專利名稱：：用于增殖人胚泡衍生干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)和方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用于基于酶促解離成單細胞懸浮液來增殖人胚泡衍生干細胞(humanblastocyst-derivedstemcell,hBS細胞)的培養(yǎng)系統(tǒng)和方法。
背景技術：
：傳統(tǒng)上，將人胚泡衍生干細胞(hBS細胞)維持在mEF(小鼠胚胎成纖維細胞)飼養(yǎng)細胞層上，并通過人工切割和轉(zhuǎn)移集落的單個小片來進行增殖[Heins等人，WO03055992,Bresagen]。這一傳統(tǒng)培養(yǎng)方法非常耗時費力，但卻是目前為止能夠?qū)BS細胞系長期維持在穩(wěn)定的正常狀態(tài)的優(yōu)選培養(yǎng)方法，并因此是適于較小規(guī)模維持培養(yǎng)的適宜方法。然而，也存在著許多與該傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)相關的技術缺陷。例如，它幾乎不可能定量有多少細胞被轉(zhuǎn)移到一個小片中，由此對于可重復性和標準化帶來負面影響。由于與自動化技術(例如自動儀器和生物反應器)的低相容性，基于這些傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)的按比例擴大生產(chǎn)過程是有限的，而且反而需要大量的工時、實驗室空間和設備例如顯微鏡。此外，通過例如密度梯度、FACS(熒光自動細胞分選法)或磁珠分選技術，以及通過例如電穿孔或病毒試劑來進行的細胞轉(zhuǎn)染技術，在解離的單細胞上施行比在細胞小片(piece)或聚集體(cluster)上施行更為優(yōu)選。因此，就所需的時間和勞力來說，酶促解離將使得hBS細胞的增殖更有效。此外，在傳代時將hBS細胞解離成單細胞將使得它們能被更精確地定量，和經(jīng)歷許多將擴大hBS細胞的潛在用途應用范圍的操作程序，并由此這將有助于自動化增殖程序。有幾個小組已經(jīng)嘗試了酶促解離，但是極少有報道基于在傳代時解離成單細胞懸浮液來增殖hBS細胞，卻反而依賴于通過使用膠原酶IV來進行傳代，由此獲得了一定大小的聚集體[Brimble等人，Bresagen，Sjfigren-Jansson等人]。例如，Sj6gren-Jansson報道了當在無飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)中避免單細胞傳代時粘附和存活增加，同時Brimble和Bresagen報道了他們利用約10~IOO個細胞大小的聚集體而且還進一步清楚地建議避免在傳代過程中解離成單細胞，因為它對生存力有負面影響(HumanEmbryonicStemCellProtocols)。還有其他小組已進行了hBS細胞的酶促解離，并發(fā)現(xiàn)為了使細胞調(diào)整適應于所述酶，必需在hBS細胞系建立過程中或者在hBS細胞系的非常早期的傳代過程中就已經(jīng)將細胞暴露于所述酶[Cowan等人],由此，只有根據(jù)這些較為近期的酶促方案建立的hBS細胞系而不是大多數(shù)目前已經(jīng)存在的hBS細胞系(傳統(tǒng)方法建立和培養(yǎng)的)可應用于酶促傳代和可能的自動化較大規(guī)模增殖和擴增。此外，當釆用在傳代時酶促解離成單細胞時，只描述了相對較低的傳代率和分傳比(1:3)[Cowan等人]，這意味著將該增殖按比例擴大成更大規(guī)模的增殖的低可能性。除了上述與在傳代中酶促解離成單細胞有關的技術困難之外，還報道了與增殖的hBS細胞系的穩(wěn)定性和品質(zhì)有關的問題[Draper等人，Buzzard等人，Mitalipova，Enver等人，Andrews等人]。例如，Draper,Buzzard和Mitalipova描述了染色體畸變的引入，例如染色體12和17q的獲得。Cowan還清楚地指明了遺傳不穩(wěn)定性，并由此建議進行定期的核型分析。Enver和Andrews描述了向著經(jīng)培養(yǎng)適應的或經(jīng)體外適應的細胞系的轉(zhuǎn)化，所述細胞系開始類似于人胚胎癌性(EC)細胞或可能表現(xiàn)出改變的多能性以及在核型方面的外遺傳改變。在hBS細胞的酶促增殖過程中所觀察到的這些變化可能歸因于過度選擇性的培養(yǎng)系統(tǒng)，其有利于特異性地抵抗群體壓力和應力的細胞，這些細胞通常在第15~20代開始出現(xiàn)。因此，需要開發(fā)這樣的培養(yǎng)系統(tǒng)，其允許當在進行傳代時將hBS細胞酶促解離成單細胞，甚至以高分傳比(splitratio)，即高增殖率，并且不產(chǎn)生上述問題。這樣的培養(yǎng)系統(tǒng)是本發(fā)明的目標。發(fā)明筒述本發(fā)明提供了具有對于hBS細胞的高度支持性培養(yǎng)環(huán)境的培養(yǎng)系統(tǒng)，其允許在每次傳代過程中酶促解離成單細胞，并且在延長的時間段內(nèi)，例如超過20代，不危及細胞系的未分化、多能和正常的狀態(tài)。本文所呈現(xiàn)的培養(yǎng)系統(tǒng)的這一支持性環(huán)境抵消了在單細胞代過程中對細胞造成的選擇壓力。養(yǎng)系統(tǒng)，其包括i)密度為至少50，000細胞/cn^的人銅養(yǎng)細胞，ii)一種或多種用于將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液的解離劑，和iii)支持性培養(yǎng)基，該培養(yǎng)系統(tǒng)通過在每個連續(xù)傳代中將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液而使得可能在延長的時間段內(nèi)增殖hBS細胞，并同時維持hBS細胞的顯著特征。此外，本發(fā)明提供了用于在根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中增殖hBS細胞的方法，所迷方法包括下列步驟i)可選地，施行調(diào)整程序(adjustmentprocedure)，以使從主細胞系獲得的hBS細胞調(diào)整適應于該培養(yǎng)系統(tǒng)，ii)通過使用一種或多種解離劑來將hBS細胞解離成單細胞懸浮液，iii)按照至少1:4，例如至少1:5的分傳比將所述單細胞懸浮液分配至一個或多個培養(yǎng)容器中，所述培養(yǎng)容器含有密度為至少50，000細胞/cn^的人飼養(yǎng)細胞，iv)溫育hBS細胞約3至約25天，期間定期更換培養(yǎng)基，v)從步驟ii)開始重復n次，其中n為至少l的整數(shù)，以便增殖hBS細胞，并同時維持此類細胞的顯著特征。與現(xiàn)有技術中已經(jīng)公開的相反，當從主細胞系培養(yǎng)物(mastercelllineculture)轉(zhuǎn)移至本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)時，hBS細胞只需要一個短的調(diào)整程序(adjustmentprocedure)，如果根本上有的話。此外，當通過在傳代時將hBS細胞集落酶促解離成單細胞懸浮液來增殖時，本發(fā)明解決了以前遇到的與所獲得的hBS細胞的低穩(wěn)定性和品質(zhì)有關的問題，因為通過本發(fā)明的方法在本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中增殖的hBS細胞可增殖超過20代，例如超過30代，并同時維持hBS細胞的顯著特征。發(fā)明描述如上所述，本發(fā)明的一個主要方面涉及一種培養(yǎng)系統(tǒng)，其允許通過將hBS細胞酶促解離成單細胞懸浮液來增殖hBS細胞，并且不丟失hBS的顯著特征。本發(fā)明的用于增殖hBS細胞的系統(tǒng)包括i)密度為至少50，000細胞/cW的人祠養(yǎng)細胞，ii)一種或多種用于將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液的解離劑，和iii)支持性培養(yǎng)基，該培養(yǎng)系統(tǒng)通過在每個連續(xù)傳代中將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液而使得可能在延長的時間段內(nèi)增殖hBS細胞，并同時維持hBS細胞的顯著特征。hBS細胞可在本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中增殖超過20代，例如超過25代，超過30代，超過35代，或超過40代，并且仍然維持此類細胞的顯著特征。本發(fā)明的一個其他方面是用于增殖hBS細胞及隨后的分離的培養(yǎng)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括i)密度為至少50，000細胞/cn^的人飼養(yǎng)細胞，ii)一種或多種用于將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液的解離劑，和Ui)支持性培養(yǎng)基，iv)用于摻入飼養(yǎng)細胞中的磁性顆粒，該培養(yǎng)系統(tǒng)使得可能從hBS細胞中分離飼養(yǎng)細胞。所述系統(tǒng)的分離效率可以是至少50%,例如至少70%，至少80°/0，至少90%,至少99%，其中分離效率意指被施加的磁力所吸引的祠養(yǎng)細胞總數(shù)目的百分比。如本文所使用的，術語"增殖"意指繁殖hBS細胞，以便擴大hBS細胞群體，即擴大hBS細胞的數(shù)量。然而，本文所述的用于增殖的培養(yǎng)系統(tǒng)和方法還可用于簡單維持hBS細胞系的目的。如本文所使用的，術語"hBS細胞的顯著特征"意指下述特征中的一、二、三、四、五、六或七個i)當在有絲分裂方面失活的飼養(yǎng)細胞上生長時展現(xiàn)出在未分化狀態(tài)下的增殖能力，和/或U)在hBS細胞增殖過程中展現(xiàn)出穩(wěn)定的染色體核型，即無畸變，和/或iii)維持在體外和體內(nèi)發(fā)育成所有類型胚層的衍生物的潛力，和/或iv)展現(xiàn)出下列分子標記物中的至少兩種OCT",堿性磷酸酶，碳水化合物表位SSEA-3,SSEA-4，TRA1-60,TRA1-81，和被單克隆抗體GCTM-2所識別的硫酸角蛋白/硫酸軟骨素細胞外周基質(zhì)蛋白聚糖的蛋白質(zhì)核心，和/或v)不展現(xiàn)出分子標記物SSEA-1或其他分化標記物，和/或vi)保持其多能性，并且在注射進無免疫應答的小鼠中時在體內(nèi)形成畸胎瘤，和/或vii)能夠分化。這些特征可以按照實施例7和8中所描述的以規(guī)則的間隔，例如每l-20代，例如每5-15代或每10代進行分析。本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)可以用于增殖hBS細胞或被維持在本文稱作"主細胞系(mastercellline)"中的細胞系。如本文所使用的，"主細胞系"指hBS細胞系的親本培養(yǎng)物，其維持在傳代時利用機械手段切開hBS細胞集落的傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)中，和"主細胞系"也指已玻璃化的(vitrified)親本培養(yǎng)物。在本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中需要密集的祠養(yǎng)細胞層，以便使得所述系統(tǒng)足以支持hBS單細胞，所述hBS單細胞明確地比聚集體中的hBS細胞對周圍環(huán)境更敏感。