專利名稱：：蛋白質(zhì)純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用包括兩個(gè)離子交換步驟并且不使用過(guò)程中(in-process)切向流過(guò)濾步驟的兩步非親和方法的蛋白質(zhì)純化，以獲得高水平的純度，該純度的蛋白質(zhì)可以配制用于人類治療。特別地，本發(fā)明涉及一種從包含多肽和一種或多種污染物的組合物中純化多肽(例如重組蛋白、抗體、抗體片l殳、Fab和Fv相關(guān)產(chǎn)物、單《連抗體、雙抗體(cliabodies)、線性抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體(包括來(lái)自抗體片段的多特異性抗體)、與Fc樣區(qū)的融合蛋白、抗體樣分子，如免疫粘附素或肽體(peptibodies))的方法。
背景技術(shù)：
：大規(guī)模、經(jīng)濟(jì)的蛋白質(zhì)純化是生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)上日益重要的問(wèn)題。治療性蛋白質(zhì)一般利用原核或真核細(xì)胞系產(chǎn)生，該細(xì)胞系被工程化為由含編碼目的蛋白質(zhì)的基因的重組質(zhì)粒表達(dá)目的蛋白質(zhì)。由于幾個(gè)原因，從提供給細(xì)胞的成分和細(xì)胞副產(chǎn)物的混合物中分離出所需蛋白質(zhì)以達(dá)到足夠的純度，如足以用作人類治療劑的純度，對(duì)于生物制品的制造者來(lái)說(shuō)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)?；诘鞍踪|(zhì)的藥物產(chǎn)品的生產(chǎn)者必需遵守嚴(yán)格的規(guī)章標(biāo)準(zhǔn)，包括極其嚴(yán)格的純度要求。為確保安全性，管理機(jī)構(gòu)，例如食品和藥品管理局(FDA)，要求基于蛋白質(zhì)的藥物產(chǎn)品基本上不含雜質(zhì)，包括與產(chǎn)品有關(guān)的污染物如重組蛋白的聚集體、片段和變體，以及與操作相關(guān)的污染物如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、培養(yǎng)基成分、病毒、DNA和內(nèi)毒素。盡管有多種蛋白質(zhì)純化方案可以應(yīng)用并被廣泛用于生物制藥產(chǎn)業(yè)，但是這些方案通常包括親和純化步驟，例如在抗體的例子中的蛋白A純化，以達(dá)到藥學(xué)上可接受的純度。盡管出現(xiàn)了先進(jìn)的層析和過(guò)濾方法，但是為獲得治療級(jí)別的純度，親和層析仍然經(jīng)常用作捕獲步驟來(lái)滿足生物醫(yī)藥抗體純化在純度、產(chǎn)率、生產(chǎn)能力方面的要求。盡管蛋白A層析對(duì)于抗體具有高結(jié)合親和性(對(duì)于人IgG來(lái)說(shuō)，大約為M),以及具有除去多達(dá)99.5%的雜質(zhì)的能力，但是對(duì)于在商業(yè)規(guī)模上應(yīng)用于純化治療性蛋白質(zhì)而言，親和層析是一種昂貴的純化步驟。蛋白A不僅比非親和介質(zhì)明顯更貴，還存在其他問(wèn)題，例如樹(shù)脂的不穩(wěn)定性、清洗的困難、配體的滲漏、污染純化產(chǎn)品的蛋白A或蛋白A相關(guān)化合物的潛在免疫原性。然而，親和介質(zhì)的高成本和不穩(wěn)定性提高了基于蛋白質(zhì)的治療劑的最終成本，特別是那些需要高劑量和/或長(zhǎng)期給藥的治療劑。僅層析就可占下游加工成本的三分之二，對(duì)于單克隆抗體來(lái)說(shuō)，親和捕獲柱的樹(shù)脂的成本可超過(guò)原材料的成本(見(jiàn)Rathore等人，CostingIssuesintheProductionofBiopharmaceuticals,BioPharmInternational,Feb1,2004)。即使使用蛋白A親和層析，也經(jīng)常不能獲得足夠的純度，除非結(jié)合幾種純化步驟，由此進(jìn)一步增加了成本并降低了產(chǎn)品的產(chǎn)率。由于抗體占市場(chǎng)上和開(kāi)發(fā)中的用于治療癌癥、自身免疫病、感染性疾病、心血管疾病和移植排斥的治療性生物制劑的比例日益增大，因此需要一種可以利用較少的步驟來(lái)純化蛋白質(zhì)的方法，由此實(shí)現(xiàn)較低的成本。美國(guó)專利公開(kāi)No.2003/0229212(其全文在此引入作為參考)描述了一種利用非親和層析純化步驟緊接著利用高效切向流過(guò)濾(HPTFF)步驟從包含宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的混合物中純化抗體的方法。通過(guò)CHOPs(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞蛋白)的減少確定，該純化方法使污染物水平在陽(yáng)離子交換純化之后為大約144,780ppmCHOPs，在陰離子交換純化之后為大約410ppmCHOPs，在HPTFF純化(最后的步驟)之后大約為17-21ppmCHOPs,因而提供了一種三步非親和方法。HPTFF的純化步驟對(duì)于獲得最終純度是關(guān)鍵性的，其使用帶電膜來(lái)分離雜質(zhì)(相對(duì)大小不限)，例如蛋白質(zhì)、DNA和內(nèi)毒素，并從包含抗體的混合物中清除蛋白質(zhì)寡聚體和降解產(chǎn)物。而且，HPTFF和其它傳統(tǒng)TFF步驟存在缺點(diǎn)，即(1)它是蛋白質(zhì)治療劑的開(kāi)發(fā)、優(yōu)化和放大中的一個(gè)額外步驟，需要膜清洗、確認(rèn)、商業(yè)上可以獲得的大規(guī)模GMP套件(對(duì)于HPTFF而言這仍然是無(wú)法獲得的)、以及額外的緩沖液、裝置和更多的處理時(shí)間，和(2)它增加了成本，同時(shí)由于損害抗體完整性(通過(guò)降解或聚集或其他影響分子活性的分子變化)而具有潛在產(chǎn)物損失的危險(xiǎn)。因此，希望可通過(guò)一種兩步非親和方法獲得高純度的蛋白質(zhì)治療劑，該方法不使用過(guò)程中TFF步驟，與基于親和力的純化方法和其他多步驟純化方法相比成本降低。如果該非親和純化方法可以去除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸、內(nèi)毒素、與產(chǎn)物相關(guān)的污染物如蛋白質(zhì)的聚集、氧化、脫酰胺化或降解形式、和培養(yǎng)基添加劑如脂質(zhì)、維生素、胰島素、氨曱喋呤、氨基酸、碳源例如葡萄糖等，它將是有益的。開(kāi)發(fā)可應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)類型的、可規(guī)?；?、可控制、并且利用更便宜、可重復(fù)使用的樹(shù)脂的純化方案，將允許其整合進(jìn)整個(gè)藥物開(kāi)發(fā)的非常早期的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中。這種純化方案的設(shè)計(jì)方法可使生產(chǎn)方法的耗資性改變減為最小，否則，該生產(chǎn)方法的改變?cè)谒幬镩_(kāi)發(fā)的后期是必需的，或更糟糕的是，在批準(zhǔn)之后是必需的。當(dāng)該方法放大并接近GMP生產(chǎn)條件時(shí)，會(huì)出現(xiàn)另外的內(nèi)在復(fù)雜性，包括與樹(shù)脂包裝和緩沖液制備相關(guān)的問(wèn)題。該生產(chǎn)方法和其能力可通過(guò)簡(jiǎn)化純化方案來(lái)改善，這種簡(jiǎn)化是通過(guò)取消處理步驟并使生產(chǎn)量和生產(chǎn)率最大化，同時(shí)保持被純化分子的完整性和純度。因此，開(kāi)發(fā)一種與常規(guī)純化方法相比以低成本生產(chǎn)高質(zhì)量、高安全性的藥物物質(zhì)的簡(jiǎn)單且有效的方法是所期望的并且是有益的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明基于以下的意外發(fā)現(xiàn)多肽和蛋白質(zhì)，特別是重組蛋白例如單克隆抗體，可通過(guò)利用不包括親和層析步驟或過(guò)程中緩沖液交換步驟(如TFF或HPTFF)的兩步純化法，乂人包含污染物例如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和培養(yǎng)基成分的被污染混合物中純化。而且，從第一步驟到第二步驟僅僅需要調(diào)節(jié)pH和/或稀釋。因而，本發(fā)明的兩步法大大降低了通常依賴親和層析或多步方法來(lái)獲得類似高水平蛋白質(zhì)純度的純化蛋白質(zhì)的成本。在本發(fā)明中，利用陽(yáng)離子交換層析(CEC)和陰離子交換層析(AEC)將蛋白質(zhì)高度純化至治療等級(jí)，而不使用親和層析或過(guò)程中TFF步驟，以產(chǎn)生雜質(zhì)(例如，含量低于百萬(wàn)分之100(ppm)的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，如CHOP,和10pg/ml或更少的核酸)含量可忽略的多于95%單體的高純度蛋白質(zhì)。本發(fā)明的純化方法也清除內(nèi)毒素、與產(chǎn)物相關(guān)的污染物，如蛋白質(zhì)的聚集、氧化、脫酰胺化或降解形式，和培養(yǎng)基添加物，如脂質(zhì)、維生素、胰島素、氨曱喋呤、氨基酸、碳源如葡萄糖，等等。在使用CEC然后使用AEC的本發(fā)明純化方法的具體實(shí)施方式中，不使用過(guò)程中TFF步驟是有利的，這導(dǎo)致更大的大規(guī)模純化能力，結(jié)合更多污染物的能力以及操作時(shí)間明顯縮短。本發(fā)明提供了純化重組蛋白的方法，所述重組蛋白包括但不限于抗體、具有Fc樣區(qū)的融合蛋白、抗體樣分子，如免疫粘附素，用以獲得適于應(yīng)用于制備治療等級(jí)組合物的高純度蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是所述高純度蛋白質(zhì)適用于制備治療等級(jí)的藥物。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種純化含有目標(biāo)蛋白質(zhì)和一種或多種污染物的混合物的方法，包括(a)將該混合物進(jìn)行ECE純化步驟，然后進(jìn)行AEC純化步驟，其中沒(méi)有過(guò)程中TFF步驟，和(b)分離目標(biāo)蛋白質(zhì)。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，AEC步驟使用陰離子交換膜。圖1顯示了如實(shí)施例1中進(jìn)行的本發(fā)明的兩步純化方法的流程圖。在該具體實(shí)施方案中，純化方法包括CEC步驟以及隨后的病毒滅活步驟和AEC步驟。在CEC和AEC步驟之間為稀釋步驟，以降低CEC洗脫物(elutionbulk)的電導(dǎo)率，并在AEC步驟中獲得所需的病毒和污染物清除。具體實(shí)施方式定義如此處所用的"蛋白質(zhì)，，通常指具有至少5個(gè)或更多個(gè)通過(guò)肽鍵連接在一起的氨基酸的肽和蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)一般是復(fù)雜的多肽，可以是抗體、受體、配體融合蛋白(包括兩個(gè)或多個(gè)在其自然狀態(tài)下不融合的多肽的至少一部分)，其片段和變體，等等，如，見(jiàn)US2003022921和US20030166869，它們?nèi)吭诖艘胱鳛閰⒖?，其中列出了多種可用本發(fā)明的方法進(jìn)行純化的蛋白質(zhì)。按照本發(fā)明的方法純化的蛋白質(zhì)可以來(lái)自任何生物(原核的或真核的)，特別是哺乳動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)"抗體"最廣義地使用，包括單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(如雙特異性抗體)、免疫粘附素以及抗體片段?？贵w或片段可以被修飾，例如脫巖藻糖基化的抗體?？贵w可針對(duì)目的"抗原"，如多肽，該抗原可以是生物學(xué)相關(guān)的治療靶標(biāo)，或非多肽抗原(如，胂瘤相關(guān)糖脂抗原，見(jiàn)美國(guó)專利No.5,091,178)。