過程中存在的其它細(xì)胞 過度生長。這就意味著現(xiàn)有技術(shù)中的培養(yǎng)衍生自肌腱細(xì)胞的方法一般不能產(chǎn) 生足夠用于組織修復(fù)過程的肌腱細(xì)胞。
因此，需要一種能培養(yǎng)足以用于組織修復(fù)過程的肌腱細(xì)胞的方法。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的第一方面提供了一種肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基，該肌腱細(xì)胞培養(yǎng) 基含有胰島素或其功能性衍生物。在一些實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基含有約 0.00005%重量/體積至0.1%重量/體積的胰島素或其功能性衍生物。在其它的 實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基含有約0.0001%重量/體積至0.001%重量/體積的胰島 素或其功能性衍生物。在其它的實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基含有約0.0006%重量 /體積的胰島素或其功能性衍生物。
第一方面的培養(yǎng)基還可以含有糖皮質(zhì)激素，例如合成的糖皮質(zhì)激素或類 糖皮質(zhì)激素分子。在一些實(shí)施方式中，該糖皮質(zhì)激素為倍他米松 (betamethasone)。該培養(yǎng)基可以含有約0.00001%重量/體積至0.1%重量/體積的糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子。在一些實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基含有約 0.0001%重量/體積至0.001%重量/體積的糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子。
在其它的實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基含有約0.0002%重量/體積的糖皮質(zhì)激素或類
糖皮質(zhì)激素分子。
本發(fā)明的第二方面提供了一種肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基，該肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基含有 糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子。在一些實(shí)施方式中，該糖皮質(zhì)激素為合成 的糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子。在其它的實(shí)施方式中，該糖皮質(zhì)激素為
倍他米松。該培養(yǎng)基可以含有約0.00001%重量/體積至0.1%重量/體積的糖皮 質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子。在一些實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基含有約0.0001% 重量/體積至0.001%重量/體積的糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子。在其它的 實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基含有約0.0002%重量/體積的糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激
素分子。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基，該肌腱細(xì)胞培 養(yǎng)基主要由胰島素或其功能性衍生物組成。在其它的實(shí)施方式中，該肌腱細(xì) 胞培養(yǎng)基主要由胰島素和糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子組成。本領(lǐng)域技術(shù) 人員易于理解的是，這些培養(yǎng)基的非必要成分包括血清、抗生素和本領(lǐng)域公 知的任何其它常規(guī)培養(yǎng)補(bǔ)充物質(zhì)。
因此，第一和第二方面的培養(yǎng)基還可以含有血清，例如胎牛血清(FBS)。 該培養(yǎng)基可以含有約15%體積/體積的血清。