因此，本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)中的人伺養(yǎng)細胞密度為約50，000至約500，000細胞/cm2，例如，約50，000至約400，000細胞/cm2,約50，000至約300，000細胞/cm2,約50，000至約200，000細胞/cm2，約60，000至約200，000細胞/cm2，約70，000至約200，000細胞/cm2。通常，在接種hBS細胞之前約1至約10天，例如，約1至約5天，約2至約4天將飼養(yǎng)細胞接種入培養(yǎng)容器中。可選地，在接種hBS細胞之前，可將培養(yǎng)基更換至少一次，例如，至少兩次，至少三次，至少四次或至少五次。用于本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)的適宜的人飼養(yǎng)細胞可來源于人組織，或者它們可在體外來源于，例如，hBS細胞或源自hBS細胞的細胞。人飼養(yǎng)細胞可以來源于的人組織包括胚胎、胎兒、新生兒、青少年或成人組織，并且它進一步包括來源于皮膚(包括包皮)、臍帶、肌肉、肺、上皮、胎盤、輸卵管、腺(glandula)、基質(zhì)(stroma)或乳房的組織。人飼養(yǎng)細胞可來源于屬于由人成纖維細胞、纖維細胞、肌細胞、角質(zhì)形成細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞組成的組的細胞類型?？捎糜谘苌孙曫B(yǎng)細胞的特定細胞類型的例子包括胚胎成纖維細胞、胚外內(nèi)胚層細胞、胚外中胚層細胞、胎兒成纖維細胞和/或纖維細胞、胎兒肌細胞、胎兒皮膚細胞、胎兒肺細胞、胎兒內(nèi)皮細胞、胎兒上皮細胞、臍帶間充質(zhì)細胞、胎盤成纖維細胞和/或纖維細胞、胎盤內(nèi)皮細胞、出生后人包皮成纖維細胞和/或纖維細胞、出生后肌細胞、出生后皮膚細胞、出生后內(nèi)皮細胞、成人皮膚成纖維細胞和/或纖維細胞、成人肌細胞、成人輸卵管內(nèi)皮細胞、成人腺子宮內(nèi)膜細胞、成人基質(zhì)子宮內(nèi)膜細胞、成人乳腺癌實質(zhì)細胞、成人內(nèi)皮細胞、成人上皮細胞或成人角質(zhì)形成細胞。當人飼養(yǎng)細胞來源于hBS細胞時，所述源自hBS細胞的細胞可以是成纖維細胞或具有間充質(zhì)表型。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，人飼養(yǎng)細胞是成纖維細胞，優(yōu)選來源于人新生兒包皮成纖維細胞。人包皮成纖維細胞飼養(yǎng)細胞系可通過下述方式從來自施行了包皮環(huán)切術的男嬰的皮膚樣品來建立所述皮膚樣品置于含有合適的無菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中，所述培養(yǎng)基例如為基礎培養(yǎng)基,例如腿M(Dulbecco，sModifiedEagle'sMedium)或扁M(Iscove，sModifiedDulbecco，sMedium)，其中補充有哺乳動物血清，例如FBS或人血清，或者補充有血清替代物和1%PEST(v/v)。優(yōu)選地，培養(yǎng)基是補充有10°/。(v/v)人血清和1%(v/v)PEST的IMDM(Invitrogen)。約5天至約30天后獲得匯合的細胞單層?，F(xiàn)在可以以約2天至約10天，例如約4天至約9天，約5天至約8天的間隔，用一種或多種解離劑，例如TrypLETMSelect,通過酶促解離來對飼養(yǎng)細胞進行傳代。在建立之后，可就人病原體的合適選擇來對飼養(yǎng)細胞進行測試，以確保它們的健康。具體而言，可以按照以下實施例3所述獲得人包皮成纖維細胞銅養(yǎng)細胞的細胞系。在另一個實施方案中，在本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中所使用的飼養(yǎng)細胞可以是商購可得的祠養(yǎng)細胞，例如，hFF細胞(AmericanTypeCultureCollection,CRL-2429ATCC,Manassas,VA)或人胚胎成纖維細胞細胞(AmericanTypeCultureCollection,CCL-llOATCC，Manassas,VA)。本發(fā)明中所使用的飼養(yǎng)細胞還可以是無限增殖化的或經(jīng)遺傳修飾的。飼養(yǎng)細胞的"無限增殖化"意指，在培養(yǎng)中通過理論上無限次的分裂進行生長的能力的獲得。為此存在幾種方法，其中一種方法是用例如病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒來轉(zhuǎn)化細胞和/或通過端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)(TERT)的表達。TERT在大多數(shù)細胞中是失活的，但是當外源性地表達hTERT時，所述細胞能夠維持足以避免復制衰老的端粒長度。此外，兩種細胞類型，即祠養(yǎng)細胞或hBS細胞，中的任一種都可以經(jīng)過磁性修飾以允許通過施加磁力來分開混合的細胞群體。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明中所使用的銅養(yǎng)細胞經(jīng)過磁性修飾。飼養(yǎng)細胞的磁性修飾可通過下列方式來完成，即將細胞群體暴露于能夠通過數(shù)種方法，例如通過電穿孔、胞吞作用或吞噬作用而摻入細胞中的磁性顆粒。此外，伺養(yǎng)細胞可以是經(jīng)過遺傳修飾的，從而具有整合入基因組中的特定基因。這些基因可編碼目的標記物或合成已知對hBS細胞有益的生物分子，例如生長因子，例如bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)。這些基因修飾還可誘導飼養(yǎng)細胞凋亡和使得能夠獲得飼養(yǎng)細胞的誘導去除。活，以便維持相對固定數(shù)目的飼養(yǎng)細胞以避免飼養(yǎng)細胞生長超過hBS細胞。人飼養(yǎng)細胞的生長失活可根據(jù)已知方法或如以下實施例1和4中所實施的，通過用抗有絲分裂劑例如絲裂霉素處理細胞來進行。備選地，可根據(jù)已知方法，通過給予細胞一定劑量的輻射，例如足以導致細胞周期停滯的Y輻射，來使得人飼養(yǎng)細胞在生長方面被失活。在飼養(yǎng)細胞的生長失活之前，可將它們培養(yǎng)在對于特定細胞類型的飼養(yǎng)細胞具有支持性的培養(yǎng)基上。當飼養(yǎng)細胞是人成纖維細胞時，培養(yǎng)基可選自Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，Iscove改良Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)，其補充有哺乳動物血清例如人血清或FBS或者血清替代物，和進一步補充有PEST。飼養(yǎng)細胞可直接種植入培養(yǎng)容器中或種植到培養(yǎng)容器的基質(zhì)成分上。該培養(yǎng)基可補充有濃度為約1至約40%v/v，例如約5至約20%v/v或10%v/v的血清，例如FBS或人血清，和/或補充有一種或多種抗生素，例如青霉素和鏈霉素。在一個特定的實施方案中，培養(yǎng)基補充有濃度為約o.1%至約io%v/v，約0.5%至約2%v/v，或優(yōu)選1°/。v/v的青霉素-鏈霉素。飼養(yǎng)細胞可在該培養(yǎng)基中以約2至約21天，例如約3至約10天，約4至約8天的間隔，例如每7天，通過使用一種或多種解離劑，以1:2至1:20，例如1:2至1:10，1:2至1:8的分傳比進行傳代。在大約2至10代后，例如在3至8代后，飼養(yǎng)細胞可如上述進行生長失活。在生長失活后，可將細胞接種于包被有合適基質(zhì)材料的培養(yǎng)容器內(nèi)的支持hBS的培養(yǎng)基中，即下面被描述為支持hBS細胞增殖的所有培養(yǎng)基都是合適的。合適的基質(zhì)材料的例子可包括重組人纖連蛋白，人胎盤細胞外基質(zhì)或明膠，例如，重組人明膠。合適的明膠濃度是約0.P/。w/v。以約50,000至約500，000細胞/cra2，例如，約60，000至約200，000細胞/cm2,或約70，000至約100，000細胞/(^2的密度接種祠養(yǎng)細胞。理想地，將第2代和第IO代之間，例如第3代和第8代之間的飼養(yǎng)細胞用作飼養(yǎng)細胞。具體而言，可按照以下實施例1和3所迷來培養(yǎng)祠養(yǎng)細胞。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，祠養(yǎng)細胞是無異源物質(zhì)的(xeno-free)祠養(yǎng)細胞，即它們從未直接或間接暴露于非人動物來源的材料，例如細胞、組織和/或體液及其衍生物。實施例3和4共同描述了人包皮成纖維細胞飼養(yǎng)細胞的無異源物質(zhì)的細胞系的建立和培養(yǎng)。,岸浙本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)系統(tǒng)，其中hBS細胞集落可在傳代時被解離成單細胞懸浮液。如本文所使用的，術語"單細胞懸浮液"意指實質(zhì)上含有單細胞的hBS細胞懸浮液，即，低于10%，例如低于8%，低于6%，低于4%，低于2%,或低于1°/。的細胞實體可以是聚集體。任何殘余的聚集體可以可選地通過使用細胞濾器來除去，所述細胞濾器的功能如具有一定孔尺寸的篩子一般，通過所述孔尺寸可收集聚集體而讓單細胞通過。如上所述，這是關鍵的步驟，因為單細胞狀態(tài)對于hBS細胞來說是苛刻的，這就是為什么以前已發(fā)現(xiàn)在細胞存活方面以及在存活細胞的穩(wěn)定性和品質(zhì)方面存在復雜問題。當在本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)的情況下使用時，一種或多種解離劑可以是酶、螯合劑或者一種或多種酶和/或一種或多種螯合劑的組合。相應地，所述一種或多種解離劑可以是至少兩種，例如至少三種，至少四種，至少五種解離劑的組合。適合用于本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)的酶可包括蛋白水解酶和/或膠原溶解酶，例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶樣、分散酶、分散酶樣、鏈霉蛋白酶、鏈霉蛋白酶樣、膠原酶、膠原酶樣和基質(zhì)金屬蛋白酶。特別合適的酶可以是重組的酶。合適的螯合劑可以是二價陽離子螯合劑，例如，EDTA、EGTA和HEDTA。在步驟ii)中解離hBS細胞集落時，除所述一種或多種解離劑外還可以加入DNA酶，這將防止由從破裂的細胞中釋放出的DNA所引起的結(jié)塊。解離劑的組合特別適合用于本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)。這樣的例子有TrypLESelect(Invitrogen)、Accutase(Chemicon)和Accumax(Chemicon)。TrypLESelect包含重組胰蛋白酶樣酶和BDTA，其是無動物成分的。Accutase包含蛋白水解和膠原溶解活性以及EDTA，其不含有哺乳動物成分或細菌來源的成分。除AccutaseTM的成分外，AccumaxTM還包舍DNA酶活性。此外，所迷一種或多種解離劑或其組合可以是無異源物質(zhì)的，即它們從未直接或間接暴露于非人動物來源的材料，例如細胞、組織，和/或體液及其衍生物。潛#差適合用于本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)基必須是高度支持hBS細胞生長的。