專利名稱：：量化在人血樣中包含的目標細胞群的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及量化在人血樣中包含的目標細胞群的方法，其包括步驟使人血與混合物接觸，所述混合物包含第一組分，所述第一組分包含至少一種非人抗體、抗體片段或其衍生物，其能夠特異結合于在第一細胞群表面表達的抗原上，所述第一細胞群與第二細胞群不同，所述第二細胞群是所述目標細胞群并且缺乏所述抗原，所述第一組分復合至第二組分，所述第二組分包含至少一種非人抗體、抗體片段或其衍生物，其能夠特異地結合于人紅細胞表面；分離血樣中包含的抗體標記的細胞和未標記細胞；收集包含所述第二細胞群的上清液；濃縮包含在所述上清液中的第二細胞群并使所述細胞群重懸于能夠選擇性裂解紅細胞的液體中；濃縮得到的細胞，基本除去所有上清液并使所述細胞重懸于確定體積的生理緩沖液中；以及確定在所述樣品中包含的第二細胞群的細胞數。此外，本發(fā)明涉及進行本發(fā)明方法的試劑在本說明書的全文中引用了幾篇文獻。本文所引用的文獻的公開內容(包括任何制造商的說明書、指示說明等)通過引用在此并入。不同類型的血細胞的計數通常是疾病的指標。例如，血液中極高的B細胞數可指示B細胞淋巴瘤，比如非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin-lymphoma)。白細胞增多(尤其是嗜中性粒細胞)通常指示各種感染；嗜酸細胞增多可指示猩紅熱、麻疹、淋病、麻風病、痢疾或過敏癥或蠕蟲；淋巴細胞增多可指示百日咳、風疹、腮腺炎。類似地，CD4+T-淋巴細胞絕對計數(CD4計數)起到HIV感染的患者免疫活性的主要臨床指標的作用(U.S.DepartmentofHealthandHuman
背景技術：
：6Services2005)，因為CD4+T-細胞是HIV病毒的天然靶宿主。它被認為是用于監(jiān)測HIV感染的臨床過程的最佳替代標記，因為這些細胞是這種病毒的天然宿主。CD4計數被用于評估免疫退化程度和向AIDS進展的速度，此外，用于確定開始抗逆轉錄病毒治療(ART)和機會性感染預防性治療(01)的時間，并且還用于當無法獲得病毒載量測量值吋監(jiān)測對ART的免疫應答(WorldHealthOrganization2005)。自從二十世紀八十年代早期，流式細胞術已經成為被接受的計算CD4+T-淋巴細胞數的標準參考方法(Donnenberg禾PDonnenberg2004)。然而，這種方法由于兩個因素在資源有限的地區(qū)無法得到廣泛的應用第一，流式細胞術要求非常昂貴的實驗儀器和試劑以及特別訓練的工作人員進行試驗。傳統的流式細胞術，比如FACSCalibur或者Coulter系統，花費50,000美元或更多來建立，并且每次試驗花費大約20至30美元(aidsmap2005)。第二，由于導致儀器相關問題的頻繁的電源故障，通常難以進行儀器維護。不同的研究人員已經嘗試減少流失細胞術的費用(Chianese等，2003;Janossy等，2002;Pattan叩anyasat等，2003;Storie等，2003a;Storie等，2003b)，但是監(jiān)測過程仍然花費大約每個樣品10美元。制造商宣布了最近開發(fā)的便攜式流式細胞儀，其運行成本為每個樣品2美元(CyTecsGmbH2005)。最近幾年，許多研究團隊開發(fā)了較低成本和較低技術要求的免疫測定，用于計算CD4+T-淋巴細胞數，其花費為大約每個樣品l-3美元。這些試驗基于顯微鏡，并且使用陽性篩選法，例如DynalBiotech的Dynabeads(Bi等，2005;Diagbouga等，2003)或者Beckman-Coulter的Cyto-Spheres(Balakrishnan等，2004;Carella等，1995)。然而，直到今天，這些方法都沒有在資源有限的地區(qū)普遍建立(Crowe等，2003)。此外，也沒有可行的試驗可用來以可接受的成本以及合適的技術設備和實驗室經驗要求來監(jiān)測人血樣中除CD4+T-淋巴細胞之外的細胞群的細胞數。因此，本發(fā)明的技術問題是提供儀器和方法，用于改進從對象獲取的樣品中細胞群的分析，尤其是在成本以及在資源有限的條件下處理方面。
發(fā)明內容通過提供在權利要求中描述的實施方式，獲得本技術問題的解決方案。因此，本發(fā)明涉及量化包含在人血樣中的目標細胞群的方法，其包括步驟(a)使人血液的樣品與混合物接觸，所述混合物包含(i)第一組分，其包含至少一種非人抗體、抗體片段或其衍生物，能夠特異結合在第一細胞群表面表達的抗原上，所述第一細胞群不同于第二細胞群，所述第二細胞群是目標細胞群并且缺乏所述抗原，其被復合到(ii)第二組分，其包含至少一種非人抗體、抗體片段或其衍生物，能夠特異結合于人紅細胞表面；其中所述接觸在允許抗原用它們的關連抗體(cognateantibody)標記的條件下進行；(b)通過密度離心分離在所述血樣中包含的抗體標記的細胞和未標記的細胞，其中介質密度的最小等級是大約1.077g/mL;(c)收集包含所述第二細胞群的上清液；(d)濃縮包含在所述上清液中的所述第二細胞群并且在能夠選擇性裂解紅細胞的液體中重懸所述細胞群；(e)在生理緩沖液中洗滌步驟(d)中得到的細胞，以除去步驟(d)中的緩沖液；(f)濃縮步驟(e)中得到的細胞，基本上除去所有上清液并重懸所述細胞于確定體積的生理緩沖液中；和(g)測定步驟(f)中獲得的細胞的數量，其中該細胞數對應于包含在所述血樣中的所述第二細胞群的細胞數。獲得人血樣的方法是本領域中己知的。術語"非人抗體"在本發(fā)明中定義為來源于除人之外的生物體的抗體。優(yōu)選地，非人抗體來源于小鼠、大鼠、羊或兔。相應的抗體可以是，例如，多克隆抗體或者單克隆抗體。所提到的它們的衍生物或片段仍然保留它們所來源的抗體的結合特異性。產生抗體的技術在8本領域是熟知的并且描述在，例如，Harlow禾tlLane"Antibodies,ALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988以及Harlow禾口Lane"UsingAntibodies:ALaboratoryManual"ColdSpringHarborLaboratoryPress,1999中。術語"抗體、抗體片段或其衍生物"也包括這樣的實施方式諸如嵌合抗體和單鏈抗體，以及抗體片段，例如Fab片段等等?？贵w片段或衍生物進一步包括F(ab')2、Fv或者scFv片段；見，例如，上述引文中的Harlow和Lane(1988)和(1999)。各種方法是本領域已知的并且可以被用于生產這類抗體和/或片段/衍生物。因此，(抗體)衍生物可以通過模擬肽學產生。此外，所描述的用于產生單鏈抗體的技術(見，美國專利4,946,778等)可以適用于產生特異于本發(fā)明多肽(一種或多種)和融合蛋白的單鏈抗體。同樣，轉基因動物可以用于表達特異于期望的細胞表面抗原的抗體。最優(yōu)選地，抗體/多種抗體是單克隆抗體/多種單克隆抗體。對于制備單克隆抗體，可以使用提供由連續(xù)細胞系培養(yǎng)產生的抗體的任何技術。