第一和第二方面的培養(yǎng)基還可以含有抗生素。在一些實(shí)施方式中，該抗 生素可以選自由氨芐青霉素、羧芐青霉素、青霉素、兩性霉素、制霉菌素、 多粘菌素-B、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、鏈霉素、四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯、 里諾霉素(linomycin)、泰妙菌素(tiamutin)和氯霉素所組成的組中的一種 或幾種。該培養(yǎng)基可以含有1%體積/體積的抗生素。
第一和第二方面的培養(yǎng)基還可以含有L-脯氨酸。在一些實(shí)施方式中，第一和第二方面的培養(yǎng)基含有0.0006%重量/體積的L-脯氨酸。
本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了一種培養(yǎng)肌腱細(xì)胞的方法，該方法包括在本 發(fā)明的第一和第二方面的培養(yǎng)基中培育肌腱細(xì)胞的步驟。在一些實(shí)施方式 中，在10。/o的C02下培養(yǎng)該肌腱細(xì)胞。在其它的實(shí)施方式中，該肌腱細(xì)胞在
2維培養(yǎng)物中。在其它的實(shí)施方式中，通過胰蛋白酶和膠原酶從肌腱和/或韌
帶組織中獲得肌腱細(xì)胞。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的肌腱細(xì)胞培養(yǎng)方法產(chǎn)生充分純的肌腱細(xì)胞
培養(yǎng)物(例如，所有存在的細(xì)胞中至少80%為肌腱細(xì)胞，優(yōu)選為至少90%， 更優(yōu)選為至少95%)。
本發(fā)明的第四個(gè)方面提供了由本發(fā)明的第三個(gè)方面的方法培養(yǎng)的肌腱 細(xì)胞在肌腱和/或韌帶疾病治療中的應(yīng)用。在一些實(shí)施方式中，該肌腱疾病為 肌腱變性(tendinosis)。在其它的實(shí)施方式中，肌腱疾病為肌腱撕裂。
本發(fā)明的第五個(gè)方面提供了由本發(fā)明的第三個(gè)方面的方法培養(yǎng)的肌腱 細(xì)胞在肌腱和/或韌帶再生中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第六個(gè)方面提供了由本發(fā)明的第三個(gè)方面的方法培養(yǎng)的肌腱 細(xì)胞在肌腱和/或韌帶重建中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第七個(gè)方面提供了治療肌腱和/或韌帶疾病的方法，該方法包 括向動(dòng)物施用由本發(fā)明第三個(gè)方面的方法培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞的步驟。在一些實(shí) 施方式中，該肌腱疾病為肌腱變性。在其它的實(shí)施方式中，該肌腱疾病為肌 腱撕裂。
本發(fā)明的第八個(gè)方面提供了再生肌腱和/或韌帶的方法，該方法包括向 有需要的動(dòng)物施用由本發(fā)明第三個(gè)方面的方法培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞的步驟。
本發(fā)明的第九個(gè)方面提供了重建肌腱和/或韌帶的方法，該方法包括向 有需要的動(dòng)物施用由本發(fā)明第三個(gè)方面的方法培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞的步驟。


圖1表示了逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增的結(jié)果，由于檢 測到了膠原的I和III條帶，這表明肌腱細(xì)胞在體外保持它們的表型。條帶1、
3和5為肌腱組織，而條帶2、 4和6來自體外培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞。條帶1和2 代表I型膠原的mRNA。
具體實(shí)施例方式
在詳細(xì)描述優(yōu)選的實(shí)施方式之前，應(yīng)該理解的是，此處所用的術(shù)語僅僅 是為了描述本發(fā)明的特殊的實(shí)施方式，而不是為了限定本發(fā)明的范圍。
此處所引用的所有出版物、專利和專利申請，不管在上文還是在下文中， 引入它們的全文作為參考。但是，引用此處所提及的出版物僅僅是為了描述 和公開該出版物中報(bào)道的可能在本發(fā)明中使用的方案和試劑。此處不應(yīng)理解 為承認(rèn)本發(fā)明沒有權(quán)利通過在先發(fā)明使這種公開內(nèi)容的日期提前。