合適的培養(yǎng)基可以是具有完全已知組成的確定成分培養(yǎng)基。合適的支持性培養(yǎng)基包括經(jīng)補充的基礎培養(yǎng)基，例如DMEM或IMDM。支持性培養(yǎng)基可補充有一種或多種以下組分哺乳動物血清，例如FBS或人血清，KN0CK0UT⑤血清替代物，青霉素，鏈霉素，非必需氨基酸，L-谷氨酰胺，P-巰基乙醇和hrbFGF(人重組堿性成纖維細胞生長因子)。在本發(fā)明中還可使用其他培養(yǎng)基。這樣的培養(yǎng)基可含有鹽、維生素、能量源(例如葡萄糖)、礦物質(zhì)和氨基酸。待添加到培養(yǎng)基中的合適的生長因子可以是例如，GABA、六氬吡啶羧酸、氯化鋰和轉(zhuǎn)化生長因子P(TGFP)和bFGF。此外，這樣的培養(yǎng)基可以是在化學上確定了成分的。培養(yǎng)基也可以是條件培養(yǎng)基，即在用作用于hBS細胞增殖的培養(yǎng)基之前已經(jīng)與飼養(yǎng)細胞例如人祠養(yǎng)細胞接觸過的培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)基包含由飼養(yǎng)細胞釋放的因子，并由此它比非條件培養(yǎng)基更加支持hBS細胞增殖。此外，該培養(yǎng)基可以是無異源物質(zhì)的，這在增殖的hBS細胞將用于任何類型的醫(yī)學應用并因而必須具有臨床標準時是尤其重要的。所述支持性培養(yǎng)基可補充有血清，例如FBS或人血清，或者備選地血清替代物，例如KN0CK0UT⑤血清替代物。所述支持性培養(yǎng)基可補充有約1%至約40%血清，例如，約5°/。至約20%血清，例如10%血清。所述支持性培養(yǎng)基可補充有一種或多種選自使得能夠維持顯著的hBS細胞特征的組的生長因子，所述組由下列物質(zhì)組成EGF(表皮生長因子)，HGF(肝細胞生長因子)，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，成纖維細胞生長因子，例如酸性FGF和/或堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，優(yōu)選地，人重組堿性成纖維細胞生長因子(hrbFGF)。在一個實施方案中，所述支持性培養(yǎng)基補充有合適濃度的hrbFGF。hrbFGF的合適濃度可以在約0.5至約1000ng/mlhrbFGF，例如，約1至約500ng/mlhrbFGF，約2至約200ng/ml或約4至約100ng/mlhrbFGF的范圍內(nèi)。下面描迷了四種合適的培養(yǎng)基。然而，考慮了其他培養(yǎng)基也可以使用，只要它們給hBS細胞提供液體形式的營養(yǎng)成分，即無機成分，例如痕量元素，和有機成分，例如氨基酸、鹽、微生物、能量提供者、碳水化合物(包括糖類)等。在本發(fā)明中使用的一種合適的培養(yǎng)基為補充有至少4ng/mlhrbFGF的Vi"0服3，培養(yǎng)基。另一種可用于本發(fā)明的合適培養(yǎng)基由DMEM或其他基礎培養(yǎng)基組成，例如KNOCKOUTDulbecco改良Eagle培養(yǎng)基，其補充有20%KN0CK01H^血清替代物以及下列處于各自終濃度的成分50單位/ml青霉素、50pg/ml鏈霉素、0.1raM非必需氨基酸、2idML-谷氨酰胺、100p-巰基乙醇、至少4ng/mlhrbFGF。可用于本發(fā)明的另一外一種合適的培養(yǎng)基(hBS細胞培養(yǎng)基)由以下組成KNOCKOUTDulbecco改良Eagle培養(yǎng)基，其補充有20%KN0CK0UT⑤血清替代物以及下列處于各自終濃度的成分50單位/ml青霉素、50pg/ml鏈霉素、0.1mM非必需氨基酸、2mML-谷氨酰胺、100|uMp-巰基乙醇以及還補充有至少4ng/mlhrbFGF。在本發(fā)明中使用的另外一種合適的培養(yǎng)基是無異源物質(zhì)的培養(yǎng)基，其包括適合于增殖hBS細胞的培養(yǎng)基。一種合適的基礎培養(yǎng)基是Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)。然而，其他培養(yǎng)基也可以起作用。除無異源物質(zhì)的基礎培養(yǎng)基之外，所迷無異源物質(zhì)的培養(yǎng)基還可以含有人血清、hrbFGF、L-谷氨酰胺或glutamax、非必需氨基酸、|3-巰基乙醇、青霉素和/或鏈霉素。在無異源物質(zhì)的培養(yǎng)基中人血清的濃度優(yōu)選為約1°/。v/v至約30%v/v人血清，例如，約10%v/v至約30%v/v人血清，約15%v/v至約25%v/v人血清，和更優(yōu)選20%v/v人血清。在無異源物質(zhì)的培養(yǎng)基中hrbFGF的濃度優(yōu)選為約2ng/ml至約100ng/mlhrbFGF，例如，約5ng/ml至約50ng/mlhrbFGF，約5ng/ml至約25ng/mlhrbFGF，約5ng/ml至約15ng/mlhrbFGF，例如至少4ng/mlhrbFGF。在無異源物質(zhì)的培養(yǎng)基中L-谷氨酰胺或Glutamax⑧的濃度優(yōu)選為約0.5mM至約20mM，例如，約0.75mM至約10印M，約1mM至約5mM,例如2mM。在無異源物質(zhì)的培養(yǎng)基中非必需氨基酸的濃度優(yōu)選為約0.01mM至約1mM，例如，約0.03mM至約0.8mM，約0.05mM至約0.6mM，約0.07mM至約0.4mM，約0.09mM至約0.2mM，例如0.1mM。在無異源物質(zhì)的培養(yǎng)基中P-巰基乙醇的濃度優(yōu)選為約10pM至約200|iM，例如，約25nM至約175jaM，約50pM至約150iaM,約75jiM至約125|iM，例如100jiM。在無異源物質(zhì)的培養(yǎng)基中青霉素的濃度為約5單位/ml至約200單位/ml，例如，約10單位/ml至約150單位/ml，約25單位/ml至約100單位/ml，約25單位/ml至約75單位/ml，例如50單位/ml。在無異源物質(zhì)的培養(yǎng)基中鏈霉素的濃度為約5jig/ml至約200pg/ml，例如，約10pg/ml至約150pg/ml，約25pg/ml至約100pg/ml,約25pg/ml至約75jag/ml，例如50pg/ml。在一個特定的實施方案中，所述培養(yǎng)基是補充有1-30%v/v人血清和2-100ng/inlhrbFGF的DMEM。在一個實施方案中，所述基礎培養(yǎng)基含有20%v/v人血清。在另一個實施方案中，所述基礎培養(yǎng)基含有至少4ng/mlhrbFGF。在我們的實驗室中已經(jīng)重復生產(chǎn)出了用于上述無異源物質(zhì)的培養(yǎng)基的優(yōu)質(zhì)人血清。在醫(yī)院血液中心就許多標準病原體對血液進行了測試(肝炎B、C，HIV，HTLV和梅毒)。因此，在無異源物質(zhì)的培養(yǎng)基中使用的人血清優(yōu)選通過以下步驟來制備1)將健康人血液收集在非肝素包被的袋中，2)搖動所述非肝素包被的袋約0.5小時至約5小時，例如，約0.5小時至約2小時的時間段，3)在最高5'C的溫度下溫育所述非肝素包被的袋至少10小時的時間段，4)可選地，根據(jù)凝固質(zhì)量進行選擇，例如，不存在未凝固的血纖蛋白、液相的不透明度，5)從凝固的材料中分離出血清，6)無菌過濾所述血清，7)從至少15名供體中匯集血清，8)使用前冷凍血清。說遞#培#系鍵在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)包括i)密度為至少50，000細胞/cii^的人新生兒包皮飼養(yǎng)細胞，ii)用于將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液的TrypLESelect,和iii)作為支持性培養(yǎng)基的補充有至少4ng/mlhrbFGF的VitroHES,該培養(yǎng)系統(tǒng)通過在每個連續(xù)傳代中將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液而使得可能在延長的時間段內(nèi)增殖hBS細胞，并同時維持hBS細胞的顯著特征。用于增殖hBS細胞的方法在另一個主要方面，本發(fā)明涉及用于在上面定義的培養(yǎng)系統(tǒng)中增殖hBS細胞的方法，所述方法包括下列步驟i)可選地，施行適應程序，以-使從主細胞系獲得的hBS細胞適應該培養(yǎng)系統(tǒng)，ii)通過使用一種或多種解離劑來將hBS細胞解離成單細胞懸浮液，iii)按照至少1:4，例如至少1:5的分傳比將所述單細胞懸浮液分配至一個或多個培養(yǎng)容器中，所述培養(yǎng)容器含有密度為至少50,000細胞/cr^的人飼養(yǎng)細胞，iv)溫育hBS細胞約3至約25天，期間定期更換培養(yǎng)基，v)從步驟U)開始重復n次，其中n為至少l的整數(shù)，以便增殖hBS細胞，并同時維持此類細胞的顯著特征。該方法提供的一項改進是，使得可能通過將hBS細胞集落酶促解離成單細胞懸浮液來重復傳代hBS細胞，并同時維持hBS細胞的顯著特征。因此，n可以為至少5，例如，至少10，至少15，至少20，至少25，至少30，至少35，或至少40。為了驗證，在從步驟ii)開始重復之前，即在傳代hBS細胞之前，hBS細胞的顯著特征得到了維持，所述方法進一步包括下列步驟vi)分析在步驟iv)中獲得的細胞以觀察hBS細胞的顯著特征是否得到維持，vii)如果hBS細胞的顯著特征得到了維持，從步驟ii)開始重復。席席在淨在步驟ii)中將hBS細胞解離成單細胞懸浮液通過用一種或多種解離劑處理hBS細胞集落來完成。在除去所使用的培養(yǎng)基后，可在PBS中洗滌hBS細胞集落，這可以耗盡鈞和鎂。向集落中添加一種或多種解離劑，并允許其通過合適的溫度例如37。C起作用一段合適的時間，即直至hBS細胞集落的外周區(qū)域開始從伺養(yǎng)細胞層中聚攏。當所述一種或多種解離劑含有一種或多種酶，則酶活性的合適量為約10單位/mL至約5000單位/mL，例如，約100單位/mL至約500單位/mL。在溫育后，可用吸移管進行反復粉碎，以便幫助所述一種或多種解離劑將細胞片分裂開以獲得hBS單細胞。由于所述一種或多種解離劑的存在可能會對一旦在步驟Hi)中接種到人飼養(yǎng)細胞上時hBS細胞形成克隆的能力產(chǎn)生不利影響，因此，可以在步驟iii)之前減少所述一種或多種解離劑的效力。所述一種或多種解離劑的效力可以例如通過下列方式來減少物理去除，例如進行離心、過濾或沉淀以將hBS細胞與所述一種或多種解離劑分開，稀釋所述一種或多種解離劑，加入所述一種或多種解離劑的一種或多種抑制劑，或過量加入所述一種或多種解離劑的一種或多種底物。備選地，所述一種或多種解離劑可以能夠自我抑制，即它們具有在某一時間段后抑制其自身功能的固有能力，例如AccutaseTM和AccumaxTM的情況。在去除所述一種或多種解離劑后，將所獲得的hBS單細胞重懸浮于本發(fā)明的支持性培養(yǎng)基中，以獲得hBS細胞的單細胞懸浮液。在上述方法的步驟iii)中，可將在所獲得的單細胞懸浮液中的hBS細胞分配至一個或多個含有如上所述制備的人祠養(yǎng)細胞的培養(yǎng)容器中，即將hBS細胞接種到飼養(yǎng)細胞上。這一接種過程的重要特征是，本發(fā)明的方法和培養(yǎng)系統(tǒng)允許將細胞以至少1:4，例如至少1:5的分傳比進行分配，這意味著hBS細胞被分配至這樣的飼養(yǎng)細胞區(qū)域，該區(qū)域為在步驟ii)之前hBS細胞所解離自的區(qū)域的五倍。關于選擇特定分傳比的標準依賴于在解離后基于形態(tài)學觀察和計數(shù)的在培養(yǎng)容器中的hBS細胞集落的匯合度、生長速度和均一性。