這類技術的實例包括雜交瘤技術(K6hler和MilsteinNature256(1975),495-497)、三體瘤技術、人B-細胞雜交瘤技術(Kozbor,ImmunologyToday4(1983),72)和EBV-雜交瘤技術，以產生人單克隆抗體(Coleetal.，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss，Inc.(1985),77-96)。BIAcore系統中使用的表面等離子體共振可以被用于提高結合到本發(fā)明多肽的表位的噬菌體抗體的功效(Schier,HumanAntibodiesHybridomas7(1996),97-105;Malmborg，J.Immunol.Methods183(1995),7-13)。在本發(fā)明中還考慮，術語"抗體、抗體片段或其衍生物"包括可以在細胞中表達的抗體構建體，例如，可以通過病毒或者質粒載體等被轉染和/或轉導的抗體構建體。在本發(fā)明中描述的抗體、抗體片段或其衍生物能夠與包含在人血樣中的細胞的表面表位特異結合/相互作用。根據本發(fā)明所使用的術語"特異結合/相互作用"是指抗體、抗體片段或其衍生物不或者基本上不與相似結構的表位交叉反應。研究中的一系列抗體的交叉反應性可以被測試，例如，通過評價在常規(guī)條件下所述系列抗體與目標表位的結合以及與許多(結構上和/或功能上)或多或少密切相關的表位的結合。只有那些在相關環(huán)境中(例如蛋白質結構中的特異基序)與目標表位結合但不或者基本上不與其它任何表位結合的抗體被認為是對目標表位特異的并且因此成為根據本發(fā)明的抗體。相應的方法被描述在，例如，上述引文中的Harlow和Lane，1988和1999中。抗體、抗體片段或其衍生物與本發(fā)明多肽或者融合蛋白的獨特的構象性表位或連續(xù)表位特異結合/相互作用。對于多肽抗原，構象性表位或非連續(xù)性表位的特征在于存在兩個或更多個不連續(xù)的氨基酸殘基，其在一級序列中是分離的，但當多肽折疊成天然蛋白質/抗原以形成表位時，在分子表面集合起來(Sela,(1969)Science166，1365andLaver,(1990)Cell61，553-6)。構成該表位的兩個或者更多個不連續(xù)的氨基酸殘基存在于一個或多個多肽鏈的不同部分。相比而言，連續(xù)表位或線性表位由存在于多肽鏈的單個線性部分中的兩個或多個不連續(xù)的氨基酸殘基組成。術語"允許抗原用其關連抗體標記的條件"描述了允許抗體、片段或其衍生物與靶細胞表面的抗原特異性結合發(fā)生的條件。進一步，在這些條件下，血樣中的細胞凝結被抑制。例如，這些條件可以通過添加合適的試劑來獲得?？梢员谎a充到樣品中以抑制或避免凝結的這類試劑的實例在下文進行了描述。術語"密度離心"在本發(fā)明中涉及通過特異細胞群的特異物理特性從樣品中分離特異細胞群的熟知方法。由于在本領域中已知免疫系統的不同細胞固有地具有不同的密度和大小，所以可以利用這些參數來分離各個亞群。因為不同大小的細胞將具有不同的沉降速率，在一定程度上它們可以通過密度離心來分開。另一方面，相同大小但不同密度的細胞可以通過使用密度梯度離心來分開。通過仔細選擇介質的密度，可以從復雜混合物(例如，淋巴細胞)中產生高度純化的細胞亞群。根據本發(fā)明，密度梯度離心被用來分離血樣的細胞。表達被至少一種抗體、抗體片段或其衍生物結合的抗原的細胞(分別地，不期望的細胞群(一種或多種))以沉淀進行聚集。上清液由血清相、用于密度離心的介質相和兩項之間的相界面組成。在相界面中，紅細胞(RBC)和第二細胞群聚集。本發(fā)明步驟(c)中的上清液的收集包括這兩相和相界面的基本回收。10根據本發(fā)明，"生理緩沖液"是pH在7.0和7.60之間并且鹽濃度接近0.85%到0.9%的緩沖液。生理緩沖液的優(yōu)選實例是磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。如本文下面所述，更優(yōu)選的是，PBS被進一步補充非人血清。為了掩蔽非特異性結合位點而添加所述血清(封閉劑)。PBS被優(yōu)選地補充大約5%的非人血清，更優(yōu)選地3%的非人血清，并且最優(yōu)選地2%的非人血清。非人血清的非限制性實例包括胎牛血清(FCS)、牛血清、小鼠血清、大鼠血清或羊血清。特別優(yōu)選的是，非人血清是FCS。據理解，可被包含在步驟(a)描述的混合物的第一組分中的不同非人抗體、抗體片段或其衍生物的數目，確定第二細胞群的同質性或異質性。在此情況下，僅僅只有一種具有一種特異性的抗體、抗體片段或其衍生物被包含在混合物的第一組分中時，僅僅單一抗原的結合成分與人血樣接觸。在這種情況下，分離的第二細胞群包含原先包含在血樣中的、除紅細胞和在細胞表面表達第一組分抗體、抗體片段或其衍生物的特異性抗原的細胞群之外的所有類型的細胞。如本文下面所述的本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，一些包含具有不同特異性的抗體、抗體片段或其衍生物的混合物允許分離均一的或者基本上均一的第二細胞群(即，具有90%以上的一種細胞類型的細胞群，例如95%以上或者98。/。以上，或者甚至99%以上，例如100%)。這通過選擇抗體、抗體片段或其衍生物來實現，所述抗體、抗體片段或其衍生物對于包包含在樣品中的除第二細胞群/目標細胞群之外的每種(不期望的)細胞群的抗原特征具有特異性。本領域普通技術人員知曉確定通過本發(fā)明方法得到的樣品中的細胞數的不同替代方法。這些替代方法包括使用ELISA的方法(例如，用過氧化物酶或者堿性磷酸酶作為活性酶)、使用膠體金的測定、使用帶刻度的毛細管測量沉淀大小的分析、在光學顯微鏡下用血細胞計數器(例如，Neubauer型)進行手動計數、在血細胞計數器(如，Sysmex型)或者電子細胞計數器(如，easy型)中自動計數。本文下面描述了確定樣品中細胞數的方法的優(yōu)選實施方式。令人驚奇地發(fā)現，與熟知的確定血液樣品中特定細胞群的細胞數的實驗方法相比，本發(fā)明的方法可以在有限的實驗室儀器要求和降低的成本下使用。所選定的細胞群的數目或者不同的選定細胞群之間的比例的確定在疾病診斷和疾病分期中是特別令人感興趣的。可以通過本發(fā)明方法分析的疾病的優(yōu)選實例是HIV感染。如今，記錄3940萬人感染了HIV，其中所有的新HIV感染的95%發(fā)生在發(fā)展中國家人群中(UNAIDS2005)。盡管抗逆轉錄病毒治療越來越負擔得起并可以得到，監(jiān)測感染和其治療兩者所必需的實驗室試驗卻不是(Balakrishnan等，2005)。本發(fā)明提供了簡易的手動和低成本技術，用于定量特定細胞群，例如從人對象例如HIV感染個體取出的血液樣品中的CD4+T-細胞。本發(fā)明的方法被開發(fā)來可在資源有限環(huán)境中操作。本領域中已知的負選擇法(例如，RosetteSep)被設計為高純度細胞富集的定性技術。直到今天，它僅僅被用作定性分析(Busch等，2004;Bischoff等，2002)。根據制造商，這種技術顯示了非常好的純度(90±5%)但不良的回收率(59±24%)，以致其不能被用作定量分析。此外，制造商建議使用相當高的量的血液(l-15mL)，其因此需要高量的抗體混合物(50-750jJL)，因此使得此方法相對昂貴(5-70€/樣品)。