專利名稱：：靶向細(xì)菌自殺途徑以開發(fā)新抗生素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量和溶解性的系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及一種尋找新抗生素的新方法，其不以常規(guī)的靶物篩選方法為基礎(chǔ)。該方法利用了細(xì)菌自殺系統(tǒng)，該系統(tǒng)盛行于除共生細(xì)菌外的所有細(xì)菌種中?？股赝ǔ０蚁蚣?xì)菌中的生物合成途徑，例如細(xì)胞壁合成、DNA復(fù)制、RNA合成、蛋白質(zhì)合成以及例如氨基酸、核苷酸和輔因子這樣的必需小分子的合成?？股貙Π型緩揭种频慕Y(jié)果是，細(xì)菌細(xì)胞生長受到抑制，其在許多情況下導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)菌通常配有所謂的毒素-抗毒素(TA)或"自殺"基因系統(tǒng)，該系統(tǒng)被認(rèn)為在生長調(diào)控、細(xì)胞死亡和應(yīng)激條件下的休眠中起重要作用。在正常生長條件下，毒素與由相同操縱子(TA操縱子)編碼的其關(guān)聯(lián)抗毒素形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而該毒素不能作用于其細(xì)胞耙。然而，在應(yīng)激條件下，不穩(wěn)定抗毒素快速降解并伴隨游離毒素在細(xì)胞質(zhì)中釋放，然后這些毒素對特定的細(xì)胞靶發(fā)揮毒性效應(yīng)。細(xì)菌基因組中存在的毒素或自殺基因的數(shù)量變化很大；大腸桿菌(Escherichiacoli)通常含有六個(gè)獨(dú)立的TA操縱子，各編碼一對抗毒素及其關(guān)聯(lián)毒素，而結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)含有約四十個(gè)這樣的操縱子。實(shí)際上除了例如衣原體(Chlamydia)和支原體(Mycoplasm)這樣專性與宿主細(xì)胞生存的細(xì)菌之外，目前所有的病原性細(xì)菌基因組序列都包含一個(gè)或多個(gè)TA操縱子。大腸桿菌的六個(gè)TA操縱子中，有三個(gè)已經(jīng)得到詳細(xì)表征；RelE是刺激核糖體內(nèi)切核糖核酸酶活性的核糖體相關(guān)因子，MazF和ChpBK作為序列特異性內(nèi)切核糖核酸酶發(fā)揮作用，稱作mRNA干擾酶(interferase)(MIase)。已經(jīng)證實(shí)，MazF當(dāng)被誘導(dǎo)時(shí)，在ACA序列處切割細(xì)胞mRNA，由此有效抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成并由此抑制細(xì)胞生長。MazF與其抗毒素MazE形成穩(wěn)定的復(fù)合物，MazF-MazE復(fù)合物的X-射線結(jié)構(gòu)已被確定。由于TA復(fù)合物對細(xì)胞沒有毒性，因此它們在大腸桿菌中得到良好表達(dá)，且易于以高產(chǎn)量純化。近來，RelE-RelB和YoeB-YefM復(fù)合物的X-射線結(jié)構(gòu)也已被確定，揭示了毒素與抗毒素如何在TA復(fù)合物中相互作用。大部分細(xì)菌在其基因組中含有大量毒素或"自殺"基因。重要的是，由這些基因產(chǎn)生的毒素既不會(huì)殺死其生活環(huán)境中的其他細(xì)菌也不會(huì)在感染過程中殺死動(dòng)物細(xì)胞。相反，它們是在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的，并對其自身有毒性。在這一新領(lǐng)域中的近期進(jìn)展已經(jīng)為這些毒素在細(xì)菌生理學(xué)、多藥物抗性的持久性、病原性、生物膜形成和進(jìn)化中所起的作用提供了許多引人入勝的認(rèn)識。如今很顯然的是，對這些毒素的研究對亍傳染性疾病和藥物科學(xué)具有重要的潛在意義。由于這些毒素中大多數(shù)都是和其同一個(gè)操縱子中的關(guān)聯(lián)抗毒素共轉(zhuǎn)錄的(因此稱作毒素-抗毒素或TA操縱子)，且在正常生長條件下它們在細(xì)胞內(nèi)形成穩(wěn)定的復(fù)合物，因此這些毒素的毒性效應(yīng)通常并不得到發(fā)揮(Bayles，2003;Engelberg-Kulka等人，2004;Hayes,2003;Rice和Bayles,2003)。然而，由于抗毒素的穩(wěn)定性遠(yuǎn)低于它們的關(guān)聯(lián)毒素的穩(wěn)定性，素的平衡，導(dǎo)致毒素在細(xì)胞內(nèi)的釋放。盡管存在許多的爭論，但認(rèn)為由TA操縱子編碼的這些毒素依賴于壓力的本質(zhì)以兩種不同的方式起作用是最為合理的。一種是通過抑制例如DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成這樣的特定細(xì)胞功能來調(diào)控生長速率。在廣泛的壓力下，毒素的量超過了抗毒素的量，細(xì)胞生長可能被完全阻滯。TA毒素在生長調(diào)控中的作用很可能是它們的初級功能。然而，它們的第二作用是自殺，即殺死它們自己的宿主細(xì)胞。在特定條件下，TA毒素可以起到清除高度受損的細(xì)胞(例如，DNA損傷或噬菌體感染)以維持健康群體的作用。質(zhì)粒中也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)有TA操縱子，其作用是在細(xì)胞分裂后殺死已經(jīng)丟失了質(zhì)粒的細(xì)胞，這就是已知的分離后殺傷(post-segregationalkilling)現(xiàn)象。因此，TA毒素主要是抑制細(xì)菌的，而不是殺死細(xì)菌的(Gerdes等人，2005)，但是在特定條件下，細(xì)胞可能達(dá)到一個(gè)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的不可逆點(diǎn)(Amitai等人，2004)。近來，Engelberg-Kulka提出，MazF，一種大腸桿菌毒素，不是細(xì)胞死亡的劊子手，而是激活下游系統(tǒng)的介體(Engelberg-Kulka等人，2005)。迄今為止，已經(jīng)詳細(xì)研究了許多來自大腸桿菌基因組的TA模塊(module):嗟菌體編碼的phd-doc模塊(Gazit和Sauer，1999)、質(zhì)粒編碼的kis-kid(Hargreaves等人，2002)、peml-pemK(Zhang等人，2004)和ccdA-ccdB(Loris等人，1999)模塊以及染色體編碼的relB-relE(Pedersen等人，2003;Takagi等人，2005)、chpBI-chpBK(Zhang等人，2005b)、mazE-mazF(Kamada等人，2003;Zhang等人，2003a，Zhang等人，2003b)、yefM-YoeB(Christensen等人，2004;Kamada等人，2005)模塊。此外，大腸桿菌基因組還包含兩種未知功能的TA模塊，dinJ-yafQ和hipB-hipA。hipB-hipA模塊已預(yù)示在導(dǎo)致多藥物抗性的持久性中起作用(Keren等人，2004;Korch等人，2003)。有趣的是，所有TA操縱子似乎都支持相似的由抗毒素及其與毒素形成的復(fù)合物進(jìn)行的調(diào)控、自身調(diào)控模式。此外，已知在各種應(yīng)激條件下產(chǎn)生的(p)ppGpp似乎在TA操縱子的誘導(dǎo)中起重要作用(參見Gerdes等人的綜述，2005)。這些毒素中一種毒素CcdB，直接與促旋酶A相互作用并阻斷DNA復(fù)制(Bahassi等人，1999;Kampranis等人，1999)。已有人提出，Kid與DnaB相互作用，DnaB是染色體復(fù)制和細(xì)胞生長所需的解旋酶(Ruiz-Echevarria等人，1995)。RelE似乎是促進(jìn)mRNA在核糖體A位點(diǎn)切割的核糖體相關(guān)因子(Hayes和Sauer，2003)。PemK(Zhang等人，2004)和MazF(Zhang等人，2003b)為mRNA降解而乾向游離的mRNA。近期多藥物抗性細(xì)菌的出現(xiàn)對公共健康是一個(gè)巨大威脅。尤其是，近期萬古霉素抗性細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)得到嚴(yán)重關(guān)注，因?yàn)槿f古霉素被認(rèn)為是對抗多藥物抗性病原體的最后手段。因此，迫切需要開發(fā)出新的抗生素，特別是靶向以前并未被開發(fā)作為目前可獲得的常規(guī)抗生素的靶的新細(xì)胞功能的抗生素。由于細(xì)菌病原體可被用于生物恐怖主義，因此至關(guān)重要的是開發(fā)出有效的非常規(guī)抗生素，其靶向新的細(xì)胞功能，例如細(xì)菌自殺TA系統(tǒng)。圖1.mazE-mazF操縱子的調(diào)控。從相同的操縱子合成MazE和MazFmRNA。一個(gè)MazE二聚體可以結(jié)合兩個(gè)MazF二聚體從而抑制MazF內(nèi)切核糖核酸酶活性，所得雜六聚體負(fù)自身調(diào)控(negativelyautoregulate)TA操縱子。MazE二聚體經(jīng)ClpPA切割，也能自身調(diào)控TA操縱子轉(zhuǎn)錄，但比MazE-MazF雜六聚體復(fù)合物弱得多。MazF二聚體，當(dāng)其未被MazE結(jié)合時(shí)，作為MIase起作用，特異性地于ACA序列處切割mRNA(Zhang等人，2003b)。該MazF內(nèi)切核糖核酸酶活性導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞生長阻滯并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。所有其他TA系統(tǒng)似乎也都以類似地方式進(jìn)行負(fù)自身調(diào)控。圖2.毒素-抗毒素復(fù)合物的X-射線結(jié)構(gòu)。A.MazF-MazE復(fù)合物。一個(gè)MazE(彩色時(shí)為藍(lán)綠色/右側(cè)的淺灰色)結(jié)合于兩個(gè)MazF同型二聚體(彩色時(shí)為藍(lán)色和淺藍(lán)色/深灰色和特別淺的灰色XKamada等人，2003)。B.RelE-RelB復(fù)合物。兩個(gè)RelB單體(彩色時(shí)為黃色和淺藍(lán)色/左側(cè)的最淺灰色和右側(cè)的特別淺的灰色)與RelE二聚體(彩色時(shí)為綠色和藍(lán)色/左側(cè)的灰色和右側(cè)的深灰色)結(jié)合。當(dāng)結(jié)合于RelE時(shí)，RelB以具有擴(kuò)展構(gòu)象的單體存在(Takagi等人，2005)。C.YoeB-YefM雜六聚體復(fù)合物。兩個(gè)YefM單體(彩色時(shí)是藍(lán)色/淺藍(lán)色和藍(lán)綠色/綠色/朝向底部的深灰色/特別淺的灰色和朝向頂部的淺灰色/灰色)各自與單個(gè)YoeB單體(彩色時(shí)為淺綠色和桔色/左上的淺灰色和朝向右下側(cè)的中度灰色)形成雜三聚體復(fù)合物(Kamada和Hanaoka,2005)。圖3.各種不同的毒素-抗毒素復(fù)合物的X-射線結(jié)構(gòu)[改良自Buts等人(2005)TrendsinBiochem，Sci.30，672-679〗。(a)MazF-MazE(4:2)雜六聚體復(fù)合物。當(dāng)結(jié)合于MazF(灰白色表面)時(shí)，MazE由球形二聚化結(jié)構(gòu)域組成(彩色時(shí)是淺藍(lán)色和粉色/淺灰色和更淺的灰色)其兩側(cè)為具有擴(kuò)展構(gòu)象的兩個(gè)C-末端MazF識別結(jié)構(gòu)域(彩色時(shí)為深藍(lán)色和紅色/左側(cè)的深灰色和右側(cè)的灰色)。在MazF不存在時(shí)，MazE的C-末端結(jié)構(gòu)域是不規(guī)則的(Kamada等人，2003)。(b)YoeB-TfefM(1:2)雜三聚體復(fù)合物。兩個(gè)YefM單體與一個(gè)YoeB單體形成雜三聚體復(fù)合物。在一個(gè)YefM單體中，N-末端結(jié)構(gòu)域完全有序(彩色時(shí)為深藍(lán)色/左側(cè)的深灰色)且結(jié)合于YoeB(呈現(xiàn)灰白色表面)，誘導(dǎo)催化位點(diǎn)中的構(gòu)象變化。在第二個(gè)結(jié)合的YoeB單體不存在時(shí)，第二個(gè)YefM單體的相應(yīng)部分(彩色時(shí)為紅色/如果不是彩色則為中間的灰色)只是部分有序(Kamada和Hanaoka，2005)。(c)RelE-RelB(2:2)雜四聚體復(fù)合物。當(dāng)結(jié)合于RelE時(shí)，RelB以具有擴(kuò)展構(gòu)象的單體存在。在其毒素伴侶不存在時(shí)，推測其為未折疊的。左側(cè)的兩個(gè)RelB單體(彩色時(shí)是紅色和藍(lán)色/左側(cè)的深灰色(藍(lán)色)和右側(cè)的灰色(紅色))結(jié)合于RelE二聚體(灰色表面)(Takagi等人，2005)。圖4，熒光探針和淬滅劑的結(jié)構(gòu)。A，ROX，6-羧基-X-羅丹明的結(jié)構(gòu)。B.Eclipse淬滅劑的結(jié)構(gòu)。該化合物是一個(gè)淬滅400至650nm寬波長范圍熒光的非熒光分子。圖5.利用CBS-1的MazF活性檢測法。A.CBS-1的切割。如文中所述實(shí)施反應(yīng)。在550nm處激發(fā)，在635nm處測定熒光。所使用的MazF量以pmole示于附圖中左側(cè)。B.根據(jù)A中的數(shù)據(jù)，MIase隨時(shí)間的反應(yīng)速率。圖6.利用T7表達(dá)系統(tǒng)在菌林BL21(DE3)中共表達(dá)毒素和抗毒素。在1mMIPTG存在下于37X:孵育生長至對數(shù)期的細(xì)胞培養(yǎng)物4-5h。對總細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。M，蛋白質(zhì)標(biāo)記；道1,無IPTG;道2，BL21(DE3)/pET21phd-doc;道3，BL21(DE3)/pET21hipB-hipA;道4，BL21(DE3)/pET21dinJ-yafQ;道5，BL21(DE3)/pET21mazE-mazF;道6，BL21(DE3)/pET21yefM-yoeB;道7，BL21(DE3)/pET28higB-higA;道8;BL2/(DE3)/pET21chpBI-chpBK;道9，BL21(DE3)/pET21vapB-vapC，和道IO，BL2/(DE3)/pET21RelB-RelE。