專利名稱：用于固定生物物質(zhì)的生物相容性三維基體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制造攜帶有生物材料的固體涂布載體。此外，本發(fā) 明涉及一種附著有生物材料的固體涂布載體以及所述固體涂布載體用于 制備醫(yī)學(xué)產(chǎn)品的用途。此外，本發(fā)明提供了一種用于接觸、過濾或清潔 患者血液、淋巴或腦脊髓液或其部分的方法、用于診斷疾病的方法以及 診斷組合物。
整個本說明書提到了多篇文獻(xiàn)。此處以參考的方式引入包含生產(chǎn)手 冊在內(nèi)的所述文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容。
背景技術(shù)：
例如單克隆抗體或其它分子的系統(tǒng)應(yīng)用對于治療腫瘤患者、代謝失 調(diào)、免疫疾病或其它疾病是重要且在不斷發(fā)展的領(lǐng)域。然而，這些分子 的系統(tǒng)應(yīng)用是極其昂貴的，并且經(jīng)常伴隨著嚴(yán)重的副作用和高死亡率。 此外，所注射的生物制劑的體內(nèi)過程通常難以確定，并且不能預(yù)見在個 體患者中的嚴(yán)重副作用。
新治療方法應(yīng)用的一種選擇是使用具有經(jīng)固定的抗體的(醫(yī)學(xué))裝置。 該方法優(yōu)于利用抗體官能性的標(biāo)準(zhǔn)治療，沒有系統(tǒng)應(yīng)用所可能存在的不 利影響。因此，利用基于(醫(yī)學(xué))裝置的該安全方法沒有看到系統(tǒng)使用抗體 經(jīng)常觀察到的嚴(yán)重副作用。該裝置在血流中的暫時或永久應(yīng)用目的在于 用固定在確定表面上的高度確定量的生物材料(可以例如意味著在確定的 休積內(nèi)有確定密度的生物材料)控制生理機(jī)能、免疫系統(tǒng)、免疫細(xì)胞或其 它血液成分、或流動的腫瘤細(xì)胞，這將可以避免某些藥物系統(tǒng)應(yīng)用的重 荷載。
使用失活抗體如Remicad浐使TNFot失活的領(lǐng)域描述有各種治療方 法。然而，已知將該抗體簡單地施用于患者會伴隨著嚴(yán)重甚至是致命的副作用(失明、休克和過敏反應(yīng)等)。此外，完全抗體(full antibody)或其片 段或衍生物的使用要求抗體的人源化和/或其它修飾，以減少或避免由于 人類患者對抗體的免疫反應(yīng)導(dǎo)致的抗體失活。
已知本領(lǐng)域描述的另一方法是名為"TheraSorb "(Miltenyi Biotech GmbH， Bergisch-Gladbach，德國)(參見R. Bambauer等，Ther Apher Dial. 2003, 7(4): 382-3卯和G. Walukat等，International Journal of Cardiology, 1996， 54(2): 191-195)。 TheraSorb⑧用于除去LDL-膽固醇、免疫球蛋白、 抗原抗體復(fù)合物、免疫復(fù)合物、抗體片段或纖維蛋白原。該方法中利用 的分離柱(apheresis column)包含結(jié)合有多克隆抗體的瓊脂糖(sepharose)。 該方法需要分離出細(xì)胞，以將血漿輸送到所述柱子中。這是該系統(tǒng)的一 個主要缺點(diǎn)，因?yàn)檫@是一種過度開支。流速較低，因此僅能處理少量的 血漿。而且，該系統(tǒng)因其復(fù)雜性而非常昂貴。
上述討論表明，迄今為止可用于治療所述疾病的方法和系統(tǒng)伴隨有 嚴(yán)重副作用或者相當(dāng)難以實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提 供能夠用生物材料例如細(xì)胞和蛋白質(zhì)治療患者的手段和方法，這將改善 所述情況。通過權(quán)利要求書中表征的實(shí)施方式可以解決該技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容
因此，在第一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種制造攜帶有生物材料 的固體涂布載體的方法，所述包括以下步驟
(a) 將固體載體與包含0.1%至10%(重量％或體積％)的至少一種硅烷 的溶液溫育，隨后除去所述溶液；
(b) 通過將所述載體與包含所述生物材料的優(yōu)選為緩沖的水溶液溫 育，隨后除去所述水溶液，將所述生物材料附著至所述載體上；和
(c) 在水溶液中溫育所述載體，所述水溶液包含選自(多)肽、氨基酸、 淀粉、糖、磷酸鹽、多元醇、聚乙二醇(PEG)或其混合物中的一種或多種 物質(zhì)。
按上述次序進(jìn)行步驟(a)、 (b)和(c)。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語"固體載體"定義為固體材料的載體。所述載體的材料可以是緊實(shí)結(jié)構(gòu)或多孔性結(jié)構(gòu)。如下文所述，優(yōu)選所述載體 是含選自由以下材料組成的組中的材料的載體玻璃、聚氨酯、聚酯、
聚砜、聚乙烯、聚丙烯、丙烯酸系聚合物(polyacryl)、聚丙烯腈、聚酰胺、 聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、羊毛填料、開孔泡沫塑料或玻璃、網(wǎng)狀塑料 或玻璃和得自海綿動物(多孔動物)的結(jié)構(gòu)體。
本發(fā)明術(shù)語"優(yōu)選為緩沖的"是指優(yōu)選為緩沖溶液。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語"生物材料"是指從活的或死的生物體或其 部分分離的材料、或能夠在人造生物系統(tǒng)中產(chǎn)生的材料以及所述材料的 化學(xué)修飾衍生物。人造生物系統(tǒng)的實(shí)例包括體外合成核酸分子或(多)肽或 用重組DNA技術(shù)制備的手段。如下文所詳細(xì)描述的，該生物材料的實(shí)例 包括真核細(xì)胞、真核細(xì)胞碎片、原核生物、原核生物碎片、古細(xì)菌、古 細(xì)菌碎片、病毒和病毒碎片。真核細(xì)胞、原核生物、古細(xì)菌和病毒的所 述碎片包括一種或更多種(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖或其任何組 合。作為選擇，術(shù)語生物材料還包括即使沒有被發(fā)現(xiàn)存在天然對應(yīng)物 (counterpart)并且是例如(半)合成或重組制造的材料的(多)肽、寡核苷酸、 多核苷酸和多糖(見下文)。
本文使用的術(shù)語"(多)肽"是指包括肽組以及多肽組的分子組。肽組 由至多30個氨基酸分子組成，多肽組由超過30個氨基酸組成。根據(jù)本 發(fā)明，"多肽"組包括"蛋白質(zhì)"。此外，根據(jù)所述定義，術(shù)語"(多)肽" 包括蛋白質(zhì)片段。該術(shù)語定義進(jìn)一步包括多肽，所述多肽為二聚物、三 聚物和更多單體的低聚物，即由超過一條氨基酸分子鏈(經(jīng)連接的氨基酸 鏈)組成。如上所述，在從真核細(xì)胞、原核生物、古細(xì)菌和病毒分離所述 蛋白質(zhì)的情況下，蛋白質(zhì)也被理解為真核細(xì)胞、原核生物、古細(xì)菌和病 毒的碎片。該術(shù)語也適用于通過重組DNA技術(shù)制備的(多)肽或用制備所 述化合物所用的細(xì)胞的其它技術(shù)制備的(多)肽。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語"寡核苷酸"是指由至少10個到至多30個 核苷酸組成的核酸分子。術(shù)語"多核苷酸"是指由超過30個核苷酸組成 的核酸分子。本文所述的寡核苷酸和多核苷酸可以是DNA、 RNA和PNA 等。包括在多核苷酸內(nèi)的分子組還包括完整的基因或染色體及其片段。所述定義還包括載體，例如克隆載體和表達(dá)載體。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語"多糖"定義為由兩個以上的糖構(gòu)成的聚合 物，因此該術(shù)語包括本領(lǐng)域中已知為低聚糖的其它分子。所述多糖可以 由支化或非支化糖鏈組成。
本發(fā)明上下文中使用的術(shù)語"硅烷"與國際純化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合
會(International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC)的定義一致，
包括一組由硅基體(matrix)和氫組成的化合物。按照該定義的硅烷可以是 支化的(異硅烷和新硅烷)或非支化(正硅垸)的。
本發(fā)明上下文中術(shù)語"體液"定義為可從患者，優(yōu)選從人類患者的 樣品獲得的液體。該體液的實(shí)例包括血液、淋巴或腦脊髓液或其部分， 例如血漿或包含清蛋白的液體部分，以及富集的白細(xì)胞(例如得自白細(xì)胞 去除術(shù))。
整個本發(fā)明使用的術(shù)語"患者"包括患病或生病的患者以及健康的 受試對象。根據(jù)本發(fā)明，患者是任何接受醫(yī)學(xué)護(hù)養(yǎng)、護(hù)理或治療的人。 人通常(但不一定)是生病或受傷的人，如果是生病或者受傷的人，則需要 由醫(yī)師或其它從醫(yī)人員治療。其它術(shù)語中，可以用術(shù)語"患者"代替可 能生病或沒有生病的"受試對象"。受試對象可以是動物，優(yōu)選為哺乳動 物，最優(yōu)選的是人類。如上所述，患者還可以是例如針對疾病或健康狀 態(tài)進(jìn)行急診或常規(guī)診斷的健康人類。其它術(shù)語中，本發(fā)明可以用于確定 患者是否患有某種疾病(或多種疾病的組合)和/或是否容易患上該疾病。
除去溶液可以理解為溶液的定性除去。因此，至少將溶液除去至一 定程度，其中剩余溶液沒有顯著改變本發(fā)明方法隨后步驟中使用的溶液 的質(zhì)量?？梢岳缤ㄟ^吸取(例如通過利用可以連接移液管等的常規(guī)泵 等)、壓縮或吹動進(jìn)行該除去?？蛇x的是，這些步驟是結(jié)合進(jìn)行的，并可 以進(jìn)一步結(jié)合空氣干燥進(jìn)行。優(yōu)選的是，將該溶液除去至至少95體積％， 例如至少98體積％或至少99體積°/。、至少99.5體積％或至少99.8體積％。
術(shù)語"溫育"是指在使步驟(a)至(c)所述化合物能夠附著至所述載體 或歩驟(a)和/或(b)提及的分子層的條件下進(jìn)行的溫育，所述溫育可以通過 間接結(jié)合進(jìn)行。溫育條件包括取決于所述步驟和溫度，進(jìn)行20分鐘至12小時的溫育。通常，在37"C溫育抗體1小時，37"C是IgM抗體穩(wěn)定的最 佳溫度?？梢詼赜齀gG抗體至至高50。C。溫度范圍可以是4。C至50'C， 優(yōu)選為2(TC至37"C，這取決于所述步驟和溫育時間。優(yōu)選的是，在步驟 (a)中，在室溫下進(jìn)行20分鐘的溫育，在步驟(b)中，在37。C進(jìn)行1小時 的溫育，在步驟(c)中，在室溫下進(jìn)行1小時的溫育。應(yīng)當(dāng)理解的是，為 了加快該過程或?yàn)榱烁纳平Y(jié)果，可以根據(jù)溫育中使用的物質(zhì)改變溫育的 時間和溫度。例如，如果使用甲醇作為步驟(a)中的溶劑，應(yīng)該保持約20°C 的較低溫度，例如約15"至約25。C，以使甲醇不發(fā)生蒸發(fā)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，術(shù)語"室溫"可以指不同的溫度，這取決于 位置和室外溫度。室溫通常為17"C至23'C。