根據本發(fā)明的方法，新開發(fā)的"改良型負選擇(modifiednegativeselection)"(MNS)技術提供回收率并減小了試劑用量以便可以被用作例如確定CD4計數的定量分析。在本發(fā)明的一種實施方式中，與制造商的方案相比，溫育時間從20分鐘增加到30分鐘，以確保完全清除所有不需要的細胞。為了實現更高的回收率，在梯度離心之后轉移整個上清液，因此保證收獲所有富集的CD4+T-細胞。此外，增添了裂解步驟，以除去殘留的RBC(紅細胞)。在最后的離心步驟之后，從微管中(優(yōu)選地完全地)除去剩余的液體。這可以通過例如使用棉簽完成。當富集的細胞(此處是CD4+T-細胞)被重懸時，優(yōu)選的殘留液體的完全去除避免不正確的稀釋。本研究中引入的MNS方法顯示出與流式細胞術的高相關性(r=0.91)。15.35±12.45%的平均差代表了分析樣品中特定細胞群的量的可接受偏差。在分離CD4+T-細胞的示例實施方式中，通過在梯度離心之后將含有期望的CD4+T-細胞的全部上清液轉移到新的微管中以收獲所有的CD4+T-細胞，回收率被進一步提高。因此，在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方式中，基本上全部含有第二細胞群的上清液在本方法12的步驟(C)中被收集/回收。術語"基本上全部"描述了收集率/回收率在上清液的90%以上，例如上清液的95%以上或者98%以上或者甚至99%以上，諸如100%。這也適用本方法的其它實施方式。本發(fā)明允許在優(yōu)選的實施方式中收獲所有目標細胞。根據本發(fā)明的教導，僅僅從例如當用微管和小試劑量工作吋血漿和Ficolf之間的相界面中收集富集的細胞不是有利的。因此，例如，對于RosetteSepTM，通過本發(fā)明的方法，回收率從原來的59±24%提高到79.36±19.13%，純度從90±5%稍微下降到81.10±10.78%。不希望被理論限制，可以理解的是較低的純度也是由于商業(yè)上可獲得的抗體混合物的組成所導致?？赡艿氖?，這種特定混合物不適合從任何血液樣品中清除所有不需要的細胞，特別是從病理血液(其可能包含，例如，數目增加的NK-細胞、YS-淋巴細胞、單核細胞)中清除。該混合物可以容易地被更好地適應本發(fā)明目的的不同混合物代替。此外，本領域己知的是，在光學顯微鏡下這些細胞有時難以與CD4+T-細胞中區(qū)分開，并且可能被誤算為假陽性。這方面解釋了幾種其它現象-表2中所見的回收率>100%，-HIV血液和非HIV血液之間純度和回收率值的差異，-HIV樣品中較低的相關性。為了本發(fā)明方法的效率，幾個步驟必須非常小心地進行。第一個是在梯度離心之后轉移(全部)上清液。該轉移的精確實施非常重要，因為其對純度和回收率都有影響如果上清液沒有完全被轉移，回收率將下降；如果RBC沉淀被混入，純度將減小。另一關鍵步驟是在本發(fā)明方法的步驟(f)中上清液的去除。該去除的效率可影響目標細胞(例如，CD4+T-細胞)的回收。當例如通過使用棉簽干燥沉淀時，細胞沉淀必須不被破壞，否則目標細胞的回收率可能下降，導致不準確的結果。在將獲得的細胞鋪層于例如血細胞計數器上之前，樣品最好被徹底地渦旋，以避免回收率的下降。手動計數過程中的"視覺門控"可以由本領域技術人員容易地進行。優(yōu)選的是，本發(fā)明的方法在取出人血樣之后很短的時間內進行，優(yōu)選地在取出血液之后24小時，更優(yōu)選地在取出血液之后12小時，甚至更優(yōu)選地在取出血液之后8、6、4或2小時。13本發(fā)明方法相對于本領域已知方法進一步的優(yōu)勢來源于這樣的事實僅僅需要少數幾件儀器例如，光學顯微鏡(優(yōu)選地具有40X物鏡)、計數室(例如，Neubauer型血細胞計數器)、微量離心機和漩渦器(vortexer)。通過將初始血液體積降低至僅僅lOOpL，所有試劑的需要量，其高于所有的抗體混合物，也得到降低。因此，分析一個樣品的成本被縮減。商業(yè)上可獲得的抗體混合物瓶U0mL)花費180美元，1L密度介質花費60美元。一次MNS-分析的總成本，包括一次性材料例如管和槍頭，可被分別估算為當使用5^L混合物時每個樣品大約0.50美元，以及當使用2)iL混合物時每個樣品0.30美元。術語"負選擇"根據其在本領域中的含義描述了一種選擇方法，其通過特異性清除不期望的細胞從樣本中聚集/分離細胞。根據本發(fā)明方法的負選擇考慮與流式細胞術的高相關性(r=0.91，p<0.0001)。因此，MNS方法表現出例如足夠的精確度，給予主治醫(yī)師可靠的CD4計數，使他能夠就ART的起始或機會性感染預防作出決定。花費0.30美元-0.50美元，甚至對于居住在發(fā)展中國家的患者也可以負擔。作為可靠的、簡易的且不昂貴的CD4+T-細胞計數方法，其代表著非常有吸引力的流式細胞術替代方法，尤其對于資源有限的條件下的小實驗室而言。對于CD4+T-細胞計數的優(yōu)選實施方式所述的優(yōu)勢當然也適用于本發(fā)明方法的其它實施方式。同樣優(yōu)選的是，根據本發(fā)明的方法在不同步驟中進行一個或者多個洗滌步驟。特別優(yōu)選的是，本方法包括在步驟(c)之后且在步驟(d)之前的步驟(c，):(c')在生理緩沖液中洗滌步驟(c)中獲得的細胞。在本發(fā)明方法優(yōu)選的實施方式中，所述第一組分和第二組分如下進行復合(i)形成抗體-蛋白A復合物、抗體-蛋白G復合物或抗體-蛋白L復合物(其中抗體-蛋白G復合物是優(yōu)選的)；或(ii)使所述第一組分和第二組分與能夠特異結合所述第一組分和第二組分的抗體溫育。蛋白A、蛋白G或蛋白L可以在固體載體上固定。這類固體載體的例子包括瓊脂糖或者瓊脂糖凝膠珠(例如，四瓊脂糖凝膠珠(tetra-sepharosebeads))。對于本發(fā)明的方法優(yōu)選的是，所述第二細胞群(目標細胞群)選自CD4+細胞群、CD8+細胞群、CD14+細胞群和CD19+細胞群。更優(yōu)選地，目標細胞群是CD4+或CD8+細胞群。進一步優(yōu)選的是，所述第一組分包含(i)至少5種非人抗體、抗體片段或其衍生物，其能夠特異結合人CD8、CD16、CD19、CD36禾卩CD56;或者(ii)至少5種非人抗體、抗體片段或其衍生物，其能夠特異結合人CD4、CD16、CD19、CD36禾卩CD56。在本方法優(yōu)選的實施方式中，第一組分中至少5種非人類抗體、抗體片段或其衍生物的量是相等的。根據本發(fā)明的方法同樣優(yōu)選的是，能夠特異結合人紅細胞表面的抗體、抗體片段或其衍生物是(i)抗血型糖蛋白(例如CD235a、CD235b、CD236或CD236R)的抗體、抗體片段或其衍生物；(ii)抗Kell抗原(例如CD238)的抗體、抗體片段或其衍生物；(iii)抗Rhesus抗原(例如CD240CE、CD240D或CD241)的抗體、抗體片段或其衍生物；(iv)抗B-CAM(例如CD239)的抗體、抗體片段或其衍生物；或(v)抗ICAM-4(例如CD242)的抗體、抗體片段或其衍生物。在可選的實施方式中，本發(fā)明涉及與血液中目標細胞群的細胞數相關的疾病診斷或分期的方法，所述方法包括用于量化目標細胞群的本發(fā)明方法的步驟，以及在第二細胞群(目標細胞群)的具體細胞數的基礎上確定(i)從中獲取血樣的人是否被疾病感染；和/或(ii)疾病的特征階段。