對于全部操縱子，例如Doc、HipA、YafQ、MazF、YoeB、HigB、ChpBK、VapC和RelE這樣的3'-末端基因產(chǎn)物，除HigB在其N-末端已融合有His標(biāo)簽外，均在其C-末端加His標(biāo)簽。對應(yīng)于毒素和抗毒素的條帶分別用綠色三角和紅色圓圏表示。注意，在該條件下，MazE和His-MazF(道5)共遷移至相同位置。圖7.YafQ，而非YoeB或RelE在酵母中的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞死亡或生長阻滯。將含有2-口m表達(dá)質(zhì)粒pYES2的等量野生型酵母細(xì)胞(其能夠利用半乳糖誘導(dǎo)毒素表達(dá))點(diǎn)到SC-ura板上以維持對表達(dá)質(zhì)粒的選擇，從左至右連續(xù)稀釋細(xì)胞(1:2)。圖8，YoeB表達(dá)抑制體內(nèi)和體外的新蛋白質(zhì)合成。A版，["S]Met向指數(shù)生長的誘導(dǎo)或未誘導(dǎo)YoeB的大腸桿菌細(xì)胞中的整合。對來源于相同培養(yǎng)體積的等量細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE，之后進(jìn)行放射自顯影。B版，用大腸桿菌提取物(Promega)加漸增量的重組YoeB進(jìn)行體外翻譯。分子量標(biāo)記的位置示于中心泳道216、132、78、45.7、32.5、18.4和7.6kDa。圖9.YoeB以與MazF顯著不同的動(dòng)力學(xué)降解mRNA。在誘導(dǎo)了來自結(jié)核分枝桿菌(MTb;頂部版)或大腸桿菌(中間版)的YoeB或大腸桿菌MazF(底部版)后，對lpp(主要外膜脂蛋白)mRNA薄惑定'性進(jìn)行Northern分4斤。圖10.YoeB與70S核糖體間的相互作用移動(dòng)了該核糖體在mRNA模板上的位置。用趾紋檢測法測定YoeB對翻譯起始復(fù)合物的效應(yīng)。A用T7RNA聚合酶產(chǎn)生來自mazG的140nt5'mRNA片段，并將其用于組裝70S核糖體和/或所示起始復(fù)合物中的其他成分。相關(guān)產(chǎn)物的位置示于左側(cè)。"核糖體"指70S核糖體，"tRM"指tRNA編。mazG的相應(yīng)片段的DNA序列梯度用于確定引物停止延伸處的序列和估計(jì)產(chǎn)物間的距離。圖11.YoeB結(jié)合大50S核糖體亞基。從有或沒有阿拉伯糖介導(dǎo)的YoeB表達(dá)(10分鐘)的指數(shù)生長期細(xì)胞收集核糖體級分，并通過蔗糖密度梯度離心分離。通過蛋白質(zhì)印跡分析，底部版反映其正上方圖中代表性級分中YoeB蛋白質(zhì)量。右側(cè)的高峰代表沉淀在蔗糖梯度頂部的tRNA和可溶性蛋白。圖12.用ompA和ompFmRNA進(jìn)行體內(nèi)引物延伸試驗(yàn)在阿拉伯糖存在下誘導(dǎo)YoeB兩小時(shí)后，提取總RNA用于引物延伸試驗(yàn)。如圖所示，對于ompAmRM，引物延伸被阻斷起始密碼子下游3個(gè)堿基，對于ompFmRM，引物延伸被阻斷起始密碼子下游6個(gè)堿基。未觀察到其他條帶。起始密碼子(GTA)和Shine-Dalgarno序列(GGAG)以灰色表示(如果是彩色的，起始密碼子是紅色的，Shine-Dalgarno是藍(lán)色的)。圖13.Doc誘導(dǎo)后的RNA印跡分析。通過加入阿拉伯糖利用pBAD栽體誘導(dǎo)doc基因。在凝膠頂部所指示的誘導(dǎo)后的時(shí)間提取總細(xì)胞■，并通過■印跡分析ompA、tufA和ompFmRM。圖14.利用含有pBADdoc的細(xì)胞，不誘導(dǎo)(左版)和誘導(dǎo)(右版)Doc的細(xì)胞的多核糖體模式。帶有和不帶有通過添加阿拉伯糖引起的Doc誘導(dǎo)的情況下，多核糖體模式如圖ll所述進(jìn)行分析。在有(上版)或無(下版)潮霉素(一種阻斷翻譯延伸反應(yīng)的抗生素)存在下，分析多核糖體模式。圖15.YafQ在體內(nèi)展示位點(diǎn)特異性內(nèi)切核糖核酸酶活性。對部分era基因的體內(nèi)引物延伸分析顯示了增強(qiáng)的由YafQ介導(dǎo)的切割(YafQ誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)是紅線下的5分鐘至120分鐘道，相對于含有era質(zhì)粒但不含YafQ質(zhì)粒的野生型大腸桿菌BW25113細(xì)胞(側(cè)翼于YafQ樣品的0、90、120分鐘道)。時(shí)間表示用0.2%阿拉伯糖在pBAD中誘導(dǎo)YafQ的分鐘數(shù)，在YafQ誘導(dǎo)前30分鐘，eramRNA用IPTG誘導(dǎo)。左側(cè)最緩慢的移動(dòng)帶代表全長引物延伸產(chǎn)物，另外三條帶代表由eramRNA中二級結(jié)構(gòu)引起的未成熟終止。真實(shí)的YafQ識別位點(diǎn)表示為那些相對于對照隨時(shí)間而增加的切割產(chǎn)物。其他的YafQ切割位點(diǎn)標(biāo)注在凝膠較高端，但仍然需要利用不同的era引物以確定切割位點(diǎn)。YafQ的明顯切割位點(diǎn)似乎是ACA(序列梯度上示出的其互補(bǔ)序列)。圖16.DinJ與YafQ形成穩(wěn)定的復(fù)合物。將dinj-yafQ模塊克隆進(jìn)PET表達(dá)栽體以使得能夠在YafQ唯一的羧基末端上添加一個(gè)His6標(biāo)簽。左版和右版中的樣品按照所示出的時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)，經(jīng)歷SDS-PAGE并用考馬斯亮藍(lán)染色。根據(jù)對來自左版樣品的親和層析，右版證實(shí)，DinJ與YafQ條共純化。純化的DinJ-YafQ帶目前正通過MALTI-TOF質(zhì)鐠進(jìn)行驗(yàn)證。圖17.來自枯草桿菌(B.subtilis)、炭疽桿菌(B.anthracis)和金黃色葡萄球菌(S,aureus)的MazF同源物與大腸桿菌MazF的序列比對。相同殘基為黑色背景，同源殘基為灰色背景。圖18.23個(gè)結(jié)核分枝桿菌VapC(mt-l至mt-23)的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。來自結(jié)節(jié)雙螯菌(Dichelobacternodosus)、問號鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans)和都伯林沙門菌(Salmonelladublin)的VapC和推定的其他結(jié)核分枝桿菌毒素MazJ(mt-l)和MazJ(mt-2)也包括在內(nèi)。圖19.克隆環(huán)GFP(厶N(yùn)del)基因。GFP片段將利用5'ATCACATATGATGGCCAGCAAAGGAGAA3'和5'AATACGAATTCGCTTTTGTAGAGCTCGTC或5'CATGAATTCATGGCCAGCAAAGGAGAA3'和5'AATAGCGGCCGCTTAGCTTTTGTAGAGCTCGTC3'和pGFP(ANdel)質(zhì)粒(下劃線的序列對應(yīng)于限制酶識別位點(diǎn))經(jīng)PCR擴(kuò)增。圖20.pET21-GFP/His和pET28-His/GFP質(zhì)粒的示意圖。(A)EcoRI和NotI，以及(B)Ndel和EcoRI將用于靶基因的克隆。以星號示出的限制酶不是獨(dú)特位點(diǎn)。圖21.Ni-NTA和His-標(biāo)記的TA復(fù)合物的相互作用。當(dāng)轉(zhuǎn)移所釋放的GFP-標(biāo)記蛋白以測定其熒光時(shí)，磁珠被拉到試管底部。發(fā)明詳述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一種篩選干擾抗毒素從而使抗毒素不能與其關(guān)聯(lián)毒素形成復(fù)合物的試劑的方法。這樣的試劑可作為抗生素來抑制細(xì)菌生長。不同于常規(guī)抗生素，預(yù)期乾向毒素-抗毒素("TA")復(fù)合物形成的抗生素將主要通過從TA復(fù)合物中游離毒素來對細(xì)胞生長起協(xié)同抑制效應(yīng)，從而導(dǎo)致去阻遏TA操縱子表達(dá)。其結(jié)果是，更多的活性毒素釋放到細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致更有效的生長抑制和最終的細(xì)胞死亡。這是由于這樣一個(gè)事實(shí)TA復(fù)合物比抗毒素獨(dú)自更為有效地抑制TA操縱子的轉(zhuǎn)錄。幾乎所有細(xì)菌都含有毒素，這些毒素在細(xì)胞中與其關(guān)聯(lián)抗毒素形成穩(wěn)定TA復(fù)合物以便使毒素不能對細(xì)胞發(fā)揮其毒性效應(yīng)。本發(fā)明提供對能夠解離TA復(fù)合物以將毒素釋放入細(xì)胞的小化學(xué)制劑的高通量篩選。該篩選技術(shù)反過來促進(jìn)新類型抗生素的檢測，這也包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的實(shí)施方案包括破壞任何TA系統(tǒng)的試劑的篩選系統(tǒng)，包括其毒素作為任何mRNA干擾酶(MIase)起作用的TA系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)上述方法為各MIase合成特異性可切割信標(biāo)(beacon)底物。本文因此提供特異針對各個(gè)其中毒素作為MIase起作用的TA系統(tǒng)的篩選系統(tǒng)。本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括利用GFP-融合TA復(fù)合物的針對非-MIase毒素的篩選系統(tǒng)，所述復(fù)合物帶有用于如下述進(jìn)行的分離的His標(biāo)簽。因此，本發(fā)明提供一種鑒定試劑的方法，所述試劑防止或部分防止抗毒素與其關(guān)聯(lián)毒素形成復(fù)合物。本發(fā)明的試劑優(yōu)選干擾抗毒素以便它們不能與其關(guān)聯(lián)毒素形成復(fù)合物。通過把向這樣的復(fù)合物的形成，本發(fā)明試劑作為新的非常規(guī)形式抗生素是頗有價(jià)值的。本發(fā)明的試劑包括特異性靶向特定細(xì)菌或特定組細(xì)菌的那些試劑。因此，本發(fā)明的篩選(鑒定)方法非常敏感，即，特異針對各特定TA系統(tǒng)。該試劑可以是任何分子，且優(yōu)選是小分子或化學(xué)制劑，但本發(fā)明不限于小分子。本發(fā)明也可以涵蓋大分子，包括肽、多肽、和蛋白質(zhì)等。本發(fā)明的方法包括，使?jié)撛谠噭┡c經(jīng)標(biāo)記的底物在溶液中接觸。如果用于鑒定作為mRNA干擾酶起作用的試劑，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述底物可包括短DNA-RM嵌合底物。這樣的底物理想地長為約5至約20個(gè)核苷酸堿基，更優(yōu)選為約12個(gè)核苷酸堿基。經(jīng)標(biāo)記的底物可以是特異針對一個(gè)特定或超過一個(gè)特定的TA系統(tǒng)的可切割信標(biāo)底物。通常，MIase抑制劑切割特定關(guān)鍵堿基，即，被MazF毒素切割的rU殘基核糖核苷酸。因此，可切割底物的一個(gè)實(shí)施方案利用了一種經(jīng)修飾的底物，其包含rU和dA之間的可切割位點(diǎn)。潛在試劑，如果作為MazF或其他毒素起作用，將在該位點(diǎn)進(jìn)行切割?？捎糜诒景l(fā)明的探針在5'端有熒光，在3'端有淬滅劑。在優(yōu)選方法中，該熒光探針是R0X，淬滅劑是Eclipse。當(dāng)被切割時(shí)，焚光探針從淬滅劑和熒光物質(zhì)上脫離下來。這樣的探針或底物稱作可切割信標(biāo)底物(CleavableBeaconSubstrates,CBS)。本領(lǐng)域已知的其他探針可用于本發(fā)明的方法。標(biāo)記探針(被切割時(shí))的檢測指示防止抗毒素與毒素形成復(fù)合物的試劑的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，底物是(1GdAdTdArUdAdCdAdTdAdTdG。在另一個(gè)實(shí)施方案中，底物是可切割信標(biāo)底物(CBS-1)且用于鑒定防17止MazE/MazF復(fù)合物形成的試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，底物是dGdAdTdArUrArCdGdTdAdTdG。在另一個(gè)實(shí)施方案中，底物是可切割信標(biāo)底物(CBS-2)且用于鑒定防止ChpBI/ChpBK復(fù)合物形成或YdcD/YdcE復(fù)合物形成的試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，底物是(1GdAdTdArUrArCdCdTdAdTdG。在另一個(gè)實(shí)施方案中，底物是可切割信標(biāo)底物(CBS-3)且用于鑒定防止YdcD/YdcE復(fù)合物形成的試劑。在用于非-MIase類型毒素的本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，底物包含綠色熒光蛋白(GFP)-標(biāo)記的抗毒素和His-標(biāo)記的毒素。可選擇地，底物包含His-標(biāo)記的抗毒素和GFP-標(biāo)記的毒素。GFP-標(biāo)記的毒素或GFP-標(biāo)記的抗毒素包含一個(gè)位于GFP和毒素之間或GFP和抗毒素之間的接頭。取決于蛋白質(zhì)，本發(fā)明的接頭具有各種不同的長度以提供蛋白質(zhì)的任選功能。GFP融合不應(yīng)當(dāng)抑制TA復(fù)合物形成。易于確定對各GFP-融合TA復(fù)合物適宜大小的接頭。在用Ni-NTA磁性瓊脂糖珠除去His-標(biāo)記的毒素之后，通過測定溶液中從GFP-標(biāo)記的抗毒素產(chǎn)生的GFP熒光信號來檢測試劑對底物，即TA復(fù)合物，的解離。