本發(fā)明方法的步驟(a)中所述的溶液可以是水溶液或非水溶液。除了 硅烷，本發(fā)明方法的步驟(a)中的水溶液可以還包含經(jīng)稀釋的蛋白質(zhì)和其 它經(jīng)稀釋的成分，例如糖或醇。在這方面， 一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)是清蛋白。 根據(jù)本發(fā)明，清蛋白包括得自動物的清蛋白(優(yōu)選為得自哺乳動物的清蛋 A，更優(yōu)選為得自人類的清蛋白)以及得自植物種子的清蛋白。清蛋白形 成哺乳動物中血清的主要成分。本發(fā)明的其它清蛋白的實(shí)例是動物的a-乳清蛋白和卵清蛋白、得自大豆的豆清蛋白、得自小麥、黑麥或大麥的 麥清蛋白、或得自豆類的豆清蛋白。在可能的過敏原情況下，優(yōu)選對清 蛋白進(jìn)行水解，特別是增強(qiáng)與人類或其它動物體的相容性。這也適用于 歩驟(a)的可選實(shí)施方式中的非水溶液。
在本發(fā)明上下文中，術(shù)語"水性溶劑"不局限于(但包括)水，而且包 括可與水混合因此能形成均相的親水性溶劑。
水性溶劑的實(shí)例包括但是不限于水、甲醇、乙醇或高級醇或其混合 物。非水溶劑的實(shí)例包括但是不限于二甲亞砜(DMSO)、苯、甲苯、二甲 苯和乙基苯，或脂肪族溶劑，如戊垸、己垸、庚烷或其混合物。
優(yōu)選的是，步驟(a)中的溶液的溶劑是水、甲醇、乙醇或其混合物、 二甲亞砜(DMSO)、苯、甲苯、二甲苯和乙基苯或戊院、己烷、庚烷或其 混合物。步驟(a)的溶液的最優(yōu)選溶劑是甲醇或乙醇。因此，溶液是指包 含溶劑的溶液，而水溶液是指包含親水性溶劑的溶液。根據(jù)本發(fā)明，所述方法的步驟(a)中的所述至少一種硅烷的濃度為 0.1%至10%(重量％或體積％)，其中，該范圍同時限定了所述溶液中的全
部硅垸的濃度。在其它術(shù)語中，如果使用一種以上的硅垸，則全部硅烷
的總量為0.1%至10%(重量％或體積％)。優(yōu)選的是，所述濃度為0.5%至 5%(重量％或體積％)。
根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(b)，將生物材料附著至固體載體可以理解為 在載體上固著(fDcation)所述材料?？梢酝ㄟ^將生物材料直接結(jié)合至固體載 體進(jìn)行該固著。作為選擇，可以利用第三化合物，例如一種或更多種硅 垸覆蓋在固體載體上的層，通過間接結(jié)合進(jìn)行該固著。根據(jù)本發(fā)明，術(shù) 語"覆蓋"包含固體載體的全部覆蓋以及部分覆蓋。在兩種替代方案中， 結(jié)合可以是通過共價或非共價鍵進(jìn)行的結(jié)合。按照本發(fā)明，可以例如通 過生物材料和載體材料之間的化學(xué)反應(yīng)或硅烷(涂布載體材料)和生物材 料之間的化學(xué)反應(yīng)獲得共價鍵。在后一情況中，硅烷用作分子橋。非共 價鍵結(jié)合的實(shí)例包括弱鍵，例如范德華鍵或其它極性鍵的結(jié)合。例如在(多) 肽和具有聚乙烯表面的固體載體之間存在所述非共價鍵。
優(yōu)選的是，用于附著生物材料例如抗體的水溶液是緩沖溶液，并具 有較低的鹽含量。本發(fā)明所述的較低鹽含量定義為0.9%(重量％)以下的鹽 濃度，優(yōu)選低于0.2%(重量％)。通常(但不是絕對地)，對于IgG和IgY， 可以使用例如由在水中的15 mM碳酸鈉和35 mM碳酸氫鈉組成的另一堿 性緩沖液(pH二9)，但是對于附著IgM，優(yōu)選使用更中性的緩沖液(pH7.0 至7.4)，例如磷酸鹽緩沖液(如PBS)。
根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(c)，由于所述載體(在水溶液中將步驟(b)中的 生物材料附著至所述載體)的附著，生物材料包埋到涂布層/涂布基體中。 通過包埋使生物材料的暴露表面最小化。
如上所述，步驟(c)的水溶液優(yōu)選具有較低鹽含量。所述水溶液可以 是緩沖水溶液。
本發(fā)明方法的所述步驟可以分批進(jìn)行，在所述批次中交換各相應(yīng)的溶液。
本發(fā)明的方法提供了涂布有基體的固體載體，其中包埋有所述的生
13物材料。示于

圖1方案中的剖面圖例示了包含所包埋的生物材料的所述
固體涂布載體的一個實(shí)施方式。
由本發(fā)明的方法制造的固體載體可以用于治療和診斷。 所述治療包括脫除體液的毒素，例如二噁英、肉毒桿菌毒素、破傷
風(fēng)毒素、脂多糖(LPS)、腐敗毒等。該載體還可以用于治療細(xì)菌或病毒疾 病。本發(fā)明方法制造的載體一種可預(yù)計的替代性應(yīng)用是用于需要刺激、 消除或除去患者某些細(xì)胞的治療。消除特定細(xì)胞群可以例如表示在治療 增殖性疾病(例如， 一般在治療癌癥特別是治療微量殘留癌中)、自身免疫 疾病或治療器官移植前的疾病中消除特定細(xì)胞群?？梢栽O(shè)想例如在疾病 治療中通過激活免疫系統(tǒng)細(xì)胞對特定細(xì)胞群進(jìn)行激活，所述免疫系統(tǒng)細(xì) 胞在激活后適于消除特定的病細(xì)胞群。另一治療方法是利用其中包埋有 遺傳或操縱(例如通過與合成或天然化合物如細(xì)胞因子、丁酸、佛波醇肉 豆蔻酸酯-乙酸酯(Phorbol myristate acetate)或全反式視黃酸溫育而分化或 通過物理操縱如熱激、深低溫保藏、離心而分化)重組體供體細(xì)胞或非操 縱供體細(xì)胞的固體涂布載體。包埋細(xì)胞可以分泌化合物，例如能夠減輕 或治愈內(nèi)分泌失調(diào)或代謝性失調(diào)的激素。以下將詳細(xì)描述上述治療方法 的實(shí)例。該治療方法可以包括在(醫(yī)學(xué))裝置的情況下，本發(fā)明方法制造的 載體的體內(nèi)應(yīng)用以及間接體內(nèi)(exvivo)應(yīng)用。因此，可以將包含固體涂布
載體的裝置植入患者進(jìn)行體內(nèi)應(yīng)用。對于間接體內(nèi)應(yīng)用，可以將包含固 體涂布載體的裝置與待處理的體液的循環(huán)連接。例如可以將得自患者動 脈或靜脈的血液引導(dǎo)通過該裝置，隨后導(dǎo)回到該患者中(與血流連接)。作 為選擇，可以將體液樣品與載體進(jìn)行體外溫育。在后面治療的隨后步驟 中，可以將體液再引入患者體內(nèi)。
本發(fā)明方法制造的固體載體的診斷應(yīng)用是例如需要檢測體液中毒素 或特定細(xì)胞群的診斷方法。利用本發(fā)明制造的固體涂布載體的診斷應(yīng)用 可以用于毒素或特定細(xì)胞群體的定量檢測。在這些應(yīng)用中，可以使用附 著有單種類型的生物材料(例如抗體)的載體。溫育所述載體和得自患者的 確定體積的體液，將能夠在通過樣品中被附著的生物材料檢測分析化合 物的量之后，定量推算出患者全體的化合物的量。例如，使用附著有許多不同類型生物材料的載體，對毒素或特定細(xì)胞群進(jìn)行定性檢測。將所 述載體與得自患者的體液進(jìn)行溫育之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠分析被樣 品中的附著生物材料特異性結(jié)合/檢測到的是哪些毒素或細(xì)胞群。
上述治療方法中，包埋的生物材料對血液、淋巴或腦脊髓液具有治 療作用，由于所述生物材料固著在固體載體上，因而沒有將附著/固定的 生物材料釋放到體液中。優(yōu)選沒有大量的附著/固定的生物材料釋放到體 液中。因此，治療或診斷用的生物材料的所需量得以最小化。由于固定 治療或診斷用的生物材料，還可以使因循環(huán)活性生物材料引起的藥物代 謝動力學(xué)問題降到最少。
本發(fā)明方法可以制造出載體表面包埋有清楚確定密度的生物材料的 載體。因此，可以清楚和可再現(xiàn)地限定包埋所產(chǎn)生載體的基體的生物材 料的效率。此外，利用本發(fā)明方法制造的載體的治療可以例如通過連接 包含所述載體的(醫(yī)學(xué))裝置與體液循環(huán)來限定治療的起始，并且例如通過 斷開所述裝置與體液循環(huán)來限定治療的終止。
本發(fā)明方法制造的載體的另一個優(yōu)異特征是，與通常制造的材料相 比，包埋的生物材料的穩(wěn)定性(保存期限)得到改善。盡管本申請人不希望 受任何理論的約束，但是據(jù)信通過提供涂布基體可以實(shí)現(xiàn)所述改善，該 涂布基體減少了生物材料的變質(zhì)過程所需的暴露表面。根據(jù)這一理解， 利用所包圍的涂布基體，可以保護(hù)包埋的生物材料并將負(fù)載在所述涂布 基體的結(jié)構(gòu)中。例如，在涂布之后，抗體受到保護(hù)并被穩(wěn)定化，由于在 載體上施加有第二層，因此可以延遲或抑制涂布至本發(fā)明載體上的抗體 的降解或分解。
本發(fā)明方法和所制造的涂布載體的另一優(yōu)異特征是，施加有本發(fā)明 方法歩驟(C)中的載體的涂布層能夠消毒所制造的載體。因此，本發(fā)明首 次公開了一種制造涂布有通常比較不穩(wěn)定和易發(fā)生變化的生物材料的固 體涂布載體的方法，其中固體涂布載體可以是經(jīng)過滅菌的，因此可以用 于治療患者或使用于需要無菌環(huán)境的方法中。如上所討論的和所附實(shí)施 例中所示的，除了促進(jìn)生物材料的穩(wěn)定性外，第二層或涂布基體還可以 防止涂布到載體上的生物材料由于卩射線輻射、Y射線輻射或X射線輻射而發(fā)生的降解。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法在步驟(C)之后進(jìn)一步包括步 驟(d):
(d)將所述載體干燥至殘留水含量〈20重量％。
根據(jù)本發(fā)明的該優(yōu)選實(shí)施方式，可以按已知的測定木材水含量的方
式計算殘留水含量。在木材的情況下，通過計算樣品中的水質(zhì)量(mj和含 水木材樣品的質(zhì)量(m》之間的比例，再乘以IOO，確定木材水含量的百分 比(x)。可以通過從含水木材樣品的質(zhì)量(mj減去干燥之后該樣品的質(zhì)量， 確定該樣品的水質(zhì)量(mj。因此，用下列公式計算木材水含量的百分比
X(%) = ^xlOO
可以類似地確定制備載體的殘留水含量，其中nv是載體樣品中的水 質(zhì)量，并且mw是徹底干燥載體樣品后載體樣品的質(zhì)量。在海綿狀載體的 情況下，n^在擠壓孔隙中的過量水后進(jìn)行確定。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法在步驟(a)之后進(jìn)一步 包括步驟(a'):
(a')將所述載體至溶液的殘留含量小于初始施用溶液的10%，優(yōu)選為 低于5%，更優(yōu)選低于2%，例如低于1%、 0.5%或0.2%。優(yōu)選的是，干 燥方法如上所述。最優(yōu)選的是采用風(fēng)千法進(jìn)行干燥。
本發(fā)明方法可以在步驟(b)之后且在步驟(c)之前進(jìn)一步包括步驟
(b,):(b')在包含封閉劑的緩沖水溶液中溫育所述載體，并除去所述水溶
—入*凇。
封閉劑可以用于制造固體載體的所述方法中，以防止在該方法的后
續(xù)步驟中加入的材料非特異性結(jié)合。在根據(jù)步驟(c)于水溶液中溫育載體
之前，該封閉還可以對生物材料的構(gòu)象穩(wěn)定性具有積極的作用。