術語"分期疾病(stagingadisease)"在本發(fā)明中描述了確定疾病發(fā)展階段的方法。這類確定對于確定一種或者多種合適藥物組合物的有希望的給藥方案是重要的。優(yōu)選的是，由本發(fā)明方法分期的疾病是HIV感染。分類(即，診斷)，尤其是HIV疾病的分類，可以由于幾種目的而進行并且應當區(qū)15別于疾病分期。分期是這樣的疾病分類，其目的主要在于對不同預后進行分組并可以用于指導治療決定。分期旨在從最輕到最重的進展順序對疾病進行分類，比起前一階段，每一在后階段具有更差的預后或者不同的醫(yī)學管理。因此，疾病的進展，例如，從HIV感染的不同階段到AIDS的表現，可以通過本發(fā)明的方法進行評價。對于HIV感染的分期，熟知的WHO標準可以被使用。對于本發(fā)明的方法優(yōu)選的是，目標細胞群是CD4+細胞群或者CD8+ZCD38+細胞群。在本發(fā)明方法的進一步優(yōu)選的實施方式中，血液是已經用能夠抑制凝固的試劑處理的血液。相應試劑的實例包括，但不限于，擰檬酸鹽、EDTA和肝素。對于本發(fā)明的方法進一步優(yōu)選的是，(i)在本發(fā)明方法的步驟(a)中，高達100|il的血液用5pl的混合物處理，禾口(ii)在本發(fā)明方法的步驟(a)之后和步驟(b)之前，所述樣品(a，)用10(^1生理緩沖液稀釋，禾口(a")在RT(室溫)下溫育至少30分鐘。按照本發(fā)明方法，優(yōu)選的是，密度介質選自蔗糖基密度介質或者碘克沙醇(.iodkanol)。特別優(yōu)選的蔗糖基密度介質的實例包括Ficoll和PerCollTM。對于本發(fā)明的方法同樣優(yōu)選的是，能夠選擇性裂解步驟(d)中紅細胞的液體(其可以是緩沖液體)選自BDFACS細胞裂解液、蒸餾水和NH4Cl-溶液。優(yōu)選地，NH4Cl-溶液特征如下pH7.3;8.29gNH4C1;0.037g二鈉-EDTA-2-水合物；0.839gNaHCC>3或l.OgKHC03;&0蒸餾水加至1升。本方法的步驟可以在任何溶解體積的液體中進行。對于本發(fā)明的方法特別優(yōu)選的是，步驟(f)的確定體積高達ioow。如本文上面所述，對于本發(fā)明的方法優(yōu)選的是，生理緩沖液是含有至少5%非人血清的磷酸緩沖鹽溶液。PBS優(yōu)選是如下的溶液pH7.4;8.77gNaCl;1.57gNa2HP04X2H20;0.163gKH2P04;H20蒸餾水加至l升。FCS的優(yōu)選濃度在上文中已經描述。因此，PBS優(yōu)選地補充16有大約5%非人血清，更優(yōu)選的3%非人血清，以及最優(yōu)選的2%非人血清。非人血清的非限制性例子包括胎牛血清(FCS)、牛血清、小鼠血清、大鼠血清或羊血清。特別優(yōu)選的是，非人血清是FCS。按照本發(fā)明，一種方法是優(yōu)選的，其中目標細胞的數目通過對所述細胞進行染色和/或計數來確定。對所述細胞進行染色和/或計數的方法包括但不限于使用ELISA(例如，使用過氧化物酶或者堿性磷酸酶作為活性酶)的方法、免疫-層析法(例如，使用膠體金或者膠體碳)、使用帶刻度的毛細管測量沉淀大小、在光學顯微鏡下于血細胞計數器中手動計數(例如Neubauer型)、在血細胞計數器(例如，Sysmex型)或電子細胞計數器(例如，casy型)中自動計數。進一步優(yōu)選的是，本發(fā)明的方法包括在步驟(f)之后和步驟(g)之前的附加步驟(f'):(f)通過使用另外的非人抗體、抗體片段或其衍生物，從所述第二細胞群(目標細胞群)正選擇在細胞表面表達進一步的特征抗原的亞群，所述非人抗體、抗體片段或其衍生物特異結合到所述抗原。任選的附加步驟(f')考慮了細胞亞群的分離，該細胞亞群一方面在細胞表面表達在本方法的前面步驟中負選擇的抗原，另一方面在細胞表面表達進一步的抗原。為了實現該附加選擇，步驟f中獲得的細胞(第二細胞群)可以按照制造商的方案與例如染色珠或順磁珠一起溫育。這些珠，例如，包被有另外的非人抗體、抗體片段或其衍生物，例如，通過使用硼酸鹽緩沖液或者通過聚合物表面進行。任選地，一個或多個另外的洗滌步驟在步驟(g)之前進行。因此，優(yōu)選的實施方式考慮了在細胞表面表達兩種不同抗原的細胞群(雙陽性細胞)的分離。按照本發(fā)明，另外的非人抗體、抗體片段或其衍生物可以在固體載體上固定。固體載體的非限制性實例包括膠乳或者瓊脂糖或者(順)磁珠、微量滴定板以及培養(yǎng)皿。對于本發(fā)明的方法進一步優(yōu)選的是，第二細胞群(目標細胞群)是CD8+細胞群，并且所述另外的非人抗體、抗體片段或其衍生物特異結合CD38。因此，根據本發(fā)明的該優(yōu)選實施方式，CD8+ZCD38+分離17自人血樣。008+/0038+雙陽性細胞的數目的確定(CD8VCD38+計數)通常在常規(guī)抗逆轉錄病毒治療中被用作替代標記。通過在治療過程中降低病毒載量，活動過度的患者免疫系統得到緩和。病毒載量下降之后，CD8+細胞毒性T細胞上的激活標記CD38被下調。這種下調是由病毒感染的循環(huán)細胞誘導的T細胞激活下降的指示。在進一步的可選實施方式中，本發(fā)明涉及進行本發(fā)明方法的試劑盒，所述試劑盒包含(a)第一組分，其包含至少一種非人抗體、抗體片段或其衍生物，能夠特異結合在第一細胞群表面上表達的抗原，所述第一細胞群不同于第二細胞群，所述第二細胞群是目標細胞群并且缺乏所述抗原，(b)第二組分，其包含至少一種非人抗體、抗體片段或其衍生物，能夠特異結合于人紅細胞表面；(c)任選地，能夠交聯所述抗體的試劑；和(d)使用說明。能夠交聯所描述的抗體、抗體片段或其衍生物的試劑的實例包括，但不限于，特異于所述非人抗體的恒定區(qū)的抗體、抗體片段或其衍生物(例如山羊抗小鼠抗體或大鼠抗小鼠抗體)或者用于化學交聯所述抗體的試劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒是這樣的試劑盒，其中所述第一組分包含(a)至少五種非人抗體、抗體片段或其衍生物，其能夠特異結合人CD8、CD16、CD19、CD36禾卩CD56;禾口/或(b)至少五種非人抗體、抗體片段或其衍生物，其能夠特異結合人CD4、CD16、CD19、CD36禾tlCD56。更優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒進一步包括(a)抗體，其特異結合在YS-淋巴細胞和/或單核細胞表面上表達但不在CD4+細胞表面上表達的蛋白質，和/或(b)抗體，其特異結合在Y5-淋巴細胞和/或單核細胞表面上表達但不在CD8+細胞表面上表達的蛋白。圖1:通過流式細胞術(FACS)和通過MNS-技術測定的CD4+T-細胞計數的相關性圖從23個HIV-患者和28個健康獻血者獲得的51個樣本的數據。相關性系數W是0.91&<0.0001)。連續(xù)藍色線是回歸線，紅色虛線表示100%相關性。圖2:分別由流式細胞術和MNS-技術測定的CD4計數的絕對差的Bland-Altman圖從23個HIV-患者和28個健康獻血者獲得的51個樣本的數據。