專利名稱：用于產(chǎn)生l-氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用細(xì)菌產(chǎn)生L-氨基酸的方法，更具體地，涉及產(chǎn)生L-氨基 酸如L-賴氨酸，L-蘇氨酸和L-谷氨酸的方法。L-賴氨酸和L-蘇氨酸可用于作 為動(dòng)物飼料，保健食品，氨基酸浸劑(amino acid infUsion)等的添加劑。L-谷氨 酸可用作食品調(diào)料(food seasoning)。
背景技術(shù)：
L-氨基酸已經(jīng)通過(guò)使用細(xì)菌的發(fā)酵方法進(jìn)行了工業(yè)化生產(chǎn)，所述細(xì)菌屬 于4豆^干菌屬C6revAacfen'M附)、才奉斥干菌屬(Co/3^e6""w^附)、，矣希氏菌屬 (&c/^n'c/7/a)等等。產(chǎn)生L-賴氨酸的方法在EP 0643135 B， EP 0733712 B, EP 1477565 A, EP 0796912 A, EP 0837134 A, WO 01/53459, EP 1170376 A,及WO 2005/010175中有描述。在這些方法中，使用的細(xì)菌菌抹有天然分離抹或其人 工突變林，也有經(jīng)重組DNA技術(shù)修飾從而增強(qiáng)L-氨基酸生物合成酶活性的 細(xì)菌菌才朱。乙酰-CoA合成酶催化從乙酸、輔酶A和ATP產(chǎn)生乙酰-CoA、焦磷酸和 AMP的反應(yīng)，其由acs基因編碼(JBacteriol. 1995 May; 177(10):2878-86.)。然 而，尚未報(bào)道增強(qiáng)乙酰-CoA合成酶的活性可以對(duì)L-氨基酸的產(chǎn)生有效。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供能夠有效產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌和使用該細(xì)菌有效產(chǎn) 生L-氨基酸的方法。通過(guò)在產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌中擴(kuò)增編碼乙酰-CoA合成酶的acs基因，改進(jìn)了 L-氨基酸的產(chǎn)生，從而完成本發(fā)明。 即，本發(fā)明如下。本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)生L-氨基酸的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培 養(yǎng)細(xì)菌，和從所述培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中收集L-氨基酸，其中所述細(xì)菌是屬于腸桿菌科CE"tera&cten'aceae family)的產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌，其經(jīng)修飾以增強(qiáng) 乙酰-CoA合成酶活性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的方法，其中通過(guò)增加編碼乙酰 -CoA合成酶的acs基因的拷貝數(shù)，或者通過(guò)修飾所述基因的表達(dá)調(diào)控序列， 來(lái)增強(qiáng)乙酰-CoA合成酶活性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的方法，其中所述acs基因選自下組(a) 包含SEQ ID NO: 3的核苷酸序列的DNA,和(b) 在嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO: 3的核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列，或者 與由所述核苷酸序列制備的探針雜交的DNA，其中所述DNA編碼具有乙酰 -CoA合成酶活性的蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的方法，其中L-氨基酸選自下組 L-賴氨酸，L-精氨酸，L-組氨酸，L-異亮氨酸，L-纈氨酸，L-亮氨酸，L-蘇氨 酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-色氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，及其組合。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的方法，其中所述細(xì)菌屬于埃希氏 菌屬,泛菌屬to—， 或腸桿菌屬era6acter)。優(yōu)選實(shí)施方案描述 在下文中，將詳述本發(fā)明。 <1>本發(fā)明的細(xì)菌本發(fā)明的細(xì)菌屬于腸桿菌科，具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力，并經(jīng)過(guò)了修飾 從而使乙酰-CoA合成酶(ACS)的活性增強(qiáng)。在本文中，術(shù)語(yǔ)"產(chǎn)生L-氨基酸 的能力"是指在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌時(shí)，在該培養(yǎng)基中以可收集的水平 產(chǎn)生和積累L-氨基酸的能力。本發(fā)明的細(xì)菌可能能夠產(chǎn)生多種L-氨基酸。L-氨基酸產(chǎn)生能力對(duì)于細(xì)菌可能是天然的，或者是通過(guò)如下方法獲得的通過(guò) 突變或重組DNA技術(shù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行修飾以賦予L-氨基酸產(chǎn)生能力。對(duì)L-氨基酸的種類沒(méi)有特別限制，其實(shí)例包括^ 咸性氨基酸如L-賴氨酸， L-鳥氨酸，L-精氨酸，L-組氨酸和L-瓜氨酸；脂肪族L-氨基酸如L-異亮氨酸， L-丙氨酸，L-纈氨酸，L-亮氨酸，和L-甘氨酸；羥基單氨基羧S殳(hydroxy monoaminocarboxylic acids)長(zhǎng)口 L-蘇氨酉交和L-絲氨酸；環(huán)習(xí)犬L-氨基酸3口 L-月甫氨 酸；芳香L-氨基酸如L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，和L-色氨酸；含硫L-氨基酸如L-半胱氨酸，L-胱氨酸，和L-曱辟u氨酸；以及酸性L-氨基酸如L-谷氨酸， L-天冬氨酸，L-谷氨酰胺，和L-天冬酰胺。本發(fā)明的細(xì)菌可能能夠產(chǎn)生兩種 或更多種的氨基酸。<1-1>賦予產(chǎn)生L-氨基酸的能力。在下文中，將敘述賦予產(chǎn)生L-氨基酸的能力的方法，以及能夠?qū)ζ滟x予 產(chǎn)生L-氨基酸能力的細(xì)菌的實(shí)例。但是，所述細(xì)菌并不限于此，只要其具有 產(chǎn)生L-氨基酸的能力即可?？蓪儆谀c桿菌科的細(xì)菌(包括那些屬于埃希氏菌屬或泛菌屬的細(xì)菌)用 作親本菌林，由其得到本發(fā)明的細(xì)菌。其它屬于腸桿菌科的細(xì)菌實(shí)例包括y-變形細(xì)菌(y-尸rafeoZ^"eha)如腸桿菌屬、克雷伯桿菌屬(《/^^'6//")、沙雷氏菌 屬CSerraWa)、歐文氏菌屬CEnWm'a)、沙門氏菌屬(Sa/wo"e〃a)和摩才艮氏菌屬可以利用Neidhardt等報(bào)道的埃希氏菌屬細(xì)菌((Backmann， B丄1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Esc/zen-c/z/a co// K-12, 第2460-2488頁(yè).表1.于F. D. Neidhardt (ed.), Esc/7en'c/2/a co// and 5b/wo"e〃a Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, ^Vashington, D.C.)