根據(jù)本發(fā)明，封閉劑包括但是不局限于人類或動物血清和該血清的 蛋白質(zhì)(例如清蛋白)、奶、卵蛋白、植物源性(例如黃豆、小麥)蛋白，包 括所述蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物(例如明膠、膠原)。包含所述封閉劑的緩沖水溶 液還可以包括氨基酸(優(yōu)選為甘氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、肉堿、鳥氨 酸、羥脯氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、瓜氨酸、菊粉、苯丙氨酸、 賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、纈氨酸、酪 氨酸、蘇氨酸、色氨酸)或氨基酸的衍生物(例如正乙?；?色氨酸、P-丙氨
酸、黑色素、多巴(DOPA))、糖(優(yōu)選為葡萄糖、甘蔗糖(saccharose)、蔗 糖)、多元醇(優(yōu)選為山梨糖醇、甘露糖醇、丙三醇、木糖醇)、聚乙二醇 (PEG)、羥乙基淀粉(HES)、磷酸鹽(例如磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉)、兩性 物質(zhì)(優(yōu)選為清潔劑，如聚山醇酸酯、TritonX-IOO)、緩沖劑(優(yōu)選TRIS、 HEPES)。
如上所述，優(yōu)選包含封閉劑的水溶液是緩沖水溶液并具有較低鹽含 量。所附實(shí)施例中給出了本發(fā)明的包含封閉劑的緩沖水溶液的實(shí)例。優(yōu) 選在室溫下進(jìn)行封閉，通常封閉1至4小時，優(yōu)選為1小時。
作為歩驟(b')的一種選擇，本發(fā)明方法包括在步驟(b)之后且在步驟(c) 之前進(jìn)行的步驟(b"):
(b")利用包含0.5重量％至10重量％的選自由以下物質(zhì)組成的組中的 物質(zhì)的水溶液封閉非結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)(多)肽(例如清蛋白，明膠或膠原)， 羥乙基淀粉(HES)、甘露糖醇、山梨糖醇和聚乙二醇(PEG)、奶、來自于 黃豆、小麥或蛋的蛋白質(zhì)。
在一個更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(b')或(b")進(jìn)一步包括在封閉 后，利用確定為適用于上述步驟(b)的水溶液進(jìn)行一個或多個洗滌步驟。 適用于該實(shí)施方式的水溶液是例如含有P/。人清蛋白的PBS。進(jìn)行所述一 個或多個洗滌步驟，以除去過量的封閉劑。根據(jù)載體的表面，通常優(yōu)選 在室溫下進(jìn)行10秒至10分鐘的所述洗滌。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，在包含選自由以下物質(zhì)組成的組中的 一種或多種物質(zhì)的水溶液中溫育步驟(c)中的載體清蛋白、羥乙基淀粉 (HES)、甘露糖醇、山梨糖醇和聚乙二醇(PEG)。
根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步優(yōu)選的是由本發(fā)明方法制造的載體的材料具有 多孔性結(jié)構(gòu)。
為了獲得用作(醫(yī)學(xué))產(chǎn)品的涂布載體的緊實(shí)設(shè)計，優(yōu)選的是載體顯示出與其總體量度相比相對較大的表面。這可以例如利用具有開孔結(jié)構(gòu)的
泡沫、羊毛(填料)或利用許多平行小管或細(xì)絲的沉降物(setting)，例如類 似于目前在血液透析中使用的多孔性中空纖維設(shè)計(參見例如 http :〃www. fmc-ag .com/internet/fmc/fmcag/agintpub .nsf/ Content/Modern—hemodialysis一+the—first—hollow-fiber—dialyzers—2004)來實(shí)
現(xiàn)。該設(shè)計優(yōu)選允許全血或上述其它體液自由流動，并且優(yōu)選的是利用 流入物和流出物之間最小的壓差并使設(shè)備內(nèi)任一點(diǎn)的血液流速<1米/秒 而在流變學(xué)上優(yōu)化載體。優(yōu)選的是沒有"盲端"，并且優(yōu)化血液成分與基 體的活性表面的接觸。具有多孔性結(jié)構(gòu)的載體的特定優(yōu)點(diǎn)是增加載體能 夠與生物材料附著的表面。即，通過增加每載體體積的載體表面，增加 生物材料可以附著/包埋載體上的量。
更優(yōu)選的是，載體材料的特征在于表面/氣體容積比為30 cm—1至300 cm—1。載體的表面被理解為全部管束(trabeculae)表面的總和。氣體容積被 理解為具有多孔性結(jié)構(gòu)的載體的全部管束中氣體的體積的總和。
可以通過例如切割具有確定總體量度的泡沫小塊來測定表面/氣體 容積比。對所述泡沫塊的全部管束進(jìn)行計數(shù)并通過顯微鏡進(jìn)行測量。利 用管束的平均長度和直徑以及每cn^的管束計數(shù)，可以在數(shù)學(xué)上獲得(假 設(shè)管束的形狀是圓形的)比表面(xxcmVcm3，其是cm"，并表示確定體積 的材料的內(nèi)表面)。
優(yōu)選的是，具有多孔性結(jié)構(gòu)的載體的材料的特征為未壓縮材料體積/ Jli縮材料體積的比為4至40。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語"材料體積比"理解為包含固體和氣體成分 的未壓縮多孔性材料和壓縮多孔性材料之間的比例。
在多孔性彈性泡沫例如PU泡沫的情況下，例如可以按照如下所述 原理測定該比例。將具有20 ml體積的圓柱形泡沫塊(未壓縮)放于具有20 ml體積的注射器中，完全向下壓迫活塞后，可從注射器標(biāo)記上讀取壓縮 體積。用于壓縮該材料(在PU多孔性泡沫的情況下)的力限定為至少20 千克/平方厘米。將體積減少的端點(diǎn)定義為兩倍壓縮壓力(在PU多孔性泡 沫的情況下，該壓力是40千克/平方厘米)不能使體積進(jìn)一步減少達(dá)10%的體積。可以重復(fù)該過程(兩倍壓力)，直至材料的體積不再進(jìn)一步減小達(dá) 10%。
按照本發(fā)明方法而進(jìn)一步優(yōu)選的是，載體材料選自由玻璃、聚氨酯 (PU)、聚酯、聚砜、聚乙烯、聚丙烯、丙烯酸系聚合物、聚丙烯腈、聚 酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、羊毛填料、開孔泡沫塑料或玻璃、網(wǎng)狀塑料 或玻璃、和得自海綿動物(多孔動物)的結(jié)構(gòu)體組成的組中的材料。例如，
可以按照對來自Pall， Dreieich(德國)的裝置LG6的描述來使用聚酯羊毛 (polyester fleece)。玻璃細(xì)絲的非限定性實(shí)例包括輸血用生物過濾器膜， 其裝在Nanjing Shuangwei Science & Technology Industries Co.LTD經(jīng)售的 白細(xì)胞濾器(Leukocyte Removal Filter)上。合適的海綿動物的實(shí)例例如在 D. Green等人的Tissue Engineering.(2003)第9巻，第6期第1159 1166 頁中有描述。
本發(fā)明方法中可以使用的材料可以具有中空纖維的結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的中
空纖維包裝件優(yōu)選具有這樣的特征未壓縮材料體積/壓縮材料體積的比
為1至10，和/或表面/氣體容積比是200 cm—1至2000 cm-1 。
在本發(fā)明方法的又一個優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟(a)中的溶液是水溶液。 作為選擇，在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟(a)中溶液是非水 溶液。前文己經(jīng)說明相應(yīng)溶液和優(yōu)選溶液的實(shí)例。
按照本發(fā)明的方法，優(yōu)選所述至少一種硅烷選自由烷氧基硅烷、有 機(jī)官能性硅垸、氫硅(氧)烷、硅氧烷和包括具有其它官能團(tuán)的甲硅烷基化 合物在內(nèi)的有機(jī)硅烷組成的組。
本發(fā)明上下文中使用的硅烷的所述組的實(shí)例包括
N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺
N-環(huán)己基氨基甲基甲基二乙氧基硅烷
N-環(huán)己基氨基甲基三乙氧基硅烷
N-苯基氨基甲基三甲氧基硅烷
(甲基丙烯酰氧基甲基)甲基二甲氧基硅烷
甲基丙烯酰氧基甲基三甲氧基硅烷
(甲基丙烯酰氧基甲基)甲基二乙氧基硅烷甲基丙烯酰氧基甲基三乙氧基硅垸
(異氰酸基甲基)甲基二甲氧基硅垸
N-三甲氧基甲硅烷基甲基-鄰-甲基氨基甲酸酯
N-二甲氧基(甲基)甲硅烷基甲基-鄰-甲基-氨基甲酸酯
N-環(huán)己基-3-氨基丙基三甲氧基硅垸
3-氨基丙基三乙氧基硅垸
N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷
3-氨基丙基三甲氧基硅烷
3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷
3-甲基丙烯酰氧基丙基三乙酰氧基硅烷
3-異氰酸基丙基三甲氧基硅烷
3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷
3-縮水甘油氧基丙基三乙氧基硅烷
3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐 (3-(Triethoxysilyl)propylbemsteinsaureanhydrid)
3-(氨基丙基)三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]硅烷 (3-氨基丙基)三(三甲基甲硅烷氧基)硅烷 (4-甲氧基苯基)三(鄰甲苯基)硅烷
(4-苯氧基苯基)(苯基)(鄰甲苯基)硅烷 二環(huán)己基-甲基-硅烷
二甲基(3-苯基丙基)硅烷
二甲基雙(2，3,4,5-四甲基-2，4-環(huán)戊二烯-l-基)硅烷
二苯基(3-苯基丙基)硅烷
二苯基(4-甲氧苯基)硅烷
二苯基(4-苯氧基苯基)硅烷
二苯基(二苯基甲氧基)(二苯基甲基)硅烷
二苯基(二苯基甲基)硅烷
二苯基(間甲苯基)硅烷
二苯基(鄰甲苯基)(4-三甲基甲硅烷基)苯基)硅烷
20二苯基(對甲苯基)硅烷 二苯基二(間甲苯基)硅烷 二苯基二(鄰甲苯基)硅烷 二苯基甲基(鄰甲苯基)硅烷 二苯基苯乙基(鄰甲苯基)硅烷
十二烷基三(2-聯(lián)苯基)硅垸
十二烷基三(2-環(huán)己基乙基)硅烷
十二垸基三(3-氟苯基)硅烷
十二烷基三(間甲苯基)硅院
乙氧基三(鄰甲苯基)硅烷
乙氧基三(2-甲氧基苯基)硅垸(1)
乙基-雙-(2，4,6-三甲基苯基)-硅烷(l)
亞乙基雙(三(癸基)硅烷)(l)
十六垸基硫基(sulfanyl)乙炔基-三甲基-硅烷
異丁基(三甲氧基)硅烷(2)
甲基-三(三甲基甲硅烷氧基)硅烷(1)
甲基苯基(4-(三甲基甲硅垸基甲基)苯基)硅垸(1)
甲基苯基(間甲苯基)硅垸(l)
甲基三(2-甲氧基乙氧基)硅烷
苯基(鄰甲苯基)硅垸(l)
苯基-三(三甲基甲硅烷氧基)硅烷(1)
苯基三(間甲苯基)硅烷(l)
苯基三(鄰甲苯基)硅烷(l)
苯基三(對甲苯基)硅垸
苯基三(2-環(huán)己基乙基)硅烷
苯基三(2-乙基己基)硅烷
苯基三(2-甲氧基乙氧基)硅垸
苯基三(4-(三甲基甲硅烷基)苯基)硅烷
苯基三(9-乙基-3-咔唑基)硅烷三(鄰甲苯基)硅烷
三乙酰氧基(乙基)硅烷
三乙酰氧基(甲基)硅垸
三乙酰氧基(乙烯基)硅垸
三乙氧基(l-苯基次乙基)硅烷