總平均差是106.588.5個細胞(中值68個細胞，范圍4-367個細胞；n-51)。圖3:"視覺門控(Visualgating)"在手動計數中，不需要的細胞被肉眼排除在外。從左到右總體照片、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、紅細胞、碎片。圖4:由流式細胞術測定的、MNS之后的CD4+T-細胞純度左散射門控(scattergate)(Rl)包括所有的淋巴細胞并且排除粒細胞、單核細胞、紅細胞以及碎片。中間整個樣品中CD4+純度的柱狀圖(無門控)?？偀o門控純度是72.5615.72%右淋巴細胞門控(Rl)內CD4+純度的柱狀圖?？偭馨图毎T控純度是81.1010.79%具體實施例方式通過下面的實施例對本發(fā)明進行了闡述，但不應當理解為本發(fā)明限制于此。實施例1:材料和方法研究設計和臨床方案該研究由通過改良的負選擇方案(MNS)和流式細胞術(FCM)進行雙重CD4T-淋巴細胞計數組成。它于2005年8月到10月之間在Leipzig市進行，其主要目的是比較MNS與FCM，特別是在兩種方法的精確度和成本方面。研究參與者包括25例感染HIV的患者和29例健康供血者。患者年齡范圍在20到71歲(平均41.79±15.11歲)。在19Leipzig,HIV-患者定其月參力QClinicforDermatologyandVenerealDiseases(皮膚病和性病診所)或ClinicforInfectiousandTropicalDiseases(傳染病和熱帶病診所)的AIDS會診時間。所有都是CD4計數在96和1037個細胞/pL的無癥狀患者，有或沒有抗逆轉錄病毒治療史。健康供血者是CD4計數在429和1696個細胞&L的正式供血者。外周靜脈血液被抽取到小Monovettes(Sarstedt、Ntimbrecht、Germany)中，以四乙酸乙二胺(EDTA)作為抗凝劑，并且在8小時內處理。研究以盲式進行并且按照EthicCommitteeonHumanResearchoftheUniversityofLeipzig的規(guī)定進行。通過流式細胞術進行CD4+T-細胞計數對于每個樣品，用4-色、2-平臺流式細胞儀(FACSCalibur;BectonDickinsonImmunocytometrySystems,Heidelberg,Germany)，按照我們的內部實驗室規(guī)程，進行CD4+T-淋巴細胞計數。100的EDTA-抗凝的外周全血用2抗-CD4-PE(Immunotech;Beckman-Coulter，Krefeld,Germany)在室溫下(RT)溫育15分鐘。通過在室溫下與2mL的BD裂解液(BDBiosciences,Heidelberg,Germany)—起溫育10分鐘，除去紅細胞。離心(在250xg、RT下5分鐘)之后，用3mL的PBS洗滌細胞，再次離心(在250xg、RT下5分鐘)，并重懸于250的PBS/1%甲醛(FA)中。所述細胞然后在FACSCalibur上分選CD4+T-細胞。最后，通過由FACSCalibur測定的CD4+細胞在所有淋巴細胞中的百分比以及通過常規(guī)血球計(Sysmex,Norderstedt,Germany)獲得的TLC計算絕對CD4計數。MNS方法計算CD4+T-細胞計數通過改良的基于密度的負選擇方案(RosetteSepTM;CellSystems,St.Katharinen,Germany)進行CD4+T-細胞的富集，其使用特殊抗體混合物進行全血細胞的富集。"RosetteSepHumanCD4+TCellEnrichmentCocktail"由抗人譜系抗原(humanlineageantigens)(CD8、CD16、CD19、CD36禾QCD56)的小鼠IgGl抗體組成，其依靠大鼠抗小鼠IgGl二抗交聯到小鼠IgGl抗人血型糖蛋白抗體，從而形成雙特異性四聚抗體復合物(tetramericantibodycomplexes)(TAC)。這些TAC通過在被靶向的有核細胞(NC)周圍形成RBC玫瑰花狀簇而交聯所有的不需要NC到多個紅細胞(RBC)上，從而提高不需要的(玫瑰花狀簇)細胞的密度，使得當在密度介質內離心時它們與游離的RBC-一起沉淀。期望的CD4+T-細胞保持未用抗體標記并且可以作為富集的群在血漿和密度介質的相界面處進行收集(StemCellTechnologiesInc.2005)。使用1.5mL微管以加入5混合物到100(iLEDTA-抗凝的靜脈全血中。該樣品用100的PBS/2%FCS稀釋，輕輕渦旋，然后RT下搖動30分鐘。對于梯度離心，該混合物用150nLFicoll-PaquePLUS密度介質(CdlSystems,St.Katharinen,Germany)置于下層，并且在微量離心機(Eppendorf,Hamburg,Germany)中離心(1000xg，5min,RT)。為了確保所有的CD4+T-細胞均被收集，全部上清液被轉移進入新的微管，非常小心地避免混合入含有不需要的細胞的RBC沉淀。所述轉移的上清液用lmLPBS/2。/。FCS洗滌，再次離心(5分鐘，1200xg，RT)，用100pLFACS細胞裂解緩沖液(BDBiosciences,Heidelberg,Germany)溫育，以除去殘余的紅細胞?；旌衔镌赗T下輕輕搖晃10分鐘，然后用lmLPBS/2%FCS洗滌，并且離心(5分鐘，1200xg，RT)。為了獲得干細胞沉淀，使用棉簽將所有剩余的液體小心地從微管中移去，小心避免破壞細胞沉淀。在100PBS/2%FCS(與原始血樣相同的量)中重懸細胞。最后，在充分渦旋之后，將10CD4+T-細胞懸浮液鋪層于Neubauer型血球計(FeinoptikGmbH,Blankenburg,Germany)上，并且在40倍放大率的光學顯微鏡下，按照肉眼排除所有的粒細胞、紅細胞、血小板和碎片的嚴格計數規(guī)則進行計數，以保證僅僅淋巴細胞被計數。就流式細胞術所使用的術語方式而言，我們稱之為"視覺門控(visualgating)"(見圖4)。純度和收率分析通過在用抗-CD4-PE(Immunotech;Beckman-Coulter，Krefeld，Germany)染色后于FACSCalibur流式細胞儀(BectonDickinson,Heidelberg,Germany)上分析富集的CD4+T-細胞，評價由MNS技術測定的每種樣本的純度。對于每個樣本，我們評估兩個CD4"T-細胞純度值fl/故射門控中的CD4+細胞百分比，其包括淋巴細胞并排除粒細胞、單核細胞、紅細胞和碎片，W樣品中CD4+細胞占所有細胞的百分比(無門控，見圖4)。因為對手動計數設置了嚴格的規(guī)則("視覺門控"，見上文)，在流式細胞術分析過程中淋巴細胞門控內獲得的CD4+純度必須被認為是相應的值，從而是顯著的值。因此，所有的進一步分析和計算都引用該純度值。對于收率(回收率)的評估，在通過MNS分析的每個樣本中CD4+T-細胞的真實數目被計算，然后被表示為通過流式細胞術fFC,所獲得的CD4+T-細胞數目的百分數。