可選擇地，如果GFP-標(biāo)記與毒素而非抗毒素融合，His-標(biāo)記與抗毒素而非毒素附著，在用Ni-NTA磁性瓊脂糖珠除去His-標(biāo)記的抗毒素之后，通過測定溶液中從GFP-標(biāo)記的毒素產(chǎn)生的GFP熒光信號來檢測TA復(fù)合物的解離。本發(fā)明還提供由本發(fā)明的任何方法鑒定的試劑。因此，本發(fā)明的試劑能夠干擾TA復(fù)合物的形成，并作為非常規(guī)抗生素起作用。TA復(fù)合物通常來自細(xì)菌細(xì)胞。本發(fā)明的新抗生素優(yōu)選針對人病原性細(xì)菌。本發(fā)明還提供含有與一種或多種常規(guī)抗生素聯(lián)合的一種或多種不同的本發(fā)明試劑的組合物。該組合物可以是還包含藥物賦形劑的藥物組合物?！N以上的任選地與一種或多種常規(guī)抗生素聯(lián)合使用的試劑將為這樣的試劑和/或抗生素提供附加或協(xié)同效應(yīng)。這樣的不同試劑可在一種病原性細(xì)菌中影響一種以上的TA復(fù)合物(系統(tǒng))，部分或完全抑制TA復(fù)合物。此外，本發(fā)明提供一種用于殺死或抑制微生物細(xì)胞生長的方法，該方法包括將病原與本發(fā)明試劑接觸。此外，本發(fā)明還提供處理感染的方法，包括施用任何本發(fā)明的藥物組合物。這樣的感染可以是肺結(jié)核、抗生素抗性或多藥物抗性細(xì)菌，例如對萬古霉素有抗性的細(xì)菌。本發(fā)明的方法還涵蓋用于生物恐怖主義的病原體。還提供了一種調(diào)控細(xì)菌細(xì)胞休眠的方法，其通過使細(xì)胞與本發(fā)明的試劑接觸以使細(xì)胞休眠而非導(dǎo)致細(xì)胞死亡來調(diào)控。"病原體，，、"微生物物質(zhì)，，、"感染物質(zhì)"在本文中可互換使用，意指導(dǎo)致其宿主疾病或患病的生物物質(zhì)。如本文所使用的"感染"是外來物種向宿主生物體的侵入。本發(fā)明的組合物可口服、口腔內(nèi)、腸胃外、鼻內(nèi)、經(jīng)直腸或局部施用。本發(fā)明方法中所使用的藥物載體和賦形劑是本領(lǐng)域中已知的。術(shù)語"抑制劑"指防止、減少、阻斷、中和或抵消另一試劑的效應(yīng)的試劑。術(shù)語"cDNA"指用逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的單鏈互補(bǔ)或拷貝DNA。單鏈cDNA常用作探針以鑒定目的DNA片段或基因中的互補(bǔ)序列。如本文中所使用，術(shù)語"編碼"、"編碼的"、"編碼性"、"被編碼"、"被編碼的"，對特定核酸來說，指儲(chǔ)存在核酸中用于翻譯成特定蛋白質(zhì)的信息。編碼蛋白質(zhì)的核酸可以在核酸的翻譯區(qū)域中含有非翻譯序列(例如，內(nèi)含子)，或者可以缺失這樣的插入非翻譯序列(例如，在cDNA中)。編碼蛋白質(zhì)的信息通過密碼子的使用來確定。通常，氨基酸序列根據(jù)"通用"遺傳密碼子由核酸編碼。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)中改變、增加或缺失所編碼序列中一個(gè)氨基酸或低百分含量氨基酸的單獨(dú)取代、缺失或添加是"保守性修飾變體，，，其中的改變導(dǎo)致用化學(xué)上類似的氨基酸取代氨基酸。術(shù)語"保守性修飾變體"適用于氨基酸和核酸序列。對于特定核酸序列，保守性修飾變體指那些編碼相同氨基酸序列或氨基酸序列保守性修飾變體的那些核酸。由于遺傳密碼簡并，大量功能相同的核酸編碼任意給定蛋白質(zhì)。例如，密碼子UUA、UUG、OJU、CUC、CUA、和CUG全部編碼亮氨酸。因此，在每一個(gè)由密碼子確定為亮氨酸的位置，該密碼子都可以被改變?yōu)樗鱿鄳?yīng)密碼子中的任何一個(gè)而不改變所編碼多肽。這樣的核酸變化是"沉默變化"并代表一個(gè)物種的保守性修飾變化。參照遺傳密碼，本文所述的每個(gè)編碼多肽的核酸序列也描述該核酸的每個(gè)可能的沉默變化。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，核酸中的各密碼子(除AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密碼子；和UGG,其通常是色氨酸的唯一密碼子，之外)可被修飾以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼本發(fā)明多肽的核酸的各沉默變化在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明包括mRNA干擾酶多肽的活性部分、片段、衍生物、突變體和功能性變體，只要這樣的活性部分、片段、衍生物、突變體和功能性變體保持mRNA干擾酶的任何生物學(xué)特性。mRNA千擾酶多肽的"活性部分"意指短于全長多肽但保持有可測定的生物學(xué)活性的肽。mRNA干擾酶的"片段"意指至少五至七個(gè)連續(xù)氨基酸的一段氨基酸殘基，通常為至少約七至九個(gè)連續(xù)氨基酸，典型為至少約九至十三個(gè)連續(xù)氨基酸，最優(yōu)選為至少約二十至三十個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸。mRNA干擾酶的衍生物或其片段意指通過改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列而經(jīng)過修飾的多肽，例如，通過操作編碼蛋白質(zhì)的核酸或通過改變蛋白質(zhì)本身。天然氨基酸序列的這樣的衍生物可包括插入、添加、缺失或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸，也可以改變或不改變原始mRNA干擾酶的必需活性。術(shù)語"基因"指位于編碼特定功能性產(chǎn)物(即，蛋白質(zhì)或RNA分子)的DNA片段上特定位置中的有序核苷酸序列。它可包括編碼DNA前后的區(qū)域以及外顯子之間的內(nèi)含子。術(shù)語"誘導(dǎo)"或"可誘導(dǎo)的"指基因或基因產(chǎn)物其轉(zhuǎn)錄或合成可通過將細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)物或某一條件下來提高。術(shù)語"誘導(dǎo)物"或"誘導(dǎo)劑"指與抑制劑蛋白質(zhì)聯(lián)合產(chǎn)生不再能夠與操縱基因結(jié)合的復(fù)合物的低分子量化合物或物理試劑。在將核酸插入細(xì)胞中的語境中，術(shù)語"引入的"、"導(dǎo)入的，，、"轉(zhuǎn)染，，、"轉(zhuǎn)化"、"轉(zhuǎn)導(dǎo)"包括涉及將核酸整合進(jìn)原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中，其中該核酸可整合進(jìn)細(xì)胞基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)，轉(zhuǎn)變成自主復(fù)制子或瞬時(shí)表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。術(shù)語"分離的"指例如核酸或蛋白質(zhì)這樣的材料，其基本上游離于如在其天然存在的環(huán)境中所發(fā)現(xiàn)的通常與之伴隨或與之相互作用的成分。分離的材料可選地包括該材料在其自然環(huán)境未曾被發(fā)現(xiàn)過的材料；或者，如果該材料是在自然環(huán)境中的，其已經(jīng)通過人類的故意干預(yù)被合成(非天然地)改變。例如，"分離的核酸"可包含插入載體(例如質(zhì)?；虿《据d體)中的DNA分子，或整合進(jìn)原核或真核細(xì)胞或宿主生物基因組DNA的DNA分子。當(dāng)應(yīng)用于RNA，術(shù)語"分離的核酸"主要指由如上所定義的分離的DNA分子所編碼的RNA分子?？蛇x擇地，該術(shù)語可指已從在其自然狀態(tài)(即，在細(xì)胞或組織中)下通常與之結(jié)合的其他核酸完全分離的RNA分子。分離的核酸(DNA或RNA)還可代表由生物學(xué)或合成途徑直接產(chǎn)生并脫離于其生產(chǎn)過程中存在的其他成分的分子。如本文所使用的術(shù)語"MazF"指一類內(nèi)切核糖核酸酶，指具有特定名稱的特定酶，以及與其具有結(jié)構(gòu)和序列同源性且與本發(fā)明MazF多肽作用一致的其活性片段和衍生物。本發(fā)明所包括的酶家族指"mRNA干擾酶"。本發(fā)明意欲擴(kuò)展至具有與本發(fā)明的這一酶家族的作用一致的結(jié)構(gòu)和功能相似性的分子。如本文中所使用的，術(shù)語"核酸"或"核酸分子"包括任何DNA或RNA分子，或者單鏈或者雙鏈，且如果是單鏈的話，還包括線性或環(huán)狀的其互補(bǔ)序列分子。在討論核酸分子時(shí)，特定核酸分子的序列或結(jié)構(gòu)可根據(jù)從5'至3'方向提供序列的通常慣例在本文中進(jìn)行描述。除非另有限制，該術(shù)語包括已知類似物。術(shù)語"操縱基因"指基因上游(5')的DNA區(qū)域，一種或多種調(diào)控蛋白(阻遏物或激活劑)可與之結(jié)合從而控制基因的表達(dá)。如本文所使用的，術(shù)語"操縱子"指控制基因表達(dá)的功能性整合遺傳單元。它由一個(gè)或多個(gè)編碼一種或多種多肽的基因以及通過調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄來控制其表達(dá)的相鄰位置(啟動(dòng)子和操縱基因)組成。術(shù)語"表達(dá)操縱子"指，可能具有例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、翻譯起始信號、多腺苷酸化信號、終止子等這樣的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列(其促進(jìn)多肽編碼序列在宿主細(xì)胞或生物體中表達(dá))的核酸片段。短語"可操作連接的"包括涉及啟動(dòng)子和第二個(gè)序列之間的功能性連接，其中啟動(dòng)子序列引發(fā)和介導(dǎo)相應(yīng)于第二個(gè)序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。通常，可操作連接的意指，被連接的核酸序列是連續(xù)的，且在必要時(shí)連接兩個(gè)連續(xù)的且在同一閱讀框中的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域。術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，其指氨基酸殘基的多聚物。這些術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在的氨基酸的人造化學(xué)類似物的氨基酸多聚物，以及天然存在的氨基酸多聚物?？s寫"PCR"指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它是一種擴(kuò)增DNA量的技術(shù)，由此使得DNA易于分離、克隆和測序。參見，例如美國專利號5,656,493、5,33,675、5，234，824和5，187，083,這些專利各自以引用方式并入本文。如本文所使用的術(shù)語"啟動(dòng)子"包括在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游(5')且涉及RNA聚合酶及其他蛋白質(zhì)的識別和結(jié)合以起始轉(zhuǎn)錄的DNA23區(qū)域。術(shù)語"可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子"指對特定化合物，即誘導(dǎo)物或誘導(dǎo)劑，的存在或?qū)o定外部條件，例如升高的溫度，產(chǎn)生應(yīng)答的啟動(dòng)子的激活。本文所使用的術(shù)語"調(diào)控"指，通過一些標(biāo)準(zhǔn)或原理抑制、促進(jìn)、控制、管理、指向或調(diào)節(jié)的作用，或者處于被抑制、促進(jìn)、控制、管理、指向或調(diào)節(jié)的狀態(tài)。術(shù)語"阻遏物"包括，與基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游特定DM序列(操縱基因)結(jié)合或者與能夠通過關(guān)閉或開啟基因而調(diào)控該基因的操縱子結(jié)合的蛋白質(zhì)或試劑。術(shù)語"核糖體RNA"(rRNA)指核糖體(所有活細(xì)胞的蛋白質(zhì)制造機(jī)器)的中心成分。這些機(jī)器在多種核糖體蛋白質(zhì)存在下自組裝成兩個(gè)復(fù)合物折疊結(jié)構(gòu)(大小亞基)。在細(xì)菌、古細(xì)菌、線粒體和葉綠體中，小核糖體亞基包含16SrRNA，其中16S中的S代表Svedberg單位；大核糖體亞基包含兩個(gè)rRNA種(5S和23SrRNAs)。細(xì)菌16S、23S和5SrRNA基因通常組裝為一個(gè)共轉(zhuǎn)錄操縱子?？赡艽嬖诜稚⒂诨蚪M中的一個(gè)或多個(gè)拷貝的操縱子。真核細(xì)胞通常具有多個(gè)拷貝的以串聯(lián)重復(fù)組裝的rRNA基因。大多數(shù)真核生物中的18SrRNA位于小核糖體亞基，且大亞基包含三個(gè)rRNA種類(5S、5.8S和25S/28SrRNAs)。術(shù)語"總RNA"包括信使RNA("mRM"，在細(xì)胞中將來自DNA的信息攜帶到其中mRM被翻譯成蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)合成的核糖體位點(diǎn)的RNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA("tRNA"，在蛋白質(zhì)翻譯過程中將特定氨基酸轉(zhuǎn)移到生長中的多肽鏈的小RNA鏈)、核糖體RNA("rRM")和非編碼RNA(也已知為RNA基因或小RNA，意指編碼不翻譯成蛋白質(zhì)的RNA的基因)。術(shù)語"十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，，縮寫為SDS-PAGE。術(shù)語特定核酸序列的"變體"、"突變體"和"衍生物"指與特定序列緊密相關(guān)但可能天然或經(jīng)過設(shè)計(jì)而帶有序列或結(jié)構(gòu)變化的核酸序列。"緊密相關(guān)"意指至少約60%，但經(jīng)常，85%以上，的核苷酸序列與限定長度的核酸序列匹配。緊密相關(guān)的核酸序列之間在核苷酸序列上的變化或差異可代表，在特定核酸序列的正常復(fù)制或加倍過程中出現(xiàn)的序列中的核苷酸變化?？