三乙氧基(3-異氰酸基丙基)硅烷
三乙氧基(3-硫代氰酸基丙基)硅垸
三乙氧基(4-甲氧基苯基)硅烷
三乙氧基[4-(三氟甲基)苯基]硅烷
三乙氧基(乙基)硅烷
三乙氧基(異丁基)硅烷
三乙氧基(辛基)硅烷
三乙基(硅烷-d)
三(十六烷基)(4-(三甲基甲硅烷基)苯基)硅烷
三甲氧基[2-(7-氧雜二環(huán)[4丄0]庚-3-基)乙基]硅垸
三甲氧基(2-苯乙基)硅烷
三甲氧基[3-(甲基氨基)丙基]硅烷
三甲氧基[3-(苯基氨基)丙基]硅垸
三甲氧基(7-辛烯-l-基)硅烷
三甲氧基(十八垸基)硅烷 三甲氧基(辛基)硅烷
三甲氧基(丙基)硅烷 三甲氧基(乙烯基)硅烷
三甲基(l,2，3，4，5-五甲基-2，4-環(huán)戊二烯-l-基)硅烷 三甲基-(-甲基-1 -苯基丙氧基)-硅烷 三甲基(l-丙烯基)硅垸
三甲基(2，3,4,5-四甲基-2,4-環(huán)戊二烯-l-基)硅垸 三甲基(2-苯基-1 ， 1 -雙(三甲基甲硅烷基)乙基)硅烷 三甲基-(4'-萘次甲-1 -基-聯(lián)苯基-4-基)硅烷三甲基-(4-硝基-苯基乙炔基)硅烷
三甲基 三甲基 三甲基 三甲基 三甲基 三甲基 三甲基 三甲基 三甲基 三甲基
:基
4-(三甲基甲硅烷基)丁氧基)硅垸 甲硫基)硅烷
苯基)硅垸 苯基硒代甲基)硅烷 苯硫基)硅烷 苯硫基甲基)硅烷
炔丙基)硅垸 丙氧基)硅垸 乙烯基)硅烷 1,2，2-三苯基乙基)硅烷 3-(三苯基甲鍺烷基)丙基)硅烷 三苯甲基)硅烷 乙烯基)硅垸 三(l-萘基)硅烷 三(2-聯(lián)苯基)硅垸 三(4-(三甲基甲硅垸基)苯基)硅烷 三(癸基)硅烷
'封
封
三(異丙硫基)存 三(苯乙基)硅垸
三(三甲基甲硅垸氧基)硅烷
三(三甲基甲硅烷基)硅烷
三乙基硅烷
l-(二甲基甲硅垸基)-2-苯乙炔 3-(三乙氧基甲硅垸基)丙基異氰酸酯 3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯 3-[三(三甲基甲硅烷氧基)甲硅垸基]丙基甲基丙烯i
鵬烯丙基(4-甲氧基苯基)二甲基硅烷 二甲氧基-甲基-十八烷基硅烷
甲氧基聚乙二醇5，000三甲基甲硅烷基醚 N-[3-(三甲氧基甲硅垸基)丙基]苯胺
炔丙基三甲基硅烷
硅2，3-萘酞菁雙(三己基甲硅烷氧化物) 叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲垸磺酸酯 四烯丙基原硅酸酯 四烯丙基硅烷
四(二甲基甲硅烷基)原硅酸酯
四甲基-dl2原硅酸酯
三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯
三(二甲基甲硅垸氧基)苯基硅垸
乙烯基三甲氧基硅烷
乙烯基三甲基硅垸
乙烯基三甲基硅垸
3-(2-氨基乙基氨基兩基-二甲氧基甲基硅烷 [3-(2-氨基乙基氨基)丙基]三甲氧基硅烷 烯丙基三甲基硅烷，和 甲基2-(三甲基甲硅烷基)丙酸酯
根據(jù)本發(fā)明方法，另外優(yōu)選的是，所述生物材料選自由真核細(xì)胞、 真核細(xì)胞碎片、原核生物、原核生物碎片、古細(xì)菌、古細(xì)菌碎片、病毒 和病毒碎片組成的組。真核細(xì)胞、原核生物、古細(xì)菌和病毒的所述碎片 包括(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸、多糖和它們的組合物。
真核細(xì)胞組包括酵母細(xì)胞、低級植物和高級植物的細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞 和高等動物細(xì)胞。優(yōu)選的是，高等動物的所述細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，更 優(yōu)選為人類細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，真核細(xì)胞、原核生物和古細(xì)菌的碎片應(yīng)理解為包括薄 膜部分(膜泡)或細(xì)胞區(qū)室(例如來自真核細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞器)或細(xì)菌細(xì)
24胞壁的成分(例如脂多糖(LPS)、肽聚糖和脂磷壁酸)。真核細(xì)胞、原核生 物和古細(xì)菌的碎片組還可以包括(多)肽，例如抗原性蛋白質(zhì)(如菌毛、蛋
白酶、熱激蛋白、甲?；?甲硫氨?；暮投舅?、Toll樣受體(TLR)、核 苷酸結(jié)合低聚域蛋白(Nod)和G-蛋白偶聯(lián)受體、甲?；?甲硫氨?；氖?體、蛋白酶激活受體和糖蛋白。糖蛋白組包括免疫受體和配體。免疫受 體和配體包括MHC復(fù)合物(負(fù)載有抗原性肽或單獨(dú)的MHC分子)和共刺
激分子。
根據(jù)本發(fā)明，病毒碎片的實(shí)例包括但是不限于諸如對于與宿主細(xì)胞 膜的相互作用和融合具有重要作用的病毒外膜多肽(例如包膜蛋白)等分 子。病毒碎片的其它實(shí)例還包括核病毒蛋白及其片段。
在本發(fā)明方法的替代性實(shí)施方式中，所述生物材料選自由通過合成 或半合成或重組制得的(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖組成的組。本 發(fā)明方法中使用的生物材料可以定義為包括沒有天然對應(yīng)物的(多)肽、寡 核苷酸、多核苷酸和多糖、以及自然存在的和人造的(多)肽、寡核苷酸、 多核苷酸和多糖的化學(xué)修飾衍生物。合成或半合成或重組制備(多)肽、寡 核苷酸、多核苷酸和多糖的方法在本領(lǐng)域中是已知的。
根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選所述(多)肽是受體。相應(yīng)受體的實(shí)例包括膜結(jié) 合受體和胞內(nèi)受體以及可溶性受體。這種受體的特別優(yōu)選實(shí)施方式是抗 體。本發(fā)明上下文中的受體被理解為與配體(受體的對應(yīng)物；在抗體的情 況下為抗原)發(fā)生特異性相互作用。功能性受體(優(yōu)選為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，與 非轉(zhuǎn)導(dǎo)性受休或截短受體相反)與其配體的相互作用可以導(dǎo)致信號級聯(lián)的 引發(fā)。該功能性受體的實(shí)例包括T細(xì)胞受體(TCR)和B細(xì)胞受體(BCR) 或共刺激受體(例如CD28)，這些受體參與免疫系統(tǒng)細(xì)胞的激活。功能性 受體與其配體的相互作用還可以導(dǎo)致不同細(xì)胞信號的引發(fā)，例如通過 Fas(CD95)或TNF超家族的其他受體(包括TNF-a受體家族)、TRAIL、死 亡受體(Death Receptor)、 Toll樣受體和Fc-受體引起的細(xì)胞凋亡。此外， 按照本發(fā)明，功能性受體與其配體的相互作用還可能導(dǎo)致抑制信號(例如 通過CTLA-4的信號)的引發(fā)。
如上所述，進(jìn)一步優(yōu)選所述受體是抗體、抗體片段或抗體衍生物。本發(fā)明上下文中描述的抗體能夠與表位特異性結(jié)合/相互作用。該表 位可以是多肽結(jié)構(gòu)，以及不包含氨基酸的化合物。本發(fā)明使用的術(shù)語"特 異性結(jié)合/相互作用"是指抗體或抗體片段不與或者基本上不與類似結(jié)構(gòu) 的表位交叉反應(yīng)。例如可以通過評估受研究的一組抗體在常規(guī)條件下與 所關(guān)注的表位的結(jié)合以及與多種或多或少(在結(jié)構(gòu)上和/或功能上)緊密相 關(guān)的表位的結(jié)合，來測試所述抗體組的交叉反應(yīng)性。只有在所關(guān)注的表 位的有關(guān)背景下(例如蛋白結(jié)構(gòu)中的特定基序)與該表位結(jié)合，但不與或基 本上不與其它表位結(jié)合的那些抗體才被認(rèn)為是對所關(guān)注的表位具有特異
性。相應(yīng)方法在例如Harlow和Lane的Antibodies(抗體)A Laboratory Manual((實(shí)驗(yàn)室操作指南)，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)或 Harlow禾卩Lane的Using Antibodies(抗體的使用)A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1999)中有描述。
抗休或抗體片段或抗體衍生物與抗原的構(gòu)象表位或連續(xù)表位特異性 結(jié)合/相互作用。構(gòu)象表位或非連續(xù)表位對于多肽抗原的特征為存在兩個 或更多個離散的氨基酸殘基，其在一級序列上是分開的，但是當(dāng)多肽折 疊為天然蛋白/抗原時聚集在分子表面上(Sela， (1969)Science 166， 1365; 和Laver， (1990)Cell 61 ， 553-556)。構(gòu)成表位的兩個或更多個離散的氨基 酸殘基存在于一條或多條(多)肽鏈的不同區(qū)域上。當(dāng)所述一條或多條(多) 肽鏈折疊成三維結(jié)構(gòu)以構(gòu)成表位時，這些殘基聚集在分子的表面上。相 反，線性表位或連續(xù)表位由兩個或多個離散的氨基酸殘基構(gòu)成，其中氨 基酸殘基存在于(多)肽鏈的單條線性節(jié)段中。
抗體可以是任何類別抗體的單克隆抗體或多克隆抗體。 術(shù)語"抗體"還包括仍保持有結(jié)合特異性的抗體衍生物或片段。本 發(fā)明抗體還包括例如合成的、嵌合的、單鏈的和人源化的抗體以及抗體 片段等實(shí)施方式。
術(shù)語"抗體片段"涉及諸如Fab， F(ab2)'或Fv片段等片段。本發(fā)明 上下文中限定的術(shù)語"抗體衍生物"是指化學(xué)修飾抗體和抗體片段。這 包括scFv片段、單域抗體等。因此，抗體衍生物通常是來自抗體分子的 (多)肽和/或經(jīng)化學(xué)/生物化學(xué)或分子生物學(xué)方法修飾的(多)肽?？贵w片段與其特異性抗原的特異性相互作用的最低要求是在允許抗體片段和表位
配合的背景(context)中存在來自可變重鏈(VH)和母體抗體的可變輕變量 鏈(VL)的一個或多個CDR?？梢岳煤线m的抗體骨架來提供所述背景。 如本領(lǐng)域己知的，術(shù)語"骨架"在抗體或抗體衍生物的情形中是指氨基 酸序列，其起到CDR之間的間隔子的作用，并延伸CDR的N-末端和C-末端，提供允許CDR形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。為例如改善結(jié)合親合性 而通過分子生物學(xué)方法對骨架或CDR序列進(jìn)行的修飾可以包括利用本領(lǐng) 域已知的傳統(tǒng)技術(shù)對(多)肽進(jìn)行的修飾，所述傳統(tǒng)技術(shù)例如為單獨(dú)使用或 組合使用本領(lǐng)域己知的一個或多個氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/ 或重組和/或任何其它修飾(例如翻譯后修飾和化學(xué)修飾，如糖基化和磷酸 化)。將所述修飾引入基于免疫球蛋白鏈氨基酸序列的DNA序列的方法 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的(參見例如Sambrook等人的Molecular Cloning: A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989 年第2版和2001年第3版；Gerhardt等人的Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press, 1994; Lefkovits 的 Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, Academic Press, 1997;或Golemis的Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual ， Cold Spring Harbor Laboratory Press ， 2002)。 如上所述，進(jìn)一步優(yōu)選抗體是單克隆抗體。 最優(yōu)選的是所述(單克隆)抗體屬于IgG組、IgM組或IgY組。 按照本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實(shí)施方式，步驟(b)中附著的生物材料 共價結(jié)合到所述載體。本文已經(jīng)描述了如何通過共價鍵實(shí)現(xiàn)生物材料與 載體的附著的方法。