真,0^-#-教=手動潘應7^數x/7楚錄度〖％_/,^0=真實CZM教/尸CCIM#教x7卵非CD4+T-細胞的分析通過在用熒光染料(Immunotech;Beckman-Coulter，Krefeld,Germany)復染色之后在FACSCalibur(Becton-Dickinson,Heidelberg,Germany)上分析雙重測定的血液樣本(lx2(iL抗體混合物和lx5pL抗體混合物)，評價MNS之后剩余的非-CD4+T-細胞的百分數。CD4-APC,CD3-FITC,CD45-PerCP，CD8-PECD3-FITC,CD16，56-PE，CD45陽PerCP,CD19-APCCD1lb-FITC,CD4-PE,CD45-PerCP,CD14-APCCD235a-PE,CD236-FITC,CD4-PECY5CD3-PE,抗-TCR-y5-FITC統計分析使用Medcalc(Medcalcsoftware,Mariakerke,Belgium),通過Bland-Altman-Plot和Passing/Bablok-回歸法，確定分別用FCM和MNS評估的CD4計數之間的關系。WindowsExcel2000軟件被用于米ti丄染色4染色522分析和描述所有的評估數據。所分析的變量是CD4+T-細胞的數目、CD4-純度以及CD4-回收率。所有的數據被計算為平均值土SD。然而，由于診斷學試驗的特點，數據被表示為中值、范圍和置信區(qū)間。實施例2:結果CD4計數范圍和閾值在該研究中，通過流式細胞術和MNS方法從51個血液樣本(23例HIV感染的患者和28例健康供血者)產生51對CD4計數值。分析47個樣品(19個HIV樣本和28個健康供血者樣本)的純度和回收率。由于運輸問題，MNS分析不能用1個健康供血者樣品和2個HIV樣品進行。由于技術問題，純度分析不能用另外4個HIV樣品進行?？偲骄鵆D計4數是707士315個細胞/fiL(中值664，范圍96—1696，"=51)。相關性對于兩種方法，圖l描述了所有分析數據的相關性圖。對于所有的分析數據，相關性系數W是0.91(p<0.0001)，對于HIV患者是0.86(pO.OOOl)，對于非HIV患者是0.90(pO.OOOl)。MNS-方法和流式細胞術之間的差異絕對平均差是106.5±88.5個細胞(中值為68個細胞，范圍4一367個細胞，『51，見圖2)。以百分比計的平均差是15.35±12.45%(中值:11.11%，范圍0.77%-49.13%,"=51)。純度和回收率表1和表2說明了純度和回收值。對于健康供血者血液，原始負選擇方法據報道產生卯±5%純的CD4+T-細胞，回收率為59±24%(StemCellTechnologiesInc.2005)。對于改良的方法，我們達到稍微低的總純度，分別為81.10±10.78%(中值83.40%，范圍38.64-95.55%，"=47，在淋巴細胞門控內)和72.56±15.72%(中值:76.82%，范圍24.97%-91.11%,"=47，無門控)。比較而言，CD4+T-細胞的總回收率可被提高到79.36±19.13%(中值82.43%,范圍38.94%-125.27%，"=47)。對于健康血液供血者(薩28)，CD4+純度是84.35±5.10%(中值85.38%，范圍46.23%-92.51%，在淋巴細胞門控內)和76.68±12.51%(中值78.65%，范圍27.27%-90.19%;無門控)。對于HIV-患者(77=19)，CD4+純度是76.31±14.53%(中值:79.93%，范圍38.64-95,55%，在淋巴細胞門控內)和66.50±17.86%(中值:71,03%，范圍24.97%-91.11%,無門控)。對于健康供血者血液，CD4+T-細胞的回收率是86.61%±12.44%(中值86.25%，范圍60.4%-111.30%)，對于HIV患者血液是68.68±22.04%(中值:63.47%,范圍38.94%-125.27%)。非CD4+T-細胞分析MNS之后剩余的非CD4+T-細胞的分析(見表3)表明，所分析的樣品中所有細胞的大約10%是紅細胞。3-4%是粒細胞，2-4%是單核細胞。這些加起來達可區(qū)分細胞的15-18%。1-2%是008+T-淋巴細胞，1。/。是B-淋巴細胞，7%是^-丁-淋巴細胞，4-7。/。是NK-細胞，加起來達難區(qū)分細胞的13-17%。混合物量的評估對3個樣品進行附加實驗，以評估用較少量的抗體混合物是否可以達到相似的精確度。使用2、3和4)iL抗體混合物量，通過MNS技術分析CD4計數中值為547個細胞/VL的樣品(流式細胞術示出細胞)。當改變抗體混合物的量時，未發(fā)現004+T-細胞計數結果的顯著差異(數據未顯示)?？芍貜托栽谔囟ǖ囊唤M實驗中評估MNS技術的可重復性，其中5個平行樣品(2個HIV樣品和3個健康供血者樣品)使用MNS技術分析兩次。差異系數是4.05%。24操作者與操作者的差異在另一個單獨的實驗中，操作者與操作者的差異被分析。無MNS技術經驗的人員中的五位被指導來按照改良的MNS方案各進行一次測定(都來自相同的血樣)。差異系數是14.45%。由五位人員測定的平均CD4計數是357個細胞/iiL，流式細胞術顯示為352個細胞L。此外，兩位具有良好的MNS經驗的人員對5個樣品進行另外的實驗。差異系數是7.19%。樣品處理的延遲樣品處理延遲的影響在5個樣品(2個HIV樣品和3個健康供血者樣品)中進行評估，其通過MNS方法在抽取血液之后的第2、8、12和24小時下進行分析。在第2小時下中值是590細胞L，在第8小時下中值是5卯個細胞—L，在第12小時下中值是560個細胞/iaL，在第24小時下中值是640個細胞L。在第2小時下平均值是520個細胞/VL，在第8小時下平均值是528個細胞/pL，在第12小時下平均值是520個細胞/VL，在第24小時下平均值是604個細胞/)uL。在12小時內平均值和中值差異不顯著。進一步的差異因為越來越多的HIV感染患者被報道為兒童，本發(fā)明的方法可以被調整用于從嬰兒血液進行CD4+定量。4個嬰兒血樣的第一次實驗顯示出與流式細胞術的相關性，r=0.89，(數據未顯示)。此外，如上面所描述，可容易地使mMNS方法適合于其它細胞(例如CD8"或者CD19+)的耙向，以及其它免疫診斷目的。為了對非洲、印度和歐洲患者群體進一步改進所述混合物，可能需要確定HIV血液中細胞組分的區(qū)域特異性。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表l.通過1\^8分析的47個樣品的箱圖(8(^100€04+純度。LG表示"淋巴細胞門控"，NG表示"無門控"。因為在手動計數過程中細胞被視覺門控，淋巴細胞門控內的CD4+純度必須被認為是相應的值并因此是顯著的值。140.00%<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表2.通過MNS分析的47個樣品的總平均CD4+回收率是79.36±19.13%(中值82.43%，范圍38.94%—125.27%)。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表3.在用熒光染料復染色之后，通過在FACSCaliburTM上分析雙重測定的血樣(lx2pL抗體混合物和lx5pL抗體混合物)，評估MNS之后剩余的非CD4+T-細胞的百分比。