除非有另外的說明，本發(fā)明的實(shí)施將使用本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的組織離解、細(xì) 胞生物學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有描述。例如，參見《細(xì) 胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法(Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology)》(Mayer禾口 Walker主編，Academic Press, London, 1987);
《細(xì)胞的分子生物學(xué)(Molecular Biology of the Cell)》(Alberts等，Garland Science, New York, 2000); Kmse禾口 Patterson主編的《組織培養(yǎng)(Tissue Culture )》(Academic Press, 1977)和《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(Culture Of Animal Cells)》 (R. I, Freshney, Alan R. Liss， Inc., 1987)。
必須注意的是，此處和隨附的權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式"一個(gè)"和 "該"包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確地表明相反。因而，例如提到的"一 個(gè)細(xì)胞"包括多個(gè)細(xì)胞，"一個(gè)分子"指的是多個(gè)分子，等等。
除非有相反的定義，此處所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的意義與本發(fā)明所
8屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解的通常意義相同。
在下面的描述中，如果沒有說明，應(yīng)當(dāng)了解的是，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是本領(lǐng) 域公知的技術(shù)，并且可以采用任何這樣的技術(shù)。
盡管可以使用與此處描述的材料和方法相似或者等價(jià)的材料和方法實(shí) 施或試驗(yàn)本發(fā)明，但是此處描述的是優(yōu)選的材料和方法。
在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基。此處使用的術(shù) 語"肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基"和"培養(yǎng)基"可交換使用，并且指的是用于有選擇地 使肌腱細(xì)胞生長的營養(yǎng)液。本發(fā)明的培養(yǎng)基含有如上文和下文中所述的特定 的成分，還含有其它非必要成分，這些主要取決于該肌腱細(xì)胞的動(dòng)物源或含 有肌腱細(xì)胞的組織和使用的培養(yǎng)環(huán)境，例如，細(xì)胞密度和/或最終用途。該肌 腱細(xì)胞培養(yǎng)基通常含有有機(jī)和無機(jī)材料的混合物，并且典型地含有如下種類 的一種或幾種成分中的至少一種
1) 能源，通常以碳水化合物的形式，例如葡萄糖；
2) 全部的必需氨基酸，通常，20種氨基酸加上半胱氨酸構(gòu)成基本的氨
基酸組；
3) 維生素和/或其它以低濃度需要的有機(jī)化合物；
4) 游離的脂肪酸；和
5) 痕量元素，其中，痕量元素定義為典型地以極低的濃度需要的無機(jī) 化合物或天然存在的元素， 一般以微摩爾級(jí)的量使用。
該培養(yǎng)基可以選擇性地添加如下的任意種類中的一種或多種成分
1) 激素和其它生長因子，例如轉(zhuǎn)鐵蛋白和表皮生長因子；
2) 鹽和緩沖劑，例如鈣、鎂和磷酸鹽；
3) 核苷和堿基，例如腺苷和胸腺嘧啶核苷、次黃嘌呤；和
4) 蛋白質(zhì)和組織水解產(chǎn)物。
該培養(yǎng)基典型地含有可商購得到的培養(yǎng)基，例如伊格基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BasalMedia Eagle) (BME)、 BGJb Medium、布瑞士特氏BMOC-3培養(yǎng)基(Brinster，s BMOC-3 Medium)、 CMRL培養(yǎng)基(CMRL Medium)、不依賴C02的培養(yǎng)基、 杜比科氏改進(jìn)的伊格培養(yǎng)基(Dulbecco，s Modified Eagle Medium) (D-MEM)、 F-10營養(yǎng)素混合物、F-12營養(yǎng)素混合物、格拉斯哥最低極限培養(yǎng)基(Glasgow Minimum Essentia Medium )、改進(jìn)的211++選擇性MEM (里克特氏改進(jìn))