按照本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實(shí)施方式，在裝有載體的轉(zhuǎn)動的管體 系中進(jìn)行步驟(a)至步驟(c)。
此外，按照本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實(shí)施方式，通過泵在所述管體 系中轉(zhuǎn)動所述溶液。
在本發(fā)明方法的不同的一個特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，由具有多孔性 結(jié)構(gòu)的材料制成的載體包含至少一種其它材料。例如，在本發(fā)明載體由上述的提供一種或更多種化學(xué)實(shí)體的材料之一制成的情況下，可以加入 一種或多種其它材料，以提供不同化學(xué)實(shí)體或改變載體性質(zhì)。這在載體 由兩種、三種或更多種材料制成的情況下也是適用的。換言之，除以上 所限定的物質(zhì)之外，根據(jù)本發(fā)明用于涂布的載體還包括至少一種其它材 料。在制造載體時，可以通過混合各成分或通過用所述一種或多種其它 材料填充載體，將所述材料加工成載體。優(yōu)選的是，所述至少一種其它 材料選自由碳、二氧化硅(Si02)、羥乙基淀粉(HES)和生物素組成的組。
包含一種其它材料的多孔性載體的實(shí)例包括例如來自Kinetic Concepts Inc.(KCI， Texas, USA)的碳填充聚氨酯和聚醚泡沫。
按照本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實(shí)施方式，步驟(a)至(c)中的所述溶液 是包含0.5體積％至10體積％清蛋白和0.5體積％至5體積％甘露糖醇的 水溶液。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的是，步驟(a)至(c)中的所述水溶液包含0.6 體積％至3體積％的清蛋白。該水溶液優(yōu)選包含0.6體積％至3體積％的 糖(例如甘露糖醇)。
在一個替代性的實(shí)施方式中，步驟(a)中的所述溶液是含0.1體積％ 全:10體積。/。硅烷的醇(alcoho1)，步驟(b)中的所述溶液是包含生物材料(例 如抗體)的水溶液，步驟(c)中的所述溶液是包含0.5體積％至10體積％清 蛋白和0.5體積％至5體積％甘露糖醇的水溶液。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的 是，步驟(a)至(c)中的所述水溶液包含0.6體積％至3體積％清蛋白。該水 溶液優(yōu)選包含0.6體積％至3體積％的糖(例如甘露糖醇)。
本發(fā)明方法可以進(jìn)一步包括對所述固體涂布載體進(jìn)行滅菌的步驟 (e)。對本發(fā)明方法制造的固體涂布載體進(jìn)行滅菌的能力尤其允許在非無 菌或半無菌的條件下制造所述固體涂布載體，其中由此制造的載體仍然 可以用于包括使固體涂布載體與體液的體內(nèi)接觸或間接體內(nèi)接觸的本發(fā) 明方法。這代表了所述方法的又一個優(yōu)異特征，因此由于具有這樣的特 征，與產(chǎn)生不能進(jìn)行滅菌的載體的成本相比，本發(fā)明如此制造的載體可 以減少固體載體的制造成本。這是因?yàn)樵谥圃旆椒ㄖ?，不需要無菌的條 件。眾所周知，常規(guī)制備的載體不適用于滅菌，因此必須在完全無菌的 條件下制造。此外，對成本有利的特征是，所述載體在用后可以通過滅菌而得以再生。該再生的載體可以隨后用于進(jìn)一步處理同一患者或不同 患者，或者用于同樣包括載體與體液的體內(nèi)或間接體內(nèi)接觸的另一種診 斷方法或同一診斷方法。
優(yōu)選的是，根據(jù)載體材料，通過環(huán)氧乙烷(EO)、卩輻射、Y輻射、X 射線、熱滅活、高壓滅菌或等離子體滅菌進(jìn)行載體的滅菌或再生。最優(yōu)
選的是，通過(3輻射或Y輻射進(jìn)行載體滅菌。適用于該實(shí)施方式的是利 用10MeV的電子加速器，以25kgray劑量進(jìn)行(3輻射。可以用環(huán)氧乙烷 滅菌對本發(fā)明載體進(jìn)行一定程度的滅菌。通常，所選擇的滅菌方法必須 不能傷害到涂布生物材料的所需活性。這種方法可以用于上述的細(xì)胞碎 片、(多)肽(特別是抗體或受體)、多核苷酸或多糖或它們的復(fù)合物。迄今 為止還未知對任何種類的細(xì)胞均適合的滅菌方法。因此，活細(xì)胞用作所 述生物材料并且對載體進(jìn)行滅菌的實(shí)施方式不是本發(fā)明的一部分。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，提供了一種由或者可由本發(fā)明的方 法制造的固體涂布載體。
在另一個替代性的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種附著有生物材料 的固體涂布載體，其中生物材料包埋到涂布基體中，該基體由直接接觸 載體的至少一種硅烷第一層和覆蓋所述第一層的第二層構(gòu)成，其中第二 層由選自由以下物質(zhì)組成的組中的至少一種物質(zhì)構(gòu)成至少一種(多)肽、
至少一種氨基酸、淀粉、至少一種糖、至少一種磷酸鹽(酯)、至少一種多
元醇和聚乙二醇(PEG)或其混合物。更優(yōu)選的是，所述第二層的所述至少 一種物質(zhì)選自包括尤其是人或動物的血清和該血清的蛋白(例如清蛋白)、 奶、卵蛋白、植物(例如黃豆、小麥)源性蛋白(包括所述蛋白的水解產(chǎn)物(例 如凝膠、膠原))的組；包括氨基酸(優(yōu)選為甘氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸、 脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、 肉堿、鳥氨酸、羥基脯氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、瓜氨酸、菊粉、 苯丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、 纈氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸)或氨基酸衍生物(例如正乙酰基色氨酸、 卩-丙氨酸、黑色素、多巴)的組；包括糖(優(yōu)選葡萄糖、甘蔗糖、蔗糖)、多 元醇(優(yōu)選為山梨糖醇、甘露糖醇、丙三醇、木糖醇)、聚乙二醇(PEG)、
29羥乙基淀粉(HES)的組；包括磷酸鹽(例如磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉)或其
混合物的組。
優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明方法制造所述固體涂布載體。
根據(jù)本發(fā)明方法提供的載體、生物材料、生物材料和涂布基體材料 的附著的定義和說明等可以比照用于本發(fā)明的固體涂布載體。
此外，本發(fā)明的固體涂布載體的特別優(yōu)異的特征已經(jīng)在上文中的本 發(fā)明方法特征記述的內(nèi)容中進(jìn)行了描述。
如在本發(fā)明的制造固體涂布載體的方法部分中所述，還優(yōu)選的是， 載體材料選自由玻璃、聚氨酯、聚酯、聚砜、聚乙烯、聚丙烯、丙烯酸 系聚合物、聚丙烯腈、聚酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、羊毛填料、開孔泡 沬塑料、網(wǎng)狀塑料和得自海綿動物(多孔動物)的結(jié)構(gòu)體組成的組。
根據(jù)本發(fā)明的固體涂布載體的一個優(yōu)選實(shí)施方式，生物材料選自由 真核細(xì)胞、真核細(xì)胞碎片、原核生物、原核生物碎片、古細(xì)菌、古細(xì)菌 碎片、病毒和病毒碎片組成的組。優(yōu)選的是，真核細(xì)胞碎片、原核生物 碎片、古細(xì)菌碎片或病毒碎片選自由(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖 組成的組。
在本發(fā)明的固體涂布載體的一個替代性實(shí)施方式中，生物材料選自 由通過合成或半合成或重組制得的(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖。 在本發(fā)明載體的一個同樣是優(yōu)選的實(shí)施方式中，第二層的所述至少
--種(多)肽是清蛋白，第二層的所述淀粉是羥乙基淀粉(HES)，和/或第二 層的所述至少一種糖是甘露糖醇或山梨糖醇。
優(yōu)選具有多孔性結(jié)構(gòu)的載體材料的特征在于表面/氣體容積比為30 cm—1至300 cm-1。
還優(yōu)選的是，具有多孔性結(jié)構(gòu)的載體材料的特征在于未壓縮材料體 積/壓縮材料體積的比為4至40。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，載體材料是中空纖維。中空纖維包裝 件優(yōu)選具有如下特征未壓縮材料體積/壓縮材料體積的比為1至10，和 /或表面/氣體容積比為200 cm—1至2000 cm"。
另外優(yōu)選的是，所述第一層的所述至少一種硅烷選自由垸氧基硅烷、有機(jī)官能性硅垸、氫硅(氧)烷、硅氧垸、有機(jī)硅烷(包括具有其它官能團(tuán) 的甲硅烷基化合物)組成的組。上述己經(jīng)提供適當(dāng)硅垸的實(shí)例。
按照本發(fā)明，所述載體的第二層可以是包含清蛋白和甘露糖醇的優(yōu) 選為干燥的混合物。優(yōu)選的是，所述混合物進(jìn)一步包含聚乙二醇(PEG)。 特別是，根據(jù)本發(fā)明，將所述混合物以液體形式施用于所述載體，隨后 在本發(fā)明載體的表面上干燥。優(yōu)選用風(fēng)干法進(jìn)行干燥。
在本發(fā)明的另 一個優(yōu)選實(shí)施方式中，生物材料共價結(jié)合至所述載體。
上文和所附實(shí)施例2描述有實(shí)現(xiàn)生物材料與固體載體的共價結(jié)合的方法。
對于本發(fā)明的固體涂布載體而言進(jìn)一步優(yōu)選的是，(b)項(xiàng)中包埋涂布 基體的(多)肽是受體。更優(yōu)選的是，所述受體是抗體或抗體片段。根據(jù)本 發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式特別想到的是，所述抗體是單克隆抗體。
包埋到本發(fā)明載體的涂布基體的(單克隆)抗體可以是任何抗體種類