梢詾樘囟康脑谛蛄兄刑禺愋栽O(shè)計(jì)和引入其他變化?？梢岳么罅空T變技術(shù)體外制造這樣的特定變化。特異性產(chǎn)生的這樣的序列變體可以稱作原序列的"突變體"或"衍生物"。本領(lǐng)域技術(shù)人員同樣能夠產(chǎn)生具有單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失、添加或置換的蛋白質(zhì)變體。除此之外，這些變體可包括(a)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被保守或非保守氨基酸取代的變體；(b)其中添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的變體；(c)其中至少一個(gè)氨基酸包含一個(gè)取代基團(tuán)的變體；(d)其中位于保守位點(diǎn)或者非保守位點(diǎn)的一個(gè)種類的氨基酸被取代為另一種類中的相應(yīng)殘基的變體；和(d)其中靶蛋白與例如融合伴侶、蛋白質(zhì)標(biāo)簽或其他化學(xué)部分這樣的另一肽或多肽融合的變體，所述另一肽或多肽可以賦予靶蛋白例如抗體表位這樣的有用性質(zhì)。用于獲得這樣的變體的技術(shù)，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的遺傳(抑制、缺失、突變等)、化學(xué)和酶促技術(shù)。如本文所使用的，術(shù)語"栽體"和"表達(dá)載體"指復(fù)制子，即，作為載體或轉(zhuǎn)運(yùn)體(transporter)的任何試劑，其上可附著另一遺傳序列或元件(DNA或RNA)以使所附著的序列或元件復(fù)制以及使序列或元件可被運(yùn)送到宿主細(xì)胞中，例如噬菌體、質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、嗟菌體或病毒。必須注意，如本文及所附權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"、"和，，、"該"以及"所迷，，包括復(fù)數(shù)指代物，除非上下文中已清楚地另外指明。本文所使用的所有科技術(shù)語具有相同的含義。除非另外定義，本文所使用的所有科技術(shù)語具有與由本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同的含義。盡管發(fā)明的實(shí)踐或測試，但優(yōu)選方法和材料是如下所描述的。本文所提及的所有公開文本均以引用方式并入本文，以公開和描述與所引用的公開文本有關(guān)的方法和/或材料。實(shí)施例為了向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供一個(gè)如何制備和使用本發(fā)明的完整公開和描述，給出以下實(shí)施例，但無意于限制發(fā)明人視作其發(fā)明的范圍，也無意于表示以下實(shí)驗(yàn)即為所進(jìn)行的全部或僅有的實(shí)驗(yàn)。已努力確保所給出數(shù)字(例如，量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但是也應(yīng)考慮一些實(shí)驗(yàn)誤差或偏離。除非另外指明，份是指重量份，分子量是指平均分子量，溫度是攝氏度，壓力為大氣壓或接近大氣壓。為篩選干擾TA復(fù)合物的潛在試劑，將使用來自人病原體和大腸桿菌的多種TA復(fù)合物，它們可以容易地用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和純化。為了檢測TA復(fù)合物的解離，可以使用高靈敏度的高通量方法，其依賴于使用mRNA千擾酶(MIase)毒素的信標(biāo)型RNA底物或非-MIase毒素的GFP-融合TA復(fù)合物的熒光檢測。毒素-抗毒素(TA)系統(tǒng)MazE-MazF毒素-抗毒素系統(tǒng)在MazEFTA系統(tǒng)(Aizenman等人，1996;Kamada等人，2003;Marianovsky等人，2001;Zhang等人，2003b)中，MazF毒素是穩(wěn)定的，MazE抗毒素/解毒劑是不穩(wěn)定的。MazE的短半衰期是因?yàn)橛葾TP-依賴性絲氨酸蛋白酶，ClpPA引起的降解(Aizenman等人，1996)。操縱子被MazE或MazE-MazF復(fù)合物負(fù)自身調(diào)控(Marianovsky等人，2001;Zhang等人，2003a)。由Engelberg-Kulka提出的受鳥噤呤-3、5'-雙-焦磷酸鹽(ppGpp)的調(diào)控(Alzenman等人，1996)已有諸多爭論，且似乎ppGpp不直接調(diào)控mazEF轉(zhuǎn)錄但間接調(diào)控MazF的活化(例如，通過Lon蛋白酶)(Gerdes等人，2005)。TA模塊的轉(zhuǎn)錄和/或mazEFmRNA的翻譯受到抑制時(shí)，出現(xiàn)MazEF-介導(dǎo)的細(xì)胞生長阻滯，因?yàn)镸azE比MazF不穩(wěn)定得多。因此，如附圖1所示，MazF從其與MazE的復(fù)合物中游離出來。嚴(yán)重的氨基酸或胸腺嘧啶饑俄(Sat等人，2003)、例如利福平和氯霉素這樣的特定抗生素(Sat等人，2001)、毒素蛋白質(zhì)Doc(Hazan等人，2001)或例如高溫、氧化應(yīng)激和DNA損傷這樣的其他壓力條件(Hazan等人，2004)導(dǎo)致出現(xiàn)MazF的活化。MazE和MazF結(jié)構(gòu)和功能歷史上MazF已被分類為翻譯抑制劑。然而，該抑制的靶實(shí)際上是mRNA，而非翻譯裝置，如我們近期已經(jīng)證實(shí)的，MazF是序列特異性的內(nèi)切核糖核酸酶(Zhang等人，2003b)。MazF顯示顯著的底物特異性。它只切割單鏈RM(而非DNA或dsRNA)，主要在序列ACA的A和C之間切割。細(xì)胞tRNA似乎由于其廣泛的二級結(jié)構(gòu)因而受到保護(hù)不被切割，而rRNA似乎由于其與核糖體蛋白質(zhì)的緊密聯(lián)系而逃脫被MazF降解。因此，MazF表達(dá)導(dǎo)致mRNA幾乎完全降解，引起與生長阻滯有關(guān)的嚴(yán)重的蛋白質(zhì)合成減少(Zhang等人，2003b)。與MazF具有序列相似性的蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)于大量細(xì)菌或其染色體外質(zhì)粒中。大腸桿菌中一種稱作PemK的R100質(zhì)粒編碼的毒素也是一種序列特異性內(nèi)切核糖核酸酶，其具有比MazF更寬的切割特異性(Zhang等人，2004)。MazF及其在大腸桿菌和其他細(xì)菌中的功能性對應(yīng)物作為mRNA干擾酶(MIases)MazE-MazF復(fù)合物的X-射線結(jié)構(gòu)已得到解決(Kamada等人，2003)。這，與兩種其他不帶其解毒劑伴侶的單獨(dú)毒素的晶體結(jié)構(gòu)(Hargreaves等人，2002;Loris等人，1999)一起，揭示了全部三種毒素之間存在相當(dāng)可觀的結(jié)構(gòu)相似性，雖然它們具有不同的靼和序列。與一項(xiàng)表明MazF(lllaa)與MazE(82aa)以一個(gè)MazE二聚體比兩個(gè)MazF二聚體的比率形成穩(wěn)定復(fù)合物(Zhang等人，2003a)的生物化學(xué)研究的數(shù)據(jù)一致，MazE和MazF復(fù)合物的X-射線晶體結(jié)構(gòu)由一個(gè)含有交互MazE和MazF同型二聚體的2:4雜六聚體組成(F2-E2-F2,附圖2A)。有趣的是，MazE的C-末端區(qū)域是高負(fù)電荷且高度無序的，并延伸至MazF同型二聚體中的兩個(gè)MazF分子之間形成的縫隙之上。MazE上的這一帶電荷延伸可模擬單鏈RNA結(jié)構(gòu)并通過阻斷其RNA底物結(jié)合位點(diǎn)來破壞MazF的內(nèi)切核糖核酸酶活性(Zhang等人，2003b)。TA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究已大大提高了我們對于單獨(dú)的毒素如何與其關(guān)聯(lián)抗毒素形成穩(wěn)定復(fù)合物的理解。除MazE-MazF復(fù)合物的X-射線結(jié)構(gòu)(Kamada等人，2003)(附圖2A)之外，最近已確定了RelB-RelE復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(Takagi等人，2005)(附圖2B)和YefM-YoeB復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(Kamada和Hanaoka，2005)。在各復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，抗毒素以下文詳細(xì)討論的各種不同方式與其關(guān)聯(lián)毒素相互作用。MazF-底物類似物復(fù)合物的麗R結(jié)構(gòu)和RelBNMR溶液結(jié)構(gòu)近期已4皮確定。如附圖2所示，在各TA系統(tǒng)中，毒素與其關(guān)聯(lián)抗毒素以特異于TA復(fù)合物的獨(dú)特方式相互作用。因此，可以僅對一種特異性病原性細(xì)菌或一組特異性病原性細(xì)菌開發(fā)極為獨(dú)特的抗生素。而且，如果一種病原體具有一種以上的TA系統(tǒng)，則可以開發(fā)針對各TA系統(tǒng)的特異性抗生素。這可以導(dǎo)致兩種不同抗生素對病原體的附加或協(xié)同效應(yīng)。此外，該提案中所開發(fā)的新抗生素與常規(guī)抗生素的作用預(yù)計(jì)是協(xié)同的，因?yàn)樗鼈兪褂猛耆煌募?xì)胞靶。將針對各TA系統(tǒng)開發(fā)一種高靈敏度的方法以篩選阻斷TA復(fù)合物形成或能夠解離TA復(fù)合物的化學(xué)制劑。這些方法可用于高通量篩選(例如，為the訓(xùn)RoadmapInitiative建立的theNIHMolecularLibrariesScreeningCenter)。以下公開文本(其各自全文以引用方式并入本文)，進(jìn)一步描述了細(xì)菌毒素，其包括Mol.Cell中的一份關(guān)于MazF-誘導(dǎo)的準(zhǔn)休眠和單-蛋白質(zhì)產(chǎn)生系統(tǒng)的論文。CharacterizationoftheinteractionswithinthemazEFaddictionmoduleofEscherichiacoliJ.Biol.Chem(2003)278，32300-32306(Zhang等人，2003a)我們證實(shí)，功能性MazEF復(fù)合物由兩個(gè)MazF二聚體加一個(gè)MazE二聚體組成。該復(fù)合物顯示結(jié)合于mazEF操縱子。MazE被發(fā)現(xiàn)直接結(jié)合于DNA，而MazF增強(qiáng)MazE的DM結(jié)合活性。最后，通過酵母雙雜合體系統(tǒng)確定了MazE和MazF之間的結(jié)合界面。我們得出結(jié)論認(rèn)為，MazE由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，N-末端DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和與MazF相互作用的C-末端結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)果與MazE-MazF復(fù)合物的X-射線結(jié)構(gòu)一致(Kamada等人，2003)。MazFcleavescellularmRNAsspecificallyatACAtoblockproteinsynthesisinEscherichiacoliMol.Cell(2003)12，913-923(Zhang等人，2003b)利用無細(xì)胞系統(tǒng)，我們證實(shí)MazF抑制蛋白質(zhì)合成但不抑制DNA復(fù)制或RM合成。隨后，我們證實(shí)MazF是只作用于單鏈RNA的序列特異性(ACA)內(nèi)切核糖核酸酶。MazF作為不依賴于核糖體的核糖核酸酶起作用，且因此，在功能上顯著區(qū)別于RelE(另一種在核糖體的A位點(diǎn)上輔助mMA切割的大腸桿菌毒素)(Pedersen等人，2003)。在誘導(dǎo)后，MazF切割幾乎所有細(xì)胞mRNA從而有效阻斷蛋白質(zhì)合成。純化的MazF在原核和真核無細(xì)胞系統(tǒng)中均抑制蛋白質(zhì)合成。該抑制被針對MazF的不穩(wěn)定的抗毒素MazE解除。因此，MazF作為通過在特異性序列切割細(xì)胞mRNA來干擾其功能并由此導(dǎo)致細(xì)胞生長阻滯的毒性內(nèi)切核糖核酸酶起作用，我們?yōu)檫@一類型的內(nèi)切核糖核酸酶設(shè)計(jì)術(shù)語"mRNA干擾酶"(MIase)。各種不同生長條件下，這樣的內(nèi)切核糖核酸酶的作用可能在細(xì)胞生理學(xué)中具有廣泛的意義。InterferenceofmRNAfunctionbythesequence-specificendoribonucleasePemkJ.Biol.Chem.(2004)279，20678-20684(Zhang等人，2004)peml-pemKTA系統(tǒng)位于質(zhì)粒R100上，通過在大腸桿菌群體中的分離后殺傷來幫助維持該質(zhì)粒。我們證實(shí)PemK是切割mRNA的另一種MIase，而Peml阻斷該活性。PemK只切割單鏈RM，優(yōu)選在"UAX(X為C、A或U)"序列中的A殘基的5'或3'側(cè)切割。盡管PemK以前被認(rèn)為通過DnaB來抑制DNA復(fù)制(Ruiz-Echevarria等人，1995)，我們現(xiàn)在清楚地顯示，PemK是一種MIase。已報(bào)導(dǎo)的ColElDNA復(fù)制的抑制可以容易地通過PemK對RNAII(ColElDNA復(fù)制的一個(gè)引物)，的MIase活性來解釋。此外，PemK誘導(dǎo)對各種真核細(xì)胞的生長抑制(delaCueva-Mendez等人，2003)也可以通過PemK對細(xì)胞mRM的MIase活性來解釋。InsightsintothemRNAcleavagemechanismbyMazF，anmRNAinterferaseJ.Biol，Chem.