(Improved MEM Zn++Option (Richter's Modification))、伊斯蔻伍氏改進(jìn)培 養(yǎng)基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、萊波維特氏L-15培養(yǎng)基
(Leibovitz'sL-15 Medium)、麥蔻伊氏5A培養(yǎng)基(McCoy's 5 A Medium)(改 進(jìn)的)、MCDB 131培養(yǎng)基(MCDB 131 Medium)、培養(yǎng)基NCTC-109(Medium NCTC-109)、最低極限培養(yǎng)基(Minimum Essential Media) (MEM)、改進(jìn)的 伊格培養(yǎng)基(Modified Eagle Medium) (MEM)、 Opti-MEM I還原的血清 培養(yǎng)基(Opti-MEM⑧I Reduced Serum Media)、 RPMI培養(yǎng)基1640(RPMI Medium 1640)、維伊冒斯氏MB 752/1培養(yǎng)基(Waymouth，s MB 752/1 Media)、 威廉斯培養(yǎng)基E. (Williams Media E.)和培養(yǎng)基199 (Medium 199)。
本發(fā)明的肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基含有胰島素或胰島素功能性衍生物。胰島素是 一種激素，天然存在形式的胰島素由胰臟產(chǎn)生。但是，本發(fā)明使用的胰島素 可以是合成的，例如，重組胰島素，或者是天然胰島素。
胰島素的"功能性衍生物"是如Chan等，2000, "Insulin-through the ages: Phylogeny of a growth promoting and metabolic regulatory hormone"(美國動(dòng)物 學(xué)家；可以在 http:〃www.findarticles.com/p/articles/mi qa3746/is 200004 /ai n8899929中得到)中所述的分子，該分子具有胰島素活性，即培養(yǎng)肌腱 細(xì)胞的能力；該分子包括胰島素的生物活性片段、胰島素的變體和胰島素的 衍生物。
在一些實(shí)施方式中，胰島素的"功能性衍生物"或胰島素的片段或胰島 素的變體具有一個(gè)或幾個(gè)被20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的天然存在或合成的氨基酸同系物取代的氨基酸殘基。這樣的同系物的例子有4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨
酸、3-甲基組氨酸、高絲氨酸、鳥氨酸、p-丙氨酸和4-氨基丁酸(butanoic acid)、 (3-丙氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羧基脯氨酸、甲狀腺氨酸、Y-氨基丁酸、 高絲氨酸、瓜氨酸等等。
可以根據(jù)Sehon及其同事(Wie等，同上)的制備與聚乙二醇(PEG) 分子共軛的胰島素的方法，用PEG制備胰島素的功能性衍生物。此外，可 以在胰島素的化學(xué)合成過程中加入PEG。制備胰島素衍生物或其片段的其它 方法包括還原/烷基化(Tarr, Methods of Protein Micro-characterisation, J. E. Silvered.，HumanaPress, Clifton N丄155-194， 1986)、?；?Tarr，同上)、與 適當(dāng)?shù)妮d體化學(xué)耦合(Mishell禾卩Shiigi， eds, Selected Methods in Cellular Immunology, W H Freeman, San Francisco, Calif. (1980),美國專禾ll No. 4,939,239)、或適度的甲醛水處理(Marsh, 1971,/"A ^r/z. a"a^邵/. /wmimo/., 41:199-215)。
應(yīng)該注意的是，術(shù)語"功能性衍生物"不包括像類胰島素生長因子I或 II這樣的分子。