的抗體。優(yōu)選的是，所述抗體屬于IgG組、IgY組或IgM組。
特別優(yōu)選的是，本發(fā)明載體包含至少一種其它材料。例如，在本發(fā) 明載體由上述的提供一種或更多種化學(xué)實(shí)體的材料之一制成的情況下， 可以加入一種或多種其它材料，以提供不同化學(xué)實(shí)體或改變載體性質(zhì)。 這在載體由兩種、三種或更多種材料制成的情況下也是適用的。換言之， 除以上所限定的物質(zhì)之外，根據(jù)本發(fā)明用于涂布的載體還包括至少一種 其它材料。在制造載體時，可以通過混合各成分或通過用所述一種或更 多種其它材料填充載體，將所述材料加工成載體。優(yōu)選的是，所述至少 -種其它材料選自由碳、二氧化硅(Si02)、羥乙基淀粉(HES)和生物素組 成的組。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方式中，通過卩輻射或y輻射對載體進(jìn) 行滅菌。適用于該實(shí)施方式的是利用10MeV的電子加速器，以25kgray 劑量進(jìn)行卩輻射。
在本發(fā)明的另一個替代性實(shí)施方式中，提供了本發(fā)明的固體涂布載 體在制備用于接觸、過濾或清潔患者的血液、淋巴或腦脊髓液的(醫(yī)學(xué)) 設(shè)備中的用途。本發(fā)明上下文中的術(shù)語"(醫(yī)學(xué))設(shè)備"是指包括本發(fā)明的固體涂布載體或用本發(fā)明方法制造的固體涂布載體的設(shè)備。以下舉例說 明了該設(shè)備的實(shí)例。該設(shè)備適于通過將其與患者體液循環(huán)連接而能夠接 觸、過濾或清潔患者的血液、淋巴或腦脊髓液，從而治療上文(制造固體 涂布載體方法的上下文中)所述的患者。此外，所述(醫(yī)學(xué))設(shè)備可以適用 于定性或定量檢測患者體液樣品中的化合物以及俘獲某些細(xì)胞，例如干 細(xì)胞(如部分上文所述)。干細(xì)胞包括多能性干細(xì)胞、專能性干細(xì)胞
(multipotent)或全能性干細(xì)胞。通過利用適當(dāng)涂布有一種或多種如上文所 限定的生物材料的本發(fā)明載體，俘獲某些細(xì)胞或一種或多種細(xì)胞群，可 以從樣品中除去至少一部分這些細(xì)胞或細(xì)胞群，所述生物材料通過在體 液樣品中進(jìn)行接觸，特異性地結(jié)合到這些細(xì)胞或細(xì)胞群。通常，可以用 細(xì)胞表面上存在的不同抗原來區(qū)別不同的細(xì)胞系、細(xì)胞物種或細(xì)胞的發(fā) 育階段。通過用例如用于抗原的相應(yīng)受體或直接抗所述抗原的抗體涂布 本發(fā)明載體，可以選擇性地俘獲所需細(xì)胞。
在本申請全文中使用的術(shù)語"接觸、過濾或清潔"是指從溶液除去 -種或多種化合物的替代性手段。因此，術(shù)語"接觸"可以是過濾和清 潔的起始?xì)i驟。
所公開的優(yōu)選的醫(yī)學(xué)設(shè)備可用于包括從體液脫除毒素(例如二噁英、 肉毒桿菌毒素、破傷風(fēng)毒素、LPS、腐敗毒等)的治療中。此外，所述設(shè) 備可用于治療細(xì)菌性疾病或病毒性疾病，特別是病毒主要負(fù)載在血液或 其它體液中的疾病(例如出血熱、a型肝炎、b型肝炎、c型肝炎、d型肝 炎、e型肝炎、HIV、登革熱)或細(xì)菌主要負(fù)載在血液或替代性體液的疾病 (例如帶有腦膜炎球菌或肺炎球菌的敗血癥)。設(shè)想所公開醫(yī)學(xué)設(shè)備的另一 個替代性應(yīng)用是用于需要刺激或除去患者某些細(xì)胞的治療。除去特定細(xì) 胞群是指在例如增值性疾病(例如微量殘留癌)、自身免疫疾病的治療或器 官移植所引起的疾病的治療中。刺激特定細(xì)胞群是指在例如通過激活免 疫系統(tǒng)細(xì)胞可以治愈或減輕的疾病治療中。激活細(xì)胞群適于消除特定的 病細(xì)胞群。
此外，利用固著至固體載體的適當(dāng)抗體(例如抗CD34或CD133)俘獲 干細(xì)胞是該設(shè)備的有用應(yīng)用。俘獲后，通過酶法釋放、冷卻液、機(jī)械力(振動等)或這些技術(shù)的組合收獲細(xì)胞。
圖3和4示意地描述了所公開的(醫(yī)學(xué))設(shè)備的實(shí)施方式的實(shí)例。 (醫(yī)學(xué))設(shè)備的一種實(shí)施方式包括暫時性或永久性植入物，其特征為本 身是本發(fā)明的固體涂布載體或本發(fā)明方法所制造的固體涂布載體的表 面，或附著有本發(fā)明的固體涂布載體或本發(fā)明方法所制造的固體涂布載 體的表面。這包括骨縫術(shù)設(shè)備、重建外科手術(shù)等使用的材料、以及新型 支架。這種新型支架可以具有免疫催化特征(如上所述的剌激、抑制或消 除特征)。
(醫(yī)學(xué))設(shè)備的另外的實(shí)施方式包括引入體外體系的導(dǎo)管、電路、設(shè)備，
例如動脈濾器、氧合器、貯器、白細(xì)胞抑制模塊(LIM)、白細(xì)胞刺激模塊 (LSM)、耐受誘導(dǎo)模塊(Tolerance Induction Module)或人造淋巴結(jié)，其包含 本發(fā)明的固體涂布載體，或者附著有本發(fā)明的固體涂布載體或根據(jù)本發(fā) 明方法制造的固體涂布載體。所述模塊已經(jīng)由例如Scholz M等人描述 (ASAIO J 2005; 51:144-147; Scholz M， Cinatl J Med Res Rev 2005; 25:331-342; Scholz M等人，J Thorac Cardiovasc Surg 2004; 127:1735-1742; Moreno JB等人，Perfusion 2004; 19:11-16)。
此外，(醫(yī)學(xué))設(shè)備的另一個替代性實(shí)施方式是內(nèi)壁是固體涂布載體或 附著有固體涂布載體的(醫(yī)學(xué))設(shè)備，包括間接體內(nèi)疫苗接種容器，分離設(shè) 備(apheresis device)、干細(xì)胞分離設(shè)備、瀉設(shè)備、注射器和暫時性或永久 性血液存儲設(shè)備(例如血庫，還有常規(guī)實(shí)驗(yàn)室或研究實(shí)驗(yàn)室中的實(shí)驗(yàn)室裝 置)。診斷(醫(yī)學(xué))設(shè)備的實(shí)例是ELISA板，其中板(或至少反應(yīng)孔)的表面 是固體涂布載體或附著有固體涂布載體。
上述所示表明疾病的實(shí)例包括具有多種起因的嚴(yán)重高脂血癥、純合 子型家族性高膽固醇血癥、雜合子型家族性高膽固醇血癥、缺陷Apo B-100缺陷癥、分離型脂蛋白(a)升高、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、干燥綜合 征(Sj6gren，s syndrome)、混合性結(jié)締組織病、擴(kuò)張性心肌病(DCM)、與凝 血因子抑制劑有關(guān)的疾病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小 板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性溶血性貧血、高丙種球蛋白血癥中的高 粘滯綜合征、重癥肌無力、格林-巴利綜合征、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性
33神經(jīng)病(CIDP)、異常蛋白血癥性多神經(jīng)病、骨髓移植、內(nèi)分泌眼眶病、I
型糖尿病(IDDM)、月市出血-肺炎綜合征(Goodpasture's syndrome)、由免疫
球蛋白或免疫復(fù)合物沉著引起的腎病、冷球蛋白血癥、天皰瘡、特應(yīng)性 皮炎、移植物抗宿主(GvH)疾病、宿主抗移植物(HvG)疾病，和各種形式
的血管炎。
本發(fā)明還提供了患者血液、淋巴或腦脊髓液的組成控制的方法，所 述方法包括將本發(fā)明的固體涂布載體與所述血液、淋巴或腦脊髓液接觸。
術(shù)語體液的"組成控制"定義為影響體液或不同體液樣品的特性的方 法。這包括過濾或清潔液體。在這種情況下，載體上的生物材料，例如 一種或多種受體將結(jié)合至體液的一種或多種成分上，并保持所述一種或 多種成分。優(yōu)選在上述生理?xiàng)l件下進(jìn)行該步驟。該定義還包括誘導(dǎo)樣品 中包含的細(xì)胞的活化狀態(tài)的變化，以及除去一種或多種特定細(xì)胞群。
根據(jù)本發(fā)明，可以在體內(nèi)、間接體內(nèi)或體外進(jìn)行患者血液、淋巴或 腦脊髓液的組成控制。
在患者的血液、淋巴或腦脊髓液的組成控制的方法的間接體內(nèi)或體 外實(shí)施方式的隨后步驟中，在與固體涂布載體接觸后，從所述載體上除 去所述血液、淋巴或腦脊髓液。
在生物材料是細(xì)胞(例如供體細(xì)胞或遺傳工程細(xì)胞/重組細(xì)胞)的實(shí)施 方式中，包含包埋生物材料的載體的接觸能夠使包埋細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)分 泌到患者體液中。所分泌的物質(zhì)是能夠治療患者疾病的有效物質(zhì)?？梢?用該方法治療的疾病包括例如糖尿病(利用島細(xì)胞或分泌胰島素的其它細(xì) 胞)、內(nèi)分泌疾病(例如利用來自甲狀腺或松果體的細(xì)胞或其它分泌有助于 治療疾病的激素的細(xì)胞)。因此，本文所述的患者的血液、淋巴或腦脊髓 液的組成控制方法能夠治療患者且副作用風(fēng)險最小。這是因?yàn)槿绻糜?體外/間接體內(nèi)的情況，供體或遺傳工程細(xì)胞/重組細(xì)胞并沒有進(jìn)入患者。 即使是體內(nèi)應(yīng)用(如上所述，其同樣構(gòu)成了本發(fā)明的實(shí)施方式)，由于與固 體載體附著的所述模式，這些細(xì)胞不能釋放到血流或其它體液中。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的上述用途和方法的特征為血液、淋巴或腦脊髓 液的組成控制，其在包含固體涂布載體的間歇容器(batch container)中進(jìn)行。作為選擇，在包含固體涂布載體的連續(xù)容器(flow through container)
中進(jìn)行血液、淋巴或腦脊髓液的組成控制。
在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種診斷疾病的方法。該方法
包括以下步驟
(a) 使患者的體液與本發(fā)明的其中包埋有受體的固體涂布載體接觸， 所述接觸在適宜使指示所述疾病的病原體或標(biāo)記蛋白與所包埋的受體特 異性結(jié)合的條件下進(jìn)行；和
(b) 檢測用于指示所述疾病的所述病原體或標(biāo)記蛋白是否已經(jīng)結(jié)合至 所包埋的受體。
可以在體內(nèi)、間接體內(nèi)或體外進(jìn)行所述方法。優(yōu)選的是，所述受體 是抗體或、抗體的片段或衍生物。最優(yōu)選的是，所述抗體是單克隆抗體。
術(shù)語"本發(fā)明的其中包埋有受體的固體涂布載體"是指，根據(jù)本發(fā) 明可由本發(fā)明方法制造的固體涂布載體或由本發(fā)明方法制造的固體涂布 載體，其中所述方法的步驟(b)中的所述生物材料由所述受體構(gòu)成或包含 所述受體。
利用本發(fā)明診斷方法診斷的疾病的實(shí)例包括上文中的述及醫(yī)學(xué)用途 和本發(fā)明治療方法的內(nèi)容中所描述的疾病?？梢岳美缈贵w樣抗 p24(HIV)(參見例如Schupbach等，J Aquir Immune Defic Syndr 2005; 40: 250-256.)或抗gB(HCMV)(參見例如Just-NuWing G等，Infection 2003; 31:
318-323)來檢測所述病原體或標(biāo)記蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，可以通過在生理?xiàng)l件下使患者體液樣品與抗體覆蓋表 面接觸，獲得使用以指示所述疾病的病原體或標(biāo)記蛋白與所附著的抗體 特異性結(jié)合的適宜條件。
本發(fā)明的診斷方法可以包括在細(xì)胞培養(yǎng)條件下溫育體液樣品材料以 富集病原體(如病毒、細(xì)菌或單細(xì)胞真核生物病原體)的步驟。
此外，本發(fā)明還提供了一種診斷組合物，所述診斷組合物包括本發(fā) 明的固體涂布載體。本發(fā)明的診斷組合物將優(yōu)選用于診斷疾病。
使用本發(fā)明的診斷組合物診斷的疾病的實(shí)例已在上文中進(jìn)行了描述。此外，本發(fā)明提供了一種純化化合物的方法，所述方法包括使包含 待純化的化合物的混合物與本發(fā)明的固體涂布載體接觸。根據(jù)附著或涂 布至載體的分子以及與化合物的特異性結(jié)合，本發(fā)明方法可以用于純化 例如蛋白質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)復(fù)合物或生物學(xué)來源或無機(jī)物來源的其它分子。
本發(fā)明的所述方法還適合于利用本發(fā)明的所述涂布載體，分離具有 不同磷酸化狀態(tài)或具有不同的翻譯后修飾的同類蛋白質(zhì)，其中涂布至載 體的分子特異性地識別這些狀態(tài)或修飾中的一種狀態(tài)或修飾。
本發(fā)明方法的原理對應(yīng)于本領(lǐng)域通常已知的親和純化的原理。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解到可使用不同形式來實(shí)施本發(fā)明的方法。例如，通 常采用的形式是填充有親和性材料的柱子，即本發(fā)明的涂布載體。
在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，附著至所述載體的分子例如 是抗體(如上所述)。
附圖展示了
圖1:
固定生物材料的涂布程序的示意圖。舉例說明的是用于生物材料(例 如抗體或細(xì)胞(或片段))的程序和它們在脅迫條件下的功能保持性。 圖2:
圖示所附實(shí)施例1中所述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的流式細(xì)胞計數(shù)-斑點(diǎn)印跡分 析。該分析說明EO滅菌后抗體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的保持。 圖3:
治療性毒素陷阱(tmp)(例如二噁英陷阱)的實(shí)施例的示意性設(shè)計。該
例舉設(shè)計允許低血流和預(yù)充容量。因此還可以用于不同的導(dǎo)管系統(tǒng)(例如
Sheldon導(dǎo)管)，例如在危重癥護(hù)理中的創(chuàng)傷、休克和敗血癥和其它情形之
后/期間使用的導(dǎo)管系統(tǒng)。
圖4:
(醫(yī)學(xué))裝置的實(shí)例的示意性圖示，其中(醫(yī)學(xué))裝置由聚氨酯泡沫帶有
被固定的抗體(例如抗CD95)的塑料盒組成。通過涂布，嗜中性粒細(xì)胞可 以暫時粘合至通過涂布而包埋的抗體上?？贵w的結(jié)合可以引發(fā)嗜中性粒細(xì)胞失活信號。
下列各實(shí)施例用于闡述本發(fā)明。 實(shí)施例1:
利用本發(fā)明的固體涂布載體誘導(dǎo)細(xì)胞群中的細(xì)胞凋亡。 該試驗(yàn)性方法的目標(biāo)是確定涂布程序在用環(huán)氧乙烷或卩輻射消毒之
后，在被固定的抗Fas(CD95; APO-l)IgM-抗體的功能活性方面的保護(hù)作用。
NUNC 8孔室玻片的涂布和抗Fas IgM的固定.-
使用兩個8孔室玻片進(jìn)行涂布。在室溫下，用250 pl含有4%(2%至 5。/。)N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺的甲醇對每個孔進(jìn)行30分鐘的 處理。反向離心(inverse centrifogation)并在層流下干燥10分鐘之后，在 37。C和90。/。濕度，用200 pl含抗體的緩沖液(l:100代表在0.64 cn^上每 孔有1叱抗體)對部分的孔進(jìn)行1小時的溫育。未處理孔用作對照。隨后， 用封閉溶液(含有5%血清和5%甘露糖醇的PBS)處理各孔30分鐘。用封 閉溶液洗滌三次，并如上所述進(jìn)行干燥。經(jīng)涂布的孔可以在4。C保存數(shù)周。 在1.7巴、45°C、 180分鐘6。/。EO、 94%<:02進(jìn)行消毒，最高溫度為47°C。
用Jurkat細(xì)胞進(jìn)行的分析
于分裂后3至5天，在2%血清的存在下，向每個所準(zhǔn)備的孔(根據(jù) 上述說明)中加入1 X 105 Jurkat細(xì)胞并溫育過夜。48小時后，將8 pl碘化 丙啶(PI)和lpl膜聯(lián)蛋白V加入每個孔中。凋亡細(xì)胞結(jié)合膜聯(lián)蛋白V，而 壞死細(xì)胞吸收PI。 15分鐘后，從各個孔中輕柔地除去細(xì)胞，并用流式細(xì)
胞計(細(xì)胞凋亡FL1;壞死FL2)測定熒光。
用PBS小心地洗滌各孔，并保存在4X:，以測試較晚時間點(diǎn)涂布程
序的保存期。 結(jié)果
如圖2中典型圖示的，經(jīng)歷自然細(xì)胞凋亡(A)的Jurkat細(xì)胞的百分比 是6.9%(范圍6%至8%)。與在沒有固定抗體的情況下經(jīng)歷消毒(B)的涂 布孔接觸的Jurkat細(xì)胞表現(xiàn)出稍微增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡(17.9。/。；范圍16%至 20%)。根據(jù)上述涂布程序(C)固定的抗Fas誘導(dǎo)54.7%細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡
37(范圍54%至58%)。用環(huán)氧乙烷(EO)消毒后，Jurkat細(xì)胞中抗體介導(dǎo)的 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)(D)是43.1。/。(范圍40%至44°/。)。因此，與未滅菌的對照 (沒有EO氣體的程序)相比，EO介導(dǎo)的抗體功能下降為約25。/。。斑點(diǎn)印 跡分析(圖2)顯示了各種細(xì)胞群(FL1 =細(xì)胞凋亡；FL2 =壞死)的熒光分布。
實(shí)施例2:白細(xì)胞抑制模塊(LIM)的制造
為了制造LIM，將泡沫浸泡在98%甲醇和2%(3-縮水甘油基-氧基丙 基)三甲氧基硅烷(Sigma)的混合物中20分鐘，然后干燥，隨后在37°。在 緩沖液中溫育100(ig抗體2小時，所述緩沖液由在水中的15mM碳酸鈉 和35mM碳酸氫鈉組成(pH9)。作為選擇，PBS可以用作抗體用緩沖液。 然后，加入包含2°/。人清蛋白的蛋白質(zhì)濃度的等滲NaCl溶液，再進(jìn)行1 小時的溫育。隨后利用包含1%人清蛋白的等滲氯化鈉溶液進(jìn)行10個洗 滌循環(huán)。最后，用包含5%人清蛋白和5%甘露糖醇的等滲鈉溶液溫育30 分鐘后干燥。環(huán)氧乙烷殺菌使抗體活性(用Jurkat細(xì)胞測試)降低約60%。 利用10 MeV電子加速器以25 kGray劑量進(jìn)行卩輻射后，與沒有滅菌的 活性相比，抗體活性保留約70%。作為選擇，可以利用Y輻射(例如利用 CcT源)進(jìn)行滅菌。
圖4圖示了LIM的示意圖。
權(quán)利要求
1. 一種制造攜帶有生物材料的固體涂布載體的方法，所述方法包括以下步驟(a)將固體載體與包含至少一種硅烷的溶液溫育，隨后除去所述溶液，所述溶液中包含的所述至少一種硅烷以重量或體積計為0.1％至10％；(b)通過將所述載體與包含所述生物材料的優(yōu)選為緩沖的水溶液溫育，隨后除去所述水溶液，從而將所述生物材料附著至所述載體上；和(c)在水溶液中溫育所述載體，所述水溶液包含選自(多)肽、氨基酸、淀粉、糖、磷酸鹽、多元醇、聚乙二醇(PEG)或其混合物中的一種或多種物質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括步驟(d):(d) 將所述載體干燥至殘留水含量〈20重量％。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括步驟(a'):(a')將所述載體干燥至所述溶液的殘留含量小于初始施用溶液的10%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括在所述 歩驟(b)之后且在步驟(c)之前的歩驟(b';):(b')在包含封閉劑的緩沖水溶液中溫育所述載體，并除去所述水溶液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括 在所述步驟(b)之后且在步驟(C)之前的步驟(b"):(b")利用包含0.5重量o/o至10重量。/。的選自由以下物質(zhì)組成的組中的 物質(zhì)的水溶液封閉未結(jié)合位點(diǎn)(多)肽、羥乙基淀粉(HES)、甘露糖醇、 山梨糖醇和聚乙二醇(PEG)、奶、來自于黃豆、小麥或蛋的蛋白質(zhì)，并且 可以在封閉后利用水溶液進(jìn)行一次或多次洗滌步驟。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(c)中的所述 載體在包含選自由以下物質(zhì)組成的組中的一種或多種物質(zhì)的水溶液中溫育清蛋白、羥乙基淀粉(HES)、甘露糖醇、山梨糖醇和聚乙二醇(PEG)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的方法，其中所述載體的所述材料具有多孔性結(jié)構(gòu)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述載體的所述材料的特征 在于表面/氣體容積比為30 cm"至300 cm"。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述載體的所述材料的 特征在于未壓縮材料體積/壓縮材料體積的比為4至40。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述載體的所述材料具有中 空纖維結(jié)構(gòu)，優(yōu)選具有如下特征未壓縮材料體積/壓縮材料體積的比為 1至10，和/或所述表面/氣體容積比為200 cm-'至2000 cm"。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的方法，其中所述載體的所 述材料選自由玻璃、聚氨酯、聚酯、聚砜、聚乙烯、聚丙烯、丙烯酸系 聚合物、聚丙烯腈、聚酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、羊毛填料、開孔泡沫 塑料或玻璃、網(wǎng)狀塑料或玻璃、以及得自海綿動物(多孔動物)的結(jié)構(gòu)體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)中的所 述溶液是水溶液。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)中的所 述溶液是非水溶液。