， 3口大腸4干菌(^yc/7en'c/z/a co//)。荬予生型 大腸桿菌菌林的實(shí)例包括K-12林及其衍生抹(derivatives),大腸桿菌MG1655 菌抹(ATCC No. 47076),和W3110菌林(ATCC No. 27325)。這些菌抹可以從 美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection; ATCC)(地址P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108， 1， United States of America)獲得。腸桿菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括成團(tuán)腸桿菌agg/oweram)和產(chǎn)氣 腸桿菌eraZ ac/er ，泛菌屬纟田菌的實(shí)例包才舌Pa"toea a"awato 。近來(lái)，在某些情況下，根據(jù)對(duì)16S rRNA核苷酸序列的分析，將成團(tuán)腸桿菌重 新歸類為成團(tuán)泛菌agg/omera—, 尸朋toea 斯氏泛菌(尸a"toeaWe"HW^)，等等。因此，本發(fā)明的細(xì)菌可以屬于腸桿菌屬或泛菌屬， 只要?dú)w類在腸桿菌科中即可。當(dāng)使用基因工程技術(shù)培育時(shí)， 可以使用"""""to AJ13355菌抹(FERM BP-6614), AJ13356菌抹 (FERMBP-6615), AJ13601菌林(FERMBP-7207)及其衍生菌抹等。在分離時(shí) 將這些菌林鑒定并保藏為成團(tuán)腸桿菌，但是如上所述，根據(jù)對(duì)16S rRNA的 核苷酸序列的分析將這些菌林重新分類為Pa"toea a"朋afe?？梢詫a(chǎn)生L-氨基酸的能力賦予如上所述的親本菌林，如下。為了賦予產(chǎn)生L-氨基酸的能力，可以使用在腸桿菌屬細(xì)菌等的常規(guī)培育 中所使用的方法，如通過(guò)獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型的突變菌林，類似物抗性菌抹，或 代謝調(diào)控突變菌抹，或者通過(guò)構(gòu)建L-氨基酸生物合成酶的表達(dá)增強(qiáng)的重組菌 抹(Amino Acid Fermentation, Japan Scientific Societies Press, 第 一版，出版日 期1986年5月30日，第77-100頁(yè))。在本發(fā)明中，為賦予菌抹產(chǎn)生L-氨基 酸的能力，可以單獨(dú)地或以組合的形式賦予如營(yíng)養(yǎng)缺陷型、類似物抗性和代 謝調(diào)控等性質(zhì)。此外，可以增強(qiáng)一種或多種L-氨基酸生物合成酶的表達(dá)。此 外，可以將賦予如營(yíng)養(yǎng)缺陷型、類似物抗性和代謝調(diào)控突變這些性質(zhì)與增強(qiáng) L-氨基酸生物合成酶的表達(dá)組合。可如下獲得具有產(chǎn)生L-氨基酸能力的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌抹，L-氨基酸類 似物抗性菌抹，和代謝調(diào)控突變菌林。對(duì)親本菌抹或野生型菌抹進(jìn)行通常的 突變處理，如用X射線或紫外線照射，或者使用誘變劑(包括N-曱基-N'-竭基 -N-亞硝基胍(NTG)和乙基曱磺酸(EMS))處理，然后選擇表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)缺陷型、 類似物抗性或代謝調(diào)控突變并且具有產(chǎn)生L-氨基酸能力的菌林?；蛑亟M技術(shù)包括增強(qiáng)編碼涉及目標(biāo)L-氨基酸生物合成的酶的基因的表 達(dá)以及降低編碼涉及目標(biāo)L-氨基酸降解的酶的基因的表達(dá)。在下文中，將例示被賦予產(chǎn)生L-氨基酸的能力的細(xì)菌，但是在本發(fā)明的 方法中將使用到的細(xì)菌不限于這些實(shí)例。產(chǎn)生L-蘇氨酸的細(xì)菌用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-蘇氨酸的細(xì)菌的親本菌抹的實(shí)例包括，但不限 于，屬于埃希氏菌屬的菌抹，如大腸桿菌(E co//) TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996)(美國(guó)專利No. 5,175,107、美國(guó)專利No. 5,705,371)、大腸桿菌 472T23/pYN7 (ATCC 98081)(美國(guó)專利No.5,631，157)、大腸桿菌NRRL-21593 (美國(guó)專利No. 5,939,307)、大腸桿菌FERM BP-3756 (美國(guó)專利No. 5,474,918)、 大腸桿菌FERM BP-3519和FERM BP-3520 (美國(guó)專利No. 5,376,538)、大腸桿 菌MG442 (Gusyatiner等，Genetika (俄語(yǔ))，14， 947-956 (1978))、大腸桿菌 VL643和VL2055 (EP 1149911 A)，等等。TDH-6菌抹在thrC基因有缺陷，也是蔗糖同化型，并且ilvA基因有泄漏 突變(leaky mutation)。該菌株的rhtA基因也有突變，該突變賦予對(duì)高濃度蘇氨酸或高絲氨酸的抗性。B-3996菌抹包含pVIC40， pVIC40是通過(guò)將含有突 變的thrA基因的thrA*BC操縱子插入到由RSF1010獲得的載體中而獲得。 這種突變的thrA基因編碼的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氬酶I對(duì)蘇氨酸的反饋 抑制基本上是脫敏的。B-3996菌抹在1987年11月19日被保藏于All-Union Scientific Center of Antibiotics (全聯(lián)盟抗生素科學(xué)中心)(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russian Federation),登錄號(hào)為RIA 1867。該菌4朱也在 1987年4月7日保藏于俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms) (VKPM) (Russia, 117545 Moscow 1， Dorozhnyproezd. 1)，登錄號(hào)為B-3996。還可以用大腸桿菌VKPM B-5318 (EP 0593792B)來(lái)獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-蘇氨酸的細(xì)菌。B-5318菌林關(guān)于異亮氨酸是原養(yǎng)型的，并且溫度敏感的人噬 菌體C1阻遏物和PR啟動(dòng)子取代了 pVIC40質(zhì)粒中的蘇氨酸操縱子的調(diào)控區(qū) 域。VKPM B-5318菌林在19卯年5月3日保藏于俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保 藏中心(VKPM),登錄號(hào)為VKPMB-5318。優(yōu)選地，將本發(fā)明的細(xì)菌額外修飾以增強(qiáng)一種或多種下列基因的表達(dá) -突變thrA基因，其編碼對(duì)蘇氨酸的反饋抑制具有抗性的天冬氨酸激酶高 絲氨酸脫氫酶I;-thrB基因，其編碼高絲氨酸激酶； -thrC基因，其編碼蘇氨酸合酶(threonine synthase); -rhtA基因，其編碼推定的跨膜蛋白； -asd基因，其編碼天冬氨酸-(3-半醛脫氫酶；以及 -aspC基因，其編碼天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)。 