可以在向培養(yǎng)基中加入待培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞之前將胰島素或功能性衍生 物加入到培養(yǎng)基中?？蛇x擇地，可以在培養(yǎng)的整個(gè)過程中向培養(yǎng)基中加入胰 島素或功能性衍生物，例如，在細(xì)胞詞養(yǎng)層存在下培養(yǎng)細(xì)胞，該細(xì)胞飼養(yǎng)層 如由分泌胰島素或功能性衍生物的P細(xì)胞形成的層。
此處所用的"片段"是保持胰島素的功能的胰島素蛋白的一部分，特別 是能夠支持培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞的生長。胰島素的片段的長度可以為至少約10 個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選約10-16個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選約10-20個(gè)氨基酸殘基。
胰島素的"變體"是具有一處或多處取代的胰島素分子，因此其二級(jí)構(gòu) 象保持不變。這樣的保守性的取代包括與原有的氨基酸殘基具有基本上相同 的疏水性、尺寸和電荷的氨基酸。這樣的取代為蛋白或肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的。例如，保守性的取代包括用脯氨酸代替甘氨酸或者相反；用丙 氨酸或纈氨酸代替甘氨酸或者相反；用異亮氨酸代替亮氨酸或者相反；用組 氨酸代替賴氨酸或者相反；用蘇氨酸代替半胱氨酸或者相反；用谷氨酰胺代 替天冬酰胺或者相反；以及用精氨酸代替谷氨酸或者相反。
胰島素的變體的另 一個(gè)例子為其中的半胱氨酸殘基被取代以使由二硫 鍵導(dǎo)致的二聚作用最小化。優(yōu)選地，半胱氨酸殘基被丙氨酸、絲氨酸、蘇氨 酸、亮氨酸或谷氨酸殘基取代。此外，胰島素或胰島素片段或胰島素衍生物 的氨基酸側(cè)鏈可以被化學(xué)修飾。另一種改性方式是胰島素的環(huán)化。
本發(fā)明的培養(yǎng)基中的胰島素或功能性衍生物的量一般為約0.00005%重 量/體積至0.1%重量/體積。在一些實(shí)施方式中，胰島素或功能性衍生物的含 量為約0.0005%重量/體積至0.01%重量/體積。在其它的實(shí)施方式中，胰島素 或功能性衍生物的含量為約0.0001%重量/體積至0.001%重量/體積。在其它 的實(shí)施方式中，胰島素或功能性衍生物的含量為約0.0006%重量/體積。
在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基含有糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子。 糖皮質(zhì)激素是類固醇激素的一類，其特征在于能夠與皮質(zhì)醇受體結(jié)合并引發(fā) 相似的作用，例如影響代謝或消炎或抑制免疫的作用。糖皮質(zhì)激素可以為天 然存在的激素或合成的藥物。
適用于本發(fā)明的合成的糖皮質(zhì)激素的例子包括氫化可的松、醋酸可的松 (cortisone acetate)、強(qiáng)的松(predisone)、強(qiáng)的松龍、甲基強(qiáng)的松龍、地塞 米松、倍他米松、氟羥脫氫皮甾醇、氯地米松、醋酸氟氫可的松(fludrocortisone sacetate)、醋酸脫氧皮質(zhì)酮(DOCA)和醛基甾酮。
"類糖皮質(zhì)激素"分子可以為具有糖皮質(zhì)激素活性(即具有培養(yǎng)肌腱細(xì) 胞的能力)的任何分子。適用于本發(fā)明的類糖皮質(zhì)激素分子的例子包括抗肝 癌物、魚藤酮(Youssef等，2003, J. Cara'"oge"e^2: 2)、利福平(Calleja等, 1998, Ato. Med, 4: 92-96)、甘草皂苷(甘草的一種成分)(Kuroyanagi和Sato,1966，垂，,15:67-75 )、以及醉茄內(nèi)酯(來自草藥睡茄(herb withanthia somnifera)) (Grandhi等，1994, J.礎(chǔ)，/z測,/" 44: 131-135)。
在一些實(shí)施例中，該糖皮質(zhì)激素為倍他米松。倍他米松是一種合成的糖 皮質(zhì)激素，其化學(xué)式為C22H29F05。
本發(fā)明的培養(yǎng)基中的糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子的含量一般為約 0.00001%重量/體積至0.1%重量/體積。在一些實(shí)施方式中，糖皮質(zhì)激素或類 糖皮質(zhì)激素分子的含量為約0.0001%重量/體積至0.001%重量/體積。在其它 的實(shí)施方式中，糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子的含量為約0.0002%重量/ 體積至0.001%重量/體積。