優(yōu)選地，抗原是生物學(xué)上重要的多肽，并且將該抗體施用于患有疾病或失調(diào)的哺乳動(dòng)物可以導(dǎo)致對(duì)該哺乳動(dòng)物的治療益處。多肽抗原包括跨膜分子(如受體)和配體如生長(zhǎng)因子。示例性的抗原包括上面討論的多肽。用于于跨膜分子，例如受體，其片段(如受體的胞外域)可用作免疫原?？蛇x擇地，表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞可用作免疫原。這樣的細(xì)胞可獲自天然來(lái)源(如癌細(xì)胞系)或可以是通過(guò)重組技術(shù)轉(zhuǎn)化而表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞。"抗體片段"至少包括全長(zhǎng)抗體的一部分，典型地為其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；單鏈抗體分子；雙抗體；線性抗體；以及由抗體片段形成的多特異性抗術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體，，在通常意義上使用，是指從一群基本同源的抗體獲得的抗體，以致組成該抗體群的各個(gè)抗體除了可能以很小的數(shù)量出現(xiàn)的天然突變以外均相同。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)一個(gè)抗原位點(diǎn)。與通常包括抗不同抗原決定簇(表位)的各種抗體的多克隆抗體制劑相比，單克隆抗體只針對(duì)該抗原上的一個(gè)決定簇。在描述抗體時(shí)術(shù)語(yǔ)"單克隆"指抗體獲自基本同源的一群抗體的特性，并且不應(yīng)理解為需要通過(guò)任何特定方法來(lái)產(chǎn)生該抗體。例如，本發(fā)明中使用的單克隆抗體可使用由Kohler等人，Nature256:495(1975)首先描述的常規(guī)雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)，或者可使用重組DNA方法(見(jiàn)，如美國(guó)專利No.4，816，567)。單克隆抗體也可從噬菌體抗體文庫(kù)中分離，如使用Clackson等人，Nature352:624-628(1991);Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1991);和美國(guó)專利Nos.5,223,409;5,403,484;5,571,698;5,427,908;5,580,717;5,969,108;6,172,197;5,885,793;6，521，404;6,544,731;6,555,313;6，582，915;和6,593,081描述的技術(shù)。此處描述的單克隆抗體包括"嵌合"抗體和"人源化"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來(lái)自特定種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，同時(shí)鏈的其余部分與來(lái)自其他種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及所述抗體的片段，只要它們顯示所需的生物學(xué)活性(美國(guó)專利No.4，816,567;和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984》。非人(例如鼠)抗體的"人源化，，形式是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。人源化抗體的大部分是人免疫球蛋白(接受抗體)，其中接受抗體的超變區(qū)殘基被具有所需特異性、親和性和能力的來(lái)自非10人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物的超變區(qū)殘基取代。在一些例子中，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。而且，人源化抗體可以包括在接受抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。這些修飾可進(jìn)一步提升抗體的性能。通常，人源化抗體包括基本上全部的至少一個(gè)、一般兩個(gè)可變域，其中全部或基本上全部的超變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的超變環(huán)，全部或基本上全部的FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體任選地還包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，典型地包括人免疫球蛋白的該部分。更多的細(xì)節(jié)可見(jiàn)Jones等人，Nature321:522-525(1986);Riechmann等人，Nature332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。嵌合或人源化抗體可基于如上所述制備的鼠單克隆抗體的序列而制備。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可獲自感興趣的鼠雜交瘤，并利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建為含有非鼠(如，人)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可利用本領(lǐng)域公知的方法(見(jiàn)例如，Cabilly等人的美國(guó)專利No.4,816,567)將鼠可變區(qū)與人恒定區(qū)連接。為了產(chǎn)生人源化抗體，可利用本領(lǐng)域公知的方法(見(jiàn)例如，Winter的美國(guó)專利No.5,225,539以及Queen等人的美國(guó)專利Nos.5,530,101;5,585,089;5，693,762和6,180,370)將鼠CDR區(qū)插入人框架中。此處描述的單克隆抗體還包括"人"抗體，其可從多種來(lái)源分離獲得，包括，例如，從病人的血液中分離或利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物重組制備。所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的例子包4舌KM-Mouse(Medarex，Inc.,Princeton,NJ)，其具有人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體(見(jiàn)WO02/43478),Xenomouse(Abgenix,Inc.,FremontCA;描述于,例如，Kucherlapati等人的美國(guó)專利Nos.5,939,598;6,075,181;6,114,598;6,150,584和6，162,%3),和HuMAb-Mouse(Medarex，Inc.;描述于，例如，Taylor,L.等人(1992)AW"cJc油20:6287-6295;Chen,J.等人(1993)/"^7a".o冊(cè)//mm簡(jiǎn)o/ogj5:647-656;Tuaillon等人(1993)A^/.Jcadt/5L490:3720-3724;Choi等人(1993)A^wreGe"e"cs4:117-123;Chen,J.等人(1993)^ETkffiO/.12:821-830;Tuaillon等人(1994)丄/m麵"o/.152:2912-2920;Taylor,L.等人(1994)她雇"畫(huà)//畫(huà)圃/。"6:579-591;和Fishwild,D.等人(1996)淑歸/i/otec/mo/og_y14:845-851,Korman等人的美國(guó)專利Nos.5,545,806;5,569，825;5,625，126;5，633，425;5,789,650;5,877,397;5,661,016;5,814,318;5，874,299;和5,770,429;5，545，807;和PCT公開(kāi)Nos.WO92/03918，WO93/12227,WO94/25585,WO97/13852,WO98/24884和WO99/45962，WO01/14424)。本發(fā)明的人單克隆抗體還可以利用SCID小鼠制備，該SCID小鼠中已經(jīng)重構(gòu)了人免疫細(xì)胞，以致在免疫后可產(chǎn)生人抗體反應(yīng)。所述小鼠描述于，例如，Wilson等人的美國(guó)專利Nos.5,476,996禾口5,698,767。術(shù)語(yǔ)"超變區(qū)"用于描述負(fù)責(zé)與抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。超變區(qū)包括來(lái)自"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(即，輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)和重鏈可變區(qū)中的殘基31-35(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3),見(jiàn)Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md.(1991))和/或來(lái)自"超變環(huán)"的殘基(即，輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變區(qū)中的殘基26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3)，Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987》。"框架"或"FR"殘基是超變區(qū)殘基之外的可變區(qū)殘基。在此處應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)"免疫粘附素，，指抗體樣分子，其將異源"粘附"蛋白(例如，受體、配體或酶)的"結(jié)合域"與免疫球蛋白恒定區(qū)的效應(yīng)器功能組合。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包括粘附素氨基酸序列與免疫球蛋白恒定區(qū)序列的融合體，該粘附素氨基酸序列具有與抗體的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)(抗原結(jié)合位點(diǎn))不同的預(yù)期結(jié)合特異性(也就是為"異源"的)。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定區(qū)序列優(yōu)選地來(lái)源于Yl、或重鏈，因?yàn)榘@些區(qū)的免疫粘附素可通過(guò)蛋白A層析(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))而純化。免疫粘附素可通過(guò)本發(fā)明的方法純化。"肽體"(pepdibody)是指含有Fc域和至少一個(gè)肽的分子。肽體可以是多聚體或二聚體或其片段，并且它們可以衍生化。肽體在美國(guó)專利公開(kāi)文本20040214190、WO00/24782和WO01/83525中詳細(xì)描述，上述文獻(xiàn)全文引入本文作為參考。術(shù)語(yǔ)"配體結(jié)合域"指任何天然細(xì)胞表面受體或其任何至少保持相應(yīng)天然受體與配體結(jié)合的性質(zhì)的區(qū)域或其衍生物。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，受體來(lái)自具有與免疫球蛋白超基因家族中的成員同源的胞外結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞表面多肽。不屬于免疫球蛋白超基因家族的成員、但被該定義所覆蓋的其他受體包括細(xì)胞因子受體，特別是具有酪氨酸激酶活性的受體(酪氨酸激酶受體)，促紅細(xì)胞生成素和神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體超家族的成員，和細(xì)胞粘附分子，如(E-、L-和P-)選擇素。