(2005)280，3143-3150(Zhang等人，2005a)利用含有XACA的RNA-DNA嵌合底物，MazF在ACA序列的5'-末端(X和A之間)切割底物，在一端產(chǎn)生一個(gè)2'，3'-環(huán)磷酸鹽，另一端產(chǎn)生一個(gè)游離5'-0H。利用這些底物，我們證實(shí)殘基X的2'-0H基團(tuán)是MazF切割所必需的，而所有的其他殘基可以是脫氧核糖。SingleproteinproductioninlivingcellsfacilitatedbyanmRNAinterferase.Mol.Cell(2005)18，253-261(Suzuki等人，2005)我們發(fā)現(xiàn)，盡管由于MazF在大腸桿菌中的誘導(dǎo)導(dǎo)致幾乎所有細(xì)胞mRNA均被MazF降解從而完全抑制細(xì)胞生長，細(xì)胞仍然是具有完全代謝活性的。這通過開發(fā)MazF的ACA-特異性MIase活性得到證實(shí)。我們發(fā)現(xiàn)，MazF和經(jīng)基因工程改造的編碼無ACA的mRNA的靶基因的相伴表達(dá)導(dǎo)致在實(shí)際上背景細(xì)胞蛋白質(zhì)合成不存在的條件下的持續(xù)且高水平(高達(dá)90%)的靶物表達(dá)。事實(shí)上，我們將大腸桿菌轉(zhuǎn)變成了生產(chǎn)單一蛋白質(zhì)的生物反應(yīng)器，因此該系統(tǒng)被稱作"單一蛋白質(zhì)生產(chǎn)"(SPP)系統(tǒng)。在完全細(xì)胞生長阻滯下細(xì)胞仍然能夠生產(chǎn)單一目的蛋白31質(zhì)，這一事實(shí)表明，在一定長的時(shí)期內(nèi)，細(xì)胞的代謝能力是完整的，由此在生長阻滯細(xì)胞中不僅能量代謝(ATP生產(chǎn))而且氨基酸和核普酸的生物合成功能也是完全有活性的。此外，轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)器也維持得很好并且是完全有功能的。因此，在MazF誘導(dǎo)的休眠下的細(xì)胞處于一種新的生理學(xué)狀態(tài)，其被稱作"準(zhǔn)休眠，，。準(zhǔn)休眠的發(fā)現(xiàn)為研究可能在細(xì)菌病原性和多藥物抗性維持中起重要作用的新細(xì)菌生理學(xué)開辟了一條令人興奮的道路。ChpBK，anmRNAinterferasefrom280,26080-26088(Zhang等人，2005b)ChpBK是一種由大腸桿菌基因組chpBIKTA模塊編碼的毒素，由116個(gè)氨基酸殘基組成。其序列顯示與MazF35。/。同一性和52%相似性。我們發(fā)現(xiàn)ChpBK是另一種以與MazF相同的方式在ACY(U，A，或G)切割mRNA的MIase。未發(fā)表的初步結(jié)果CharacterizationofdualsubstratebindingsitesinthehomodimericstructureofEscherichiacolimRNAinterferaseMazF.J.Mol.Biol.(Li等人，2005)出版中我們最近在與加拿大多倫多大學(xué)安大略癌癥研究所(OntarioCancerInstitute,theUniversityofToronto,Canada)的教授Dr.M.Ikura的合作中確定了與底物類似物形成復(fù)合物的MazF二聚體的NMR結(jié)構(gòu)。我們證實(shí)在MazF同型二聚體的凹面上有個(gè)一雙重底物結(jié)合位點(diǎn)，因此MazF同型二聚體是一個(gè)配有兩個(gè)相同的用于mRNA加工的結(jié)合位點(diǎn)的雙齒(bidentate)內(nèi)切核糖核酸酶。然而重要的是，CharacterizationofEscherichiacoliJ.Biol.Chem.(2005)占據(jù)一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的單個(gè)MazE分子能夠影響兩個(gè)位點(diǎn)的構(gòu)象，從而有效地阻礙MazF的MIase活性。結(jié)核分枝桿菌中的多種mRNA干擾酶我們證實(shí)結(jié)核分枝桿菌包含至少七個(gè)編碼MazF同源物的基因(mtl至mt7)，其中四個(gè)當(dāng)在大腸桿菌中被誘導(dǎo)時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞生長抑制。我們還發(fā)現(xiàn)，MazF-mtl、-mt3和-mt6作為類似于大腸桿菌MazF的序列特異性mRNA干擾酶起作用。這些結(jié)果表明，多種mRNA干擾酶的存在對于人組織中該病原的多維休眠應(yīng)答可能是重要的。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基本原理——除例如衣原體、支原體和麻風(fēng)分枝桿菌(M.leprae)這樣的專性細(xì)胞內(nèi)病原體外，包括病原性細(xì)菌在內(nèi)的所有細(xì)菌均含有自殺基因(Pandey和Gerdes，2005)。尤其有趣的是注意到，某些自由生存細(xì)菌，其生長極為緩慢，具有大量TA系統(tǒng)；例如，結(jié)核分枝桿菌包含至少38個(gè)TA系統(tǒng)。在這些可用作生物武器的病原性細(xì)菌中，炭疽桿菌含有一個(gè)MazF-MazETA系統(tǒng)，鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis)含有五個(gè)不同的TA系統(tǒng)。內(nèi)毒梭菌(Clostridiumbotulinum)的基因組序列無法獲得，但是其近親破傷風(fēng)梭菌(C.tetani)含有至少一個(gè)Phd-DocTA系統(tǒng)。這些事實(shí)十分引人注意地暗示，細(xì)菌TA系統(tǒng)是開發(fā)顯著區(qū)別于目前可獲得的常規(guī)抗生素的新抗生素的理想靶物。所有TA系統(tǒng)被認(rèn)為在正常生長條件下以毒素-抗毒素復(fù)合物的形式在最佳生長細(xì)胞中表達(dá)以便抑制毒性效應(yīng)。迄今為止，如附圖3所示，已經(jīng)解決了三種毒素-抗毒素復(fù)合物X-射線結(jié)構(gòu)。引人注意的是，各組形成彼此不同的獨(dú)特復(fù)合物。然而，所有這些抗毒素在細(xì)胞中比其關(guān)聯(lián)毒素更不穩(wěn)定得多，因此當(dāng)應(yīng)激條件下蛋白質(zhì)合成受阻時(shí)，抗毒素被細(xì)胞蛋白酶消化將毒素釋放入細(xì)胞。結(jié)果細(xì)胞生長受到抑制并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，基于以下原因，任何阻斷毒素和抗毒素間相互作用的化學(xué)制劑均可作為細(xì)菌的潛在抗生素(1)這些化學(xué)制劑將從抗毒素與其關(guān)聯(lián)毒素的復(fù)合物中完全或部分釋放出抗毒素，并且所釋放抗毒素將被細(xì)胞蛋白酶快速除去從而導(dǎo)致細(xì)胞中游離毒素的釋放，(2)毒素-抗毒素復(fù)合物是比抗毒素單獨(dú)更強(qiáng)有力得多的針對其操縱子的阻遏物，因此，在化學(xué)制劑存在下細(xì)胞中將合成更多的毒素和抗毒素，和(3)在這些化學(xué)制劑存在下，新合成的抗毒素將不能與其關(guān)聯(lián)毒素形成穩(wěn)定的復(fù)合物。結(jié)果，毒素的細(xì)胞濃度將升高，從而導(dǎo)致細(xì)胞生長抑制。靶向毒素-抗毒素復(fù)合物的抗生素的協(xié)同效應(yīng)(抗毒素的去除進(jìn)一步誘導(dǎo)毒素產(chǎn)生)是獨(dú)特的，且為本發(fā)明抗毒素的一個(gè)尤其重要的特性。這一新類型抗生素的另一個(gè)重要方面是，它們可能特異針對各毒素-抗毒素復(fù)合物或者僅特異針對一組同源TA系統(tǒng)，由此有可能開發(fā)出有效抵抗特定病原體的獨(dú)特抗生素。如我們以下所描述的，來自大腸桿菌的所有TA復(fù)合物(MazF-MazE、YoeB-YefM、YafQ-DinJ、RelE-RelB、ChpBK-ChpBI和HipA-HipB)已被分離并且可以在我們實(shí)驗(yàn)室得到，且將用于各篩選方法的開發(fā)。此外來自枯草桿菌的YdcE-YdcD復(fù)合物(YdcE與炭疽桿菌MazF同源物96%相同)、來自劇毒大腸桿菌CFT073的HigB-HigA復(fù)合物、來自謹(jǐn)菌體Pl的Doc-Phd復(fù)合物和來自流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)的VapC-VapB復(fù)合物也已被純化，并且可以容易地在我們實(shí)驗(yàn)室獲得。這十個(gè)TA復(fù)合物幾乎包括了細(xì)菌中所有已知的TA系統(tǒng)；其中一些作為mRMA干擾酶(MazF，ChpBKandYdcE)起作用，而其他的作為刺激核糖體內(nèi)在內(nèi)切核糖核酸酶活性(RelE)或阻斷翻譯起始(YoeB)的核糖體相關(guān)因子起作用。還確定了YafQ、HipA、Doc、HigB和VapC的毒性機(jī)制。我們還純化了來自金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的MazF-MazE同源復(fù)合物和來自結(jié)核分枝桿菌的VapC-VapB復(fù)合物。結(jié)核分枝桿菌含有多達(dá)23個(gè)不同的VapC-VapBTA系統(tǒng)。本發(fā)明提供了在加入試劑后檢測毒素從各TA系統(tǒng)的TA復(fù)合物中解離的方法，所述試劑可以是小分子化學(xué)制劑、其他分子或任何能夠部分或全部抑制TA復(fù)合物形成的試劑。這些方法依賴于熒光探針的使用以在加入小分子化學(xué)制劑后檢測從TA復(fù)合物釋放的毒素或釋放的抗毒素。毒素和抗毒素之間的相互作用發(fā)生在其表面非常廣泛的區(qū)域上，并且包括電荷和疏水性相互作用(參見附圖3)。因此，一制。然而，兩種或多種這些弱抑制劑的加入可能導(dǎo)致巨大的協(xié)同抑制效應(yīng)，如果它們各自在不同位點(diǎn)與TA復(fù)合物相互作用。因此，可以根據(jù)這些抑制化合物設(shè)計(jì)一種新化學(xué)制劑，其將聯(lián)合這些抑制化合物的效應(yīng)。還有可能發(fā)現(xiàn)并不直接干擾TA相互作用，但與毒素或抗毒素之一結(jié)合從而產(chǎn)生導(dǎo)致毒素和抗毒素從TA復(fù)合物上解離的變構(gòu)構(gòu)象變化的化學(xué)制劑。研究I檢測序列特異性MIase活性的高靈敏度底物的開發(fā)將使用一種已被詳細(xì)表征的MIase，MazF作為開發(fā)高靈敏度底物的模型蛋白質(zhì)，利用它可以在高通量化學(xué)制劑篩選中檢測從MazE-MazF復(fù)合物釋放的甚至小量MazF。為此目的，我們合成了12個(gè)堿基的短DNA-RNA嵌合底物dGdAdTdArUdTdAdTdG。我們近來已經(jīng)顯示，rU殘基是使核糖核苷酸被MazF切割的關(guān)鍵堿基(Zhang等人，2005a)。為了開發(fā)檢測MazFmRNA干擾酶活性的最敏感方法，我們通過在5'末端附著熒光探針在3'末端附著淬滅劑對這一底物進(jìn)行了修飾。除非在rU和dA間發(fā)生切割使得焚光探針從淬滅劑脫離，否則該修飾底物并不發(fā)出熒光。我們將mRNA千擾酶這種類型的底物稱為可切割信標(biāo)底物或CBS。我們利用了R0X(6-羧基-X-羅丹明)對5'-末端修飾和利用Eclipse作為淬滅劑在3'-末端修飾(分別為附圖4A和B)。兩個(gè)分子間的距離為12堿基，該距離足以使Eelipse淬滅5'-末端R0X的熒光。在眾多熒光探針中，我們選擇了R0X，因?yàn)樗軌虻挚构馄锥以趯抪H范圍內(nèi)都是穩(wěn)定的。我們選擇了Eclipse作為淬滅劑，因?yàn)樗叨确€(wěn)定且因此可安全地用于所有寡核苷酸脫保護(hù)反應(yīng)中。此外，Eclipse實(shí)質(zhì)上比其他淬滅劑更缺電子，由此導(dǎo)致對寬范圍染料的更好淬滅。方法MazF的可切割信標(biāo)底物(CBS)的合成。僅在被切割時(shí)(被MazF切割的情況)發(fā)射熒光的12堿基MA-RNA嵌合信標(biāo)底物(CBS-1)是丄Rox"dGdAdTdArUSnH5BdTdAdTdG-Eclipse合成:i口下利用EpochEclipseQuencherCPG(EpochBiosciences,Inc.)對3'-末端修飾，DNA-RNA嵌合底物由DNA/RM合成儀(AB13400)合成。對于5'末端，使用了氨基接頭(C6)(ABI)。對于DNA片段，使用了DNAamidite(Proligo)，對于RNA片段(rU殘基)，使用了RNAamidite(Proligo)進(jìn)行寡核苷酸合成。合成后，利用28%氨(用水稀釋的)乙醇(3:1)從CPG處將寡核苷酸切下。55'C下孵育由此獲得的溶液6小時(shí)以從各堿基上除去保護(hù)基團(tuán)。反應(yīng)后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器干燥樣品。之后將產(chǎn)物溶解于TEA-3HF/TEA/1-NMP(4:3:6)中，并在65C下處理溶液6小時(shí)以除去第4位上的rU殘基2'-0H基團(tuán)上的保護(hù)基團(tuán)。[TEA-三乙胺，TEA-3HF-三乙胺-三-氫氟酸鹽，且1-NMP-1-甲基-2-吡咯烷酮]脫鹽后，通過反相HPLC純化產(chǎn)物。該階段的產(chǎn)物為5'-NH2-dGdAdTdArUdAdCdAdTdAdTdG-Eclipse-3'。在弱堿性條件下用R0X-SE(Invitrogon)修飾產(chǎn)物。通過凝膠過濾純化反應(yīng)混合物以除去游離R0X染料。用PAGE進(jìn)一步純化所得產(chǎn)物以將ROX-修飾產(chǎn)物與未修飾產(chǎn)物分離。脫鹽后冷凍干燥終產(chǎn)物CBS-1。MazF對CBS-1的切割反應(yīng)——如上所示，預(yù)計(jì)CBS-1在rU和dA殘基之間被切割，導(dǎo)致熒光發(fā)射。在一項(xiàng)預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們合成了小量CBS-1并用純化的MazF進(jìn)行切割反應(yīng)。MIase反應(yīng)按照下述實(shí)施將5jul(5x)MazF緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.8)，10y1蒸餾水和5y1CBS-l溶液(2pmol/jal)混合，混合物在37^C下預(yù)溫育。