編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的大腸桿菌thrA基因的序列已經(jīng)闡 明(核普酸位置337至2799， GenBank登錄號(hào)NC—000913.2, gi: 49175990)。 thrA 基因位于大腸桿菌K-12染色體上thrL和thrB基因之間。編碼高絲氨酸激酶 的大腸桿菌thrB基因的核苷酸序列已經(jīng)闡明(核芬酸位置2801至3733, GenBank登錄號(hào)NC—000913.2, gi: 49175990)。 thrB基因位于大腸桿菌K-12 染色體上的thrA和thrC基因之間。編碼蘇氨酸合酶的大腸桿菌thrC基因的 核香酸序列已經(jīng)闡明(核普酸位置3734至5020，GenBank登錄號(hào)NC—000913.2, gi: 49175990)。 thrC基因位于大腸桿菌K-12染色體上thrB基因和yaaX開放 閱讀框之間。所有3個(gè)基因作為一個(gè)獨(dú)立的蘇氨酸操縱子一起發(fā)揮功能。為增強(qiáng)蘇氨酸操縱子的表達(dá)，可以從操縱子中將影響轉(zhuǎn)錄的弱化子區(qū)域去除(WO2005/049808, WO2003/097839)。編碼具反饋抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的突變thrA基因，以 及thrB和thrC基因可以作為一個(gè)操縱子從熟知的pVIC40質(zhì)粒中獲得。該質(zhì) 粒存在于產(chǎn)生蘇氨酸的大腸桿菌VKPM B-3996菌抹中，在美國(guó)專利No. 5,705,371中有詳述。rhtA基因在大腸桿菌染色體上的18 min處，靠近glnHPQ操縱子，glnHPQ 編碼谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的成分。rhtA基因與ORF1 (ybiF基因，核普酸位置764 至1651， GenBank登錄號(hào)AAA218541, gi:440181)相同并且位于pexB與ompX 基因之間。已將表達(dá)由ORF1編碼的蛋白的序列命名為rhtA基因(rht:對(duì)高絲 氨酸和蘇氨酸的抗性)。同樣地，rhtA23突變是相對(duì)于ATG起始密碼子在-l 位置用A-對(duì)-G取代(ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology (第17界國(guó)際生物化 學(xué)與分子生物學(xué)大會(huì)暨美國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)協(xié)會(huì)年會(huì)摘要)，San Francisco, California, 1997年8月24-29日,摘要號(hào)457， EP 1013765 A)。大腸桿菌的asd基因的核苷酸序列已經(jīng)闡明(核苷酸位置3572511至 3571408， GenBank登錄號(hào)NC—000913.1, gi:16131307)，并且可以根據(jù)該基因 的核苷酸序列利用引物通過(guò)PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);參見White, T.J.等，Trends Genet.,5, 185 (1989))來(lái)獲得。其它微生物的asd基因可以通過(guò)類似方式獲得。同樣，大腸桿菌的aspC基因的核普酸序列已經(jīng)闡明(核苷酸位置983742 至984932, GenBank登錄號(hào)NC—000913.1, gi:16128895),并且可以通過(guò)PCR 獲得。其它微生物的aspC基因可以通過(guò)類似方式獲得。產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌產(chǎn)生L-賴氨酸的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的實(shí)例包括對(duì)L-賴氨酸類似物具 有抗性的突變體。L-賴氨酸類似物抑制屬于埃希氏菌屬細(xì)菌的生長(zhǎng)，但是當(dāng) L-賴氨酸共存于培養(yǎng)基中時(shí)這種抑制會(huì)被全部或部分脫敏。L-賴氨酸類似物 的實(shí)例包括，但不限于，噁溶菌素，賴氨酸氧肟酸(lysinehydroxamate)， S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC),，曱基賴氨酸，a-氯代己內(nèi)酰胺等。將屬于埃希 氏菌屬的細(xì)菌進(jìn)行常規(guī)的人工誘變處理可以得到對(duì)這些賴氨酸類似物具有抗性的突變抹?？捎糜诋a(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌菌抹的具體實(shí)例包括大腸桿菌AJ11442 (FERM BP-1543， NRRL B-12185;參見美國(guó)專利No.4，346， 170)和大腸 桿菌VL61L在這些微生物中，L-賴氨酸對(duì)天冬氨酸激酶的反饋抑制是脫敏的。可將WC196菌抹用作產(chǎn)生L-賴氨酸的大腸桿菌細(xì)菌。通過(guò)賦予W3110 菌抹AEC抗性來(lái)培育這種細(xì)菌菌抹，W3110菌林源自大腸桿菌K-12。將所 得菌4朱命名為大腸桿菌AJ13069菌^^，并于1994年12月6日保藏在通商產(chǎn) 業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology)(現(xiàn)為獨(dú)立行 政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6， 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken， 305-8566， Japan),取得登錄號(hào)FERM P-14690。其后根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定 于1995年9月29日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，并取得登錄號(hào)FERMBP-5252 (美國(guó)專利 No. 5,827,698)。用于衍生本發(fā)明產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌的親本菌林實(shí)例還包括下述菌株， 在所述菌林中將編碼L-賴氨酸生物合成酶的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)增強(qiáng)。涉 及L-賴氨酸生物合成的酶的實(shí)例包括，但不限于，二氫吡啶二羧酸合酶 (dapA)、天冬氨酸激酶(lysC)、 二氫吡啶二羧酸還原酶(dapB)、 二氨基庚二酸 脫羧酶(lysA)、 二氨基庚二酸脫氫酶(ddh)(美國(guó)專利No. 6，040,160)、磷酸烯醇 丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)和天冬氨酸酶(aspA) (EP 1253195 A)。此外，親本菌抹中涉及能量效率(energy efficiency)的基因(cyo) (EP 1170376 A)、編碼煙酰胺核香酸轉(zhuǎn)氫酶的基因(pntAB)(美國(guó)專利No. 5,830,716)、 ybjE基因(W02005/073390)、 gdh基因(Gene23:199-209(1983))、 arcA基因(EP 1382686A)或它們的組合的表達(dá)增加。用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌的親本菌抹的實(shí)例還包括將催化 下述反應(yīng)的酶的活性減少或消除的菌林，所述反應(yīng)通過(guò)從L-賴氨酸生物合成 途徑分支，生成除L-賴氨酸外的化合物。