術(shù)語(yǔ)"受體結(jié)合區(qū)"用于指一種受體的任何天然配體(包括細(xì)胞粘附分子)或至少保持相應(yīng)天然配體的受體結(jié)合能力的這些天然配體的任何區(qū)域或衍生物。該定義尤其包括來(lái)自上述受體的配體的結(jié)合序列。"抗體-免疫粘附素嵌合體"包括將一種抗體(如此處所定義的)的至少一個(gè)結(jié)合域與至少一個(gè)免疫粘附素(如本申請(qǐng)所定義的)組合而成的分子。示例性的抗體-免疫粘附素嵌合體是Berg等人，PNAS(USA)88:4723-4727(1991)和Chamow等人，丄Immunol.153:4268(1994)描述的雙特異性CD4-IgG嵌合體。此處所用的"混合物"包含目的多肽(期望對(duì)其進(jìn)行純化)和一種或多種污染物，也就是雜質(zhì)?；旌衔锟芍苯荧@自產(chǎn)生該多肽的宿主細(xì)胞或生物體。作為非限定性的例子，可根據(jù)本發(fā)明的方法純化的混合物包括收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和條件細(xì)胞培養(yǎng)上清液。已經(jīng)"部分純化"的混合物已經(jīng)進(jìn)行了層析步驟，例如，非親和層析、親和層析等等。"條件混合物"是為本發(fā)明方法中的層析步驟而制備的混合物，例如細(xì)胞培養(yǎng)上清液，所述制備包括將混合物進(jìn)行緩沖液交換、稀釋、加鹽、pH滴定或過(guò)濾中的一個(gè)或多個(gè)，以設(shè)定pH和/或電導(dǎo)率范圍和/或緩沖液基質(zhì)，從而獲得所需的層析性能。"條件混合物，，可用于將第一層析柱上的加樣條件標(biāo)準(zhǔn)化。通常，混合物可通過(guò)多種本領(lǐng)域公知的分離方法獲得，例如，通過(guò)利用過(guò)濾或離心將生物反應(yīng)器反應(yīng)結(jié)束后的肉湯中的死細(xì)胞和活細(xì)胞與其他成分物理分離，或通過(guò)將細(xì)胞培養(yǎng)上清液濃縮和/或滲濾為特定范圍的pH、電導(dǎo)率和緩沖液種類濃度。術(shù)語(yǔ)"雜質(zhì)，，和，，污染物"以及其語(yǔ)法上的變化可互換地用于表示除了期望從含有目的蛋白質(zhì)的組合物中移出的該目的蛋白質(zhì)之外的任何物質(zhì)。污染物包括但不限于任何生物大分子例如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(如，CHOPs)、目的蛋白質(zhì)之外的蛋白質(zhì)、核酸(如，DNA和RNA)、脂質(zhì)、糖類、內(nèi)毒素、細(xì)菌或其他微生物例如酵母、培養(yǎng)基成分，和作為在層析中使用的吸附劑的部分并可能在層析過(guò)程中進(jìn)入樣品中的任何分子，等等。術(shù)語(yǔ)"目的蛋白質(zhì)"和"目標(biāo)蛋白質(zhì)"可互換地用于指期望根據(jù)本發(fā)明的方法從混合物中純化的上述蛋白質(zhì)，例如，抗體。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)"或"HCP，，指表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞的代謝(細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外)產(chǎn)生的任何蛋白質(zhì)，包括任何從宿主細(xì)胞的基因組中表達(dá)的蛋白質(zhì)或重組表達(dá)的蛋白質(zhì)，不考慮目標(biāo)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是任何能夠表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物(如，CHO和鼠骨髓瘤細(xì)胞系例如NS0)、昆蟲(chóng)、細(xì)菌、植物和酵母細(xì)胞系。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方式中，HCP是"中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞蛋白質(zhì)"，或"CHOP",其指任何來(lái)源于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢("CHO")細(xì)胞培養(yǎng)物的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)("HCP")。HCP通常作為包含目的蛋白質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)基或裂解液[例如，收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液("HCCF")]中的雜質(zhì)存在。包含目的蛋白質(zhì)的混合物中存在的HCP的量提供了一種對(duì)目的蛋白質(zhì)純度的量度。通常，蛋白質(zhì)混合物中HCP的量以相對(duì)于該混合物中目的蛋白質(zhì)含量的百萬(wàn)分比來(lái)表示。術(shù)語(yǔ)"百萬(wàn)分之"或"ppm"在此可互換地用于指通過(guò)本發(fā)明的方法純化的目的蛋白質(zhì)的純度的量度。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在溶液中時(shí)，單位ppm指相對(duì)于以亳克/毫升表示的目的蛋白質(zhì)，以納克/毫升表示的HCP的量(即，如下文實(shí)施例所述，HCPppm二(CHOPng/ml)/(目的蛋白質(zhì)mg/ml))。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被干燥，例如凍干時(shí)，ppm指(HCPng)/(目的蛋白質(zhì)mg)。術(shù)語(yǔ)"純化"及其語(yǔ)法上的變化用于表示完全或部分地去除包含蛋白質(zhì)和一種或多種雜質(zhì)的混合物中的至少一種雜質(zhì)，從而提高組合物中蛋白質(zhì)的純度水平(也就是，通過(guò)降低該組合物中雜質(zhì)的含量(ppm))。根據(jù)本發(fā)明，純化用兩個(gè)非親和層析步驟進(jìn)行，而沒(méi)有過(guò)程中TFF步驟。本發(fā)明的一種方法可純化目的蛋白質(zhì)，以獲得含有少于100ppm的HCP、優(yōu)選少于90ppm、少于80ppm、少于70ppm、少于60ppm、少于50ppm、少于40ppm、少于30ppm、或少于20ppm的HCP的組合物，其通過(guò)ELISA測(cè)定。如此處所用的術(shù)語(yǔ)"分離"及其語(yǔ)法上的變化是指從其他物質(zhì)中分離純化的目的蛋白質(zhì)，例如，從用于純化目的蛋白質(zhì)的柱或樹(shù)脂中分離，以獲得均質(zhì)的組合物，其中包含基本沒(méi)有污染物、雜質(zhì)和其他物質(zhì)的目的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"層析，，是指通過(guò)在該方法的特定緩沖條件下使混合物流經(jīng)吸附劑滲濾而將混合物中的目的溶質(zhì)如目的蛋白質(zhì)與混合物中的其他溶質(zhì)分離的方法，由于溶質(zhì)的性質(zhì)例如pl、疏水性、大小和結(jié)構(gòu)，該吸附劑或強(qiáng)或弱地吸附或保留溶質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"層析"的使用包括柱和膜的類型。"吸附劑，，是任何能夠通過(guò)與目的分子直接相互作用或與附著到吸附劑上的化合物相互作用而將另一種物質(zhì)吸附到其表面上的固定的固態(tài)物質(zhì)。在各種類型的層析中有用的吸附劑在本領(lǐng)域是公知的并且通過(guò)商業(yè)途徑可以容易地獲得。術(shù)語(yǔ)"親和層析"和"蛋白質(zhì)親和層析"可互換地用來(lái)指一種蛋白質(zhì)合，通常作為空間互補(bǔ)性和結(jié)合位點(diǎn)處的一種或多種化學(xué)相互作用如15靜電力、氫鍵、疏水力和/或范德華力的組合。這些相互作用不是歸因于分子的通常性質(zhì)，例如等電點(diǎn)、疏水性或大小，而是目的分子與配體的特異性相互作用的結(jié)果，所述配體例如是適于蛋白A和抗體相互作用的精確的疏水性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。蛋白A是吸附劑的一個(gè)例子，其可被固定到固體支持物如瓊脂糖上，用于結(jié)合含F(xiàn)C區(qū)的分子。見(jiàn)Ostrove(1990)，GuidetoProteinPurification,MethodsofEnzymology182:357-379,其全文在此引入作為參考?？墒褂萌魏闻潴w純化其相應(yīng)的特異性結(jié)合蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，生物特異性配體與層析固相物質(zhì)共價(jià)結(jié)合，并且當(dāng)溶液接觸該層析固相物質(zhì)時(shí)可與溶液中目的蛋白質(zhì)(如，抗體、酶或受體蛋白質(zhì))接觸。目的蛋白質(zhì)在層析步驟中保持對(duì)于生物特異性配體(例如，抗原、底物、輔因子或激素)的特異性結(jié)合親和性，同時(shí)混合物中的其他溶質(zhì)和Z或蛋白質(zhì)不與配體可檢測(cè)地或特異性地結(jié)合。目的蛋白質(zhì)與固定配體的結(jié)合允許污染蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)通過(guò)層析介質(zhì)，同時(shí)目的蛋白質(zhì)保持與固相物質(zhì)上的固定配體特異性結(jié)合。然后利用低pH、高pH、低鹽、高鹽、竟?fàn)幮耘潴w等從固定配體上移除特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，并與洗脫緩沖液一起通過(guò)層析柱。也可能存在相對(duì)于目的蛋白質(zhì)具有較低相對(duì)濃度的污染蛋白質(zhì)和其他類型的污染物例如核酸和內(nèi)毒素，它們4交早地通過(guò)柱子。術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合"和"結(jié)合特異性"及其語(yǔ)法上的變化描述目的蛋白質(zhì)與配體之間的通常特異性且可逆的相互作用，其需要蛋白質(zhì)和配體結(jié)構(gòu)在結(jié)合位點(diǎn)處的空間互補(bǔ)性與結(jié)合位點(diǎn)處的一種或多種靜電力、氫鍵、疏水力和/或范德華力的組合作用。配體應(yīng)該具有允許其與基質(zhì)附著而不破壞其結(jié)合活性的化學(xué)可修飾基團(tuán)。配體與結(jié)合物質(zhì)的理想的親和力為在自由溶液中10-4到10—8M?？臻g互補(bǔ)性越大以及在結(jié)合位點(diǎn)處的其他力越強(qiáng)，蛋白質(zhì)對(duì)其相應(yīng)配體的結(jié)合特異性也越大。特異性結(jié)合的非限制性實(shí)例包括抗體-抗原結(jié)合、酶-底物結(jié)合、酶-輔因子結(jié)合、金屬離子螯合、DNA結(jié)合蛋白-DNA結(jié)合、調(diào)節(jié)蛋白-蛋白質(zhì)相互作用，等等。術(shù)語(yǔ)"非親和層析"和"非親和純化"指不使用親和層析而是需要溶質(zhì)(如目的蛋白質(zhì))與吸附劑基質(zhì)之間的非特異性結(jié)合相互作用的純化步驟。此處使用的術(shù)語(yǔ)"非特異性結(jié)合"指目的蛋白質(zhì)與結(jié)合在固相基質(zhì)上的配體或其他化合物之間的相互作用，所述相互作用是通過(guò)在相互作用位點(diǎn)處的非特異性相互作用，例如通過(guò)靜電力、氫鍵、疏水力和/或范德華力，但是缺乏增強(qiáng)非結(jié)構(gòu)力例如親和(特異性)結(jié)合的效果的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性。