通過加入不同濃度的MazF(5p1)起始反應(yīng)(參見附圖5)。所使用的激發(fā)和發(fā)射波長分別為550和635nm。初步結(jié)果示于附圖5，從該附圖可以得到如下許多有趣的觀察結(jié)果1.該12-堿基CBS-1底物作為MazF的適宜且敏感的底物起作用，表明分別附著在12堿基核苷酸5'-末端和3'-末端的ROX和Eclipse不會(huì)阻斷MazFMIase酶促反應(yīng)。2.反應(yīng)起始速率與MazF濃度之間存在線性關(guān)系。3.反應(yīng)中所使用的MazF與引發(fā)因子(用于MazF高表達(dá)的一種冷休克分子伴侶)融合。有趣的是，該融合蛋白可在無MazE——MazF的抗毒素存在下表達(dá)。目前并不知道MazF與引發(fā)因子融合時(shí)的這一低毒性的原因。所使用的蛋白質(zhì)似乎僅表現(xiàn)一輪切割反應(yīng)且可能不完全切割底物。無論如何，該試驗(yàn)清楚地證實(shí)我們的底物能夠檢測甚至低濃度MazF的MIase活性，且因此其將適用于高通量篩選潛在抗生素。基于這些初步結(jié)果，將利用沒有任何融合的純化MazF重復(fù)該試驗(yàn)。其他MIase的特異性可切割信標(biāo)底物的合成迄今為止，除MazF外，已經(jīng)對另外兩種MIases，來自大腸桿菌K12的ChpBK(Zhang等人，2005b)和來自枯草桿菌的YdcE(Pellegrini等人，2005)進(jìn)行了表征。我們將為這些MIases合成以下12-堿基CBS底物對于ChpBK:ROX-dGdAdTdA]UHHffldGdTdAdTdG-Eclipse(CBS-2)i對于YdeE.ROX-dGdAdTdAjHSHdCdTdAdTdG-Eclipse(CBS-3)將根據(jù)上述用于CBS-1的方法來合成這些CBS底物。ChpBK和YdcE均(但MazF不)可切割CBS-2,而CBS-3僅可被YdcE切割。這些底物對于檢測特異性MIase具有重要意義，且可用于對未知的且其特異性尚未被表征的MIase進(jìn)行表征。如研究2中所討論的，在確定YoeB和YafQ的切割特異性后，我們將為為它們設(shè)計(jì)新的CBS底物。本發(fā)明包括破壞任何TA系統(tǒng)的試劑的篩選系統(tǒng)，所述TA系統(tǒng)包括其毒素作為任何MIase起作用的TA系統(tǒng)。由于我們從研究2發(fā)現(xiàn)了更多MIase并確定了它們的特異切割序列，我們將根據(jù)上述方法為各MIase合成特異性可切割信標(biāo)底物。通過這種方式，我們將能開發(fā)出特異針對其毒素作為MIase起作用的單獨(dú)TA系統(tǒng)的篩選系統(tǒng)。預(yù)期問題及其解決辦法在附圖5中，由于所使用蛋白具有單輪切割活性，因此底物未被完全水解。如上述所提到的，當(dāng)用純化的MazF重復(fù)試驗(yàn)時(shí)，反應(yīng)靈敏度將有可能顯著提高。然而，如果反應(yīng)仍未改善，那么可能意味著這是MazF的內(nèi)在酶促特性或者所使用底物的特性。在后一種情況中，產(chǎn)物的疏水性(ROX或Eclipse任一)可能干擾MazF的第二輪結(jié)合。為中和該效應(yīng)，我們將在反應(yīng)中混入各種不同的溫和去污劑，其將通過38解離結(jié)合的反應(yīng)產(chǎn)物而不影響酶活性來提高底物的可接近性。研究2從大腸桿菌和其他病原性細(xì)菌中分離各種不同的TA復(fù)合物。在本研究中，我們將從非病原性和病原性細(xì)菌中分離許多TA復(fù)合物(參見表1)1.在研究3(在研究3中TA復(fù)合物將用于篩選小化學(xué)制劑)之前，我們將確保從各種不同細(xì)菌中克隆的表1各TA操縱子在大腸桿菌中良好表達(dá)。這對于建立篩選系統(tǒng)是很重要的。2.我們將確定尚未進(jìn)行表征的TA系統(tǒng)的細(xì)胞靶。這將使我們能夠如之前部分中對MazF所述的那樣為各TA系統(tǒng)開發(fā)出獨(dú)特的底物。如附圖6所示，我們已經(jīng)克隆了來自大腸桿菌K12的全部六個(gè)TA系統(tǒng)(MazF-MazE、ChpBK-ChpBI、RelE-RelB、YoeB-YefM、YafQ-DinJ和HipA-HipB)并利用T7表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá)(亦參見表l)。在所有情況中，TA復(fù)合物都得到良好表達(dá)。由于所有毒素蛋白質(zhì)都是His標(biāo)記的，因此所有TA復(fù)合物均可利用Ni-NTA樹脂容易地純化，并如之前對MazF所描述的進(jìn)一步從其中純化出毒素(Zhang等人，2003b)。在這六個(gè)TA系統(tǒng)中，RelE(Hayes和Sauer，2003;Pedersen等人，2003)、MazF(Zhang等人，2003b)和ChpBK(Zhang等人，2005b)已進(jìn)行過表征(參見表1)。我們將純化剩余三種毒素YoeB、YafQ和HipA并鑒定它們的細(xì)胞靶。此外，我們將從劇毒大腸桿菌CFT073林系中分離HigA-HigB復(fù)合物。HigA-HigB是細(xì)菌(包括鼠疫耶爾森菌，鼠疫的病原學(xué)試劑)中最豐富的TA系統(tǒng)之一。已報(bào)道YdcE-YdcD復(fù)合物來自枯草桿菌。炭疽桿菌MazF同源物與枯草桿菌YdcE具有93%的同一性，類似地，YdcD與其炭疽桿菌對應(yīng)物具有53%同一性。因此，阻斷YdcE-YdcD復(fù)合物形成的所有或一些化學(xué)制劑可能也抑制炭疽桿菌中的MazF-MazE同源復(fù)合物形成。表l.本申請中研究的TA系統(tǒng)列表TA棋塊(毒素-抗毒素)'細(xì)菌或鎮(zhèn)菌體長度(a.a毒素.)抗毒素毒素fe琳大腸桿菌K12"1e2mRNAChpBK"ChpBI大腸桿菌K1211663大腸桿菌K12的79核糖體大煬桿菌K128492核糖體YatQ-DlnJ大脈桿菌K129286mRNA大腸桿菌K12440助未知大腸桿菌CR073知94未知！枯草桿菌93mRNA金黃色葡萄球菌，2056VapC-Vap6流行性感窗桿菌，327S未知噬菌體pif2673未知我們還將分離來自金黃色葡萄球菌(一種導(dǎo)致從皮膚感染至危及生命的廣譜疾病的最普通人病原體)的MazF-MazE同源物。因此，嬸選針對該病原體的新抗生素也是非常重要的，尤其是因?yàn)槌霈F(xiàn)了該病原體的多藥物抗性菌株。我們還將從流行性感冒桿菌(H.influenzae)(人呼吸道中的一種常見病原體)和結(jié)核分枝桿菌中分離多種VapC-VapB復(fù)合物。后一種病原體通常含有大量(多至23個(gè))TA系統(tǒng)。這意味著，TA系統(tǒng)可能在這一最具破壞性的人病原體的休眠中起重要作用。應(yīng)當(dāng)注意到，有可能發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致對該病原體中的VapC-VapBTA系統(tǒng)完全或部分抑制的化學(xué)制劑。最后，我們將從噬菌體Pl分離Doc-Phd復(fù)合物，在另一種人病原體霍亂弧菌(Vibriocholerae)中發(fā)現(xiàn)了其同源物。大腸桿菌YoeB的細(xì)胞耙的特征新近已確定了YefM-YoeB(2:1)復(fù)合物的X-射線結(jié)構(gòu)(Kamada和Hanaoka，2005)。利用純化的YoeB，作者顯示，YoeB優(yōu)選在A或G殘基處切割RNA，并推測YoeB毒性是由其內(nèi)切核糖核酸酶活性導(dǎo)致的。由Kamada和Hanaoka給出的這些體夕卜數(shù)據(jù)與由Gerdes及其同事公開的體內(nèi)數(shù)據(jù)(Christensen等人，2004)—致。然而，如下所示，我們的結(jié)果清楚地表明，YoeB的該效應(yīng)不是其主要功能。我們的初步數(shù)據(jù)有力支持了這一假說YoeB的主要靶物是翻譯起始復(fù)合物并且它特異性抑制翻譯起始。如下所述已經(jīng)獲得了充分的初步數(shù)據(jù)。然而，額外的試驗(yàn)將清楚地鑒定出YoeB的確切細(xì)胞靼物，以及該蛋白質(zhì)的翻譯起始抑制機(jī)制。1.YoeB毒性特異針對原核生物——與后面所述另一種MIaseYofQ相反，YoeB在酵母細(xì)胞中沒有毒性(附圖7)。這與YoeB結(jié)合于在細(xì)菌和酵母間不保守的50S核糖體這一事實(shí)一致。2.YoeB是一種在其誘導(dǎo)后立即阻斷細(xì)胞生長和細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的非常有效的毒素一一利用阿拉伯糖-可誘導(dǎo)的pBAD載體誘導(dǎo)YoeB后，在5分鐘內(nèi)細(xì)胞生長(未顯示)和蛋白質(zhì)合成幾乎完全受到抑制(附圖8)。相反，在誘導(dǎo)MazF(序列特異性核糖核酸酶，其功能不依賴于核糖體)后的更長時(shí)間(至少15-20分鐘)之后，細(xì)胞蛋白質(zhì)合成才受到抑制(Zhang等人，2003b)。3.YoeB誘導(dǎo)后細(xì)胞mRNA是穩(wěn)定的——盡管YoeB誘導(dǎo)對蛋白質(zhì)合成的突然抑制，YoeB誘導(dǎo)后的細(xì)胞mRNA比MazF誘導(dǎo)后的細(xì)胞mRNA穩(wěn)定得多(附圖9)。最重要的是，在MazF誘導(dǎo)后，全長lppmRNA非常迅速地消失(5分鐘內(nèi))，而YoeB誘導(dǎo)一個(gè)小時(shí)以上后，仍然存在基本量的全長lppmRNA。用兩種無關(guān)mRNAs，ompA和rpsAmRNA獲得了類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。我們還用結(jié)核分枝桿菌YoeB—一其在大腸桿菌中也具有很高毒性——實(shí)施了該試驗(yàn)，類似于大腸桿菌YoeB，它在誘導(dǎo)后90分鐘并不完全切割lppmRM。4.YoeB與翻譯起始復(fù)合物結(jié)合——趾紋實(shí)驗(yàn)證實(shí)，YoeB的添加導(dǎo)致趾紋帶向正常趾紋帶(起始密碼子下游13-14個(gè)堿基)上游偏移ll個(gè)堿基。該帶僅能在核糖體存在下觀察到(附圖10)。特別是，在相同條件下，在無核糖體存在下，mRNA不被YoeB切割(道2，附圖10)。5.YoeB是50S核糖體相關(guān)蛋白一一由于YoeB結(jié)合于翻譯起始復(fù)合物(附圖10)，因此我們下一步調(diào)查了YoeB是否與核糖體亞基之一有特異性聯(lián)系。我們從過表達(dá)YoeB的細(xì)胞制備了核糖體富集的提取物，在蔗糖密度梯度上純化了核糖體并觀察到Y(jié)oeB共沉降物具有含有完整70S核糖體的級分以及含有50S核糖體亞基的級分(附圖11)。因此，YoeB在體內(nèi)與核糖體的50S而非30S亞基特異性結(jié)合。此外，YoeB與70S核糖體結(jié)合這一事實(shí)表明，它不抑制30S亞基與50S亞基之間的相互作用。6.YoeB在體內(nèi)特異性阻斷起始密碼子下游幾個(gè)堿基的引物延伸——我們的假說"YoeB通過與翻譯起始復(fù)合物結(jié)合從而抑制翻譯起始，，預(yù)言，YoeB誘導(dǎo)導(dǎo)致全長mRNA的積聚且由此mRNA中在翻譯起始密碼子附近而非在任何其他位置的引物延伸被阻斷。如附圖12中所能看到的，引物延伸被阻斷在ompA和ompFmRNA起始密碼子下游的幾個(gè)堿基處，且重要的是，在起始密碼子上游和下游未檢測到其他帶。這表明，YoeB的確特異性阻斷翻譯起始，而并不作為將在起始密碼子上游和下游顯示切割的內(nèi)切核糖核酸酶起作用。總之一一YoeB是原核細(xì)胞中的特異性蛋白質(zhì)合成抑制劑，其結(jié)合于50S核糖體。我們推測，體內(nèi)(Christensen等人，2004)和體外(Kamada和Hanaoka，2005)觀察到的明顯內(nèi)切核糖核酸酶活性是YoeB的內(nèi)在特性，其僅能在延長誘導(dǎo)YoeB后或在RNA與大量YoeB體外孵育時(shí)被檢測到。我們將繼續(xù)調(diào)查YoeB與核糖體的相互作用導(dǎo)致翻譯起始抑制的精確分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法我們的結(jié)果清楚顯示，YoeB是一種新型毒素。我們還沒有鑒定YoeB的確切細(xì)胞靶物及其f1起翻譯起始抑制的分子機(jī)制。我們將繼續(xù)對YoeB進(jìn)4亍研究以實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。YoeB細(xì)胞乾物的鑒定我們將采用以下兩種不同方法將使用酵母雙雜交系統(tǒng)，其在我們實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)用于鑒定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，來尋找在大腸桿菌中與YoeB相互作用的蛋白質(zhì)。在第二種方法中，我們將開始與Dr.DanielWilson(Max-PlanckInstituteforMolecularGenetics)--一位低溫-電子顯微鏡學(xué)(cryo-electronmicroscopy)的專家合作，我們目前正與他合作鑒定Der(大腸桿菌中的一種必需GTPase)在50S核糖體亞基上的位置。此外，我們還使用了無大腸桿菌細(xì)胞系統(tǒng)(Promega)并利用例如polyU這樣的^L清楚限定的合成同聚物來確證YoeB特異性抑制翻譯起始而非翻譯延伸。PolyU在無細(xì)胞系統(tǒng)中用于合成聚苯丙氨酸，它不需要tRNAfM、因?yàn)閜olyU沒有起始密碼子。如果我們的假說是正確的，那么YoeB將不會(huì)抑制polyPhe合成。YoeB-YefM復(fù)合物用于化學(xué)制劑篩選的用途為了篩選抑制YoeB-YefM復(fù)合物形成的化學(xué)制劑，我們將釆用兩種獨(dú)立的方法；一種方法開發(fā)其負(fù)責(zé)切割富含嘌呤的序列的弱內(nèi)在內(nèi)切核糖核酸酶活性(Kamada和Hanaoka，2005)，另一種方法利用如研究3中所述的GFP-融合技術(shù)。對于前一方法，如Kamada和Hanaoka所示，我們將開發(fā)含有富含嘌呤的YoeB切割序列的CBS底物(Kamada和Hanaoka，2005)。將如研究1中所述合成該CBS底物。Doc細(xì)胞耙物的特征1.細(xì)胞mRNA的穩(wěn)定——已從噬菌體P1中克隆了Doc-PhdTA操縱子，并利用T7表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá)(附圖6)。