催化通過(guò)從L-賴氨酸生物合成途徑 分支，生成除L-賴氨酸外的化合物的反應(yīng)的酶的實(shí)例包括高絲氨酸脫氫酶 (WO 95/23864)，賴氨酸脫羧酶(美國(guó)專利No. 5,827,698),和蘋果酸酶(malic enzyme) (WO2005/010175)。在大腸桿菌中，賴氨酸脫羧酶由cadA基因(Genbank登錄號(hào)NP—418555, SEQ ID NO: 5)和ldcC基因(Genbank登錄號(hào)NP—414728, SEQ ID NO: 7)編碼 (WO96/17930),因此可以破壞這些基因以增強(qiáng)產(chǎn)生L-賴氨酸的能力。可以應(yīng) 用與cadA基因和ldcC基因同源的DNA分子，只要它們能夠引起與宿主細(xì) 菌染色體上的cadA基因和ldcC基因的同源重組。例如，與cadA基因同源 的DNA分子在嚴(yán)緊條件下可以與SEQ ID NO: 5的互補(bǔ)鏈雜交，與ldcC基因 同源的DNA分子在嚴(yán)緊條件下可以與SEQ ID NO: 7的互補(bǔ)鏈雜交。產(chǎn)生L-半胱氨酸的細(xì)菌用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-半胱氨酸細(xì)菌的親本菌抹的實(shí)例包括，但不限 于，屬于埃希氏菌屬的菌林，如用編碼反饋抗性絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的不同cysE 等位基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM15菌抹(美國(guó)專利No. 6,218,168,俄羅斯專利申 請(qǐng)2003121601),過(guò)表達(dá)編碼適于分泌有毒物質(zhì)的蛋白的基因的大腸桿菌 W3110 (美國(guó)專利5,972,663)，半胱氨酸脫巰基酶(cysteine desulfohydrase)活性 減少的大腸桿菌菌林(JPll 155571 A2);由cysB基因(WO0127307Al)編碼的半 胱氨酸調(diào)節(jié)子的正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控物活性增強(qiáng)的大腸桿菌W3110菌林，等等。產(chǎn)生L-亮氨酸的細(xì)菌用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-亮氨酸細(xì)菌的親本菌抹的實(shí)例包括，但不限于， 屬于埃希氏菌屬的菌抹，如對(duì)亮氨酸有抗性的大腸桿菌菌抹(例如，菌抹57 (VKPM B-7386,美國(guó)專利No. 6，124,121))或?qū)α涟彼犷愃莆?包括P-2-漆吩 丙氨酸、3-羥基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5，5,5-三氟亮氨酸)有抗性的大腸桿菌菌 株(JP 62-34397 B和JP 8-70879 A);通過(guò)WO96/06926中描述的遺傳工程方法 獲得的大腸桿菌菌抹；大腸桿菌H-9068 (JP 8-70879 A)，等等。可以通過(guò)增強(qiáng)涉及L-亮氨酸生物合成的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)來(lái)改進(jìn)本 發(fā)明的細(xì)菌。這些基因的實(shí)例包括leuABCD搡縱子中的那些，所述操縱子優(yōu) 選地包括經(jīng)過(guò)突變的leuA基因，從而使該基因編碼對(duì)L-亮氨酸反饋抑制具有 抗性的異丙基蘋果酸合酶(美國(guó)專利6,403,342)。此外，可以通過(guò)增強(qiáng)編碼從 細(xì)菌細(xì)胞分泌L-氨基酸的蛋白的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)來(lái)改進(jìn)本發(fā)明的細(xì) 菌。這類基因的實(shí)例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP 1239041 A2)。產(chǎn)生L-組氨酸的細(xì)菌用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-組氨酸細(xì)菌的親本菌抹的實(shí)例包括，但不限于， 屬于埃希氏菌屬的菌林，如大腸桿菌24菌抹(VKPM B-5945, RU2003677);大 腸桿菌80菌株(VKPM B-7270, RU2119536);大腸桿菌NRRL B-12116 — B12121 (美國(guó)專利No. 4,388,405);大腸桿菌H-9342 (FERM BP-6675)和 H-9343 (FERM BP-6676)(美國(guó)專利No. 6，344，347);大腸桿菌H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087);大腸桿菌AI80/pFM201 (美國(guó)專利No. 6,258,554)等 等。用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L -組氨酸細(xì)菌的親本菌林的實(shí)例還包括如下菌 林，所述菌株中編碼L-組氨酸生物合成酶的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)增強(qiáng)。這 些L-組氨酸生物合成酶的實(shí)例包括ATP磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(hisG)、磷酸核糖 基AMP環(huán)化水解酶(hisl)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶(hisIE)、磷酸核糖 基亞氨曱基-5-氨基咪峻氨曱酰核糖核苷酸異構(gòu)酶(phosphoribosylformimino-5 -aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase) (hisA)、酖胺轉(zhuǎn)移酶(hisH)、組 氨醇磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶(hisC)、組氨醇磷酸酶(hisB)、組氨醇脫氫酶(hisD)等。已知編碼L-組氨酸生物合成酶的基因(hisG， hisBHAFI)被L-組氨酸所抑 制，因此還可以通過(guò)向ATP磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(hisG)中引入誘導(dǎo)對(duì)反饋抑制 有抗性的突變來(lái)有效地增強(qiáng)產(chǎn)生L-組氨酸的能力(俄羅斯專利Nos. 2003677 和2119536)。具有產(chǎn)生L-組氨酸能力的菌抹具體實(shí)例包括大腸桿菌FERM-P 5038和 5048,其已經(jīng)用攜帶編碼L-組氨酸生物合成酶的DNA的載體轉(zhuǎn)化(JP 56-005099 A)，用rht (即用于氨基酸輸出的基因)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌抹 (EP1016710A),賦予了磺胺胍、DL-l,2,4-三唑-3-丙氨酸和鏈霉素抗性的大腸 桿菌80菌抹(VKPMB-7270,俄羅斯專利No. 2119536)，等等。產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-谷氨酸細(xì)菌的親本菌抹的實(shí)例包括，但不限于， 屬于埃希氏菌屬的菌4朱，如大腸桿菌VL334thrC+ (EP 1172433)。大腸桿菌 VL334 (VKPM B-1641)是L-異亮氨酸和L-蘇氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，并且在thrC和 ilvA基因中被突變(美國(guó)專利No. 4,278,765)。