依賴于非特異性結(jié)合而不是親和性的層析方法的例子包括離子交換層析(例如，陰離子和陽(yáng)離子交換)和疏水電荷誘導(dǎo)層術(shù)語(yǔ)"疏水電荷誘導(dǎo)層析"(或"HCIC")是一種混合模式的層析方法，其中混合物中的目的蛋白質(zhì)在沒(méi)有添加鹽(例如，易溶鹽)的情況下通過(guò)溫和的疏水相互作用與雙模式(即，一種模式用于結(jié)合，另一種模式用于洗脫)可離子化配體結(jié)合[見(jiàn)Boschetti等人，2000,GeneticEngineeringNews20(13)]。"疏水電荷誘導(dǎo)層析4對(duì)脂"是包含配體的固相，所述配體具有親硫效應(yīng)(即，利用親硫?qū)游龅男再|(zhì))、疏水性以及用于其分離能力的可離子化基團(tuán)的組合性質(zhì)。因此，一種在本發(fā)明的方法中使用的HCIC樹(shù)脂包含在中性(生理學(xué))或微酸性pH,例如大約pH5到10,優(yōu)選大約pH6到9.5時(shí)可離子化并且適度疏水性的配體。在此pH范圍里，配體大部分不帶電荷，通過(guò)溫和的非特異性疏水相互作用與目的蛋白質(zhì)結(jié)合。當(dāng)pH降低時(shí)，配體獲得電荷，由pH轉(zhuǎn)移引起的對(duì)溶質(zhì)的靜電荷排斥使疏水結(jié)合破壞。適用于HCIC的配體的例子包括任何可離子化的芳香族或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和染料，包括其衍生物，見(jiàn)Burton和Harding,JournalofChromatographyA814:81-81(1998)和Boschetti,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods49:361-389(2001),這些物質(zhì)在連接臂和/或配體結(jié)構(gòu)上具有脂肪族鏈和至少一個(gè)硫原子。HCIC樹(shù)脂的例子包括MEPHYPERCEL(PallCorporation;EastHills,NY).。術(shù)語(yǔ)"離子交換"和"離子交換層析"指一種層析方法，其中目的可離子化溶質(zhì)(例如，混合物中的目的蛋白質(zhì))在適當(dāng)?shù)膒H和電導(dǎo)率的條件下與連接(例如通過(guò)共價(jià)連接)于固相離子交換材料上的帶有相反電荷的配體相互作用，以致目的溶質(zhì)以強(qiáng)于或弱于混合物中溶質(zhì)雜質(zhì)或污染物的作用力與該帶電荷化合物發(fā)生非特異性相互作用?；旌衔镏械奈廴救苜|(zhì)可比目的溶質(zhì)更快或更慢地從離子交換材料柱上洗去或者與樹(shù)脂結(jié)合或從樹(shù)脂上除去。"離子交換層析"具體包括陽(yáng)離子交換、陰離子交換以及混合模式層析。短語(yǔ)"離子交換材料"指帶負(fù)電荷的固相(即陽(yáng)離子交換樹(shù)脂)或帶正電荷的固相(即陰離子交換樹(shù)脂)。在一個(gè)實(shí)施方式中，可通過(guò)將一種或多種帶電配體(或吸附劑)附著到固相上(例如通過(guò)共價(jià)連接)而提供電荷。可替代地，或者除此之外，電荷可以是固相固有的性質(zhì)(例如，如在二氧化硅的例子中，其總體上帶負(fù)電荷)。"陽(yáng)離子交換樹(shù)脂"指具有負(fù)電荷的固相，并且其具有可與通過(guò)或穿過(guò)該固相的水溶液中的陽(yáng)離子交換的自由陽(yáng)離子?？梢允褂萌魏胃街谶m于形成陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的固相上的帶負(fù)電配體，例如，羧酸鹽、磺酸鹽以及下述的其他物質(zhì)。商業(yè)上可以獲得的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂包括，但不限于，例如，具有以下基團(tuán)的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂基于磺酸的基團(tuán)(如，來(lái)自GEHealthcare的MonoS、MiniS、Source15S和30S、SPSepharoseFastFlowfM、SPSepharoseHighPerformance,來(lái)自Tosoh的ToyopearlSP-650S和SP-650M,來(lái)自BioRad的Macro-PrcpHighS，來(lái)自PallTechnologies的CeramicHyperDS、TrisacrylM和LSSP和SpherodexLSSP);基于磺乙基(sulfoethyl)的基團(tuán)(^口，來(lái)自EMD的FractogelSE,來(lái)自AppliedBiosystems的PorosS-10和S-20);基于磺丙基的基團(tuán)(如，來(lái)自Tosoh的TSKGelSP5PW和SP-5PW—HR，來(lái)自AppliedBiosystems的PorosHS—20和HS50);基于磺異丁基的基團(tuán)(如，來(lái)自EMD的FractogelEMDSO,);基于次碌l酸乙基(sulfoxyethyl)的基團(tuán)(如，來(lái)自Whatman的SE52、SE53和Express-IonS);基于羧甲基的基團(tuán)(如，來(lái)自GE■Healthcare的CMSepharoseFastFlow,來(lái)自BiochromLabsInc.的HydrocellCM,來(lái)自BioRad的Macro-PrepCM,來(lái)自PallTechnologies的CeramicHyperDCM、TrisacrylMCM、TrisacrylLSCM,來(lái)自Millipore的MatrexCellufineC500和C200,來(lái)自Whatman的CM52、CM32、CM23和Express一IonC,來(lái)自Tosoh的ToyopearlCM-650S、CM-650M和CM-650C);基于石黃酸和羧酸的基團(tuán)(如，來(lái)自J.T.Baker的BAKERBONDCarboxy-Sulfon);基于羧酸的基團(tuán)(如,來(lái)自J.TBaker的WPCBX，來(lái)自DowLiquidSeparations的DOWEXMAC-3,來(lái)自Sigma-Aldrich的Amberlite弱陽(yáng)離子交換劑、DOWEX弱陽(yáng)離子交換劑和Diaion弱陽(yáng)離子交換劑，以及來(lái)自EMD的FractogelEMDCOO-);基于石黃酸的基團(tuán)(如，來(lái)自BiochromLabsInc.的HydrocellSP,來(lái)自DowLiquidSeparations的DOWEX細(xì)篩強(qiáng)酸陽(yáng)離子樹(shù)脂,來(lái)自J.T,Baker的UNOsphereS，WPSulfonic,來(lái)自Sartorius的SartobindS膜，來(lái)自Sigma-Aldrich的Amberlite強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑、DOWEX強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑和Diaion強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑);和基于正磷酸的基團(tuán)(如，來(lái)自Whatman的Pll)。如果需要，可以使用陽(yáng)離子交換膜代替陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，例如SartobindS(Sartorius;Edgewood,NY)。"陰離子交換樹(shù)脂，，指帶有正電荷因而其上附著有一種或多種帶正電的配體的固相。任何附著于適于形成陰離子交換樹(shù)脂的固相上的帶正電配體都可使用，例如季氨基。例如，AEC中使用的配體可以是季銨，如季烷基胺和季烷基烷醇胺，或胺、二乙胺、二乙基氨基丙基、氨基、三甲基銨乙基、三曱基節(jié)基銨、二甲基乙醇千基銨、多胺。此外，對(duì)于AEC，可以使用具有帶正電配體(如上述配體)的膜代替陰離子交換樹(shù)脂。商業(yè)上可以獲得的陰離子交換樹(shù)脂包括但不限于來(lái)自AppliedBiosystems的DEAE纖維素、PorosPI20、PI50、HQ10、HQ20、HQ50、D50，來(lái)自GEHealthcare的MonoQ、MiniQ、Source15Q和30Q、Q、DEAE和ANXSepharoseFastFlow、QSepharosehighPerformance,QAESEPHADEXTM和FASTQSEPHAROSE,來(lái)自J.T.Baker的WPPEI、WPDEAM、WPQUAT，來(lái)自BiochromLabInc.的HydrocellDEAE和HydrocellQA,來(lái)自Biorad的UNOsphereQ、Macro-PrepDEAE和Macro-PrepHighQ，來(lái)自PallTechnologies的CeramicHyperDQ、ceramicHyperDDEAE、QHyperZ、TrisacrylM和LSDEAE、SpherodexLSDEAE、QMASpherosilLS、QMASpherosilM，來(lái)自DowLiquidSeparations的DOWEX細(xì)篩強(qiáng)石咸I型和II型陰離子樹(shù)脂和DOWEXMONOSPHERE77、弱堿陰離子，來(lái)自Millipore的MatrexCellufineA200、A500、Q500和Q800，來(lái)自EMD的FractogelEMDTMAE、FractogelEMDDEAE和FractogelEMDDMAE,來(lái)自Sigma-Aldrich的AmberliteI型和II型弱及強(qiáng)陰離子交換劑、DOWEXI型和II型弱及強(qiáng)陰離子交換劑、DiaionI型和II型弱及強(qiáng)陰離子交換劑、Duolite，來(lái)自Tosoh的TSKgelQ和DEAE5PW和5PW-HR、ToyopearlSuperQ-650S、650M和650C、QAE-550C和650S、DEAE-650M和650C,來(lái)自Whatman的QA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、Express-IonD和Express-IonQ。如果需要，可以使用陰離子交換膜代替陰離子交換樹(shù)脂。在商業(yè)上可以獲得的陰離子交換膜包括但不限于來(lái)自Sartorius的SartobindQ、來(lái)自PallTechnologies的MustangQ和來(lái)自Millipore的InterceptQ膜。"混合模式離子交換樹(shù)脂"指利用陽(yáng)離子、陰離子和/或疏水部分進(jìn)行共價(jià)修飾的固相?；旌夏Ｊ诫x子交換樹(shù)脂的例子包括BAKERBONDABXTM(J.T.Baker;Phillipsburg，NJ)、陶瓷羥磷灰石I型和II型和氟化羥磷灰石(BioRad;Hercules,CA)、CaptoMMC(GEHealthcare;Waukesha,WI)矛口MEP和MBIHyperCel(PallCorporation;EastHills,NY)。術(shù)語(yǔ)"親硫的"指蛋白質(zhì)具有的對(duì)緊密靠近硫醚基團(tuán)的砜基的選擇性(Porath等人，1985)。"親硫?qū)游?也被稱為"親硫吸附層析"，是一類非親和層析，其中含有親硫區(qū)域和芳香族氨基殘基的目的蛋白質(zhì)與用于分離該蛋白質(zhì)的含^L配體結(jié)合。親^L凝膠可通過(guò)用p-巰基乙醇還原20二乙烯砜(與Sepharose4B偶聯(lián))而制備。親硫吸附層析基于電子供體-受體性質(zhì)并與基于疏水性的層析明顯不同。不與親硫吸附劑發(fā)生疏水性結(jié)合和離子相互作用，因?yàn)榱?乙基砜結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著的疏水性或離子電荷。商業(yè)上可以獲得的親硫?qū)游鰳?shù)脂的例子包括FractogelEMDTA(Merck;KGaA;Darmstadt,德國(guó))、Uniflow和S叩erflow樹(shù)脂(Clontech;MountainView,CA)和T-Gel(Pierce;Rockford，IL)。術(shù)語(yǔ)"固相"用于表示任何非水性基質(zhì)，一種或多種配體可附著于其上，或者，在大小排斥層析中，其可指樹(shù)脂的凝膠結(jié)構(gòu)。固相可以是任何能夠以這樣方式附著配體的基質(zhì)，例如，純化柱、離散粒子的不連續(xù)相、膜、濾器、凝膠，等等。