參考文獻1.Aidsmap.Monitoringtheimmunesystem,www.aidsmap.com.2005.2.BalakrishnanP,DunneM,KumarasamyN,CroweS,SubbulakshmiG,GaneshAK,CeceliaAJ,RothP,MayerKH,ThyagarajanSP,SolomonS(2004)Aninexpensive,simple,andmanualmethodofCD4T-cellquantitationinHIV-infectedindividualsforuseindevelopingcountries.Ja/(is-Jowwa/q/"/4c《t>e(i/mmw77eDq/c/eqy^Sywti/^imes,36:1006-1010.3.BalakrishnanP，SolomonS,KumarasamyN，MayerKH(2005)Low-costmonitoringofHIVinfectedindividualsonhighlyactiveantiretroviraltherapy(HAART)indevelopingcountries,/"d/awJownia/o/她Wca/T^earc/，121:345-355.4.BiXQ,GatanagaH，TanakaM，HondaM,IdaS,KimuraS，OkaS(2005)ModifiedDynabeadsmethodforenumeratingCD4(+)T-lymphocytecountforwidespreaduseinresource-limitedsituations,/a油-Jcwwa/0/y4c，7W/mm朋eDe力c/ewc少iSjW/'函es，38:1-4.5.BischoffFZ，Ma，ez-DoD，MartinezDI,HomeC,DangD,BurkeA，LewisDE，SimpsonJL(2002)IntactfetalcellisolationfrommaternalbloodusingneitherMACSnorflowcytometry:Improvedisolationusingasimplewholebloodprogenitorcellenrichmentapproach(RosetteSep(TM)).j置n'cawJowma/。/7/顧awGewe"oy,71:563.6.BuschR，CesarD,Higuera-AlhinoD，GeeT,HellersteinMK，MccuneJM(2004)IsolationofperipheralbloodCD4(+)TcellsusingRosetteSep(TM)andMACS(TM)forstudiesofDNAturnoverbydeuteriumlabeling.Jow/7ia/。/7mmMw/og7'ca/她Ao成286:97-109.7.CarellaAV,MossMW,ProvostV，QuinnTC(1995)AManualBeadCountsinHumanImmunodeficiencyVirus-InfectedIndividuals.CY/w/ca/cwc/Dz'agTzast/c丄flZwato//""2w,o/ogy,2:623-625.8.ChianeseR,NebuloniE,DePaschaleM,GattiA,MenaM(2003)AbsoluteTCD4(+)countingbyaminimalistdual-platformflowcytometricmethod.Jowrwo7o/7egw/a/073//oweo5ta"c17:358-365.9.CroweS，TumbullS,OelrichsR,D觀eA(2003)Monitoringofhumanimmunodeficiencyvirusinfectioninresource-constrainedcountries.C//"/ca//"/ecf/owsD^eosas1'37:S25-S35.10.CyTecsGmbH.NewPerspectivesforMonitoringHIV-infectedPatientsinDevelopingCountriesbyAffordableCD4+T-cellCounts.www.cytecs.com.2005.11.DiagbougaS,ChazallonC,KazatchkineMD,dePerrePV,InwoleyA,M'BoupS，DavidMP,TeninAT,SoudreR,AboulkerJP,WeissL(2003)Successfulimplementationofalow-costmethodforenumeratingCD4(+)Tlymphocytesinresource-limitedsettings:theANRS12-26study,j油，17:2201-2208.12.DonnenbergAD,DonnenbergVS(2004)PhenotypicandFunctionalMeasurementsonCirculatingImmuneCellsandtheirSubsets.In:LotzeMTandThomsonAW,eds.Meas^r/"gTwwwm.(y.,5咖'c5Wewceawe/C7/m,ca/尸rac"ce.AcademicPress,237-242.13.JanossyG,JaniIV,KahanM,BamettD,MandyF，ShapiroH(2002)PreciseCD4T-cellcountingusingreddiodelaserexcitation:Forricher,forpoorer.C^towC,50:78-85.14.PattanapanyasatK，LerdwanaS，ShainH，NoulsriE,ThepthaiC,PrasertsilpaV，EksaengsriA，KraisintuK(2003)Low-costCD4enumerationinHIV-infectedpatientsinThailand,/^/awP<aq./kJowwa/爿〃ergyawe//wwMwo/ogy,21:105-113.15.StemCellTechnologiesInc.RosetteSepforseparationofHUMANcells,https:〃www.stemce11.com/product,.catalog/rosettesep.asp2005.16.StorieI,SawleA,GoodfellowK，WhitbyL,GrangerV,ReillyJT,BamettD(2003a)FlowratecalibrationI:Anovelapproachforperformingabsolutecellcounts.C_ytome〖/7尸arj8-C7/w/ca/C少fcw7er乂55B:1-7.17.StorieI,SawleA,WhitbyL,GoodfellowK,GrangerV，ReillyJT,BamettD(2003b)FlowratecalibrationII:AclinicalevaluationstudyusingPaaLeucoGatingasasingle-platformprotocol.Cytowe"_FcrWB-C7/m.ca/C_ytome")',55B:8-13.18.U.S.DepartmentofHealthandHumanServices.GuidelinesfortheUseofAntiretroviralAgentsinHIV-1-InfectedAdultsandAdolescents.http:〃AIDSinfo.nih,.gov/guidelines.2005.19.UNAIDS.AIDSEpidemicUpdate2004.www.unaids.org.2005.20.WorldHealthOrganization.CD4+T-cellenumerationtechnologies.http:〃www.who.irtt.2005.29權利要求1.