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一種 硅烷選自由垸氧基硅烷、有機(jī)官能性硅烷、氫硅(氧)烷、硅氧烷和包括具 有其它官能團(tuán)的甲硅烷基化合物在內(nèi)的有機(jī)硅烷。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物材料 選自由真核細(xì)胞、真核細(xì)胞碎片、原核生物、原核生物碎片、古細(xì)菌、 古細(xì)菌碎片、病毒和病毒碎片組成的組。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述真核細(xì)胞碎片、原核 生物碎片、古細(xì)菌碎片或病毒碎片選自由(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和 多糖組成的組。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物材料 選自由合成或半合成制得的(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖組成的組。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述(多)肽是受體。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述受體是抗體、抗體片 段或抗體衍生物。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的方法，其中所述抗體屬于IgG組、 IgY組或IgM組。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1至21任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物材料 通過共價鍵附著至步驟(b)中的所述載體上。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)所述的方法，其中所述步驟(a)至 步驟(c)在裝有所述載體的轉(zhuǎn)動的管體系中進(jìn)行。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1至23任一項(xiàng)所述的方法，其中所述溶液通過 泵在所述管體系中轉(zhuǎn)動。
25. 根據(jù)權(quán)利要求7至24任一項(xiàng)所述的方法，其中由具有多孔性 結(jié)構(gòu)的材料制成的所述載體包含至少一種其它材料。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述至少一種其它材料選 白由碳、二氧化硅、羥乙基淀粉和生物素組成的組。
27. 根據(jù)權(quán)利要求1至26任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)至(c)中 的所述溶液是包含0.5體積％至10體積％清蛋白和0.5體積％至5體積％ li「露糖醇的水溶液。
28. 根據(jù)權(quán)利要求1至26任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)中的所 述溶液是含有0.1體積％至10體積％硅烷的醇，步驟(b)中的所述溶液是 包含所述生物材料的水溶液，步驟(c)中的所述溶液是包含0.5體積％至 10體積％清蛋白和0.5體積％至5體積％甘露糖醇的水溶液。
29. 根據(jù)權(quán)利要求1至28任一項(xiàng)所述的方法，所述方法進(jìn)一步包 括對所述固體涂布載體進(jìn)行滅菌的步驟(e)。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中通過環(huán)氧乙垸(EO)、(3輻射、 Y輻射、X射線、熱滅活、高壓滅菌或等離子體滅菌對所述載體進(jìn)行滅 菌。
31. —種能夠由或者由權(quán)利要求1至30任一項(xiàng)所述的方法制造的固體涂布載體。
32. —種附著有生物材料的固體涂布載體，其中所述生物材料包埋 到涂布基體中，該涂布基體由直接接觸所述載體的至少一種硅烷第一層 和覆蓋所述第一層的第二層構(gòu)成，所述第二層由選自由以下物質(zhì)組成的組中的至少一種物質(zhì)構(gòu)成至少一種(多)肽、至少一種氨基酸、淀粉、至少一種糖、至少一種磷酸鹽、至少一種多元醇和聚乙二醇(PEG)或其混合
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的載體，其中所述載體的所述材料具有 多孔性結(jié)構(gòu)。
34. 根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的載體，其中所述載體的所述材料 選自由玻璃、聚氨酯、聚酯、聚砜、聚乙烯、聚丙烯、丙烯酸系聚合物、 聚丙烯腈、聚酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、羊毛填料、開孔泡沫塑料、網(wǎng) 狀塑料和得自海綿動物(多孔動物)的結(jié)構(gòu)體組成的組。
35. 根據(jù)權(quán)利要求32至34任一項(xiàng)所述的載體，其中所述生物材料 選自由真核細(xì)胞、真核細(xì)胞碎片、原核生物、原核生物碎片、古細(xì)菌、 占細(xì)菌碎片、病毒和病毒碎片組成的組。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的載體，其中所述真核細(xì)胞碎片、原核 生物碎片、古細(xì)菌碎片或病毒碎片選自由(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和 多糖組成的組。
37. 根據(jù)權(quán)利要求32至34任一項(xiàng)所述的載體，其中所述生物材料 選自由合成或半合成或重組制得的(多)肽、寡核苷酸、多核苷酸和多糖組 成的組。
38. 根據(jù)權(quán)利要求32至37任一項(xiàng)所述的載體，其中所述第二層的 至少一種(多)肽是清蛋白，所述第二層的所述淀粉是羥乙基淀粉(HES)， 和/或所述第二層的所述至少一種糖是甘露糖醇或山梨糖醇。
39. 根據(jù)權(quán)利要求32至38任一項(xiàng)所述的方法，其中具有多孔性結(jié) 構(gòu)的所述載體的所述材料的特征在于表面/氣體容積比為30 cm—1至300 cm一 o
40. 根據(jù)權(quán)利要求33至39任一項(xiàng)所述的載體，其中具有多孔性結(jié)構(gòu)的所述載體的所述材料的特征在于未壓縮材料體積/壓縮材料體積的比為4至40。
41. 根據(jù)權(quán)利要求33至39任一項(xiàng)所述的載體，其中所述載體的所 述材料是中空纖維，優(yōu)選具有如下特征未壓縮材料體積/壓縮材料體積 的比為1至10，和/或表面/氣體容積比為200cm-'至2000cm-'。
42. 根據(jù)權(quán)利要求32至41任一項(xiàng)所述的載體，其中所述第一層的 所述至少一種硅垸選自由烷氧基硅烷、有機(jī)官能性硅垸、氫硅(氧)烷、硅 氧烷、包括具有其它官能團(tuán)的甲硅烷基化合物在內(nèi)的有機(jī)硅烷組成的組。
43. 根據(jù)權(quán)利要求32至42任一項(xiàng)所述的載體，其中所述第二層是 包含清蛋白和甘露糖醇的優(yōu)選為干燥的混合物。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的載體，其中所述第二層進(jìn)一步包含聚 乙二醇(PEG)。
45. 根據(jù)權(quán)利要求32至44任一項(xiàng)所述的載體，其中所述生物材料 通過共價鍵附著至所述載體。
46. 根據(jù)權(quán)利要求36至45任一項(xiàng)所述的載體，其中所述(多)肽是受體。
47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的載體，其中所述受體是抗體、抗體片 段或抗體衍生物。
48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的載體，其中所述抗體是單克隆抗體。
49. 根據(jù)權(quán)利要求47或48所述的載體，其中所述抗體屬于IgG組、 IgY組或IgM組。
50. 根據(jù)權(quán)利要求32至49任一項(xiàng)所述的載體，其中所述載體包含 至少一種其它材料。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的載體，其中所述至少一種其它材料選 自由碳、二氧化硅、羥乙基淀粉和生物素組成的組。
52. 根據(jù)權(quán)利要求32至51任一項(xiàng)所述的載體，其中所述載體通過(3輻射或Y輻射進(jìn)行滅菌。
53. 權(quán)利要求32至52任一項(xiàng)所述的固體涂布載體在制備用于接 觸、過濾或清潔患者的血液、淋巴或腦脊髓液的醫(yī)學(xué)產(chǎn)品中的用途。
54. —種控制患者的血液、淋巴或腦脊髓液的組成的方法，所述方法包括將所述血液、淋巴或腦脊髓液與權(quán)利要求32至52任一項(xiàng)所述的 固體涂布載體接觸。
55. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的用途或權(quán)利要求52所述的方法，其中 在包含所述固體涂布載體的間歇容器中進(jìn)行患者的血液、淋巴或腦脊髓 液的組成控制。
56. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的用途或權(quán)利要求52所述的方法，其中 在包含所述固體涂布載體的連續(xù)容器中進(jìn)行患者的血液、淋巴或腦脊髓 液的組成控制。
57. —種診斷疾病的方法，所述方法包括以下步驟(a) 使患者的體液與權(quán)利要求46至52任一項(xiàng)所述的固體涂布載體接 觸，所述接觸在適宜使指示所述疾病的病原體或標(biāo)記蛋白與所包埋的受 體特異性結(jié)合的條件下進(jìn)行；和(b) 檢測用于指示疾病的所述病原體或標(biāo)記蛋白是否已經(jīng)結(jié)合至所包 埤的受體。
58. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述受體是抗體、抗體片 段或抗體衍生物。
59. —種診斷組合物，所述診斷組合物包含權(quán)利要求32至52任一 項(xiàng)所述的固體涂布載體。
60. —種純化化合物的方法，所述方法包括將包含待純化的所述化 合物的混合物與權(quán)利要求32至52任一項(xiàng)所述的固體涂布載體接觸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制造攜帶有生物材料的固體涂布載體的方法。此外，本發(fā)明還涉及附著有生物材料的固體涂布載體以及所述固體涂布載體在制備醫(yī)學(xué)產(chǎn)品中的用途。此外，本發(fā)明還提供了一種接觸、過濾或清潔患者的血液、淋巴或腦脊髓液的方法、診斷疾病的方法以及診斷組合物。
文檔編號C12N11/00GK101437853SQ200780016328
公開日2009年5月20日 申請日期2007年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月5日
發(fā)明者斯特凡·馬格拉夫, 馬丁·肖爾茨 申請人:白血球保健股份有限公司