可用于形成固相的材料的例子包括多糖(例如瓊脂糖和纖維素)和其他機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)例如二氧化硅(如可控孔玻璃)、聚(苯乙烯二乙烯基)苯、聚丙晞酰胺、陶覺(jué)顆粒及其中任一種的衍生物。本發(fā)明不限于任何用于層析步驟中的特定固相材料，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以選擇適當(dāng)?shù)墓滔嗖牧嫌糜诒景l(fā)明。本文中用來(lái)指一種層析類型的"膜"通常是具有吸附性質(zhì)的聚合微量濾膜，如乙酸纖維素和聚偏氟乙烯。在層析中使用膜代替樹(shù)脂是有利的，因?yàn)椴恍枰b填、合格化(qualifying)、驗(yàn)證或者進(jìn)行清除和再循環(huán)研究。而且，膜提供了更高的清除能力值，例如比樹(shù)脂對(duì)應(yīng)物高200倍，以及高流速能力，使循環(huán)只有數(shù)分鐘，這顯著縮短了清除污染物所需的時(shí)間。膜可以在使用分步洗脫的快速層析中使用，或者作為可以處理極大體積的流通模式使用。結(jié)果，與樹(shù)脂相比，可以使緩沖液利用減少最多達(dá)90%,從而明顯節(jié)約成本。另外，膜層析技術(shù)允許以比傳統(tǒng)層析方法快100倍的高流速大規(guī)模清除DNA，從而允許在每個(gè)生產(chǎn)轉(zhuǎn)換中處理大體積。出于實(shí)施的目的，在必須用吸附劑避免氣泡的同時(shí)，它們不能破壞膜的結(jié)構(gòu)?？紤]到這些過(guò)濾器的結(jié)構(gòu)，它們的性能基本上不依賴于所附裝置的類型，如泵的類型。它們不象傳統(tǒng)層析柱那樣受到擴(kuò)散限制。由于膜的大孔結(jié)構(gòu)，使用膜吸附劑比使用傳統(tǒng)凝膠對(duì)極大生物分子和病毒的結(jié)合能力顯然更高。術(shù)語(yǔ)"去污劑"指離子型、兩性離子型和非離子型表面活性劑，其對(duì)于防止蛋白質(zhì)的聚集以及防止污染物與目的蛋白質(zhì)的非特異性相互作用或結(jié)合是有用的，并且可以在用于本發(fā)明的多種緩沖液中存在，所述緩沖液包括凈化、平衡、上樣、上樣后清洗、洗脫或清除緩沖液。在具體的實(shí)施方式中，可將去污劑加到清洗緩沖液中?？捎糜诒景l(fā)明的去污劑的例子包括但不限于聚山梨醇酯(如，聚山梨醇酯20或80);泊洛沙姆(poloxamers)(例如泊洛沙姆188);Triton;十二烷基硫酸鈉(SDS);月桂基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；月桂基-、肉豆蔻基-、亞油基-、或硬脂酰-磺基甜菜堿(sulfobetaine);月桂基-、肉豆蔻基-、亞油基-、或硬脂酰-肌氨酸；亞油基-、肉豆蔻基-、或鯨蠟基-甜菜堿；月桂酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、亞油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-、棕櫚酰胺丙基-、或異硬脂酰胺丙基-甜菜堿(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕櫚酰胺丙基-、或異硬脂酰胺丙基—二曱胺；甲基椰油基?；撬徕c或曱基油基?；撬岫c；M0NAQUATTM系歹寸(MonaIndustries,Inc.,Paterson,N丄)；IgepalCA-630、Pluronic、Triton、BRIJ、AtlasG2127、Genapol、HECAMEG、LUBROLPX、MEGA、NP、THESIT、TOPPS、CHAPS、CHAPSO、DDMAU、EMPIGENBB、AWITTERGENT和C12E8。去污劑可添加到任何工作緩沖液中，還可包含在含有目的分子的料液中。去污劑的含量可以是任何適于蛋白質(zhì)純化方法的量，例如，從大約0.001%到大約20%,典型地從大約0.01%到大約1°/0。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，在用于CEC的清洗緩沖液中使用聚山梨醇酯80。本發(fā)明中使用的"緩沖液"是通過(guò)其酸-堿共軛成分的作用阻止由添加酸或堿引起pH變化的溶液。多種緩沖液可用于本發(fā)明的方法中，取決于緩沖液的所需pH和純化方法的具體步驟[見(jiàn)Buffers.AGuideforthePreparationandUseofBuffersinBiologicalSystems,Gueffroy,D.,ed.CalbiochemCorporation(1975)]?？捎糜诳刂票景l(fā)明方法所需pH范圍的緩沖液成分的非限制性實(shí)例包括醋酸鹽、檸檬酸鹽、組氨酸、磷酸鹽、銨緩沖液例如醋酸銨、琥珀酸鹽、MES、CHAPS、MOPS、MOPSO、HEPES、Tris等，以及下列物質(zhì)的組合TRIS-蘋(píng)果酸-NaOH、馬來(lái)酸鹽、氯代醋酸鹽、曱酸鹽、苯曱酸鹽、丙酸鹽、吡啶、哌。秦、ADA、PIPES、ACES、BES、TES、三(幾曱基)甲基甘氨酸(tricine)、二(羥乙基)甘氨酸(bicine)、TAPS、乙醇胺、CHES、CAPS、曱胺、哌啶、O-硼酸、碳酸、乳酸、丁二酸、二乙基丙二酸、雙甘氨肽、HEPPS、HEPPSO、咪唑、笨酚、POPSO、琥珀酸鹽、TAPS、基于胺的、節(jié)胺、三曱基或二曱基或乙基或苯基胺、乙二胺、或嗎啉。需要時(shí)緩沖液中也可含有其他成分(添加劑)，例如，可用鹽調(diào)節(jié)緩沖液的離子強(qiáng)度，例如，氯化鈉、石克酸鈉和氯化鉀；以及其他添加劑，例如氨基酸(如甘氨酸和組氨酸)、離液劑(如尿素)、醇(如乙醇、甘露醇、甘油、芐醇)、去污劑(見(jiàn)上文)、以及糖(例如蔗糖、甘露醇、麥芽糖、海藻糖、葡萄糖和果糖)。緩沖液成分和添加劑以及使用濃度可根據(jù)本發(fā)明使用的層析類型而改變。緩沖液的pH和電導(dǎo)率可根據(jù)純化方法中哪一步驟使用緩沖液而改變?？梢允褂胮H與所選配體和樹(shù)脂/膜相容的任何合適的緩沖液純化目的蛋白質(zhì)，如上述緩沖液。在CEC中，根據(jù)純化步驟和使用的緩沖液，緩沖液的pH可在3到IO之間，更優(yōu)選大約pH4.0到9.0，電導(dǎo)率可為大約0.1到40mS/cm,更優(yōu)選為大約0.5到15mS/cm。在AEC中，根據(jù)純化步驟和使用的緩沖液為大約0.1到10.0mS/cm,更優(yōu)選大約0.5到5mS/cm。在整個(gè)純化方法中使用的緩沖液將在下文對(duì)每個(gè)層析步驟更詳細(xì)地描述。"凈化"溶液一般用于在純化步驟之前通過(guò)除去任何結(jié)合的污染物例如生物來(lái)源的污染物而凈化在柱層析中使用的樹(shù)脂。只要與根據(jù)本發(fā)明的方法選擇的特定柱和樹(shù)脂相容，任何期望的緩沖液都可用于此目的。優(yōu)選地，凈化溶液的pH庫(kù)交高，例如，為pH10或更高，更優(yōu)選pHll或更高，更優(yōu)選pH12或更高；或者，凈化溶液的pH可以較低，例如為pH4或更低，更優(yōu)選pH3或更低。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法中使用的樹(shù)脂用包含1NNaOH、pH^12的凈化溶液來(lái)凈化。"平衡緩沖液，，用于在向樹(shù)脂中裝載含有待純化的目的蛋白質(zhì)的混合物之前調(diào)節(jié)在CEC或AEC中使用的層析介質(zhì)例如樹(shù)脂或膜的pH和電導(dǎo)率?？捎糜诖四康牡倪m合的緩沖液在本領(lǐng)域是熟知的，例如，上述緩沖液，并包括其pH值與用于純化目的蛋白質(zhì)的層析步驟中選擇使用的樹(shù)脂相容的任何緩沖液。在具體實(shí)施方式中，用于CEC和AEC的平衡緩沖液種類是基于磷酸鹽或TRIS的緩沖液。平衡緩沖液的電導(dǎo)率和/或pH使得目的多肽與樹(shù)脂結(jié)合或目的蛋白質(zhì)流經(jīng)柱子而一種或多種雜質(zhì)與柱子結(jié)合，這取決于是使用CEC還是使用AEC。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，在層析介質(zhì)的pH和電導(dǎo)率分別在平衡緩沖液的土0.2和±0.4mS/cm以內(nèi)時(shí)，更優(yōu)選分別在平衡緩沖液的士O.l和±0.2mS/cm以內(nèi)時(shí)，完成平衡。在CEC中，平衡緩沖液的pH為大約3到大約9，更優(yōu)選為大約4.0到大約8.0,電導(dǎo)率為大約0.1到大約40mS/cm，更優(yōu)選為大約0.5到大約10.0mS/cm。在AEC中，平衡緩沖液的pH為大約4到大約10，更優(yōu)選pH為大約6到9,電導(dǎo)率為大約0.1(WFI)到大約10mS/cm，更優(yōu)選電導(dǎo)率為大約0.5到大約5mS/cm。"上樣緩沖液"用于將含目的蛋白質(zhì)的混合物上樣到柱子上。應(yīng)當(dāng)理解，如果使用膜作為層析介質(zhì)，則按照本領(lǐng)域使用的常規(guī)方法，上樣緩沖液只與膜接觸。任何適當(dāng)?shù)木彌_溶液都可用作上樣緩沖液。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，上樣緩沖液為磷酸鹽或TRIS緩沖液。對(duì)于CEC，選擇上樣緩沖液的電導(dǎo)率和pH使得目的蛋白質(zhì)與層析介質(zhì)結(jié)合而污染物可以流過(guò)。對(duì)于AEC,選4奪上樣緩沖液的電導(dǎo)率和pH4吏得目的蛋白質(zhì)可以流過(guò)而污染物被層析介質(zhì)保留。適合用作上樣緩沖液的緩沖液在本領(lǐng)域是公知的，例如，上述的那些緩沖液。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，用于CEC和AEC的上樣緩沖液所使用的pH和電導(dǎo)率可以與上述用于CEC和AEC的平衡緩沖液相當(dāng)(如果不相同的話)。在此使用的術(shù)語(yǔ)"清洗緩沖液"或"上樣后清洗液"是指用于在洗脫目的蛋白質(zhì)前從層析樹(shù)脂(例如當(dāng)使用柱時(shí))中除去雜質(zhì)的緩沖液。術(shù)語(yǔ)"清洗"及其語(yǔ)法上的變化用于描述適當(dāng)?shù)那逑淳彌_液通過(guò)或流經(jīng)層析樹(shù)脂。在本發(fā)明中，清洗緩沖液在CEC中使用，并且可以在AEC中用來(lái)將產(chǎn)物"推出"柱子，但它不是必需的。在膜AEC中清洗緩沖液是不必要的，因?yàn)槟康牡鞍踪|(zhì)不被AEC膜介質(zhì)保留。需要時(shí)，清洗、平衡和上樣緩沖液可以是相同的。CEC中使用的清洗緩沖液的pH和電導(dǎo)率為，使得一種或多種雜質(zhì)從樹(shù)脂上洗脫下來(lái)而樹(shù)脂保留目的多肽。需要時(shí)，清洗緩沖液可以含有如上所述的去污劑，例如聚山梨醇酯。清洗緩沖液的pH和電導(dǎo)率的選擇對(duì)于在不顯著洗脫目的蛋白質(zhì)的情況下除去HCPs和其他污染物是重要的。以上對(duì)于平衡和上樣緩沖液所述的pH和電導(dǎo)率條件足以實(shí)現(xiàn)該目的。為了在洗脫步驟之前除去比目的蛋白質(zhì)親水性更強(qiáng)和酸性或堿性更強(qiáng)的污染物并降低系統(tǒng)的電導(dǎo)率，在混合物上樣后，在用于CEC的后續(xù)清洗步驟中使用的清洗緩沖液的電導(dǎo)率和pH可以降低或保持或升高。選擇清洗緩沖液的pH和電導(dǎo)率，使得目的蛋白質(zhì)保留在該方法使用的CEC樹(shù)脂中。適合用作清洗緩沖液的緩沖液的實(shí)例如上所述。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，清洗緩沖液是基于磷酸鹽或TRIS的緩沖液。CEC中使用的清洗緩沖液的pH可為大約3到大約10,更優(yōu)選的pH是大約4到大約9，電導(dǎo)率為大約0.1到大約40mS/cm，更優(yōu)選的電導(dǎo)率為大約0.5到大約5mS/cm。如此處所用的術(shù)語(yǔ)"洗脫緩沖液"是指用于從CEC樹(shù)脂中洗脫目的蛋白質(zhì)的緩沖液。術(shù)語(yǔ)"洗脫"及其語(yǔ)法上的變化是指通過(guò)利用適當(dāng)?shù)臈l件從層析材料中移出一種分子，例如目的多肽，所述適當(dāng)?shù)臈l件例如是，通過(guò)改變圍繞層析材料的緩沖液的離子強(qiáng)度或pH,通過(guò)添加配體的竟?fàn)幮苑肿?