利用生長(zhǎng)于野生型大腸桿菌菌抹 K12 (VKPM B-7)中的噬菌體P1，通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)轉(zhuǎn)移thrC基因的野生型等位基因。結(jié)果，獲得了 L-異亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌抹VL334thrC+ (VKPM B-8961)。用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-谷氨酸細(xì)菌的親本菌林的實(shí)例包括，但不限于， 編碼L-谷氨酸生物合成酶的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)增強(qiáng)的菌抹。涉及L-谷氨 酸生物合成的酶的實(shí)例包括谷氨酸脫氫酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷 氨酸合成酶(gltAB)、異檸檬酸脫氫酶(icdA)、烏頭酸水合酶(acnA， acnB)、檸 檬酸合酶(citrate synthase; gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸脫氫酶 (aceEF, lpdA)、丙酮酸激酶(pykA, pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇 化酶(eno)、磷酸甘油酸變位酶(pgmA)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸 脫氫酶(gapA)、丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpiA)、果糖二磷酸醛縮酶(fbp)、磷酸果糖激 酶(pfkA， p&B)和葡糖磷酸異構(gòu)酶(pgi)。經(jīng)修飾以使檸檬酸合成酶(citrate synthetase)基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 基因和/或谷氨酸脫氬酶基因的表達(dá)增強(qiáng)的菌抹的實(shí)例包括在EP1078989A、 EP955368A和EP952221A中公開的那些菌抹。用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-谷氨酸細(xì)菌的親本菌抹的實(shí)例還包括將下述酶 的活性減少或去除的菌林，所述酶催化除L-谷氨酸外的化合物的合成，并且 從L-谷氨酸生物合成途徑中分支。這類酶的實(shí)例包括異檸檬酸裂合酶，a-酮 戊二酸脫氫酶，磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶，乙酸激酶，乙酰羥酸合酶(acetohydorxy acid synthase),乙酰乳酸合酶,甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，乳酸脫氫酶，和谷氨酸脫羧酶。 在美國(guó)專利Nos. 5,378,616和5,573,945中描述了 a-酮戊二酸脫氫酶活性缺失 或降低的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌及其獲得方法。具體地，這些菌4^包括下面的大腸桿菌W3110sucA::Kmr大腸桿菌AJ12624 (FERM BP-3853)大腸桿菌AJ12628 (FERM BP-3854)大腸桿菌AJ12949 (FERM BP-4881)通過(guò)破壞大腸桿菌W3110的a-酮戊二酸脫氫酶基因(在下文稱為"sucA基 因")來(lái)獲得大腸桿菌W3110sucA::Kmr。該菌4朱的a-酮戊二酸脫氫酶完全缺失。產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌的其它實(shí)例包括屬于埃希氏菌屬并且具有對(duì)天冬氨 酸抗代謝物的抗性的細(xì)菌。這些菌抹也可能是a-酮戊二酸脫氫酶活性缺陷的，包括例如大腸桿菌AJ13199 (FERMBP-5807)(美國(guó)專利No. 5.908,768)，額外 具有弱L-谷氨酸分解能力的FERM P-12379菌抹(美國(guó)專利No. 5,393,671); AJ13138 (FERMBP-5565)(美國(guó)專利No. 6,110,714),等等。產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌的實(shí)例還包括a-酮戊二酸脫氫酶活性缺失或a-酮戊 二酸脫氫酶活性降低的屬于泛菌屬的突變菌林，并且可以如上所述獲得。這 些菌抹包括尸a"toeaAJ13356 (美國(guó)專利No. 6,331,419)。將AJ13356于1998年2月19日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工 學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)在稱作獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許;微生物 保藏中心，Central 6, l-l, Higashi l-Chome， Tsukuba-shi, Ibaraki-ken， 305-8566， Japan),登錄號(hào)為FERM P-l6645。其后按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，在l"9 年1月11日將其轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，并得到登錄號(hào)FERM BP-6615。作為破壞 aKGDH-El亞基基因(sucA)的結(jié)果，尸a"to^ AJ13356的a-酮戊二酸脫氬酶活性缺失。當(dāng)將上述菌株分離時(shí)將其鑒定為成團(tuán)腸桿菌，并且作為成 團(tuán)腸桿菌AJ13356保藏。但是，近來(lái)基于對(duì)16S rRNA的核苦酸測(cè)序等，將 其重新歸類為尸a"toe"朋a"fl他。盡管AJ13356作為成團(tuán)腸桿菌保藏在前述保 藏單^[立，就本i兌明書而言，將它們描述為awawato 。產(chǎn)生L-苯丙氨酸的細(xì)菌用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-苯丙胺酸細(xì)菌的親本菌林包括，但不限于，屬 于埃希氏菌屬的菌抹，如大腸桿菌AJ12739 (tyrA::Tn10， tyrR) (VKPM B-8197);具有pheA34基因的大腸桿菌HW1089 (ATCC 55371)(美國(guó)專利No. 5，354，672);大腸桿菌MWEC101-b (KR8卯3681);大腸桿菌NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146和NRRL B-12147 (美國(guó)專利No. 4,407,952)。 同樣地，可使用大腸桿菌K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566),大 腸桿菌K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)，大腸桿菌K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP畫12662)和命名為AJ 12604 (FERM BP-3579)的大腸桿菌K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4， pACMAB]作為親本菌 林(EP 488424 Bl)。