一種量化包含在人血樣中的目標細胞群的方法，其包括步驟(a)使人血液的樣品與混合物接觸，所述混合物包含(i)第一組分，其包含至少一種非人抗體、抗體片段或其衍生物，能夠特異結合在第一細胞群表面表達的抗原上，所述第一細胞群不同于第二細胞群，所述第二細胞群是目標細胞群并且缺乏所述抗原，其被復合到(ii)第二組分，其包含至少一種非人抗體、抗體片段或其衍生物，能夠特異結合于人紅細胞表面；其中所述接觸在允許抗原用它們的關連抗體標記的條件下進行；(b)通過密度離心分離在所述血樣中包含的抗體標記的細胞和未標記的細胞，其中所述介質的密度的最小等級是大約1.077g/mL；；(c)收集包含所述第二種細胞群的上清液；(d)濃縮包含在所述上清液中的所述第二細胞群并且在能夠選擇性裂解紅細胞的液體中重懸所述細胞群；(e)在生理緩沖液中洗滌步驟(d)中得到的細胞，以除去步驟(d)中的緩沖液；(f)濃縮步驟(e)中獲得的細胞，基本上除去所有上清液并重懸所述細胞于確定體積的生理緩沖液中；和(g)測定步驟(f)中獲得的細胞的數量，其中該細胞數對應于包含在所述血樣中的所述第二細胞群的細胞數。2.權利要求1所述的方法，另外包括在步驟(c)之后且在步驟(d)之前的步驟(c'):(c'):在生理緩沖液中洗滌步驟(c)中獲得的細胞。3.權利要求1或2所述的方法，其中所述第一組分和第二組分如下進行復合(i)形成抗體-蛋白A復合物；或(ii)使所述第一組分和第二組分與能夠特異結合所述第一組分和第二組分的抗體溫育。4.權利要求l到3任一項所述的方法，其中所述第二細胞群選自€04+細胞群、CD8+細胞群、CD14+細胞群以及CD19+細胞群。5.權利要求1到4任一項所述的方法，其中所述第一種組分包含(i)至少5種非人抗體、抗體片段或其衍生物，能夠特異結合人CD8、CD16、CD19、CD36禾卩CD56;或者(ii)至少5種非人抗體、抗體片段或其衍生物，能夠特異結合人CD4、CD16、CD19、CD36禾QCD56。6.權利要求1到5任一項所述的方法，其中所述能夠特異結合于人紅細胞表面的抗體、抗體片段或其衍生物是(i)抗血型糖蛋白的抗體、抗體片段或其衍生物；(ii)抗Kdl抗原的抗體、抗體片段或其衍生物；(iii)抗Rhesus抗原的抗體、抗體片段或其衍生物；(iv)抗B-CAM的抗體、抗體片段或其衍生物；或(v)抗ICAM-4的抗體、抗體片段或其衍生物。7.與血液中目標細胞群的細胞數相關的疾病診斷或分期的方法，所述方法包括權利要求1到6任一項所述方法的步驟，以及在所述第二細胞群(目標細胞群)的具體細胞數的基礎上確定(i)從中獲取血樣的人是否被疾病感染；和/或(ii)所述疾病的特征階段。8.權利要求7所述的方法，其中所述疾病是HIV感染。9.根據權利要求8所述方法，其中所述目標細胞群是CD4+細胞群或者CD8VCD38+細胞群。10.權利要求1到9任一項所述的方法，其中所述血液是已經用能夠抑制凝固的試劑處理的血液。11.權利要求1到IO任一項所述的方法，其中(i)在權利要求1的步驟(a)中，高達lOOpl的血液用5^1的混合物處理，和(ii)在權利要求l的步驟(a)之后和步驟(b)之前，所述樣品(a')用100|il生理緩沖液稀釋，和(a")在室溫下溫育至少30分鐘。12.權利要求1到11任一項所述的方法，其中所述密度介質選自蔗糖基密度介質或者碘克沙醇。13.權利要求1到12任一項所述的方法，其中所述能夠選擇性溶解步驟(d)中紅細胞的液體選自BDFACS裂解液、蒸餾水和NH4C1-溶液。14.權利要求1到13任一項所述的方法，其中權利要求(l)的步驟(f)的所述確定體積達ioopi。15.權利要求1到14任一項所述的方法，其中所述生理緩沖液是含有至少5%非人血清的磷酸緩沖鹽溶液。16.權利要求1到15任一項所述的方法，其中所述目標細胞的數目通過對所述細胞進行染色和/或計數來確定。17.權利要求1到16任一項所述的方法，包括在步驟(f)之后和步驟(g)之前的附加步驟(f'):(f，)通過使用另外的非人抗體、抗體片段或其衍生物，從所述第二細胞群正選擇在所述細胞表面表達進一步的特征抗原的亞群，所述非人抗體、抗體片段或其衍生物特異結合到所述進一步的抗原。18.權利要求17所述的方法，其中所述第二細胞群是CD8+細胞群，并且所述另外的非人抗體、抗體片段或其衍生物特異結合CD38。19.進行權利要求1到18任一項所述方法的試劑盒，其包含(a)第一組分，其包含至少一種非人抗體、抗體片段或其衍生物，能夠特異結合在第一細胞群表面上表達的抗原，所述第一細胞群不同于第二細胞群，所述第二細胞群是目標細胞群并且缺乏所述抗原，(b)第二組分，其包含至少一種非人抗體、抗體片段或其衍生物，能夠特異結合于人紅細胞表面；(c)任選地，能夠交聯所述抗體的試劑；和(d)使用說明。20.權利要求19所述的試劑盒，其中所述第一組分包含(a)至少五種非人抗體、抗體片段或其衍生物，其能夠特異結合人CD8、CD16、CD19、CD36禾QCD56;禾口/或(b)至少五種非人抗體、抗體片段或其衍生物，其能夠特異結合人CD4、CD16、CD19、CD36禾卩CD56。21.權利要求19或20所述的試劑盒，進一步包括(a)抗體，其特異結合在Y5-淋巴細胞和/或單核細胞表面上表達但不在CD4+細胞表面上表達的蛋白質，和/或(b)抗體，其特異結合在Y5-淋巴細胞和/或單核細胞表面上表達但不在CD8+細胞表面上表達的蛋白質。全文摘要本發(fā)明提供量化在人血樣中包含的目標細胞群的方法，其包括步驟使人血樣與混合物接觸，所述混合物包含第一組分，所述第一組分包含至少一種非人抗體、抗體片段或其衍生物，其能夠特異結合于在第一細胞群表面表達的抗原上，所述第一細胞群與第二細胞群不同，所述第二細胞群是所述目標細胞群并且缺乏所述抗原，所述第一組分復合至第二組分，所述第二組分包含至少一種非人抗體、抗體片段或其衍生物，其能夠特異地結合于人紅細胞表面；分離血樣中包含的抗體標記的細胞和未標記細胞；收集包含所述第二細胞群的上清液；濃縮包含在所述上清液中的第二細胞群并使所述細胞群重懸于能夠選擇性裂解紅細胞的液體中；濃縮得到的細胞，基本除去所有上清液并使所述細胞重懸于確定體積的生理緩沖液中；以及確定在所述樣品中包含的第二細胞群的細胞數。此外，本發(fā)明提供進行本發(fā)明方法的試劑盒。文檔編號C12N5/00GK101438164SQ200780016194公開日2009年5月20日申請日期2007年5月7日優(yōu)先權日2006年5月5日發(fā)明者A·博爾德,R·沃思,U·薩克申請人:弗勞恩霍夫協會