，通過(guò)改變分子的疏水性，或通過(guò)改變配體的化學(xué)性質(zhì)(如，電荷)，使得目的蛋白質(zhì)不能與樹(shù)脂結(jié)合因而從層析柱上洗脫下來(lái)。術(shù)語(yǔ)"洗出液"是指當(dāng)對(duì)柱子進(jìn)行洗脫時(shí)從柱子上洗下的含有目的多肽的流出液。在洗脫目的多肽后，柱子可根據(jù)需要進(jìn)行再生、凈化和儲(chǔ)存。選擇洗脫緩沖液的pH和電導(dǎo)率，以使目的蛋白從本方法使用的CEC樹(shù)脂上洗脫下來(lái)。適于用作洗脫緩沖液的緩沖液的實(shí)例如上所述。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，洗脫緩沖液是基于磷酸鹽或TRIS的緩沖液。用于CEC的洗脫緩沖液的pH可為大約3到大約10,更優(yōu)選的pH為大約4到大約9,電導(dǎo)率為大約0.1到大約40mS/cm,更優(yōu)選的電導(dǎo)率為大約5到大約15mS/cm。需要時(shí)，可以使用另外的溶液處理柱子以重新使用。例如，可以使用"再生溶液"從純化方法使用的柱子上"清除"或除去緊密結(jié)合的污染物。典型地，再生溶液具有足以從樹(shù)脂上基本上去除任何殘存的雜質(zhì)和目的蛋白質(zhì)的電導(dǎo)率和pH。AEC膜不結(jié)合目的蛋白質(zhì)并且不重復(fù)使用。因此，使用膜AEC可能是有利的，因?yàn)樗谑褂们爸恍枰闷胶饩彌_液平衡。膜AEC中使用的平ff緩沖液的pH可以是大約4到大約10，更優(yōu)選的pH為大約6到大約9,電導(dǎo)率為大約0.1到大約10mS/cm,更優(yōu)選的電導(dǎo)率為大約0.5到大約5mSZcm。此處使用的術(shù)語(yǔ)"電導(dǎo)率"指水溶液在特定溫度下在兩個(gè)電極之間傳導(dǎo)電流的能力。電流通過(guò)離子轉(zhuǎn)運(yùn)在溶液中流動(dòng)。因此，隨著水溶液中存在的離子量的增加，溶液將具有更高的電導(dǎo)率。在本發(fā)明的一種方法中，在特定pH范圍內(nèi)，純化一般可以在大約4到大約37°C、更優(yōu)選大約15到大約25。C的溫度下進(jìn)行。電導(dǎo)率的測(cè)量單位是毫西門(mén)子每厘米(mS/cm),可利用標(biāo)準(zhǔn)電導(dǎo)儀進(jìn)行測(cè)量。溶液的電導(dǎo)率可通過(guò)改變其中離子的濃度而改變。例如，為了獲得期望的電導(dǎo)率，可以改變?nèi)芤褐械木彌_劑的濃度和/或鹽(例如，NaCl或KC1)的濃度。優(yōu)選地，如下面實(shí)施例所述改變鹽濃26度以獲得期望的電導(dǎo)率。多肽的"pl"或"等電點(diǎn)"是指多肽的正電荷與負(fù)電荷平衡時(shí)的pH?？筛鶕?jù)多種常規(guī)方法計(jì)算pl，例如，根據(jù)多肽上氨基酸和/或唾液酸殘基的凈電荷或通過(guò)利用等電聚焦來(lái)計(jì)算。如此處所用的"低pH保持"(lowpHhold)是指含目的蛋白質(zhì)的洗出液的pH的降低，其中pH降低至低于大約pH5，優(yōu)選低于大約pH4，更優(yōu)選低于大約pH3.7，最優(yōu)選大約pH3.4到大約3.6，以實(shí)現(xiàn)病毒滅活(即，病毒滴度至少降低2log，更優(yōu)選降低3log以上)，隨后升高pH,以制備用于第二層析步驟的洗出液或?qū)a(chǎn)物帶至為目的產(chǎn)品的分子完整性提供穩(wěn)定性的基質(zhì)中。任何適當(dāng)?shù)乃峥蓱?yīng)用于含目的蛋白質(zhì)的洗出液中，以降低pH進(jìn)行低pH保持，例如，基于1NHC1或冰醋酸的溶液。4壬何適當(dāng)?shù)氖蓱?yīng)用于洗出液中，以將其pH還原至更中性的范圍，如，1NNaOH或lNTris。"切向流過(guò)濾"或"TFF"或"橫向流過(guò)濾"是指一種過(guò)濾方法，其中樣品混合物沿膜的頂面循環(huán)，同時(shí)施加的壓力使某些溶質(zhì)和小分子穿過(guò)該膜。在TFF中，溶液一般與濾膜平行地流動(dòng)。膜兩邊的壓力差導(dǎo)致液體和可濾過(guò)溶質(zhì)(其分子量小于膜或有類似的性質(zhì)，如球蛋白)穿過(guò)濾器。這可作為連續(xù)流方法進(jìn)行，因?yàn)槿芤悍磸?fù)地在膜上流過(guò)，而穿過(guò)濾膜的液體被連續(xù)地抽入獨(dú)立的循環(huán)中。在HPTFF(高效切向流過(guò)濾)中，膜帶有電荷，因此利用分子的大小和電荷來(lái)分離污染物(見(jiàn)美國(guó)專利公開(kāi)No.2003/0229212)。如果需要，TFF可用于交換緩沖液，其中目的蛋白質(zhì)在本發(fā)明方法開(kāi)始之前溶于另一種更適于結(jié)合到層析樹(shù)脂上的緩沖液中。然而，在本發(fā)明的方法中，過(guò)程中TFF步驟(即，在兩個(gè)層析步驟之間發(fā)生的TFF)是不必要的，因?yàn)樵趯游鲞^(guò)程中使用的緩沖液和配體的性質(zhì)允許直接從一個(gè)純化步驟轉(zhuǎn)移到下一個(gè)純化步驟。如此處所用的"過(guò)程中"是指在開(kāi)始使用CEC的捕獲步驟之后及在AEC過(guò)程中完成收集目的蛋白質(zhì)之前進(jìn)行的任何方法、步驟、操作等等。過(guò)程中方法可直接導(dǎo)致純度的變化(如過(guò)程中TFF)，但不是導(dǎo)致純度變化所需的(例如pH和/或電導(dǎo)率調(diào)節(jié))?？善谕帽景l(fā)明的方法獲得治療級(jí)的蛋白質(zhì)純度，在這種情況中任選地可以使用本領(lǐng)域公知的附加步驟。例如，為了獲得既清除外來(lái)病毒又清除內(nèi)源病毒的病毒清除能力，可以使用低pH滅活和病毒過(guò)濾方法，包括帶電膜過(guò)濾(例如，來(lái)自CUNO的VRCUNO、來(lái)自PallTechnologies的DV20、來(lái)自Asahi的Planova過(guò)濾器)。如此處所用的"深度過(guò)濾"是一種使用深度濾器的過(guò)濾方法，其典型的特征是其設(shè)計(jì)為將顆粒保留在過(guò)濾基質(zhì)內(nèi)。深度濾器的能力一般用深度來(lái)定義(如，10英寸或20英寸的基質(zhì))、因而用保持固體的能力來(lái)定義。在本發(fā)明的一種方法中，深度濾器可用于提高純化方案的病毒清除能力，然而這是任選的步驟，不是獲得本發(fā)明方法的純度水平所必需的。用于去除病毒的深度濾器可在純化方案中的任何時(shí)間點(diǎn)上使用，但出于濾器成本的考慮優(yōu)選地在第一層析步驟之后使用，此時(shí)處理體積4交<氐。方法的描述在本發(fā)明的方法中，利用CEC然后利用AEC純化目的蛋白質(zhì)，達(dá)到少至大約100ppm或更少的HCP、10pg/mg或更少的DNA以及高達(dá)99%或更高的單體純度的純度。不需要TFF也不需要另外的層析步驟即可獲得這樣高水平的純度。目的蛋白質(zhì)可由已被基因工程化以產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的活宿主細(xì)胞產(chǎn)生或表達(dá)。將細(xì)胞基因工程化以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域是公知的。見(jiàn)例^口，Ausabel等人，eds.(1990),CurrentProtocolsinMolecularBiology(Wiley，NewYork)和美國(guó)專利Nos.5，534，615和4,816,567，每篇都特別在此引入作為參考。所述的方法包括將編碼蛋白質(zhì)并允許該蛋白質(zhì)表達(dá)的核酸導(dǎo)入到活的宿主細(xì)胞中。這些宿主細(xì)胞可以是在培養(yǎng)中生長(zhǎng)的細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、或優(yōu)選動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞包括但不限于大腸桿菌細(xì)胞。合適的大腸桿菌菌抹的例子包括HBIOI、DH5a、GM2929、JM109、KW251、NM538、NM539,以及任何不能切割外源DNA的大腸桿菌菌抹?？衫玫恼婢拗骷?xì)胞包括但不限于釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母和曲霉細(xì)胞?？衫玫膭?dòng)物細(xì)胞系的幾個(gè)例子是CHO、VERO、DXBll、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3、NS0和WI138。新的動(dòng)物細(xì)月包系可利用本領(lǐng)域4支術(shù)人員熟知的方法(如，通過(guò)轉(zhuǎn)化、病毒感染和/或篩選)建立。在具體實(shí)施方式中，目的蛋白質(zhì)在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生(見(jiàn)，例如WO94/11026)。CHO細(xì)胞的各種類型在本領(lǐng)域是已知的，例如，CHO-Kl、CHO-DG44、CHO-DXBll、CHO/dhfr—和CHO-S。用編碼目的蛋白質(zhì)的核酸工程化的宿主細(xì)胞可以在本領(lǐng)域公知的允許蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)。從細(xì)胞碎片制備用于純化蛋白質(zhì)的混合物首先依賴于蛋白質(zhì)的表達(dá)方法。一些蛋白質(zhì)直接從細(xì)胞分泌到周圍的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，而另外一些蛋白質(zhì)保留在細(xì)胞內(nèi)。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，可利用任何方法，例如機(jī)械剪切、滲透休克以及酶處理法使細(xì)胞裂解。裂解使細(xì)胞的全部?jī)?nèi)容物釋放到勻漿中，另外產(chǎn)生可通過(guò)離心或過(guò)濾除去的亞細(xì)胞片段。在蛋白質(zhì)生產(chǎn)過(guò)程中，由于細(xì)胞的自然死亡和宿主細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的釋放，直接分泌的蛋白質(zhì)會(huì)產(chǎn)生類似的問(wèn)題，盡管程度較小。當(dāng)使用重組技術(shù)時(shí)，目的蛋白質(zhì)可在細(xì)胞內(nèi)、在周質(zhì)間隙中產(chǎn)生，或直接分泌到培養(yǎng)基中。本發(fā)明的方法不依靠任何特定的方法來(lái)清除細(xì)胞碎片。熟練技術(shù)人員可利用任何方法實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。如果蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，作為第一步驟，可(例如)通過(guò)離心或過(guò)濾步驟除去微粒碎片、宿主細(xì)胞或裂解片段，以制備用于純化的混合物。如果蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中，則可通過(guò)(例如)切向流過(guò)濾(TFF)或深度過(guò)濾從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離重組宿主細(xì)胞，以制備用于純化的混合物。根據(jù)本發(fā)明，一旦獲得了含有目的蛋白質(zhì)的混合物(即，在適當(dāng)宿主細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)后已經(jīng)回收了蛋白質(zhì))，即可如上文所述，在適當(dāng)條件下利用CEC和AEC的組合(見(jiàn)圖l)進(jìn)行目的蛋白質(zhì)與混合物中污染物的分離。獲得本發(fā)明方法可得到的純度水平不需要其他過(guò)程中純化步驟，如TFF或HPTFF。僅僅根據(jù)需要在兩個(gè)層析步驟之間進(jìn)行pH調(diào)節(jié)和/或稀釋以制備用于在第二層析步驟中純化的混合物。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，AEC步驟使用的膜采用季銨離子配體，而CEC步驟使用與樹(shù)脂連接的基于磺酸的配體。