此外，還可使用由yedA基因或yddG基因編碼的蛋白活 性增強(qiáng)的產(chǎn)生L-苯丙氨酸的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌(美國(guó)專利申請(qǐng) 2003/0148473 Al和2003/0157667 Al)。產(chǎn)生L-色氨酸的細(xì)菌用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-色氨酸細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例包括，但不限于， 屬于埃希氏菌屬的菌抹，如可以使用大腸桿菌JP4735/pMU3028 (DSM10122) 和JP6015/pMU91 (DSM10123)，其色氨酰-tRNA合成酶缺陷，該酶由突變的 trpS基因編碼(美國(guó)專利No. 5，756，345);大腸桿菌SV1M (pGH》，其具有編 碼對(duì)絲氨酸反饋抑制有抗性的磷酸甘油酸脫氫酶的serA等位基因和編碼對(duì)色 氨酸反饋抑制有抗性的鄰氨基苯曱酸合酶(anthranilate synthase)的trpE等位基 因(美國(guó)專利6,180,373);色氨酸酶缺陷的大腸桿菌AGX17(pGX44) (NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRLB-12264)(美國(guó)專利No. 4,371,614);產(chǎn) 生磷酸晞醇丙酮酸的能力增強(qiáng)的大腸桿菌AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333,美國(guó)專利No. 6，319，696)等等。此外，還可以使用由yedA基因 或yddG基因編碼的蛋白活性增強(qiáng)的產(chǎn)生L-色氨酸的埃希氏菌屬細(xì)菌(美國(guó)專 利申請(qǐng)2003/0148473 A1和2003/0157667 Al)。用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-色氨酸細(xì)菌的親本菌抹的實(shí)例還包括其中選自 鄰氨基苯曱酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脫氫酶(serA)和色氨酸合酶(trpAB)中的 一種或多種酶活性增強(qiáng)的菌株。鄰氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脫氫酶兩者 受L-色氨酸和L-絲氨酸的反饋抑制，因此可以向這些酶中引入導(dǎo)致反饋抑制 脫敏的突變。具有此類突變的菌林的具體實(shí)例包括具有脫敏的鄰氨基苯曱酸 合酶的大腸桿菌SV164菌林和通過(guò)將質(zhì)粒pGH5轉(zhuǎn)入大腸桿菌SV164獲得的酸甘油酸脫氫酶的serA基因。用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-色氨酸細(xì)菌的親本菌抹的實(shí)例還包括用色氨酸 操縱子轉(zhuǎn)化的菌株，所述色氨酸搡縱子包含編碼脫敏的鄰氨基苯曱酸合酶的 基因(JP 57-71397 A,JP 62-244382 A,美國(guó)專利No. 4,371,614)。此外，可以通 過(guò)增強(qiáng)色氨酸操縱子(trpBA)中編碼色氨酸合酶的基因的表達(dá)來(lái)賦予產(chǎn)生L-色氨酸的能力。色氨酸合酶由a和P亞基組成，分別由trpA和trpB編碼。另 外，可以通過(guò)增強(qiáng)異檸檬酸裂合酶-蘋果酸合酶操縱子的表達(dá)來(lái)改進(jìn)產(chǎn)生L-色氨酸的能力(W02005/103275)。產(chǎn)生L-脯氨酸的細(xì)菌用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-脯氨酸細(xì)菌的親本菌抹實(shí)例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌抹，如ilvA基因缺陷并且能夠產(chǎn)生L-脯氨酸的大腸桿菌 702ilvA (VKPM B掘2) (EP 1172433)?？梢酝ㄟ^(guò)增強(qiáng)涉及L-脯氨酸生物合成的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)來(lái)改進(jìn)本 發(fā)明的細(xì)菌。用于產(chǎn)生L-脯氨酸細(xì)菌的優(yōu)選基因的實(shí)例包括編碼對(duì)L-脯氨酸 反饋抑制脫敏的谷氨酸激酶的proB基因(德國(guó)專利3127361)。此外，可以通 過(guò)增強(qiáng)一種或多種編碼從細(xì)菌細(xì)胞分泌L-氨基酸的蛋白的基因的表達(dá)來(lái)改進(jìn) 本發(fā)明的細(xì)菌。這些基因包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041 A2)。具有產(chǎn)生L-脯氨酸活性的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的實(shí)例包括下列大腸桿 菌菌林NRRL B-12403和NRRL B-12404 (英國(guó)專利2075056), VKPM B-8012 (俄羅斯專利申請(qǐng)2000124295)，德國(guó)專利3127361中描述的質(zhì)粒突變體， Bloom F.R.等描述的質(zhì)粒突變體(The 15th Miami winter symposium (第15界邁 阿密冬季研討會(huì))，1983,第34頁(yè))等等。產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-精氨酸細(xì)菌的親本菌抹包括，但不限于，屬于 埃希氏菌屬的菌林，如大腸桿菌237菌抹(VKPM B-7925)(美國(guó)專利申請(qǐng) 2002/058315 Al)及其帶有突變的N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamate synthase)的衍生菌抹(俄羅斯專利申請(qǐng)No. 2001112869),大腸桿菌382菌抹 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)，引入了編碼N-乙酰谷氨酸合成酶 (N-acetylglutamate synthetase)的 argA 基因的產(chǎn)生4青氨酸的菌才朱 (EP1170361A1),等等。用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌的親本菌抹的實(shí)例還包括編碼L-精氨酸生物合成酶的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)增強(qiáng)的菌抹。L-精氨酸生物合成 酶的實(shí)例包括N-乙酰谷氨酰磷酸還原酶(argC)、鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(argJ)、 N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(argD)、鳥氨酸氨曱酰基轉(zhuǎn)移酶 (argF)、精氨琥珀酸合成酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)和氨曱?；姿?合成酶(carAB)。產(chǎn)生L-纈氨酸的細(xì)菌用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-纈氨酸的細(xì)菌的親本菌4朱實(shí)例包括，但不限于，經(jīng)修飾以過(guò)表達(dá)ilvGMEDA操縱子的菌抹(美國(guó)專利No. 5,998,178)。理想的 是將衰減所需的ilvGMEDA操縱子的區(qū)域移除以使操縱子的表達(dá)不會(huì)被產(chǎn)生 的L-纈氨酸所削弱。此外，理想的是將操縱子中的ilvA基因破壞從而降低蘇 氨酸脫氨酶的活性。