上述因素越高，可以采用越高的分傳比而不危及細胞的穩(wěn)定性和品質(zhì)，以及所到達的hBS細胞的數(shù)目擴張越大。合適的分傳比可以在約1:4或1:5至約1:5000，例如，約1:20至約1:1000，約1:50至約1:500的范圍內(nèi)，其中常用的分傳比為約1:20。溫f在以一定的分傳比接種hBS細胞后，在濕潤氣氛即優(yōu)選約95%的濕度中，于約37。C下，溫育所述細胞約3至約25天，例如，約4至約20天，或約6至約12天。在步驟iv)中的溫育期間，可以以每周約1至約14次，例如，每周約2至約6次，每周約2至約4次，例如每周三次的間隔，更換培養(yǎng)基。濕嫁#—由于將hBS細胞集落酶促解離成單細胞懸浮液(這是本發(fā)明的一個重要要素)對于hBS細胞而言是與壓力、可能的低附著和隨后的低增殖、自發(fā)分化以及甚至可能的細胞死亡相關的重大變化，因此，可能必需通過使hBS細胞在更溫和的條件下經(jīng)歷一次或多次傳代來使得hBS細胞調(diào)整適應于本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)。更溫和的條件意指，比在增殖方法本身中所規(guī)定的來說更小的分傳比和更長的溫育時間。因此，本發(fā)明的調(diào)整程序包括下列步驟a)通過使用一種或多種解離劑來將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液，b)按照至少1:3的分傳比將所述單細胞懸浮液分配至一個或多個培養(yǎng)容器中，所述培養(yǎng)容器含有密度為至少50,000細胞/cr^的人飼養(yǎng)細胞，c)溫育hBS細胞約5至約30天，例如約7至約16天或約7至約IO天，期間以規(guī)則的時間間隔更換培養(yǎng)基，d)可選地，從步驟a)開始重復至多5次，以便獲得均一的未分化hBS細胞集落。均一的集落意指在整個集落區(qū)域內(nèi)具有平均的細胞密度且沒有堆積結(jié)構(gòu)的集落。步驟a)中的解離和步驟c)中的培養(yǎng)基更換基本上如在上文所述的增殖方法的步驟ii)中的解離和步驟iv)—樣來進行。然而，本發(fā)明所提供的一項改進是，必需的調(diào)整程序(如果根本上有的話)是短的，并且可在許多目前已存在的根據(jù)例如W003055992建立和培養(yǎng)的hBS細胞系上進行。因此，如果包括步驟d),則它可以進行至多5次，例如，至多4次，至多3次，至多2次。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，如上面定義的用于在培養(yǎng)系統(tǒng)中增殖hBS細胞的方法包括下列步驟i)施行適應程序，其包括下列步驟a)通過使用一種或多種解離劑來將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液，b)按照至少1:3的分傳比將所述單細胞懸浮液分配至一個或多個培養(yǎng)容器中，所述培養(yǎng)容器含有密度為至少50，000細胞/ci^的人伺養(yǎng)細胞，c)溫育hBS細胞約5至約30天，例如約7至約16天或約7至約10天，期間以規(guī)則的時間間隔更換培養(yǎng)基，d)從步驟a)開始重復至多5次，以便獲得均一的未分化hBS細胞集落，ii)通過使用一種或多種解離劑，例如TrypLETMSelect,將hBS細胞解離成單細胞懸浮液，iii)按照至少1:4,例如至少1:5的分傳比將所述單細胞懸浮液分配至一個或多個培養(yǎng)容器中，所述培養(yǎng)容器含有密度為至少50,000細胞/cm2的人飼養(yǎng)細胞，iv)溫育hBS細胞約3至約25天，期間定期更換培養(yǎng)基，v)從步驟ii)開始重復至少20次，以便增殖hBS細胞，并同時維持此類細胞的顯著特征。為、癉根據(jù)本發(fā)明的用于將祠養(yǎng)細胞與hBS細胞彼此分開的合適方法可包括下列步驟i)在接種之前，將飼養(yǎng)細胞暴露于磁性顆粒以獲得經(jīng)磁性修飾的飼養(yǎng)細胞；ii)在可選地更換培養(yǎng)基之后，在經(jīng)磁性修飾的飼養(yǎng)細胞上接種并隨后培養(yǎng)hBS細胞至少一天；iii)使飼養(yǎng)細胞和hBS細胞的混合群體與培養(yǎng)容器脫離，并且通過使用一種或多種解離劑例如TrypLESelect來將所述群體解離成單細^5包懸浮液，和iv)通過施加磁力來將飼養(yǎng)細胞與hBS細胞分來。所述方法中的分離效率可以是至少50%,例如至少70%，至少80%、至少90%、至少99%，其中分離效率意指被施加的磁力所吸引的銅養(yǎng)細胞總數(shù)目的百分比。蹤掙在齡#為了研究根據(jù)本發(fā)明所獲得的hBS細胞是否維持了hBS細胞的顯著特征，將Cellartis，hBSC系SA001和SA121轉(zhuǎn)移到本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中并根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)20~40連績代。在第20代及以上時，徹底表征所述hBS細胞。用顯微鏡評估單個細胞的形態(tài)學和集落的形態(tài)學，其揭示出了hBS細胞及其集落的正常形態(tài)學(圖1)。使用免SSEA-3，SSEA-4，Tral-60，Tral-81，SSEA-1)(實施例7，圖2和圖5)。通過核型分析和FISH分析施行的遺傳表征揭示出，核型維持了超過20代(實施例8，圖3和圖5)。通過在SCID小鼠中形成畸胎瘤來評估根據(jù)本發(fā)明所獲得的hBS細胞的多能性，其揭示出hBS細胞在超過20代后為多能的未分化的hBS細胞(實施例9，圖4和圖5)。其他對根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的hBS細胞進行表征的例子可以是克隆存活的分析，例如對以不同的培養(yǎng)物組合和參數(shù)(例如，飼養(yǎng)細胞類型和密度、解離劑和暴露于解離劑的時間)接種的相同數(shù)目的單細胞施行集落形成測定法。本發(fā)明中鑒定的兩個重要的參數(shù)是i)解離劑的選擇，其傾向于對于所形成的集落的數(shù)目而言具有重要性，和ii)飼養(yǎng)細胞類型的選擇，其傾向于對于所形成的克隆在處于未分化狀態(tài)方面的品質(zhì)而言具有重要性。分化等級(gradeofdifferentiation)可依次通過顯微鏡中的形態(tài)學來進行分析，并且可能與先前完成的關于已知的未分化和分化標記物的標i己物表達分析相關聯(lián)?？蛇M一步就其端粒酶活性來表征干細胞和胚泡衍生干細胞，所述端粒酶活性可以用例如稱作TelomerasePCRELISA試劑盒(Roche)的試劑盒來進行測試。該試劑盒利用端粒酶的內(nèi)在活性，其中通過經(jīng)聚合酶鏈式反應(PCR)對產(chǎn)物進行擴增，和用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)對其進4亍檢測。端粒酶活性也可以通過QPCR來測定。此外本發(fā)明中的細胞分化狀態(tài)可以通過關于特定基因的QPCR來進行測試。以下簡短描述了其是如何實施的?？刹捎脵C械方法使未分化的或分化的hBS細胞集落作為完整集落與培養(yǎng)板脫離，并在PBS中洗滌和貯存于-80。C。進一步地，可根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用例如QiagenRNeasyMiniKit來提取RNA。使用合適的試劑盒，例如Bio-RadiScriptFirstStrandSynthesisKit(根據(jù)生產(chǎn)商的說明書)，在Rotorgene3000(CorbettResearch)中進行逆轉(zhuǎn)錄，并在合適的條件下進行QPCR。可在相同的輪回中定量所有基因，并且如果可能的話，可以通過基于遺傳標記物計算獨個樣品的數(shù)學指數(shù)(mathematicalindices)來比較幾個樣品的分化狀態(tài)。(更詳細的方案描述于WO2006094798中。)在本文所呈獻的發(fā)明中所使用的獨個組分，例如飼養(yǎng)細胞、培養(yǎng)基和胚泡，以及根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的hBS細胞系，可以在使用前就人病原體進行測試，例如，支原體、1和2型人免疫缺陷病毒、乙型和丙型肝炎、巨細胞病毒、l和2型單純皰滲病毒、EB病毒和人乳頭狀瘤病毒。不存在人病原體對于hBS細胞系和分化的細胞或來源于此類細胞系的其他生物材料的任何臨床用途來說是重要的。本發(fā)明的其他方面在如下所迷的本發(fā)明的其他方面中，在上述主要方面下所討論的細節(jié)和詳情應當能夠比照適用。根據(jù)本發(fā)明獲得的hBS細胞可經(jīng)歷其他用于操作和/或分析hBS細胞的程序。例如，根據(jù)本發(fā)明獲得的hBS細胞系可用于制備分化的細胞。此外，根據(jù)本發(fā)明的hBS細胞或細胞系能夠經(jīng)歷凍融。在一種特定的實施方案中，在本發(fā)明中獲得的hBS細胞系可根據(jù)先前由Celiartis(WO2004098285)所呈獻的玻璃化(vitrification)方法進行凍融。為了提高hBS細胞培養(yǎng)物的均一性，本發(fā)明中獲得的細胞可以是如W02005059116中所描述的克隆衍生化(clonalderivation)的對象。此外，根據(jù)本發(fā)明獲得的hBS細胞可轉(zhuǎn)移至如WO2004099394中所描述的無飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)。由本申請人于別處描述的用于確定例如hBS細胞的分化狀態(tài)的QPCR方法可應用于根據(jù)本發(fā)明獲得的hBS細胞或其衍生物，例如已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明獲得并隨后經(jīng)歷細胞分化程序的細胞。在本段中提及的專利申請通過提及而合并入本文。本發(fā)明使得可能在傳代時將hBS細胞集落解離成單細胞，這提供了幾項超越現(xiàn)有培養(yǎng)系統(tǒng)和方法的改進。以下概述了幾項根據(jù)本發(fā)明獲得的hBS細胞特別適合用于的應用，以進一步強調(diào)本發(fā)明所提供的益處和改進。與現(xiàn)有培養(yǎng)系統(tǒng)和方法相比較，本發(fā)明有助于hBS細胞的增殖，這是因為本發(fā)明使大的分傳比成為可能，從而與現(xiàn)有方法相比較允許更大程度的hBS細胞數(shù)量的擴張。這意味著，本發(fā)明提供了改進的關于按比例擴大hBS細胞的擴張規(guī)模的可能性。由于本發(fā)明而成為可能的在傳代時獲得單細胞懸浮液和高分傳比這一組合使得能夠?qū)崿F(xiàn)hBS細胞的可按比例變化的(scalable)生產(chǎn)，這還可以成為自動化的對象。因此，可按比例變化的生產(chǎn)可以通過本發(fā)明程序的完全或部分自動化來實現(xiàn)，由此提供了節(jié)約時間和費用的用于增殖hBS細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)和方法。因此，本發(fā)明的一個實施方案涉及利用本文所公開的用于增殖hBS細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)和/或方法來進行hBS細胞的可按比例變化的生產(chǎn)。在本發(fā)明的該實施方案中所使用的所述一種或多種解離劑可包括TrypLESelect、AccutaseTM和Accumax中的至少一種。