這些層析技術(shù)基于多種性質(zhì)(如電荷)分離蛋白質(zhì)混合物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，需要時(shí)可以將低pH保持引入本方法中作為過(guò)程中步驟。由于管理機(jī)構(gòu)對(duì)治療性蛋白質(zhì)生產(chǎn)中病毒清除的要求，必須至少有兩個(gè)單獨(dú)的病毒滅活和清除的步驟，基于不同的化學(xué)作用模式，其典型地是低pH保持和病毒過(guò)濾步驟。本發(fā)明可以在任意點(diǎn)，在AEC步驟之前或之后，提供低pH保持。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在兩個(gè)層析步驟之間的pH保持可利用任何本領(lǐng)域公知的方法實(shí)現(xiàn)，以達(dá)到一般通過(guò)低pH保持獲得的病毒清除，只要包含目的蛋白質(zhì)的混合物在應(yīng)用于AEC步驟之前被適當(dāng)?shù)鼐彌_。低pH保持通常導(dǎo)致電導(dǎo)率提高至少0.5mS/cm。pH保持和中和后獲得的pH可能在適當(dāng)?shù)膒H范圍內(nèi)，大約4至大約10,優(yōu)選大約6至大約9。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，低pH保持步驟不是獲得本發(fā)明方法可達(dá)到的純度水平所必需的。例如，并非意在限制酸和堿試劑或pH值，低pH保持可以利用(例如)1NHC1、磷酸或冰醋酸進(jìn)行，以降低CEC洗出液的pH到大約3.4至3.6的范圍內(nèi)，然后加入(例如)2MTrispH9.0,以提高洗出液的pH到大約7.0。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到可以使用各種酸和堿。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到在本發(fā)明方法中使用的低pH保持步驟的時(shí)間條件。典型地，低pH保持進(jìn)行至少大約15分鐘，優(yōu)選大約30分鐘，更優(yōu)選大約45分鐘，更優(yōu)選可達(dá)大約60分鐘，最優(yōu)選可達(dá)大約90分鐘。在特定純化方案中，根據(jù)被純化的蛋白質(zhì)不同，可期望進(jìn)行低pH保持長(zhǎng)達(dá)5小時(shí)?；蛘?，可以按照常規(guī)方法添加去污劑并在溶液中4妄觸一定時(shí)間來(lái)滅活病毒。如果希望獲得治療級(jí)蛋白質(zhì)制劑，可采用第二病毒清除步驟，例如病毒過(guò)濾步驟，然而，達(dá)到本發(fā)明方法可獲得的純度水平不需要該步驟。可在病毒清除中使用的過(guò)濾裝置是本領(lǐng)域公知的(如，UltiporVFGradeDV20或DV50和FiltronTFF(PallCorporation,EastHills,NY);Vi扁lve(Millipore，Billerica，MA);VRCUNO(CUNO;Meriden,CT);和Planova(AsahiKaseiPharma,PlanovaDivision,BuffaloGrove,IL)。為了除去病毒和其他生物物質(zhì)，一般使用小于20nm的孔徑，這樣可除去脊髓灰質(zhì)炎病毒。可以在該過(guò)程中最小化后進(jìn)行。本發(fā)明的層析步驟可通過(guò)任何機(jī)械方法進(jìn)行。層析可在柱上進(jìn)行。柱子可使用或不用壓力并從頂部到底部或從底部到頂部運(yùn)行。需要時(shí)，根據(jù)本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法，柱子中的液體流的方向在層析過(guò)程中可轉(zhuǎn)換。層析也可利用批處理進(jìn)行，其中通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒?，包括重力、離心或過(guò)濾，將固體支持物與用來(lái)上樣、清洗和洗脫樣品的液體分離。層析還可以如下進(jìn)行利用與對(duì)于層析樹(shù)脂所描述的同樣的化學(xué)原理，使樣品接觸比其他濾器更強(qiáng)地吸附或保留樣品中的一些分子的帶電荷濾器。盡管用于本發(fā)明的柱子的準(zhǔn)備步驟可被修改以適應(yīng)操作者的個(gè)人需求，但是提供下述描述作為指導(dǎo)，而且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)理解在不偏離本發(fā)明精神的前提下可以進(jìn)行改變。柱子和膜按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行準(zhǔn)備。在純化之前，柱子一般利用凈化溶液進(jìn)行凈化，然后利用易溶鹽例如lMNaCl使其帶電荷，并利用平衡緩沖液進(jìn)行平衡。在凈化步驟中，一般在凈化溶液加到柱子上后停留例如大約15-30分鐘，優(yōu)選大約1小時(shí)，以清潔具有任何結(jié)合的污染物(包括生物來(lái)源的污染物)的樹(shù)脂。電荷化(charge)步驟通過(guò)置換凈化溶液而中和^f脂，例如，在CEC中，可利用NaCl從柱子中置換NaOH并保持樹(shù)脂配體與正電離子接觸。在柱子電荷化后，用平衡緩沖液平衡柱子，以準(zhǔn)備樹(shù)脂結(jié)合目的蛋白質(zhì)的pH和電導(dǎo)率。例如，當(dāng)其pH和電導(dǎo)率分別在平衡緩沖液的pH和電導(dǎo)率土O.l和±0.2mS/cm以內(nèi)時(shí)，柱子可以認(rèn)為是平衡的。制備上樣混合物，其典型地是在適當(dāng)?shù)木彌_鹽(即上樣緩沖液)中濃縮和進(jìn)行了緩沖液交換的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。利用任選地可與平銜-緩沖液相同的上樣緩沖液，將獲自重組宿主細(xì)胞的上樣混合物(即，含有希望純化的目的蛋白質(zhì))上樣到被平衡的柱(CEC)上。當(dāng)混合物流過(guò)柱子的固相時(shí)，目的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)(例如，如果蛋白質(zhì)在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生，則為HCPs)差異性地與固相結(jié)合，由此使蛋白質(zhì)和污染物在通過(guò)層析柱時(shí)分離。一旦混合物被上樣到柱子上并且目的蛋白質(zhì)與樹(shù)脂結(jié)合，就利用所述的清洗緩沖液進(jìn)行清洗步驟以從柱子中清除污染物。任選地，清洗步驟的進(jìn)行可以采用比其他清洗和洗脫步驟更慢的流速(但不是必需的)，例如，采用相當(dāng)于幾分鐘(例如，2-30分鐘)停留時(shí)間的流速。流速將在下文更詳細(xì)地討論。為了最大化地清除HCPs，清洗緩沖液的pH和電導(dǎo)率是重要的。在本方法中，CEC中的清洗步驟清除了核酸和剩余的HCPs同時(shí)保留了目的蛋白質(zhì)。為從柱子上洗脫目的蛋白質(zhì)，利用如上所述的適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液，以使目的蛋白質(zhì)與柱子脫離結(jié)合。緩沖液組合物中的緩沖液、鹽和/或其他化合物的類型和濃度使得目的蛋白質(zhì)相對(duì)于雜質(zhì)差別洗脫。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員利用此處提供的實(shí)施例作為指導(dǎo)，可容易地確定用于上樣、清洗和洗脫緩沖液的適當(dāng)?shù)膒H和電導(dǎo)率范圍，從而在洗脫過(guò)程中回收目的蛋白質(zhì)。為了使含目的蛋白質(zhì)的洗出液中的HCPs減至最少，可利用下文描述的降低的流速。當(dāng)從柱子上洗脫目的蛋白質(zhì)時(shí)，根據(jù)從上升A，到下降A(chǔ)，的峰的形成收集目的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可在平衡緩沖液通過(guò)柱子時(shí)通過(guò)測(cè)量平衡緩沖液在250-280nm處的吸光度而容易地確定基線。為了減少HCPs的集合以制備含目的蛋白質(zhì)的純化組合物，優(yōu)選在最大峰高度的25%之前收集含目的蛋白質(zhì)的洗出液。32基本上，本發(fā)明采用的分離方法使污染物以不同速率沿著長(zhǎng)柱子向下移動(dòng)，獲得隨著它們進(jìn)一步沿柱子向下流動(dòng)而增強(qiáng)的物理分離，同時(shí)目的蛋白質(zhì)附著于層析介質(zhì)上，然后根據(jù)緩沖液進(jìn)行差別洗脫。在本發(fā)明的純化方法中，混合物沿柱子向下移動(dòng)的降低的流速為大約2-10分鐘停留時(shí)間，優(yōu)選不超過(guò)30分鐘停留時(shí)間。在一個(gè)本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，層析步驟中的流速相當(dāng)于不超過(guò)大約6分鐘的停留時(shí)間。盡管流速對(duì)于獲得本發(fā)明方法可獲得的純度水平不是關(guān)鍵因素，仍然提供了流速作為指導(dǎo)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)需要改變流速。通過(guò)本發(fā)明方法測(cè)量蛋白質(zhì)純化效率的優(yōu)選方法是測(cè)量宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的去除。純化的蛋白質(zhì)優(yōu)選是如上文定義的均質(zhì)組合物。樣品在任何純化階段的蛋白質(zhì)濃度可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定。這些方法在本領(lǐng)域是公知的，包括1)比色法，例如Lowry測(cè)定、Bradford測(cè)定、Smith測(cè)定、膠體金測(cè)定；2)利用蛋白質(zhì)的UV吸收性質(zhì)的方法；和3)基于凝膠上染色蛋白條帶與相同凝膠上已知量的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)作比較而進(jìn)^亍的一見(jiàn)覺(jué)估測(cè)。見(jiàn)例如，Stoschek(1990),QuantitationofProtein,inGuidetoProteinPurification,MethodsinEnzymol.182:50-68。含目的蛋白質(zhì)的均質(zhì)組合物的蛋白質(zhì)污染物可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法測(cè)定，例如，通過(guò)酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA;見(jiàn)例如，Reen(1994),Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay(ELISA),于BasicProteinandPeptideProtocols,MethodsMol.Biol.32:461-466，其全文在此引入作為參考)。含目的蛋白質(zhì)的均質(zhì)組合物中可能存在的核酸的含量可通過(guò)任何適當(dāng)方法確定。例如，可使用一種利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的檢測(cè)。核酸可降至低于10pg/mg的水平。如此回收的蛋白質(zhì)可以按照本領(lǐng)域公知的常規(guī)配制方法配制在生物醫(yī)藥可接受的組合物中，用于各種需要高度純化的蛋白質(zhì)組合物的診斷、治療和其他用途。在收集含目的蛋白質(zhì)的洗出液之后，可通過(guò)利用具有較高摩爾濃度和/或改變的pH的溶液清洗層析介質(zhì)，釋放任何可能保持與柱子結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后可以用一種溶液(例如，再生溶液)使柱子再生，該溶液具有從層析介質(zhì)中釋放大多數(shù)或全部蛋白質(zhì)并減少或消除任何可能存在于層析介質(zhì)中的微生物污染物的效果。隨后，柱子可被沖洗并保存在防止微生物生長(zhǎng)的溶液中。所述溶液可包含氫氧化鈉，但也可使用其他試劑，例如乙醇、疊氮鈉、苯曱醇或高濃度的易溶鹽。