用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-纈氨酸的細(xì)菌的親本菌抹的實(shí) 例還包括氨酰t-RNA合成酶的突變體(美國(guó)專利No. 5,658,766)。例如，可以 使用大腸桿菌VL1970，該菌抹在編碼異亮氨酸t(yī)RNA合成酶的ileS基因中具 有突變。已將大腸桿菌VL1970在1988年6月24日保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè) 微生物保藏中心(VKPM) (Russia, 113545 Moscow, 1 Dorozhny Proezd.)，登錄 號(hào)為VKPMB-4411。此外，還可以使用生長(zhǎng)需要硫辛酸(lipoic acid)的突變體和/或缺乏lT-ATP 酶的突變體(W096/06926)。產(chǎn)生L-異亮氨酸的細(xì)菌用于獲得本發(fā)明的產(chǎn)生L-異亮氨酸細(xì)菌的親本菌林的實(shí)例包括，但不限 于，對(duì)6-二曱基氨基。票呤有抗性的突變體(JP 5-304969 A),對(duì)異亮氨酸類似物 如硫代異亮氨酸(thiaisoleucine)和異亮氨酸氧將酸具有抗性的突變體，以及額 外對(duì)DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突變體(JP 5-130882A)。此外，還可以使用以編碼涉及L-異亮氨酸生物合成的蛋白(如蘇 氨酸脫氨酶和乙酰羥酸合酶(acetohydroxate synthase))的基因轉(zhuǎn)化的重組菌抹 (JP 2-458 A， FR 0356739和美國(guó)專利5,998,178)?！磍-2〉A(chǔ)CS活性的增強(qiáng)可以通過(guò)對(duì)上述具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力的細(xì)菌進(jìn)行修飾，以增強(qiáng)ACS 活性來(lái)獲得本發(fā)明的細(xì)菌。然而，可以在對(duì)細(xì)菌進(jìn)行修飾以增強(qiáng)ACS活性之 后再賦予產(chǎn)生L-氨基酸的能力。如下所述，可以通過(guò)提高編碼具有ACS活性 的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)ACS活性，這可以通過(guò)修飾表達(dá)調(diào)控區(qū)例如啟 動(dòng)子以增強(qiáng)內(nèi)源基因的表達(dá)，或通過(guò)引入含有基因的質(zhì)粒以增強(qiáng)該外源基因 的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，等等。而且，這些方法可以進(jìn)行組合。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"ACS活性"代表催化從乙酸、輔酶A(CoA)和ATP以 產(chǎn)生乙酰-CoA、焦磷酸和AMP的反應(yīng)的活性(EC 6.2.1.1)。輔酶A十乙酸+ATP 4乙酰-0>八+焦磷酸+AMP也有報(bào)道ACS催化從丙酸產(chǎn)生丙酰輔酶A的反應(yīng)(Eur J Biochem 2002;269(24);6184-94),還報(bào)道了 ACS能夠作為4-香豆酸CoA連接酶 (4-coumarate CoA lygase)發(fā)揮作用(Genome Biol 4(9);R54)。 輔酶A十丙酸+^ ^丙酰0^+焦磷酸+AMP 輔酶A + 4-香豆酸+ATP^香豆酰-0)八+焦磷酸+AMP 可以通過(guò)測(cè)量乙酰氧厲酸的量來(lái)確認(rèn)ACS活性的增強(qiáng)，乙酰氧肟酸是由短語(yǔ)"修飾以增強(qiáng)ACS的活性，，包括與野生型菌抹或未修飾菌抹相比每細(xì) 胞的ACS分子數(shù)增加的情形和每分子的ACS活性改進(jìn)的情形。與野生型菌 林或未修飾菌抹相比，ACS活性改進(jìn)不少于每細(xì)胞150%,優(yōu)選地不少于每 細(xì)胞200%,更優(yōu)選地不少于每細(xì)胞300%?？梢宰鳛閷?duì)照使用的屬于腸^干菌 科的野生型菌林的實(shí)例包括大腸桿菌MG1655菌抹(ATCC No. 47076), W3110 菌抹(ATCC No. 27325),和AJ13335菌抹(FERM BP-6615)?？梢酝ㄟ^(guò)增加編碼具有ACS活性的蛋白的基因(acs基因)的表達(dá)來(lái)增強(qiáng) ACS活性。與野生型或未經(jīng)修飾菌抹相比增加的表達(dá)可以通過(guò)與野生型或未 經(jīng)修飾菌抹比較acs基因的mRNA水平來(lái)確認(rèn)。確認(rèn)基因表達(dá)的方法包括 Northern雜交和RT-PCR (Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA)， 2001))。表達(dá)可以是任意水平的，只要與野生 型或未經(jīng)修飾菌林相比有所增加即可，例如，與野生型或未經(jīng)修飾菌4朱相比 表達(dá)優(yōu)選地增加為不少于1.5倍，更優(yōu)選地不少于2倍，進(jìn)一步更優(yōu)選地不 少于3倍。同時(shí)，增強(qiáng)acs基因的表達(dá)也可以通過(guò)與野生型或未經(jīng)修飾菌抹 相比相應(yīng)蛋白水平的增加來(lái)確認(rèn)，所述蛋白水平可以例如使用抗體通過(guò) ^Vestem -卩跡方'法來(lái)才企觀寸(Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA)， 2001》。acs基因的實(shí)例包括來(lái)自大腸桿菌的acs基因。在本發(fā)明中，大腸桿菌的 acs基因的實(shí)例包括SEQ ID NO: 3的acs基因(GenBank登錄號(hào)No. NC—000913 的核苷酸號(hào)4283436..4285394的互補(bǔ)《連)。其它來(lái)源的acs基因?qū)嵗ㄊ笠咭疇柹暇?論ra/w'" p"to)的acs基因 (GenBank登錄號(hào)No. NC—004088的核香酸號(hào)577565..579529的互補(bǔ)鏈)，傷 寒沙門氏菌CS"/mo"e〃a (y/ /z/)的acs基因(GenBank登錄號(hào)No. AL627282的核 芬酸號(hào)120832..122790的互補(bǔ)鏈)，霍亂弧菌(7/Z Wo c/zo/erae)的acs基因(GenBank登錄號(hào)No. NC—002505的核苷酸號(hào)305121..307121的互補(bǔ)鏈)以及 鼠傷寒沙門氏菌(5"a/wowe〃" (y/ /z/wwn'ww/)的acs基因(GenBank登錄號(hào)No. NC—003197的核普酸號(hào)4513714..4515672的互補(bǔ)4連)。此外，根據(jù)與上面列出的基因的同源性，可以通過(guò)克隆從以下細(xì)菌獲得 acs基因的同源物屬于埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、 歐文氏菌屬、耶爾森氏菌屬(l^^mV0等的？變形細(xì)菌；棒狀桿菌型細(xì)菌 (coryneform bacterium)長(zhǎng)口谷氨酸才奉沖干菌(Co/^weZ acten'wm g7wtom/cww), 或豸L發(fā) 酵4豆診干菌(BreWZ)acten.Mm /acto/^mewfwm)， i"艮單月包菌屬(尸化zWcwowoy)纟田菌^口4同 纟錄4叚單月包菌(尸sewciomo"as aerwg7'"cwa); 分4支斗干菌屬(聊co6a"en'wm)纟田菌^口結(jié) 核分枝桿菌(Mycok cten'ww ^&wiJa^);等等。可以使用例如在SEQ ID NOS: 1和2中顯示的合成的寡核芬酸，通過(guò)PCR擴(kuò)增所述同源物?？