本發(fā)明的另一實施方案是，使用TrypLESelect、AccutaseTM和/或AccumaxTM用于hBS細胞的可按比例變化的生產(chǎn)。用于按比例擴大培養(yǎng)的hBS細胞的生產(chǎn)和操作可采用新穎的用于大批培養(yǎng)(bulkculture)的培養(yǎng)系統(tǒng)，例如多孔培養(yǎng)板、多層培養(yǎng)瓶和生物反應器模塊。根據(jù)我們的系統(tǒng)，hBS細胞或源自hBS細胞的細胞在多孔形式的培養(yǎng)板、多層培養(yǎng)瓶或生物反應器模塊中的的制備、處理和分析不需要人工選擇和顯微操作，并因此能夠利用自動儀器化來按比例擴大和自動化。合適的自動儀器可基于XYZ計量給料頭(dispensinghead)，它使得能夠向培養(yǎng)容器例如液體操作站中吸移入和從其中吸移出液體，或者可以基于在培養(yǎng)容器和吸移管的操作期間模擬人的運動的機械手。在自動儀器系統(tǒng)內(nèi)，環(huán)境參數(shù)，例如溫度、營養(yǎng)供應、pH、壓力、剪切力和氧氣，應當維持在最佳限度內(nèi)。達到作為在根據(jù)本發(fā)明獲得的單細胞懸浮液中的單細胞的hBS細胞，使得能夠利用已知的定量程序和裝置來對hBS細胞進行精確定量，例如，NucleoCounter、HemocytometerManualCount、FlowcytometerAutomatedCount。這樣的定量是重要的，以便能夠標準化和改進hBS細胞可能經(jīng)歷的所有類型程序。此外，在傳代時使hBS細胞成為單細胞還使得這些細胞能夠經(jīng)歷本領域中已知的不同的細胞分離和細胞分選技術，例如，密度梯度介質(zhì)、基于抗體的層析法或抗體包被的磁珠，例如為了將hBS細胞與飼養(yǎng)細胞的殘余物分開。備選地，在步驟ii)中獲得的hBS細胞的單細胞懸浮液可經(jīng)歷不同種類的分選技術，例如，F(xiàn)ACS(熒光自動細胞分選法)或磁珠分選法、密度梯度離心、(親和)層析分離，例如為了將經(jīng)轉(zhuǎn)染的hBS細胞與未轉(zhuǎn)染的hBS細胞分開。在本發(fā)明中所描述和產(chǎn)生的單細胞溶液中的hBS細胞可以是用于下列過程的優(yōu)良起點，即進行有限稀釋克隆(limitingdilutioncloning)以從hBS細胞系中產(chǎn)生具有獨特特征的克隆。此外，為了進一步促進根據(jù)本發(fā)明所培養(yǎng)的hBS細胞的利用，可以從祠養(yǎng)細胞中分離出hBS細胞。在下文中，描述了一種這樣的分離方法，但無意對于其他可能的方法而言限制了范圍。用于從飼養(yǎng)細胞中分離hBS細胞的一種可能方法是，允許小的鐵顆粒摻入所述細胞類型之一中。這樣的摻入可以通過細胞自發(fā)完成(例如通過胞吞作用或吞噬作用)，或者通過電穿孔完成。細胞可在接種前暴露于懸浮于培養(yǎng)基中的合適的鐵顆粒。伺養(yǎng)細胞在暴露于鐵顆粒之前可以是經(jīng)過絲裂霉素C處理的或者以備選的方式在有絲分裂方面停滯的。鐵顆?？梢跃哂袛?shù)種類型或標號(brand)。它們還可以是Fe2+離子或Fe3+離子或其混合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用了Endorem。鐵顆粒還可具有1.0nm至50nm的直徑，例如2.0和40nm之間的直徑，4.0和30nm之間的直徑。4失顆粒的濃度可以在0.1ug/ml和560ug/ml之間變化，例如0.2至300ug/ml，0.5至100ug/ml，0.75至10ug/ml，1.0至3.0ug/ml。細胞可暴露于含鐵的溶液約l分鐘至約48小時，例如約20分鐘至約12小時，例如約60分鐘至約5小時，例如約2至3小時。在暴露于磁性顆粒后，可將飼養(yǎng)細胞接種入培養(yǎng)容器中并更換培養(yǎng)基。一旦形成了層并且直至在接種飼養(yǎng)細胞后至少一周，就將hBS細胞的單細胞溶液接種在飼養(yǎng)細胞上?？蓪BS細胞保持培養(yǎng)在含鐵的飼養(yǎng)細胞上至少1天，例如至少2、至少4、至少7、至少10、至少20天。進一步地，分離可通過下列方式來進行如上所迷產(chǎn)生混合細胞群體的單細胞懸浮液，并隨后將所述細胞懸浮液暴露于磁力。該磁力可來源于尺寸與其中保持有待分離的細胞的容器或管相容的任何合適的磁體。所述分離的一種可能的概要描述于實施例13中。根據(jù)本發(fā)明獲得的hBS細胞還特別適合于經(jīng)歷細胞轉(zhuǎn)染程序，這是因為hBS細胞的單細胞狀態(tài)避免了電穿孔過程中的細胞融合，由此避免了混合的克隆和改善了轉(zhuǎn)染效率。因此，在本發(fā)明的一種實施方案中，所獲得的hBS細胞經(jīng)歷細胞轉(zhuǎn)染程序，例如，通過使用病毒試劑、lipofectamin、電穿孔、磷酸鉀介導，以便獲得經(jīng)遺傳修飾的hBS細胞。hBS細胞的遺傳修飾可用于數(shù)種應用，例如，用作報告基因，用于基因敲入和基因敲除，其在例如藥物發(fā)現(xiàn)中的開發(fā)性(developmental)測定法和測試中使用，和用于毒性測試，以及用作疾病模型。此外，根據(jù)本發(fā)明獲得的hBS細胞適合用于多孔平板測定法中，因為所獲得的單細胞懸浮液可以容易地均勻地分配在多孔平板中。因此，本發(fā)明的hBS細胞的單細胞懸浮液可用于多孔平板測定法中，例如以便進行不同化合物的毒性測試或者在藥物開發(fā)程序中鑒定藥物候選物。卓勿應,者孕濕本發(fā)明進一步涉及hBS細胞的單細胞懸浮液，當其經(jīng)歷如上所述的用于增殖此類細胞的方法時，所述單細胞懸浮液能夠存活并維持hBS細胞的顯著特征超過20代，例如，超過25代，超過30代，超過35代或超過40代。雄勿森本發(fā)明進一步涉及hBS細胞系，當其經(jīng)歷如上所述的用于增殖此類細胞的方法時，所述hBS細胞系能夠存活并維持hBS細胞的顯著特征超過20代，例如，超過25代，超過30代，超過35代或超過40代。途在某些情況下，可能有利的是將在本發(fā)明的單細胞懸浮液中的細胞接種到飼養(yǎng)細胞上，其中飼養(yǎng)細胞以例如低于約50，000細胞/cm2、約10，000細胞/cm2、約15，000細胞/cm2、約20，000細胞/cm2、約25，000細胞/cm2的低密度存在。這可能是恰當?shù)?，例如作為中間步驟，即在用于毒性測試的鑒別應用中或者在用于從hBS細胞系衍生出分化的細胞類型的系統(tǒng)中使用之前，在本發(fā)明中所描述的程序的最后或最終步驟。在這樣的應用中，當從飼養(yǎng)細胞中分離出hBS細胞時，低飼養(yǎng)細胞密度可能是有利的。旅^本《銀的試^盒在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種或多種試劑盒，其包含一種或多種根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)的組分。因此，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包含至少一種，例如至少兩種下述組分i)單hBS細胞群體ii)使用者手冊，其描述了用于增殖hBS細胞的方法。此外，本發(fā)明還涉及這樣的試劑盒，其包含包括i)單細胞群體的第一組分，和至少一種，例如至少兩種或至少三種下述組分ii)人飼養(yǎng)細胞，Hi)—種或多種用于將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液的解離劑，和iv)支持性培養(yǎng)基。在上述試劑盒中，單細胞群體可以來源于無異源物質(zhì)的衍生的hBS細胞系，并且任何其他組分ii)-iv)中的一種或多種可以是無異源物質(zhì)的。優(yōu)選地，本發(fā)明試劑盒的其他組分可以是根據(jù)對于本發(fā)明方法所描述的細節(jié)和詳情而描述了分離方法的使用者手冊和/或磁體。利用hFF和酶(TrypLESelect)作為單細胞進行培養(yǎng)和傳代的hBS細胞集落的形態(tài)學。a)在它們的第一次酶促解離后，使hBS細胞集落進行適應。b)在早期調(diào)整過程中觀察到的具有異質(zhì)細胞群體的區(qū)域(在新系統(tǒng)中第一次傳代)。c)聚集體的大小，即在酶解傳代過程中的單細胞。d)在hFF上的hBS細胞的單細胞懸浮液。e)在酶促解離后兩天，經(jīng)調(diào)整而適應于當前系統(tǒng)的hBS細胞。f)經(jīng)調(diào)整適應的hBS細胞集落。g)均一的hBS細胞集落(至右上)。h)具有hBS細胞集落的培養(yǎng)孔，總覽。比例尺為50(c)，100(a,b，g)，200(d),250(e，f),1.66mm(h)。癡么.在以下中，"SAOOlTrypLe"指來自Cellartis，s細胞系SAOOl的hBS細胞，其已通過使用TrypLESelectTM進行了增殖，和"SA002TE"指來自相同細胞系的hBS細胞，其已通過使用胰蛋白酶-EDTA進行了增殖。在使用TrypLESelect和胰蛋白酶-EDTA進行超過20次酶促傳代后，SAOOl的免疫組織化學染色就下列物質(zhì)進行染色的SAOOlTrypLe:Oct-4(a)、TRA-1-81(c)、SSEA-4(e)和堿性磷酸酶(g)。就下列物質(zhì)進行染色的SAOOlTE:Oct-4(b)、TRA-1-81(d)、SSEA-4(f)和堿性磷酸酶(h)。比例尺為100(a-g)。比例尺為250|nm(g)。在使用TrypLESelectTM進行25次傳代后，SA001的核型和FISH(a)來自SAOOlTrypLE的染色體是二倍體正常的。該圖顯示了代表性的核型。(b)SAOOlTE，二倍體正常的。(c，d)對來自SAOOlTrypLE(c)和SA001TE(d)的所選擇的染色體的FISH分析證明，這些細胞是XY和二倍體正常的，染色體X(藍色)、Y(金色)、13(紅色)、18(水綠色)和21(綠色)。射,SA001的體內(nèi)多能性測試。在使用TrypLESelect和胰蛋白酶-EDTA進行超過20次傳代后的畸胎瘤。在分別進行27次和22次酶促傳代后，來自SAOOlTrypLE(a，c，e)和SA001TE(b，d，f)的畸胎瘤的組織學分析。(a，b)神經(jīng)外胚層(外胚層)，(c，d)軟骨(中胚層)，(e，f)分泌上皮(內(nèi)胚層)比例尺為25(a，c，e)和50(b，d，f)。在使用TrypLESelectT"進行20次酶促單細胞傳代后，SAin的表征。(a)0ct-4免疫組織化學染色，(b)TRA-l-60，(c)SSEA-3，(d)SSEA-4，(e)堿性磷酸酶。(f)在進行20次單細胞酶促傳代后，SA1HTrypLE的二倍體正常的核型。(g-i):在23次傳代后源自SA1H的畸胎瘤(g)神經(jīng)外胚層(外胚層)，(h)軟骨(中胚層)，(i)分泌上皮(內(nèi)胚層)。比例尺a-e:100nm,g-i:50nm。使用TrypLESelect進行單細胞酶促傳代導致克隆存活提高。當在TrypLESelect處理后將細胞轉(zhuǎn)移到hFF上時，導致所形成的hBS細胞集落的數(shù)目與胰蛋白酶-EDTA處理相比而言增加到3倍(儼00.1)。如果將解離的hBS細胞鋪板在hFF上，則與如果將它們鋪板在mEF上相比而言導致良好集落的數(shù)目顯著增加(f0.2)。所顯示的數(shù)據(jù)是平均值+標準誤差(/=3)。窗7;培養(yǎng)一周后的hFF細胞。(A)顯示了收集在磁體上的hFF，和(B)顯示了在懸浮液中存在的少量剩余的hFF細胞。窗《,在人胚胎成纖維細胞(AmericanTypeCultureCollection,CCL-110ATCC,Manassas,VA)上進行的使用TrypLETMSelect的單細胞酶促傳代。