由于該復(fù)合物易于大量制備，我們已開始與哥倫比亞大學(xué)的Dr.JohnHunt合作以確定其X-射線結(jié)構(gòu)。由于例如霍亂弧菌這樣的人病原體中存在其同源物(29%同一性和47°/。同源性)，因此篩選針對該TA系統(tǒng)的化學(xué)制劑具有重要的藥學(xué)實(shí)用性。此外，我們迄今的初步結(jié)果揭示，該毒素是一種非常有效的生長抑制劑，其通過在翻譯延伸水平抑制蛋白質(zhì)合成。最顯著的是，如從附圖13所看到的，甚至在Doc誘導(dǎo)后120分鐘細(xì)胞mRNA仍未被降解。2.翻譯延伸的有效抑制劑——似乎Doc功能類似于氯霉素和潮霉素，后二者通過阻斷細(xì)胞mRNA降解來穩(wěn)定多核糖體。事實(shí)上，甚至不添加潮霉素，2小時(shí)Doc誘導(dǎo)后的多核糖體模式也不會(huì)改變[附圖14中的右版；比較上版(含潮霉素)與下版(不含潮霉素)]。另一方面，在無Doc誘導(dǎo)時(shí)，如果未加入潮霉素，則多核糖體消失(附圖14中左側(cè)下版)。這清楚地指示，Doc毒素以與氯霉素和潮霉素類似的方式抑制翻譯延伸。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法我們還將調(diào)查這一新的蛋白質(zhì)合成抑制劑。我們目前制備了針對Doc蛋白質(zhì)的抗血清，其將被用于鑒定與Doc相互作用的核糖體亞基。與Dr.JohnHunt合作確定的Doc-Phd復(fù)合物的X-射線結(jié)構(gòu)將為Doc和Phd間的相互作用提供豐富信息，并為其細(xì)胞毒性提供一定認(rèn)識。我們還將開始與Dr.DanielWilson合作以確定Doc相互作用在核糖體上的確切位點(diǎn)。如對YoeB所討論的，我們還將利用無細(xì)胞系統(tǒng)來確證，不考慮所使用的mRNA，Doc都是一種非常有效的蛋白質(zhì)合成延伸抑制劑。來自大腸桿菌的YefQ-DinJ復(fù)合物中YafQ的特征1.原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的通用生長抑制劑——有趣的是，如附圖7所示，YafQ象MazF—樣，不僅作為大腸桿菌而且作為酵母的生長抑制劑起作用，而YoeB或RelE是原核細(xì)胞特異性生長抑制劑。這些結(jié)果表明，YafQ具有與YoeB或RelE顯著不同的作用機(jī)制，因?yàn)槠浒形飶募?xì)菌到真核細(xì)胞是保守的。2.YafQ是一種序列特異性MIase——我們的初步數(shù)據(jù)表明，除MazF和ChpBK外，YafQ是另一種MIase，一種序列特異性內(nèi)切核糖核酸酶(附圖15)。大腸桿菌BW25113細(xì)胞用阿拉伯糖可誘導(dǎo)YafQ質(zhì)粒和表達(dá)非特異性基因(在此為era基因)的IPTG可誘導(dǎo)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，以確定與對照相比(其僅從該基因的天然染色體拷貝表達(dá)YafQ)YafQ誘導(dǎo)是否導(dǎo)致在特異性位點(diǎn)對eramRNA的切割提高。以下顯示的結(jié)果表明，類似于MazF，YafQ識別ACA序列，然而該MIase是否識別任何其它特異性序列仍有待確定。3.DinJ與YafQ形成復(fù)合物——我們利用親和層析來證實(shí)YafQ與DinJ形成穩(wěn)定的復(fù)合物(附圖16)。該表達(dá)系統(tǒng)目前被我們的合作者Dr.JohnHunt(哥倫比亞大學(xué))用于制備X-射線晶體學(xué)樣品。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法如我們已經(jīng)對MazF所實(shí)施的那樣，我們將利用不同的天然mRNA和合成RNA實(shí)施詳盡實(shí)驗(yàn)以確定YafQMIase活性的確切特異性(Zhang45等人，2005a)。基于由此確定的切割特異性，我們將合成YafQ的CBS底物。大腸桿菌的HipA-HipB復(fù)合物中HipA的特征HipA由于其高分子量而成為一種非常不尋常的毒素。盡管所有其他毒素均由約100個(gè)氨基酸殘基組成，來自大腸桿菌K12的HipA由440個(gè)殘基組成。已暗示該hipB-hipA模塊在導(dǎo)致多藥物抗性的持久性(persistence)中起作用。已知，野生型大腸桿菌細(xì)胞群體的特定部分甚至在沒有藥物抗性基因存在下都對包括青霉素在內(nèi)的許多抗生素具有抗性。這一被稱作"細(xì)菌持久性(bacterialpersistence)，，的現(xiàn)象被認(rèn)為是用抗生素治療患者過程中的主要藥物問題。持久性與細(xì)菌群體(其是遺傳學(xué)相同的)中預(yù)先存在的異質(zhì)性有關(guān)，因?yàn)樵谡ＩL細(xì)胞和生長速率降低的"持久，，細(xì)胞間存在表型轉(zhuǎn)換。有趣的是，一個(gè)hipA突變體菌林(hipA7、G22S和D291A)增強(qiáng)"持久"細(xì)胞抵抗多種不同抗生素的細(xì)胞表型(Moyed和Bertrand,1983)。對HipA細(xì)胞乾物的鑒定可以為持久性表型的分子機(jī)制提供重要認(rèn)識。實(shí)驗(yàn)^L計(jì)和方法在我們實(shí)驗(yàn)室，HipA-HipB復(fù)合物已在大腸桿菌中良好表達(dá)(附圖6)。對該復(fù)合物的X-射線結(jié)構(gòu)分析已經(jīng)開始(與哥倫比亞大學(xué)的Dr.JohnHunt合作)。為了鑒定HipA的細(xì)胞靶物，我們將首先使用酵母雙雜交系統(tǒng)，并且還嘗試通過一個(gè)在Ni-NTA樹脂上利用His-標(biāo)記的HipA的下拉實(shí)驗(yàn)(pul卜downexperiment)來分離可能與HipA相互作用的細(xì)胞因子。HipA的其他特征將依賴于如上鑒定的細(xì)胞靶物。由于HipA7突變體蛋白對細(xì)胞無致死效應(yīng)，我們將表達(dá)和純化該突變體蛋白以用于進(jìn)一步的生化表征。我們對由HipA在大腸桿菌中的誘導(dǎo)引起的細(xì)胞絲狀(filamentaUon)表型尤其感興趣，其表明HipA可能與細(xì)胞分裂直接或間接相關(guān)(例如通過抑制DNA復(fù)制)。我們計(jì)劃利用針對HipA的抗血清來確定HipA的細(xì)胞定位，該抗血清目前正在我們實(shí)驗(yàn)室中制備。預(yù)期從這些實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果將為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)方法提供重要基礎(chǔ)，以解決HipA對細(xì)胞生長發(fā)揮其毒性效應(yīng)的確切分子機(jī)制。大腸桿菌的HigA-HigB復(fù)合物中HigB的特征已經(jīng)表達(dá)了HigB-HigA復(fù)合物(附圖6)。我們現(xiàn)在將借助上迷用于YoeB、Doc、YafQ和HipA的方法繼續(xù)鑒定HigB的細(xì)胞靶物。由于該系統(tǒng)是原核細(xì)胞中的主要TA系統(tǒng)之一，因此如研究3中所迷HigB-HigA復(fù)合物也將被包括在內(nèi)用于篩選小分子。來自革蘭氏陽性細(xì)菌的MazF同源物的特征如之前所討論的，篩選針對來自枯草桿菌(YdcE)和金黃色葡萄球菌的MazF同源物的小分子對于開發(fā)針對例如炭疽桿菌和金黃色葡萄球菌這樣的革蘭氏陽性病原體的新抗生素具有重要意義。因此，我們將克隆和表達(dá)它們的TA復(fù)合物用于研究3。YdcE的RNA切割特異性已被Pellegrini等人確定(Pellegrini等人，2005)。來自金黃色葡萄球菌的MazF同源物的RNA切割特異性將按照與對大腸桿菌MazF所實(shí)施的類似的方式來確定(Zhang等人，2003b)。流行性感冒桿菌和結(jié)核分枝桿菌中VapC-VapB復(fù)合物中VapC的特征。我們已經(jīng)克隆和表達(dá)了來自流行性感冒桿菌的VapC-VapB復(fù)合物(附圖6)。我們還發(fā)現(xiàn)，流行性感冒桿菌VapC的表達(dá)對大腸桿菌是致死的(未示出)。目前，其細(xì)胞靶物未知。試驗(yàn)i史計(jì)和方法流行性感冒桿菌VapC的特征一一我們已經(jīng)克隆和表達(dá)了來自流行性感冒桿菌的VapC-VapB復(fù)合物(附圖6)。我們還發(fā)現(xiàn)，流行性感冒桿菌VapC的表達(dá)對大腸桿菌有致死效應(yīng)(未示出)。然而，在液體培養(yǎng)中，細(xì)胞生長繼續(xù)許多代并形成伸長的細(xì)胞(未示出)。這表明，DNA復(fù)制可能被VapC抑制，因?yàn)橐阎獙M復(fù)制的抑制可阻斷細(xì)胞分裂從而導(dǎo)致絲狀細(xì)胞的形成。在本申請中，我們將首先如在我們的關(guān)于MazF的特征的論文中所描述的，通過研究VapC誘導(dǎo)對尿嘧咬向RNA中摻入、胸腺嘧咬向DM中的摻入以及甲硫氨酸向蛋白質(zhì)合成中的摻入的效應(yīng)，體內(nèi)鑒定VapC的細(xì)胞耙物(Zhang等人，2003b)。我們還將利用酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定在細(xì)胞中與VapC相互作用的蛋白質(zhì)。由于我們將表達(dá)其中在VapC的C-末端帶有His標(biāo)簽的VapC-VapB復(fù)合物，我們還將嘗試通過一個(gè)利用Ni-NTA樹脂的下拉實(shí)驗(yàn)來分離可能與VapC相互作用的細(xì)胞因子。VapC的進(jìn)一步特征將依賴于VapC的細(xì)胞靼物。來自結(jié)核分枝桿菌的VapC同源物——結(jié)核分枝桿菌不尋常地含有大量(23個(gè))VapC-VapB同源物。它們的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系示于附圖18。由于這些模塊可能對該病原體在人組織中的休眠起重要作用，因此值得將靶向這些復(fù)合物以篩選小分子。該病原體還具有9個(gè)MazF同源物，它們?nèi)慷家言谖覀儗?shí)驗(yàn)室中克隆。其中一些在大腸桿菌中良好表達(dá)，且其MIase活性也已被表征(一份手稿正在接受審閱)。因此，我們不能預(yù)見在這些VapC-VapB模塊的克隆和表達(dá)中的任何問題。我們將選擇來自系統(tǒng)發(fā)生樹上不同分支的六個(gè)(mt-3、mt-7、mt-14、mt-16、mt-18和mt-22)，它們將在大腸桿菌中克隆和表達(dá)。我們將根據(jù)如上所述用流行性感冒桿菌VapC獲得的結(jié)果表征它們的毒性。它們的TA復(fù)合物將被表達(dá)為GFP-融合蛋白以如研究3中所述篩選小分子。研究3:檢測TA復(fù)合物解離的高靈敏度通用方法的開發(fā)小分子化學(xué)制劑對毒素-抗毒素復(fù)合物的解離可通過，在用Ni-NTA磁性瓊脂糖珠除去His-標(biāo)記的毒素后，測量溶液中從GFP-標(biāo)記的抗毒素產(chǎn)生的GFP熒光信號來檢測。GFP融合技術(shù)已成為生物化學(xué)研究中不可缺少的工具。然而，已顯示，GFP-融合蛋白需要在GFP和靶蛋白之間有一個(gè)適當(dāng)?shù)慕宇^序列以維持靶蛋白的功能。因此，各融合蛋白被設(shè)計(jì)為具有一個(gè)用于實(shí)現(xiàn)該蛋白的最佳功能的長度不同的接頭是至關(guān)重要的。對于本申請，GFP融合不應(yīng)當(dāng)抑制抗毒素和毒素形成復(fù)合物。為此，我們已經(jīng)開發(fā)了一個(gè)包含具有寬長度范圍的接頭的接頭文庫。利用該文庫，我們可以為各GFP-融合TA復(fù)合物鑒定出最佳大小的接頭。基本原理由于大多數(shù)如上述分離的毒素的細(xì)胞靶物還未鑒定，因此本發(fā)明的方法是可以應(yīng)用于所有TA系統(tǒng)的通用方法。重要的是建立以高靈敏度方式檢測從TA復(fù)合物中解離出的抗毒素的條件。因此，本發(fā)明的方法是一種利用GFP-和His-標(biāo)簽的篩選方法。實(shí)驗(yàn)方法無NdeIGFP基因的構(gòu)建——綠色熒光的蛋白(GFP)是一種自發(fā)熒光的蛋白。GFP可在任何生物體中表達(dá)并保持其特征性熒光激發(fā)和發(fā)射特性。由于已顯示它是極為穩(wěn)定的且由此它易于忍受在其N-末端或C-末端的蛋白質(zhì)融合，因此當(dāng)它與目的蛋白融合時(shí)，它被廣泛用作報(bào)告基因以監(jiān)控表達(dá)模式。將使用質(zhì)粒pcDNA3-lNT-GFP-T0P0(Invitrogen)中的突變GFP基因，因?yàn)橐淹ㄟ^三循環(huán)的DNA改組產(chǎn)生了這一GFP基因，導(dǎo)致(1)在大腸桿菌中的高溶解性，和(2)比野生型GFP高40倍的熒光。此外，該GFP基因的密碼子使用已優(yōu)化為利于在大腸桿菌中表達(dá)。隨后將該GFP蛋白稱作環(huán)-3-GFP。環(huán)-3-GFP基因含有一個(gè)Ndel位點(diǎn)(位于第235至240位堿基；堿基1是GFP編碼序列的第一個(gè)堿基)。我們將首先通過定點(diǎn)誘變，以pcDM3-1NT-GFP-T0P0質(zhì)粒為模板，向GFP基因中引入一個(gè)點(diǎn)突變以除去該Ndel位點(diǎn)(CAIATG—>CAgATG)而不改變其氨基酸序列。將所得質(zhì)粒命名為pGFP(ANdel)。注意，pcDNA3-1NT-GFP-T0P0質(zhì)粒的GFP基因在其編碼序列之后不含終止密碼子。帶有His-和GFP-標(biāo)簽的基于pET的質(zhì)粒的構(gòu)建——將以pGFP(厶N(yùn)del)質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增GFP基因(附圖19)。將PCR產(chǎn)物導(dǎo)入經(jīng)Ndel和EcoRI消化的pET21質(zhì)粒(Novagen)(附圖20A)和導(dǎo)入經(jīng)EcoRI和Notl消化的pET28質(zhì)粒(Novagen)(附圖20B)。將所得質(zhì)粒分別命名為pET21-GFP/His和pET28-His/GFP，它們分別在GFP序列下游和上游帶有一個(gè)His-標(biāo)簽。注意，為終止翻譯將在pET28-His/GFP質(zhì)粒的GFP編碼序列后導(dǎo)入終止密碼子(TAA)?