下述實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，而非意在限制。實(shí)施例本實(shí)施例描述了利用本發(fā)明的純化方法進(jìn)行抗體純化(見(jiàn)圖1)。制備了抗腫瘤抗原(TA)的完全人類抗體。利用CHODG44細(xì)胞制備了轉(zhuǎn)染瘤。在中性pH(7到8)和電導(dǎo)率為10到20mS/cm的合成的、無(wú)血清的、成分確定的培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。DG44CHO細(xì)胞生長(zhǎng)到密度大約為2-10xl()S細(xì)胞/ml。通過(guò)利用60MO2CUNO濾器(Meriden，CT)過(guò)濾以使細(xì)胞培養(yǎng)物澄清。將得到的細(xì)胞培養(yǎng)上清液濃縮并在pH6.2的70mM磷酸鈉中滲濾。表1和2顯示了本發(fā)明的兩步純化方法用于生產(chǎn)治療級(jí)蛋白質(zhì)物質(zhì)的操作細(xì)節(jié)的概況。第一非親和層析步驟是利用FractogelEMDSEHiCap樹(shù)脂進(jìn)行捕獲的陽(yáng)離子交換層析，緊接著是利用INHC1或冰醋酸的低pH保持，以將洗出液的pH降低到3.4-3.6,使用2MTrispH9.0將級(jí)分的pH提高到7.0。該方法利用如表1中顯示的用于各自樹(shù)脂的平衡、上樣、清洗和洗脫緩沖液在CEC步驟中進(jìn)行。表1.用于抗體捕獲的陽(yáng)離子交換層析主要操作細(xì)節(jié)的概要。結(jié)合能力為40mg/ml樹(shù)脂。流速用相應(yīng)的停留時(shí)間來(lái)表示，以提供較寬的實(shí)驗(yàn)靈活性。工作溫度在15-25。C之間。NaP:磷酸鈉。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表2.上樣制劑用于抗體精制的陰離子交換層析膜主要操作細(xì)節(jié)的概述。結(jié)合能力為2100mg/ml膜。流速以相應(yīng)的床體積來(lái)表示，以提供較寬的實(shí)驗(yàn)靈活性。工作溫度在15-25。C之間。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>NaP:A粦酸鈉。BV:系統(tǒng)的床體積。流速(mL/min)=[(線性流速(cm/hr)]/(60min/hr)]x[正面表面積(cm2)]純化方法不使用過(guò)程中緩沖液交換步驟，即，樣品從第一層析步驟到第二步驟只進(jìn)行pH調(diào)節(jié)和稀釋操作以進(jìn)行任選的低pH保持。在該實(shí)施例中為了制備治療級(jí)別的蛋白質(zhì)組合物，使用了稀釋、病毒滅活、病毒清除和配制步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些步驟都不會(huì)影響蛋白質(zhì)產(chǎn)物相對(duì)于其它有機(jī)化合物的純度。利用標(biāo)準(zhǔn)ELISA檢測(cè)來(lái)確定CHOP水平，利用PCR確定DNA水平，并且利用HPLC-SEC確定抗體單體的純度，該實(shí)施例的純化方法獲得均質(zhì)的組合物，其含有少于100卯m的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(見(jiàn)下面表3)、少于lOpgDNA/mg抗體以及大于99%的單體，這允許將純化的物質(zhì)進(jìn)一步加工和配制為治療級(jí)產(chǎn)品。第一步驟后的污染物濃度為200到1500ng/mg的CHOPs,以及95%到100%的單體。結(jié)果顯示在表3中。表3.利用建議的純化方案去除污染物的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>權(quán)利要求1.一種純化包含目標(biāo)蛋白質(zhì)和一種或多種污染物的混合物的方法，包括(a)對(duì)該混合物進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析步驟，然后進(jìn)行陰離子交換層析步驟，和(b)分離目標(biāo)蛋白質(zhì)。2.—種純化包含目標(biāo)蛋白質(zhì)和一種或多種污染物的混合物的方法，所述混合物已經(jīng)利用陽(yáng)離子交換層析進(jìn)行了部分純化，該方法包括(a)對(duì)該混合物進(jìn)行陰離子交換層析步驟，和(b)分離目標(biāo)蛋白質(zhì)。3.—種純化包含抗體和一種或多種污染物的混合物的方法，包括(a)對(duì)該混合物進(jìn)行陽(yáng)離子交換柱層析，然后進(jìn)行陰離子交換層析，和(b)分離目標(biāo)蛋白質(zhì)。4.權(quán)利要求1-3的方法，其中所述污染物選自宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、宿主細(xì)胞代謝物、宿主細(xì)胞組成蛋白質(zhì)、核酸、內(nèi)毒素、產(chǎn)物相關(guān)的污染物、脂質(zhì)、培養(yǎng)基添加物和培養(yǎng)基衍生物。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)被純化為大約百萬(wàn)分之100(ppm)或更少的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和大約10pg/mg或更少的核酸的純度。6.權(quán)利要求1或3的方法，進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)選自病毒滅活和病毒清除的額外步驟。7.權(quán)利要求l-3的方法，其中所述陰離子交換層析在pH為大約4到大約IO且電導(dǎo)率為大約0.1到大約10mS/cm的條件下進(jìn)行。8.權(quán)利要求1-3的方法，其中所述陰離子交換層析在pH為大約6.0到大約9.0且電導(dǎo)率為大約0.5到大約5mS/cm的條件下進(jìn)行。9.權(quán)利要求1-3的方法，其中所述陰離子交換層析使用膜。10.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述陽(yáng)離子交換層析在pH為大約3到大約IO且電導(dǎo)率為大約0.1到大約40mS/cm的條件下進(jìn)行。11.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述陽(yáng)離子交換層析在pH為大約4.0到大約9.0且電導(dǎo)率為大約0.5到大約15mS/cm的條件下進(jìn)行。12.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述陽(yáng)離子交換層析步驟使用選自磺酸、羧酸、羧甲基磺酸、磺基異丁基、磺基乙基、羧基、磺丙基、磺?；⒋瘟蛩嵋一驼姿岬呐潴w。13.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述陽(yáng)離子交換層析步驟在選自下組的樹(shù)脂或膜上進(jìn)行PorosHS、PorosS、羧曱基纖維素、SartobindS、BAKERBONDABXTM、固定于瓊脂糖上的磺丙基和固定于瓊脂糖上的石黃?；?，MonoS、MiniS、Source15S、30S、SPsepharose、CMSepharose、BAKERBONDCarboxy-Sulfon、WPCBX、WPSulfonic、HydrocellCM、HydrocelSP、UNOsphereS、Macro-PrepHighS、Macro-PrepCM、CeramicHyperDS、CeramicHyperDCM、CeramicHyperDZ、TrisacrylMCM、TrisacrylLSCM、TrisacrylMSP、TrisacrylLSSP、SpherodexLSSP、DOWEX細(xì)篩強(qiáng)酸陽(yáng)離子樹(shù)脂、DOWEXMAC-3、MatrexCellufineC500、MatrexCellufineC200、FractogelEMDS03-、FractogelEMDSE、FractogelEMDCOO-、Amberlite弱及強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑、Diaion弱及強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑、TSKGelSP-5PW-HR、TSKGelSP-5PW、ToyopearlCM(650S、650M、650C)、ToyopearlSP(650S、650M、650C)、CM(23、32、52)、SE(52,53)、Pll、Express-IonC和Express-IonS。14.權(quán)利要求1—3的方法，其中所述陰離子交換層析步驟使用選自季銨或胺、二乙胺、二乙氨基丙基、氨基、三甲基銨乙基、三曱基芐基銨、二甲基乙醇千基銨、多胺的配體。15.權(quán)利要求1-3的方法，其中所述陰離子交換層析步驟使用選自下組的樹(shù)脂或膜進(jìn)行DEAE纖維素、SartobindQ、MonoQ、MiniQ、Source15Q、Source30Q、ANXSepharoseFastFlow、QSepharosehighPerformance、CaptoQ、QAESEPHADEXTM、FASTQSEPHAROSE、WPPEI、WPDEAM、WPQUAT、HydrocellDEAE、HydrocellQA、UNOsphereQ、Macro-PrepDEAE、Macro-PrepHighQ、CeramicHyperDQ、ceramicHyperDDEAE、SpherodexLSDEAE、QMASpherosilLS、QMASpherosilM、MustangQ、DOWEX細(xì)篩強(qiáng)堿I型陰離子樹(shù)脂、DOWEX細(xì)篩強(qiáng)堿II型陰離子樹(shù)脂、DOWEXMONOSPHERE77、來(lái)自DowLiquidSeparations的弱石咸陰離子、InterceptQ膜、MatrexCellufineQ500、MatrexCellufineA500和MatrexCellufineQ800、FractogelEMDTMAE、FractogelEMDDEAE和FractogelEMDDMAE和Amberlite。16.權(quán)利要求1-3的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)是抗體或抗體片段。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述抗體是一種單克隆抗體。18.權(quán)利要求16的方法，其中所述抗體是一種完全人類抗體。19.權(quán)利要求16的方法，其中所述抗體或其片段選自單鏈抗體、雙抗體、線性抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、脫巖藻糖基化抗體、肽體、Fab、Fab'、F(ab')2和Fv。20.權(quán)利要求1-3的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)是一種免疫粘附21.—種制備目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，包括培養(yǎng)工程化表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞，將目標(biāo)蛋白質(zhì)回收在混合物中，以及根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述純化該混合物。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)是抗體或抗體片段。23.權(quán)利要求21的方法，進(jìn)一步包括將純化的蛋白質(zhì)配制成藥物組合物的步驟。全文摘要本發(fā)明提供純化蛋白質(zhì)的方法。具體地，本方法利用一種兩步非親和離子交換層析方法，而不使用過(guò)程中切向流過(guò)濾步驟。文檔編號(hào)C12N15/85GK101437839SQ200780016347公開(kāi)日2009年5月20日申請(qǐng)日期2007年3月9日優(yōu)先權(quán)日2006年3月20日發(fā)明者A·阿魯納庫(kù)馬里,G·M·M·費(fèi)雷拉申請(qǐng)人:米德列斯公司