實施例入逸犮成^舉敘敏匈#敘敏的潛#及斧為匈#惑^^##^逸從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(CRL-2429ATCC，Manassas,VA)獲得商購可得的hFF，并培養(yǎng)在補充有10%FBS(Invitrogen)和1%青霉素-鏈霉素的Iscove，s麵M(GibcoInvitrogenCorporation,Paisley,Scotland;http:〃www.invitrogen.com)中。使用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)以1:2和1:8之間的分傳比定期地(每周)對細胞進行傳代。hFF的匯合單層用絲裂霉素-C(Sigma)進行處理(10pg/ml，2.5小時)，并在補充有4ng/ml人重組堿性成纖維細胞生長因子(hrbFGF，Invitrogen)的VitroHESTM培養(yǎng)基中以70，000-80，000細胞/cm2的密度鋪板于經(jīng)0.1%明膠(Sigma)包被的IVF皿中。在第4代和第12代之間將hFF細胞用作飼養(yǎng)細胞。入^靡^^維勿應^潛#及#力匈#勿應^"^途從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCL-110ATCC，Manassas,VA)獲得商購可得的人胚胎成纖維細胞，并培養(yǎng)在補充有10%FBS(Invitrogen)和1%青霉素-鏈霉素的Iscove，sDMEM(GibcoInvitrogenCorporation，Paisley，Scotlandjhup://www.invUrogen.com)中。使用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)以1:2和1:8之間的分傳比定期地(每周)對細胞進行傳代。人胚胎成纖維細胞的匯合單層用絲裂霉素-C(Sigma)進行處理(10pg/ml，2.5小時)，并在補充有4ng/ml人重組堿性成纖維細胞生長因子(hrbFGF，Invitrogen)的VitroHESTM培養(yǎng)基中以70，000-80，000細胞/cm卩的密度鋪板于經(jīng)0.1%明膠(Sigma)包被的IVF皿中。在第4代和第12代之間將人胚胎成纖維細胞用作祠養(yǎng)細胞，圖8。人逸犮成^舉勿/敏匈參癡。敏^f^如勿應^將來自施行了包皮環(huán)切術的8周齡男孩的人包皮樣品無菌收集在含有2x慶大霉素的無菌IMDM(Invitrogen)中。將皮膚外植體置于含有IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen)、1。/。青霉素-鏈霉素(GibcoInvitrogenCorporation)和10%人血清的25cm2原代組織培養(yǎng)瓶(BectonDickinson)中。在大約10天后，建立了匯合單層。使用TrypLESelect(Invitrogen)對細胞進行連續(xù)傳代。在擴展后，就標準的一組人病原體(支原體、1型和2型HIV、乙型和丙型肝炎、巨細胞病毒、l型和2型單純皰滲病毒、EB病毒、人乳頭狀瘤病毒)對它們測試，所有結(jié)果均為陰性。紹夢〃^C^舉""-力o"《eJ建j^逸發(fā)4^舉勿應勿應^浙4匈參勿應^在鋪板無異源物質(zhì)的人成纖維細胞伺養(yǎng)細胞之前，在室溫下用0.r/fl重組人明膠(Fibrogen)包被經(jīng)組織培養(yǎng)基處理的孔至少1小時。然后將在IMDM、10。/。人血清和1%青霉素-鏈霉素中生長的無異源物質(zhì)的hFF003(第5代至第8代)細胞的匯合單層用絲裂霉素-C(Sigma)進行處理(10pg/ml,2.5小時)。將經(jīng)絲裂霉素-C處理過的銅養(yǎng)細胞在培養(yǎng)基中以200,000細胞/2.89cm2鋪板于IVF孔(BectonDickinson)中，所述培養(yǎng)基基于補充有10°/。(v/v)人血清、1%青霉素-鏈霉素、1%Glutamax、0.5mmol/Lp-巰基乙醇和1%非必需氨基酸(GibcoInvitrogenCorporation)的廳M(如上述)。在放置具有其內(nèi)部細胞團細胞及來源于其的細胞或hBS細胞的胚泡之前，將培養(yǎng)基更換為DMEM(如上述)，現(xiàn)在其補充有20。/。(v/v)人血清、4ng/mLhrbFGF、1%青霉素-鏈霉素、1%Glutamax、0.5mmol/LP-巰基乙醇和1%非必需氨基酸(GibcoInvitrogenCorporation)。(與實施例3中所述相同的培養(yǎng)基。)摔力W5r橫移_￡灕傻潛遂培#差如先前[Heins,Noakssson]及W003055992中所述，建立并表征了hBS細胞系SA001、SA002、SA002.5、SA121、SA167、SA348、SA461和SA502(CellartisAB，G6teborg，Sweden，http:〃www.cellartis.com)。這才羊的材料可以從CellartisAB獲得，也可以通過NIH干細胞登^己處http:〃stemcells.nih.gov/research/registry/獲得。CellartisAB有兩種hBS細胞系(SA001和SA002)和通過NIH可獲得的SA002的一個亞克隆(SA002.5)。這些hBS細胞系已被頻繁地用于本發(fā)明。所有所使用的hBS細胞系均是得到批準的并且由英國干細胞庫指導委員會(UKStemCellBankSteeringCommittee)進行了登記，以及SAOOl、SA002和SA002.5由MEXT(Japan)批準。在試驗之前，在IVF皿中將這些細胞系維持于在補充有4ng/mlhrbFGF的VUroHESTM培養(yǎng)基(VitrolifeAB，Kungsbacka，Sweden,http:〃www.vitrolife.com)中的經(jīng)絲裂霉素-C失活的mEF飼養(yǎng)細胞層上，并通過使用微毛細管作為切割和轉(zhuǎn)移工具進行手工切割。為了將hBS細胞從傳統(tǒng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)移至酶促解離中，除去所使用的培養(yǎng)基，并用PBS(Invitrogen)洗滌一次培養(yǎng)皿。然后向每個IVFja中,添力口體^p、為0.5mL的TrypLESelect(Invitrogen)、Accutase(Chemicon)或胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)。皿在37。C下進行溫育，直至hBS細胞集落的外部區(qū)域開始從飼養(yǎng)細胞層聚攏。然后通過用吸移管進行反復粉碎來將細胞片擊散成單細胞懸浮液，轉(zhuǎn)移到離心管中，并以400g離心5分鐘。棄去上清液，將hBS細胞粒狀沉淀重懸浮于新鮮VitroHESTM培養(yǎng)基中，并將單細胞懸浮液接種于IVFJni中，所述IVF皿含有失活的hFF的密集飼養(yǎng)細胞層。遞過^^斧為卓細應老浮濕遽^f傳^^迷存W力^勿應^雜炎潛崖為了進行酶促增殖，將hBS細胞維持于培養(yǎng)系統(tǒng)中，所述培養(yǎng)系統(tǒng)由高密度的hFF飼養(yǎng)細胞和補充有4ng/mlhrbFGF的VitroHES培養(yǎng)基組成。通過用PBS(Invitrogen)洗滌培養(yǎng)亞以除去培養(yǎng)基來起始酶促解離。然后向每個皿中加入體積為0.5mL的TrypLESelect(Invitrogen)、Accutase(Chemicon)或胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)。皿在37。C下進行溫育，直至hBS細胞集落的外部區(qū)域開始從祠養(yǎng)細胞層聚攏。然后通過用吸移管進行反復粉碎來將細胞片擊散成單細胞懸浮液。隨后將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到離心管中，并以400g離心5分鐘。棄去上清液，并將hBS細胞粒狀沉淀重懸浮于新鮮VitroHESTM培養(yǎng)基中。然后以在1:4或1:5和l::500之間的分傳比將細胞接種于新的IVF皿中，所迷IVF亞含有失活的hFF的密集飼養(yǎng)細胞層。在新系統(tǒng)中的最初幾次傳代過程中，在我們稱作調(diào)整程序的過程中，使用較低的分傳比。在不超過5次傳代后，以在U0和1:500之間的分傳比分割hBS細胞系。將培養(yǎng)物維持在處于37'C和95%濕度下的培養(yǎng)箱中。每2~3天用新鮮VitroHES+4ng/mlhrbFGF替換用過的培養(yǎng)基。根據(jù)各hBS細胞系的生長速度，每612天將細胞進行傳代。在提交本申請時，SA001和SA121細胞系都已經(jīng)培養(yǎng)超過了20代(其中維持了正常的核型)，并已進一步根據(jù)常規(guī)的緩慢冷凍方法在其補充有10%DMS0的正常培養(yǎng)基中進行了凍融。郝辨7力^勿應#義瘦逸織^夢和逸織/A夢為、浙在4%低聚曱醛中將hBS細胞培養(yǎng)物固定15分鐘，在0.5%trition溶液(Sigma-Aldrich)中滲透化5分鐘，并隨后用在PBS(Invitrogen)中的5^FBS進行封閉。細胞與一抗溶液一起在4。C下溫育過夜。所使用的一抗特異于0ct-4、TRA-l-60、TRA-1-81、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4(SantaCruzBiotechnology，SantaCruz，CA，http:〃www.southernbiotech.com)。在室溫下與綴合有FITC或Cy3的二抗(JacksonImmunoreserachLaboratories)—起溫育60分鐘。細胞核用DAPI(Sigma)進行復染。按照生產(chǎn)商(Sigma-Aldrich)的說明書，使用堿性磷酸酶活性檢測試劑盒來測定堿性磷酸酶的活性。使用NikonEclipseTE-2000U焚光顯孩t鏡來評估和記錄染色。在超過20代后，SA001和SA121都顯示出所有上述hBS細胞特征。對于核型分析，在秋水仙酰胺存在下溫育hBS細胞，用胰蛋白酶進行消化，固定，并安放在載玻片上。通過DAPI染色來使染色體可視化，使用配備有合適的濾鏡和軟件(CytoVision;AppliedImaging;SantaClaraCA，http://www,appliedimagingcorp.com)的倒置顯微鏡進行排列和記錄。對于熒光原位雜交(FISH)分析，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書并作較小修改，使用包含針對染色體12、13、17、18、21、X和Y的探針的商購可得的試劑盒。在配備有合適的濾鏡和軟件(CytoVision)的倒置顯微鏡下分析載玻片。在本發(fā)明的系統(tǒng)中培養(yǎng)超過20代后，SA001和SA121均顯示正常的核型。在更加高的代時，證實FISH是正常的。謬力^錄遂》V^f如早期所述[Heins等人]，通過在免疫缺陷小鼠(SCID)中的畸胎瘤形成來評估多能性。簡而言之，將未分化的hBS細胞集落機械切割成200x200-jum片，并通過外科手術將其置于重癥聯(lián)合SCID小鼠(C.B-17/lcrCr卜scidBR;CharlesRiverLaboratories)的腎囊下。8周后處死小鼠，切取胂瘤并在4%低聚甲醛中進行固定。在組織學上評估在經(jīng)蘇木精和伊紅染色的石蠟切片中是否存在來源于所有三種胚層的未分化的人組織，例如，神經(jīng)外胚層、軟骨和腸樣上皮。