該培養(yǎng)基還可以含有血清。該血清可以來自任何動(dòng)物，但是一般為牛血 清。在一些實(shí)施方式中，該血清為胎牛血清。該培養(yǎng)基中的血清的含量可以
為約1%%體積/體積至30%體積。在一些實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基中的血清的 含量為約5%體積/體積至20%體積/體積。在其它的實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基中 的血清的含量為約10%體積/體積至15%體積/體積。
該培養(yǎng)基還可以含有一種或多種抗生素。該抗生素為天然的或合成的物 質(zhì)，能殺滅或抑制微生物的生長。適用于本發(fā)明的培養(yǎng)基的抗生素的例子包 括氨芐青霉素、羧芐青霉素、青霉素、兩性霉素、制霉菌素、多粘菌素-B、 慶大霉素、卡那霉素、新霉素、鏈霉素、四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯、里諾霉素 (linomycin)、泰妙菌素(tiamutin)禾口氯霉素。
該培養(yǎng)基可以含有約0.001%體積/體積至5%體積/體積的抗生素。在一 些實(shí)施方式中，抗生素的含量為約0.01%體積/體積至0.05%體積/體積。在其 它的實(shí)施方式中，抗生素的含量為約1%體積/體積。
L-脯氨酸為脯氨酸的L-型立體異構(gòu)體，是動(dòng)物蛋白中常見的20種氨基 酸之一。只有L-型立體異構(gòu)體出現(xiàn)在哺乳動(dòng)物蛋白中。
該培養(yǎng)基的pH值可以為待培養(yǎng)的細(xì)胞能夠生長的任何pH值。在一些實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基的pH值為約9.0至約3.0。在其它的實(shí)施方式中，該 pH值為約5.0至8.0。在其它的實(shí)施方式中，該pH值為約7.0至7.5。在其 它的實(shí)施方式中，該pH值為約7.2。
本發(fā)明的培養(yǎng)基可以通過本領(lǐng)域公知的任何方法制備。例如，可以通過 將干成分溶解在水中，并調(diào)節(jié)液體的pH值到適當(dāng)?shù)闹刀苽??？梢杂帽姸?方法中的一種進(jìn)行滅菌，例如過濾或輻射。然后可以向該培養(yǎng)基中加入任何 無菌的流態(tài)成分。
然后，可以將待培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞或含有肌腱細(xì)胞的組織加入到該培養(yǎng)基 中。此處所用的術(shù)語"肌腱細(xì)胞"指的是在動(dòng)物的肌腱中可見的紡錘狀成纖 維樣細(xì)胞。肌腱細(xì)胞一般具有伸長的細(xì)胞核和薄的細(xì)胞質(zhì)，常見于肌腱的膠 原纖維上。通?？梢愿鶕?jù)產(chǎn)生I型膠原和表達(dá)標(biāo)記"軟骨發(fā)生早期特異性轉(zhuǎn) 錄因子(sclemxis)"鑒定肌腱細(xì)胞?？梢杂酶鞣N方法從任何含肌腱細(xì)胞的組 織中分離肌腱細(xì)胞，這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。在一些實(shí)施方式中， 可以通過常規(guī)方法從活組織檢查材料中分離肌腱細(xì)胞。例如，可以從需要肌 腱治療或再生的動(dòng)物的機(jī)體的任何肌腱中提取活體組織。這樣的肌腱包括但 不限于，屈肌腕橈骨(flexor carpi radialis)肌腱和跟骨肌腱。
在一些實(shí)施方式中，該肌腱細(xì)胞或含肌腱細(xì)胞組織為"自體同源的細(xì)胞 或組織"，即來自于待接受治療的動(dòng)物機(jī)體的肌腱細(xì)胞或組織。
此處所用的"動(dòng)物"指的是任何動(dòng)物，例如人類或?qū)θ祟愑薪?jīng)濟(jì)價(jià)值和 /或社會(huì)價(jià)值的哺乳動(dòng)物，例如，除人類之外的食肉動(dòng)物(例如，貓和狗)、 豬科動(dòng)物(豬、大食用豬和野豬)、反芻動(dòng)物(如畜牛、牛、綿羊、長頸鹿、 鹿、山羊、野牛(bison)和駱駝)、以及馬。因?yàn)轼B類對人類也具有經(jīng)濟(jì)價(jià) 值，因此，本發(fā)明還提供了對鳥類的治療，包括治療瀕臨滅絕的、動(dòng)物園的 和家養(yǎng)的鳥類，特別是馴養(yǎng)的禽類，例如，家禽，如火雞、小雞、鴨子、鵝、 珍珠雞等。因此，本發(fā)明提供了對家畜的治療，包括但不限于，馴養(yǎng)的豬科動(dòng)物(豬和大食用豬)、反芻動(dòng)物、馬、家禽等等。該術(shù)語不表示特殊的年 齡。因此，包括成年的和初生的受試者。