；趐ET的帶有His-標(biāo)記的毒素基因和GFP-標(biāo)記的抗毒素基因的質(zhì)粒及與之相反的質(zhì)粒的構(gòu)建一一我們將利用幾個(gè)來源于不同生物的TA操縱子構(gòu)建基于pET的表達(dá)質(zhì)粒。通常，毒素基因在它們的操縱子中位于其抗毒素下游。然而，也有幾個(gè)例外具有毒素-抗毒素的不同位置，例如在higB-higA操縱子中higA(抗毒素)位于higB(毒素)下游。由于我們不知道His-標(biāo)簽或GFP-標(biāo)簽對于構(gòu)建保持其完整毒素-抗毒素復(fù)合物形成特性的融合蛋白是不是理想，我們將(l)為一般TA操縱子(以抗毒素-毒素的順序；例如hipB-hipA、dinJ-yqfQ、yefM-yoeB、relB-relE、phd-doc、vapB-vapC、ydcD-ydcE和金黃色50葡萄球菌的mazE-mazF同源物)構(gòu)建His-抗毒素/毒素-GFP和GFP-抗毒素/毒素-His，和(2)為反向TA操縱子(以毒素-抗毒素的順序；例如higB-higA)構(gòu)建His-毒素/抗毒素-GFP和GFP-毒素/抗毒素-GFP。注意，這些構(gòu)建中省略了大腸桿菌mazE-mazF和chpBI-chpBK基因(參見研究1)。我們將為各TA操縱子設(shè)計(jì)兩對帶有EcoRI/Notl和Ndel/EcoRI位點(diǎn)的PCR引物。利用這些引物，各TA操縱子將被擴(kuò)增并克隆進(jìn)分別經(jīng)EcoRI/Notl和Ndel/EcoRI消化的pET21-GFP/His和pET28-His/GFP兩個(gè)質(zhì)粒中。所得質(zhì)粒將用于這些TA復(fù)合物的純化。TA復(fù)合物的純化一一371C下在合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有如上構(gòu)建的基于pET的TA表達(dá)質(zhì)粒的BL21(DE3)菌株至對數(shù)生長期。TA基因?qū)⒂?mM異丙基-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)四小時(shí)。離心收集細(xì)胞并重懸于緩沖液A[50mMNaH2P04，300mMNaCl，10mM咪唑，lmM(5-巰基乙醇(P-ME)]。用Frenchpressurecell(ThermoIEC，MA)裂解細(xì)胞，低速離心除去細(xì)胞碎片和未破損細(xì)胞。將上清液通過0.45pm過濾器(Millipore)并加載至Ni-NTA柱(QIAGEN)。用緩沖液A徹底洗滌該柱，TA復(fù)合物將用緩沖液A中的150fflM咪唑洗脫。將樣品收集在一起，并用含有50mMNaCl和5mMP-ME的50mMTris-HCl(pH8.0)緩沖液透析。通過測定GFP焚光信號對所釋放的毒素/抗毒素進(jìn)行定量一一在開發(fā)一種高通量篩選分析之前，重要的是建立用于檢測與毒素/抗毒素融合的GFP的熒光信號的條件。我們將利用可商業(yè)可獲得的Ni-NTA磁性瓊脂糖珠(QIAGEN)分離從其復(fù)合物中解離出來的GFP-標(biāo)記的毒素/抗毒素。Ni-NTA磁性瓊脂糖珠是含有磁性顆粒的瓊脂糖珠，且其具有共價(jià)結(jié)合于其表面的強(qiáng)金屬螯合次氨基三乙酸(NTA)基團(tuán)。它們用鎳預(yù)先充電并可用于單支試管或96孔板中的純化。這些磁珠可以少量使用一一低至IOju1仍可用于純化高達(dá)10pg的蛋白質(zhì)一一因此，它們對于在96孔板中的高通量微小規(guī)模純化是很便利的。GFP蛋白的熒光特性不受用6M胍-HCl,8M尿素或l。/。SDS的延長處理的影響。利用濃度高達(dá)lmg/ml的各種蛋白酶(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、胰酶制劑)的延長(48h)處理并不改變GFP的強(qiáng)度(Bokman和Ward,1981)。GFP在高達(dá)65X:的中性緩沖液中仍是穩(wěn)定的，且展現(xiàn)5.5至12的寬范圍pH穩(wěn)定性。各GFP-標(biāo)記蛋白以與其非GFP-標(biāo)記對應(yīng)蛋白類似的方式與其關(guān)聯(lián)蛋白形成復(fù)合物。將用8M尿素解離結(jié)合于Ni-NTA樹脂上的等量TA復(fù)合物以檢測溶液中^皮釋放的GFP的熒光。在eppendorf管中，結(jié)合于緩沖液A中的Ni-NTA磁性瓊脂糖珠的TA復(fù)合物將于室溫下用8M尿素處理30分鐘。將試管置于強(qiáng)力磁性NdFeB(釹鐵硼)盤頂部以將所釋放的GFP-標(biāo)記蛋白拉到試管底部(附圖21)。將上清液轉(zhuǎn)移到空試管中，我們將利用分光光度計(jì)通過488nm處的激發(fā)和檢測515nm處的發(fā)射來測定上清液的熒光。不含尿素的緩沖液A中的樣品將被用作背景對照。預(yù)期問題的解決方案—些GFP-標(biāo)記毒素/抗毒素由于其GFP融合而不能正確形成其預(yù)期的TA復(fù)合物。如果存在這種情況，我們將在GFP和靶蛋白之間引入一個(gè)額外的接頭肽。另一個(gè)問題是，GFP可能使毒素或抗毒素失活。我們將通過檢查所有GFP-融合毒素的毒性來對此進(jìn)行測試，所述GFP-融合毒素在本申請中將通過將它們插入pBAD載體來構(gòu)建。如果用這些pBAD構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞展示對所加入的阿拉伯糖敏感，我們將得出結(jié)論認(rèn)為，GFP-融合不影響毒素的毒性。以類似的方式，我們還將把毒素-GFP-融合的抗毒素模塊插入到相同pBAD栽體中。如果用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞顯示阿拉伯糖-敏感性，則GFP-與特定抗毒素的融合使抗毒素喪失其與其關(guān)聯(lián)毒素相互作用的能力。以這種方式，我們應(yīng)當(dāng)能夠選擇可用于高通量篩選的毒素。如果這些構(gòu)建體中沒有任何一個(gè)給出令人滿意的結(jié)果，那么我們將嘗試以下方法(l)我們將延長GFP和毒素或抗毒素間的接頭，這將減少GFP對毒素或抗毒素的干擾，和(2)作為最后的辦法，我們將在毒素或抗毒素的C-末端摻入一個(gè)半胱氨酸殘基，以便TA復(fù)合物能夠用例如馬來酰亞胺(Invitrogen)這樣的小熒光分子進(jìn)行共價(jià)修飾。參考文獻(xiàn)Aizenman,E.'Engelberg-Kulka^H.'andGlaser,G.(1996).AnEscherichiacolichromosomal"addictionmodule"regulatedbyguanosine[corrected]3'，5，'bispyrophosphate:amodelforprogrammedbacterialcelldeath.ProcNatlAcadSciUSA93，6059-6063.Amitai，S.，Yassin,Y.,andEngelberg-Kulka^H.(2004).MazF-raediatedceldeathinEscherichiacoli:apointofnoreturn.JBacteriol18<5,8295-8300.Bahassi，E.M,,O'De4M.H.，Allali，N.,Messens.，J.,Gellei%M,,andCouturier,M.(1999).InteractionsofCcdBwhhDNAgyTase.InactivationofGyra，poisoningofthegyrase-DNAcomplex,andtheantidoteactionofCcdA.JBioiChem274，10936-10944.Bayles,K.W.(2003).AxethemolecularstrategiesthatcontrolapoptosisconservedinbacteriaTrendsMicrobiol11,306-311.Bokman'S.R,andWard,W.W.(1981),RenaturatjonofAequoreagree-fluorescentprotein.BiochetnBiophysResCommun101,1372-1380.Christensen,S.K.,Maenhaut-Michd,G.,Mine,N.,Gottesman,S.,Gerdes，K,，andVanMederen,L.(2004).OverproductionoftheLonproteasetriggersinhibitionoftranslationinEscherichiacoli:involvementoftheye!M-yoeBloxin-aiUiloxinsystem.MolMicrobiol51'1705-1717.delaCueva-Mendez,G.tMills,A.D.，Clay-Fanrace,L.,Diaz-Orejas,R.，andLaskey，R.A.(2003).RegulatablekillingofeukaryoticcellsbytheprokaryoticproteinsKidandKis.EmboJ22,246-25.Engelberg-Kulka，H.，Hazan,R.,andAmitai,S.(2005).mazEF:achromosomaltoxin-antitoxinmodulethattriggersprogrammedcelldeathinbacteria.JCellSci118，4327-4332.Engelberg-Kulka'H.,Sat,B.'Reches，M.，Amitai，S.,andHa2:an，R.(2004).Bacterialprogrammedcelldeathsystemsastargetsforantibiotics.TrendsMicrobiol12,66-71,Gazit,E.,andSauer,R.T.(1999).TheDoctoxinandPhdantidoteproteinsofthebacteriophagePIplasmidaddictionsystemformaheterotrimericcomplex.JBiolChenti274,16813-16818.GerdeS,K.,Christensen,S.K.，andLobner-Olesen，A.(2005).Prokaryotictoxin-antitoxinstressresponseloci.NatHevMicrobioi3,371-382.Hargreaves,D.'Santos-Sierra,S.,Giraldo,R.,Sabariegos-Jareno，R.,de!aCueva-Mendez，G.,Boelens,R.,Diaz"Orejas,R.,andRafferty,J.B.(2002).StructuralandfijnctionalanalysisofthekidtoxinproteinfromE,coliplasmidRl.Structure(Camb)10，1425-1433.Hayes,C.S.,andSauer，JR_T.(2003).CleavageoftheAsitemRNAcodonduringribosomepausingprovidesamechanismfortranslationalqualitycontrol.Mo，Cdl12,903-9!.Hayes,F.(2003).Toxins-antitoxins:plasmidmaintenance,programmedceldeath,andcellcyclearrest.Science301,1496-1499,Hazan,R.,Sat,B.,andEngelberg-Kulka,H.(2004).EscherichiacolimazEF-mediate4celldeathistriggeredbyvariousstressfulconditions.JBacteriol186,3663-3669.Hazan,R.，Sat,B.,Reches,M.,andEngelberg-Kulka,H.(200).PostsegregatiormlkillingmediatedbythePIphage"addictionmodule"phd-docrequirestheEscherichiacoliprogrammedcelldeathsystemmazEF.JBacteriol183,2046-2050,Kamada,K.，andHanaoka'F,(2005),ConformationalchangeinthecatalyticsiteoftheribonucleaseYoeBtoxinbyYefManUtoxhi.Mo!Cell19，497-509.Kamada,K.,Hanaoka,F.,andBurley，S.K.(2003).CrystalStructureoftheMazE/MazFComplex.MolecularBasesofAntidote-ToxinRecognition.MolCell11,875-884.Kainpranis,S.C.,Howells^A.J.，andMaxwell,A.(1999).TheinteractionofDNAgyrasewiththebacterialtoxinCcdB:evidencefortheexistenceoftwogyrase-CcdBcomplexes.JMolBiol293,733-744.Keren,I.,Shah,D.,Spoering'A.,Kaldalu,N.,andLewis,K.(2004).SpecializedpersistercellsandthemechanismofmultidrugtoleranceinEscherichiacoli.JBacteriol186，8172掘0.Korch,S.B.，Henderson,T.A.,andHill,T.M.(2003).CharacterizationofthehipA7alleleofEscherichiacoliandevidencethathighpersistenceisgovernedby(p)ppGppsynthesis.MolMicrobiol50,1199-1213.UG.Y.,Zhang,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)標(biāo)記的底物在溶液中接觸，由此標(biāo)記的檢測指示防止抗毒素與毒素形成復(fù)合物的試劑的存在。本發(fā)明還提供能夠干擾毒素-抗毒素復(fù)合物形成的試劑。這樣的試劑可作為針對人病原性細(xì)菌的新的非常規(guī)抗生素。文檔編號C12Q1/68GK101443455SQ200780017057公開日2009年5月27日申請日期2007年3月22日優(yōu)先權(quán)日2006年3月22日發(fā)明者M(jìn)·伊諾葉,N·沃伊奇科,井上晃一申請人:新澤西內(nèi)科與牙科大學(xué)