甚至在超過20代后，在來自在本發(fā)明系統(tǒng)中培養(yǎng)的SA001和SA121的畸胎瘤中均證實了所有三種胚層。在雜傻傳A系鍵力M細^系除上面提及的hBS細胞系SA001和SA121夕卜，hBS細胞系SA167和SA002也已成功轉(zhuǎn)移到并培養(yǎng)于如上所述的酶促傳代系統(tǒng)中。培養(yǎng)于所述酶促傳代系統(tǒng)中的hBS細胞系的特征示于下表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>縮寫p，酶促傳代次數(shù)；TE，月爽蛋白酶-EDTA;TrypLE，TrypLESelectjUndiff,未分化；ND，未測定；Endo，內(nèi)胚層；Ecto，外胚層；Meso，中胚層。本才法W獲邀'/么T重茇^;^爭遽遂^^所發(fā)明的用于酶促培養(yǎng)hBSC系的一個巨大好處是，已證實它能夠穩(wěn)定、強有力和容易地繁殖數(shù)種細胞系。七種不同的hBSC系已被重復用于評估和建立所述方法。此外，還證實對于數(shù)種不同的hBS細胞系，所發(fā)明的用于建立hBS細胞系以進行隨后的培養(yǎng)方法的調(diào)整程序也是穩(wěn)定和快速的。每種細胞系建立的次數(shù)顯示于括號中SA001(6)，SA002(5)，SA002.5(>3)，SA167(3)，SA348(>4),SA461(>10)和SA502(2)。在工業(yè)化細胞培養(yǎng)生產(chǎn)中，可以施朽"限據(jù)本發(fā)明的連續(xù)建立來按比例擴大hBS細胞系的培養(yǎng)。紹辨"桌遂承4W定法為了測試所述酶促傳代和培養(yǎng)系統(tǒng)的支持能力，通過使用TrypLETMSelect、AccutaseTM或胰蛋白酶-EDTA將傳統(tǒng)培養(yǎng)的hBS細胞(在mEF上，采用機械傳代)解離成單細胞。稀釋所述hBS細胞，并以兩種密度接種入在新的IVF皿中的hFF或mEF上，產(chǎn)生約350和700個hBS細胞/cm2。每2-3天更換培養(yǎng)基。約一周后，除去培養(yǎng)基，并用lxPBS(Gibco，invitorgen)洗滌細胞，隨后才艮據(jù)生產(chǎn)商(Sigma-Aldrich)的說明書進行堿性磷酸酶染色。對從所有四個測試組中獲得的hBS細胞集落的數(shù)目進行計數(shù)。對于未分化的hBS細胞集落的數(shù)目的半定量評估，如果當在倒置顯微鏡中目視觀察時超過50%的集落是未分化的，則這些集落被記為陽性。這些試驗一式兩份地進行，并重復三次。將hBS細胞系SA002.5用于這些試驗。不管使用何種酶，在hFF上大約90%的集落被評為未分化的(參見圖6)。在200個經(jīng)評估的用AccutaseTM處理的集落中，191個被判定為未分化的。作為比較，如果將解離的hBS細胞鋪板在mEF上，則獲得良好集落數(shù)目的顯著降低；只有約60%的集落被評為未分化的(圖6)。在所測試的兩種稀釋物中，品質(zhì)差異是類似的。因此，使用作為飼養(yǎng)細胞的hFF和用于進行解離的TrypLESelect似乎是用于促進未分化的多能hBS細胞的克隆存活的最有利組合。，辦W冉y(tǒng)^^遂摒在^C力"S勿應哞為、岸力？尸一個裝有匯合的hFF細胞的T-75瓶用絲裂霉素C處理2-3小時以抑制細胞增殖。在絲裂霉素C處理后，hFF用lxPBS洗滌多次，之后通過使用lx胰蛋白酶-EDTA或lxTrypLESelect將其解離成單細胞。將細胞的等分試樣在血細胞計數(shù)器中進行計數(shù)，并將細胞稀釋至適當濃度。如果待測試不同濃度的磁性顆粒(Endorem)，則將細胞懸浮液分至不同的管中，然后將不同量的磁性顆粒加入至管中。然后在管中混合hFF和磁性顆粒，之后將懸浮液鋪板在經(jīng)明膠包被的IVF皿(Falcon)中。每個IVF皿接種大約200，000個hFF細胞。所測試的Endorem濃度在5.6ug至560ug/孔和200，000細胞的范圍內(nèi)，其相應于2.8ug/ml至280ug/ml。在接種后1-2天，更換100°/。培養(yǎng)基，這除去了大部分未結(jié)合的和未胞吞的鐵顆粒。更換培養(yǎng)基后大約24小時，將hBS細胞添加至具有hFF銅養(yǎng)細胞的板上。為了將hFF收集在磁體上，在lxPBS中漂洗細胞一次，并用胰蛋白酶-EDTA或lxTrypLESelect解離成單細胞。然后將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到eppendorf管中并置于與磁體緊密接觸。讓細胞附著到磁體上幾分鐘，然后從管中除去剩余的溶液。之后，從磁體上移去管，并向管中加入合適的培養(yǎng)基或lxPBS,然后將含有飼養(yǎng)細胞的溶液重懸浮以進行細胞計數(shù)和驗證分離效率。在磁體上捕獲了至少90%的hFF(90%的分離效率)(參見圖7)，不管所測試的不同濃度。當將經(jīng)酶促傳代的hBS細胞接種在磁性的hFF上時，hBS細胞附著、增殖并形成細胞集落(數(shù)據(jù)未顯示)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage45</formula>權利要求1.用于增殖人胚泡衍生干(hBS)細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，其包括i)密度為至少50,000細胞/cm2的人飼養(yǎng)細胞，ii)一種或多種用于將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液的解離劑，和iii)支持性培養(yǎng)基，該培養(yǎng)系統(tǒng)通過在每個連續(xù)傳代中將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液而使得可能在延長的時間段內(nèi)增殖hBS細胞，并同時維持hBS細胞的顯著特征。2.根據(jù)權利要求1的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中人飼養(yǎng)細胞的密度為約50，000至約500，000細胞/cm2，例如，約50,000至約400，000細胞/cm2，約50,000至約300，000細胞/cm2，約50，000至約200，000細胞/cm2，約60，000至約200，000細胞/cm2，約70，000至約200，000細胞/cm2。3.根據(jù)權利要求1或2中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述人飼養(yǎng)細胞來源于人組織。4.根據(jù)權利要求3的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述人組織來源于胚胎、胎兒、新生兒、青少年或成人組織。5.根據(jù)權利要求3或4中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述人組織來源于皮膚、臍帶、肌肉、肺、上皮、胎盤、輸卵管、腺、基質(zhì)或乳房，所述皮膚包括包皮。6.根據(jù)前述權利要求中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述人飼養(yǎng)細胞在體外來源于，例如，hBS細胞或源自hBS細胞的細胞。7.根據(jù)前述權利要求中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述人飼養(yǎng)細胞來源于屬于由人成纖維細胞、纖維細胞、肌細胞、角質(zhì)形成細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞組成的組的細胞類型。8.根據(jù)前述權利要求中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述人飼養(yǎng)細胞是成纖維細胞。9.根據(jù)權利要求8的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述飼養(yǎng)細胞來源于人新生兒包皮成纖維細胞。10.根據(jù)權利要求6的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述源自hBS細胞的細胞是成纖維細胞或具有間充質(zhì)表型。11.根據(jù)前述權利要求中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述人祠養(yǎng)細胞來源于胚胎成纖維細胞、胚外內(nèi)胚層細胞、胚外中胚層細胞、胎兒成纖維細胞和/或纖維細胞、胎兒肌細胞、胎兒皮膚細胞、胎兒肺細胞、胎兒內(nèi)皮細胞、胎兒上皮細胞、臍帶間充質(zhì)細胞、胎盤成纖維細胞和/或纖維細胞、胎盤內(nèi)皮細胞、出生后人包皮成纖維細胞和/或纖維細胞、出生后肌細胞、出生后皮膚細胞、出生后內(nèi)皮細胞、成人皮膚成纖維細胞和/或纖維細胞、成人肌細胞、成人輸卵管內(nèi)皮細胞、成人腺子宮內(nèi)膜細胞、成人基質(zhì)子宮內(nèi)膜細胞、成人乳腺癌實質(zhì)細胞、成人內(nèi)皮細胞、成人上皮細胞或成人角質(zhì)形成細胞。12.根據(jù)前述權利要求中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述人飼養(yǎng)細胞在生長方面被失活。13.根據(jù)權利要求12的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述人飼養(yǎng)細胞通過絲裂霉素處理而在生長方面被失活。14.根據(jù)權利要求12的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述人祠養(yǎng)細胞通過輻射而在生長方面被失活。15.根據(jù)前述權利要求中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中在接種所述hBS細胞之前約1至約10天，例如，約1至約5天，約2至約4天接種所述人飼養(yǎng)細胞。16.根據(jù)權利要求15的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中在接種所述hBS細胞之前，將培養(yǎng)基更換至少一次，例如，至少兩次，至少三次，至少四次或至少五次。17.根據(jù)前述權利要求中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述一種或多種解離劑是酶。18.根據(jù)權利要求17的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述酶是蛋白水解酶。19.根據(jù)權利要求17或18中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述酶是膠原溶解酶。20.根據(jù)權利要求17-19中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述酶選自胰蛋白酶、胰蛋白酶樣、分散酶、分散酶樣、鏈霉蛋白酶、鏈霉蛋白酶樣、膠原酶、膠原酶樣和基質(zhì)金屬蛋白酶。21.根據(jù)權利要求17-20中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述酶是重組的酶。22.根據(jù)前述權利要求中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述一種或多種解離劑是螯合劑。23.根據(jù)權利要求22的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述螯合劑是二價陽離子螯合劑。