可以從任何含肌腱細(xì)胞的組織中(如，肌腱)獲得或分離肌腱細(xì)胞。肌 腱是動(dòng)物體內(nèi)連接肌肉與骨胳的組織。該肌腱可以來自動(dòng)物的任何解剖部 分，可以為旋轉(zhuǎn)帶肌腱、岡上肌腱、肩胛下肌腱、胸大肌肌腱、腓骨肌腱、
跟肌腱(achille，s tendon)、前脛肌肌腱(tibialis anterior)、膝關(guān)節(jié)前交叉韌 帶、膝關(guān)節(jié)后交叉韌帶、后腿肌腱、外側(cè)韌帶(lateral ligament)、內(nèi)側(cè)韌帶 (medial ligament)、髕骨肌腱(patella tendon)、 二頭肌腱和三頭肌腱。
在一些實(shí)施方式中，將由活組織檢查分離出來的肌腱組織清洗并切碎成 外植塊，該外植塊能夠在細(xì)胞培養(yǎng)中生長產(chǎn)生自由肌腱細(xì)胞。在一些實(shí)施方 式中，將切碎的組織進(jìn)行酶消化和/或與能和(^2+連接或螯合的試劑(例如 乙二胺四乙酸(EDTA))作用，細(xì)胞和細(xì)胞之間的粘接依賴于(^2+。適用的 酶的例子包括膠原酶、胰蛋白酶和蛋白酶中的一種或幾種。
在一種優(yōu)選的方法中，在含有2.5%重量/體積的胰蛋白酶和5.5%重量/ 體積的膠原酶的不含苯酚紅的標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)不大于lmm的切碎的 肌腱組織，在5%的C02中37"C下培養(yǎng)至少3小時(shí)。
在一些實(shí)施方式中，在酶消化后，活組織檢査材料中的細(xì)胞通過將活體 組織溶液離心并用細(xì)胞生長培養(yǎng)基將得到的沉淀清洗分離。可選擇地，然后 可以通過過濾將肌腱細(xì)胞從該肌腱的其它成分中分離出來，例如使用篩網(wǎng)， 如150微米的無菌尼龍篩網(wǎng)。另一種途徑是基于一些細(xì)胞類型易于強(qiáng)烈地吸 附在塑料或玻璃上，從而將它們與吸附不強(qiáng)烈的肌腱的成分分離開?？蛇x擇 地，可以使用與細(xì)胞特異性結(jié)合的抗體將細(xì)胞從肌腱的其它成分中分離出 來，例如，使用與基體結(jié)合的或與熒光染料耦合的抗體，然后可以通過具有 熒光活性的細(xì)胞分選(FACS)技術(shù)分離該抗體。
然后可以將細(xì)胞加入到本發(fā)明的培養(yǎng)基中，在適當(dāng)?shù)臈l件下孵育。在一些實(shí)施方式中，分離后，在5X的C02氣氛中于37。C下將細(xì)胞培養(yǎng)約3天至 5周。當(dāng)然，培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間周期可以改變。
如上所述，本發(fā)明的培養(yǎng)基含有胰島素或功能性衍生物和/或糖皮質(zhì)激 素或類糖皮質(zhì)激素分子。肌腱細(xì)胞一般很難在細(xì)胞培養(yǎng)中生長，并且易于變 得不穩(wěn)定和去分化。但是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)胰島素尤其能夠使肌腱細(xì)胞 更穩(wěn)定地生長，甚至在包括軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等其它細(xì)胞的存在下的培 養(yǎng)中也能夠生長。因此，只要本發(fā)明的培養(yǎng)基中存在胰島素，那么肌腱細(xì)胞 就可以選擇性地生長。如在其它地方所描述的，可以將胰島素由外界加入到 該培養(yǎng)基中?？蛇x擇地，可以通過將肌腱細(xì)胞和能夠向培養(yǎng)基中分泌胰島素 的飼養(yǎng)細(xì)胞共同培養(yǎng)來天然地產(chǎn)生胰島素。
因此，在本發(fā)明的上下文中，"詞養(yǎng)細(xì)胞"或"供食者(feeders)"是能 夠分泌胰島素的細(xì)胞，這樣，共培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞就能夠像本發(fā)明要求的那樣 生長。不管肌腱細(xì)胞實(shí)際上是在無飼養(yǎng)細(xì)胞存在下生長還是在飼養(yǎng)細(xì)胞的存 在下生長，在一些實(shí)施方式中，肌腱細(xì)胞達(dá)到了需要分離成一個(gè)或多個(gè)傳代 培養(yǎng)的細(xì)胞密度。每一輪的傳代培養(yǎng)稱作傳代。當(dāng)將肌腱細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng) 時(shí)，稱為將肌腱細(xì)胞傳代。肌腱細(xì)胞的特異性種群有時(shí)稱作，或者特征在于， 其傳代的次數(shù)。例如，傳代了十次的培養(yǎng)的細(xì)胞種群被稱作P10培養(yǎng)。初級(jí) 培養(yǎng)，即細(xì)胞從組織中分離后的首次培養(yǎng)，記作P0。首次傳代培養(yǎng)之后， 該細(xì)胞被稱為二級(jí)培養(yǎng)(Pl或傳代1)。第二次傳代培養(yǎng)之后，該細(xì)胞成為 三級(jí)培養(yǎng)(P2或傳代2)，依此類推。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在傳 代過程中可能有許多種群翻倍；因此培養(yǎng)的種群翻倍數(shù)大于傳代數(shù)。傳代期 間的細(xì)胞的增殖(即種群翻倍數(shù))取決于許多因素，包括但不限于，接種密 度、基質(zhì)、培養(yǎng)基、生長條件和傳代間隔。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法制備了培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)的充分純的肌腱細(xì)胞。此 處所用的術(shù)語"充分純的"指的是在培養(yǎng)物中，肌腱細(xì)胞是主要的細(xì)胞，其它污染性細(xì)胞(例如成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等等)的數(shù)目很少。優(yōu)選地，培 養(yǎng)物中存在的細(xì)胞的至少80%為肌腱細(xì)胞，更優(yōu)選為至少90%，最優(yōu)選為所
有細(xì)胞中的至少95%為肌腱細(xì)胞。
當(dāng)?shù)玫匠渥銛?shù)量或體積的肌腱細(xì)胞后，可以用標(biāo)準(zhǔn)方法將其存庫或儲(chǔ)
存。例如，可以通過在-18(TC下深低溫保藏將肌腱細(xì)胞常規(guī)地儲(chǔ)存。本發(fā)明 的肌腱細(xì)胞可以在各種條件下深低溫保藏，例如本領(lǐng)域公知的條件。
重要地，優(yōu)選情況下，在培養(yǎng)階段或者傳代后或者深低溫保藏后對肌腱 細(xì)胞的表型進(jìn)行評(píng)定。有許多種方法評(píng)定進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞的表型。一 種方法是評(píng)定培養(yǎng)的細(xì)胞的形態(tài)。例如，肌腱細(xì)胞是具有伸長的細(xì)胞核和薄 的細(xì)胞質(zhì)的紡錘狀細(xì)胞。
對肌腱細(xì)胞的表型進(jìn)行評(píng)定的另一種方法是確定該細(xì)胞的表達(dá)標(biāo)記是 否對該細(xì)胞類型具有特異性。例如，肌腱細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，軟骨發(fā)生早期 特異性轉(zhuǎn)錄因子，軟骨發(fā)生早期特異性轉(zhuǎn)錄因子是所有介導(dǎo)肌肉與骨骼連接 的連接組織的高度特異性標(biāo)記。肌腱細(xì)胞還表達(dá)分化標(biāo)記，如I型膠原、III 型膠原和飾膠蛋白聚糖。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，可以根據(jù)肌腱細(xì)胞最終用途對本發(fā)明的 肌腱細(xì)胞進(jìn)行單層或3-維培養(yǎng)。"單層"是只有一層細(xì)胞(2-維)。3-維培養(yǎng) 指的是具有深度、寬度和高度的培養(yǎng)，例如在基質(zhì)或支架上培養(yǎng)生長。
因此，本發(fā)明還關(guān)注包括接種到基質(zhì)或支架上的用于組織修復(fù)和/或再 生的肌腱細(xì)胞的組合物，該肌腱細(xì)胞優(yōu)選為自體同源的肌腱細(xì)胞。"接種" 指的是使肌腱細(xì)胞與支持基質(zhì)或支架接觸，在移植前粘附(用粘合劑或不用 粘合劑)在支持基質(zhì)上一段時(shí)間。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，細(xì)胞只保持在支持基質(zhì)的一個(gè)表面或邊 緣，或到特定的深度(如此處所述的)，即，細(xì)胞附著在支持基質(zhì)的一個(gè)表 面或與支持基質(zhì)相鄰，如美國
發(fā)明者鄭銘豪 申請人:西澳大利亞大學(xué)