24.根據(jù)權利要求22或23中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述螯合劑選自EDTA、EGTA和HEDTA。25.根據(jù)前述權利要求中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述一種或多種解離劑是至少兩種，例如至少三種，至少四種，至少五種解離劑的組合。26.根據(jù)權利要求25的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述解離劑組合包括一種或多種酶和一種或多種螯合劑。27.根據(jù)權利要求25或26中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述螯合劑組合是無異源物質(zhì)的。28.根據(jù)權利要求25-27中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述解離劑《且合選自商購可4尋的由TrypLESelect、Accutase;^AccumaxTM^SL>^的組合。29.根據(jù)前述權利要求中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述支持性培養(yǎng)基選自DMEM和IMDM。30.根據(jù)前述權利要求中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述支持性培養(yǎng)基補充有約0.5至約1000ng/mlhrbFGF，例如，約1至約500ng/mlhrbFGF,約2至約200ng/ml或約4至約100ng/mlhrbFGF。31.根據(jù)前述權利要求中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述支持性培養(yǎng)基補充有約1至約40°/。血清，例如，約5至約20%血清，例如約10%血清。32.根據(jù)權利要求31的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述血清是FBS或人血清。33.根據(jù)前述權利要求中任一項的培養(yǎng)系統(tǒng)，所述培養(yǎng)系統(tǒng)包括i)密度為至少70，000細胞/cm卩的人新生兒包皮飼養(yǎng)細胞，ii)用于將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液的TrypLESelect,和Hi)補充有至少4ng/mlhrbFGF的VUroHES支持性培養(yǎng)基,該培養(yǎng)系統(tǒng)通過在每個連續(xù)傳代中將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液而使得可能在延長的時間段內(nèi)增殖hBS細胞，并同時維持hBS細胞的顯著特征。34.用于在根據(jù)權利要求1-33中任一項所定義的培養(yǎng)系統(tǒng)中增殖hBS細胞的方法，所述方法包括下列步驟i)可選地，施行適應程序，以使從主細胞系獲得的hBS細胞適應該培養(yǎng)系統(tǒng)，ii)通過使用一種或多種解離劑來將hBS細胞解離成單細胞懸浮液，Hi)按照至少1:4的分傳比將所述單細胞懸浮液分配至一個或多個培養(yǎng)容器中，所述培養(yǎng)容器含有密度為至少50，000細胞/cW的人祠養(yǎng)細胞，iv)溫育hBS細胞約3至約25天，期間定期更換培養(yǎng)基，v)從步驟ii)開始重復n次，其中n為至少l的整數(shù)，以便增殖hBS細胞，并同時維持此類細胞的顯著特征。35.根據(jù)權利要求34的方法，其進一步包括下列步驟vi)分析在步驟iv)中獲得的細胞以觀察hBS細胞的顯著特征是否得到維持，vii)如果hBS細胞的顯著特征得到了維持，從步驟ii)開始重復。36.根據(jù)權利要求34或35中任一項的方法，其中n是至少5，例如，至少10，至少15，至少20，至少25,至少30，至少35,或至少40。37.根據(jù)權利要求34-36中任一項的方法，其中在步驟ii)中將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液通過用一種或多種解離劑處理hBS細胞集落來完成。38.根據(jù)權利要求34-37中任一項的方法，其中在步驟iii)之前減少所述一種或多種解離劑的效力。39.根據(jù)權利要求38的方法，其中通過物理去除所述一種或多種解離劑、稀釋所述一種或多種解離劑、加入所述一種或多種解離劑的一種或多種抑制劑、過量加入所述一種或多種解離劑的一種或多種底物、或者所述一種或多種解離劑的固有自我抑制來減少所述一種或多種解離劑的效力。40.根據(jù)權利要求34-39中任一項的方法，其中所述分傳比為約1:4至約1:5000,例如，約1:20至約1:1000，約1:50至約1:500。41.根據(jù)權利要求40的方法，其中所述分傳比為1:20。42.根據(jù)權利要求34-41中任一項的方法，其中將在步驟iii)中獲得的hBS細胞溫育約3至約25天，例如，約4至約20天，或約6至約12天。43.根椐權利要求34-42中任一項的方法，其中在步驟iv)中的培養(yǎng)基更換每周進行約1至約14次，例如，每周進行約2至約6次，每周進行約2至約4次，例如每周進行3次。44.根據(jù)權利要求34-43中任一項的方法，其中所述適應程序包括下列步驟a)通過使用一種或多種解離劑來將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液，b)按照至少1:3的分傳比將所述單細胞懸浮液分配至一個或多個培養(yǎng)容器中，所述培養(yǎng)容器含有密度為至少50，000細胞/cm2的人詞養(yǎng)細胞，c)溫育hBS細胞約5至約30天，期間以規(guī)則的時間間隔更換培養(yǎng)基，d)可選地，從步驟a)開始重復至多5次，以便獲得均一的未分化hBS細胞集落。45.根據(jù)權利要求44的方法，其中將在步驟c)中獲得的hBS細胞溫育約5至約30天，例如，約7至約16天或約7至約10天。46.根據(jù)權利要求44或45中任一項的方法，其中包括步驟d)。47.根據(jù)權利要求46的方法，從步驟a)開始的重復進行至多5次，例如，至多4次，至多3次，至多2次。48.根據(jù)權利要求44-47中任一項的方法，其中在步驟c)中的培養(yǎng)基更換每周進行約1至約14次，例如，每周進行約2至約6次，每周進行約2至約4次，例如每周進行3次。49.根據(jù)權利要求34-48中任一項的方法，所述方法包括下列步驟i)施行適應程序，其包括下列步驟a)通過使用一種或多種解離劑來將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液，b)按照至少l:3的分傳比將所述單細胞懸浮液分配至一個或多個培養(yǎng)容器中，所述培養(yǎng)容器含有密度為至少50，000細胞/cm2的人伺養(yǎng)細胞，c)溫育hBS細胞約5至約30天，例如約7至約16天或約7至約10天，期間以規(guī)則的時間間隔更換培養(yǎng)基，d)從步驟a)開始重復至多5次，以便獲得均一的未分化hBS細胞集落，ii)通過使用一種或多種解離劑，例如TrypLE"1Select,將hBS細胞解離成單細胞懸浮液，iii)按照至少1:4的分傳比將所述單細胞懸浮液分配至一個或多個培養(yǎng)容器中，所述培養(yǎng)容器含有密度為至少50，000細胞/(^2的人銅養(yǎng)細胞，iv)溫育hBS細胞約3至約25天，期間定期更換培養(yǎng)基，v)從步驟ii)開始重復至少20次，以便增殖hBS細胞，并同時維持此類細胞的顯著特征。50.hBS細胞的單細胞懸浮液，其中低于10%,例如低于5%，低于2%或低于1%的細胞顯示為細胞聚集體，當經(jīng)歷根據(jù)權利要求34-49中任一項所定義的用于增殖此類細胞的方法時，所述單細胞懸浮液能夠存活并維持hBS細胞的顯著特征超過20代，例如，超過25代，超過3G代，超過35代或超過40代。51.hBS細胞的無異源物質(zhì)的單細胞懸浮液，其中低于10%，例如低于5°/，低于2%或低于1%的細胞顯示為細胞聚集體，當經(jīng)歷根據(jù)權利要求34-49中任一項所定義的用于增殖此類細胞的方法時，所迷單細胞懸浮液能夠存活并維持hBS細胞的顯著特征超過20代，例如，超過25代，超過30代，超過35代或超過40代。52.來自于hBS細胞的改良細胞系，當經(jīng)歷根據(jù)權利要求34-49中任一項所定義的用于增殖此類細胞的方法時，所迷改良細胞系能夠存活并維持hBS細胞的顯著特征超過20代，例如，超過25代，超過30代，超過35代或超過40代。53.根據(jù)權利要求1-33中任一項所定義的培養(yǎng)系統(tǒng)用于大規(guī)模生產(chǎn)hBS細胞的用途。54.根據(jù)權利要求53的培養(yǎng)系統(tǒng)的用途，其中所迷一種或多種解離劑包括TrypLETMSelect、Accutase—Accumax中的至少一種。55.根據(jù)權利要求34-49中任一項所定義的方法用于大規(guī)模生產(chǎn)hBS細胞的用途。56.根據(jù)權利要求55的方法的用途，其中所述一種或多種解離劑包括TrypLETMSelect、Accutase~Accumax中的至少一種。57.蛋白7jc解酵侈'J:ft口TrypLESelect、Accutase—/ilAccumax用于大規(guī)模生產(chǎn)hBS細胞的用途。58.試劑盒，其包含至少一種，例如至少兩種下述組分i)通過根據(jù)權利要求34-49中任一項所定義的方法可獲得的單hBS細胞群體，ii)使用者手冊，其描述了用于增殖hBS細胞的方法。59.根據(jù)權利要求58的試劑盒，其中所述用于增殖hBS細胞的方法根據(jù)權利要求34-49中任一項所定義。60.試劑盒，其包含包括i)通過根據(jù)權利要求34-49中任一項所定義的方法可獲得的單細胞群體的第一組分，和至少一種，例如至少兩種或至少三種下述組分ii)人飼養(yǎng)細胞，iii)一種或多種用于將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液的解離劑，和iv)支持性培養(yǎng)基，其中，ii)-iv)根據(jù)權利要求2-33中任一項所定義。61.根據(jù)權利要求58-60中任一項的試劑盒，其中所述單細胞群體來源于無異源物質(zhì)的衍生的hBS細胞系，并且任何其他組分ii)-iv)中的一種或多種是無異源物質(zhì)的。全文摘要本發(fā)明涉及用于基于酶促解離成單細胞懸浮液來增殖人胚泡衍生干細胞(hBS細胞)的培養(yǎng)系統(tǒng)和方法。所述用于增殖人胚泡衍生干(hBS)細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)包括i)密度為至少50,000細胞/cm²的人飼養(yǎng)細胞，ii)一種或多種用于將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液的解離劑，和iii)支持性培養(yǎng)基，該培養(yǎng)系統(tǒng)通過在每個連續(xù)傳代中將hBS細胞集落解離成單細胞懸浮液而使得可能在延長的時間段內(nèi)增殖hBS細胞，并同時維持hBS細胞的顯著特征。文檔編號C12N5/08GK101443445SQ200780016941公開日2009年5月27日申請日期2007年3月16日優(yōu)先權日2006年3月17日發(fā)明者C·埃勒斯特羅姆,H·賽伯,R·斯特瑞爾申請人:塞拉提斯股份公司