梢酝ㄟ^(guò)使用由Karlin和Altschul開發(fā)的BLAST算法(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993))或Pearson開發(fā)的FASTA算法(Methods Enzymol., 183, 63 (1990))確定氨基酸序列間和核苷酸序列間的同源性。根據(jù)BLAST算法， 開發(fā)了稱為BLASTN和BLASTX的程序(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)。短語(yǔ)"acs基因的同源物，，包括源自其它細(xì)菌的基因以及天然或人工突變 的基因，其與上述acs基因具有高度的結(jié)構(gòu)相似性并且編碼具有ACS的蛋白。 "acs基因的同源物"包括編碼蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)與SEQ ID NO: 4全 序列具有至少80%，優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%,特別優(yōu)選至少98%的 同源性，并且所述蛋白質(zhì)具有ACS活性?？梢酝ㄟ^(guò)將基因在宿主細(xì)胞中表達(dá) 并且檢測(cè)ACS活性來(lái)確認(rèn)ACS活性。同時(shí)，acs基因不限于野生型基因，還可以是突變體或人工修飾的基因， 其編碼具有SEQ ID NO: 4氨基酸序列的蛋白，但是所述蛋白在一個(gè)或多個(gè)位 置可能包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代，缺失，插入或添加，只要其ACS活性 得以維持即可。在本發(fā)明中，盡管取決于在蛋白質(zhì)中氨基酸殘基在三維結(jié)構(gòu) (ternary structure)中的位置和蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的類型，術(shù)語(yǔ)"一個(gè)或幾個(gè)" 特指1到20，優(yōu)選1至10,更優(yōu)選1至5。上述取代優(yōu)選為保守取代，保守 取代的實(shí)例包括芳香族氨基酸之間的取代，如Phe、 Trp和Tyr之間的取代； 疏水氨基酸之間的取代，如Leu、 lie和Val之間的取代；極性氨基酸之間的 取代，如Gln和Asn之間的取代；堿性氨基酸之間的取代，如Lys、 Arg和 His之間的取代；S交性氨基S交之間的取代，如Asp和Glu之間的取代；具有羥基的氨基酸之間的取代，如Ser和Thr之間的取代。保守取代的具體實(shí)例 包括用Ser或Thr取代Ala;用Gln、 His或Lys取代Arg;用Glu、 Gln、 Lys、 His或Asp取代Asn;用Asn、 Glu或Gln取代Asp;用Ser或Ala取代 Cys;用Asn、 Glu、 Lys、 His 、 Asp或Arg取代Gln;用Gly、 Asn、 Gln、 Lys 或Asp取代Glu;用Pro取代Gly;用Asn、 Lys、 Gln、 Arg或Tyr取代His; 用Leu、 Met、 Val或Phe取代lie;用Ile、 Met、 Val或Phe取代Leu;用Asn、 Glu、 Gln、 His或Arg取 Lys;用Ile、 Leu、 Val或Phe取 Met;用Trp、 Tyr、 Met、 Ile或Leu取代Phe;用Thr或Ala取代Ser;用Ser或Ala取代Thr; 用Phe或Tyr取代Trp;用His、 Phe或Trp取代Tyr;和用Met、 Ile或Leu 取代Val。同時(shí)，由于具有acs基因的細(xì)菌中的個(gè)體差異，類型的不同等，上 述氨基酸的取代，缺失，插入，添加或倒位可以是天然存在的突變(突變體或 變體)。同時(shí)，acs基因可以是在嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO: 3的互補(bǔ)核苷酸序列 雜交，或者與能夠由該序列制備的探針雜交的DNA，只要該基因編碼具有 ACS活性的蛋白即可。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)緊條件"是指形成所謂特異性雜 合體而不形成非特異性雜合體的條件。難以用數(shù)值來(lái)清楚地定義該條件，其 實(shí)例包括下述條件，在該條件下具有高同源性的DNA，例如，具有至少80%, 優(yōu)選至少90°/。，更優(yōu)選至少95°/。，或特別優(yōu)選至少98%同源性的DNA互相 雜交，而具有少于80%同源性的DNA不互相雜交；其具體實(shí)例包括在常規(guī) Southern雜交中的洗滌條件，即，在60。C，優(yōu)選在68。C，在1 x SSC、0.1% SDS， 優(yōu)選0.1xSSC、 0.1。/。SDS的鹽濃度，洗滌一次，優(yōu)選兩次或三次的條4牛?？梢酝ㄟ^(guò)例如利用基因重組技術(shù)增加細(xì)胞內(nèi)基因的拷貝數(shù)來(lái)提高上述 acs基因的表達(dá)。例如，將包含該基因的DNA片段連接到在宿主細(xì)菌內(nèi)發(fā)揮 功能的載體，優(yōu)選多拷貝載體上，從而制備重組DNA，并且使用該重組DNA 來(lái)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)菌。當(dāng)使用大腸桿菌的acs基因時(shí)，可以通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；White, T丄et al.， Trends Genet. 5, 185 (1989))來(lái)獲得acs基因，其使用基于SEQ ID NO: 3的核苷酸序列的引物，例如，SEQ ID NOS: 1和2的引物，并且使用大腸桿 菌的染色體DNA作為模板。不同細(xì)菌的ac s基因也可以從所選細(xì)菌的染色體 DNA或基因組DNA文庫(kù)中通過(guò)PCR獲得，其使用基于所選細(xì)菌的acs基因 或其它種類細(xì)菌的acs基因的已知序列，或基于ACS蛋白的氨基酸序列而制備的寡核苷酸作為引物。還可以使用基于序列制備的寡核苷酸作為探針，通過(guò)雜交來(lái)從不同細(xì)菌獲得acs基因。染色體DNA可以從作為DNA供體的細(xì) 菌中通過(guò)Saito和Miura的方法(Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Experiment Manual for Biotechnology, edited by The Society for Biotechnology, Japan, p97-98, BaifUkan Co., Ltd., 1992)等制備。然后，通過(guò)將由PCR擴(kuò)增得到的acs基因連接到能夠在宿主細(xì)菌中發(fā)揮 功能的載體DNA來(lái)制備重組DNA。能夠在宿主細(xì)菌中發(fā)揮功能的載體實(shí)例 包括能夠在宿主細(xì)菌中自主復(fù)制的載體。在大腸桿菌中自主復(fù)制的載體的實(shí)例包括pUC19、 pUC18、 pHSG299、 pHSG399、 pHSG398、 pACYC184, (pHSG和pACYC可從Takara Bio Inc.獲 得)，RSF1010 (Gene vol. 75(2), p271-288, 1989)， pBR322、 pMW219、 pMW119 (pMW可從Nippon Gene Co., Ltd.獲得)，pSTV28和pSTV29 (Takara Bio Inc.)。 也可以利用噬菌體DNA載體。為將基因連接到上述載體上，用與包含acs基因的DNA片段末端的識(shí)別 位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的限制性酶來(lái)消化載體。通常利用連接酶如T4 DNA連接酶來(lái)進(jìn) 行連接。消化和連接DNA的方法，染色體DNA的制備，質(zhì)粒DNA的制備， 轉(zhuǎn)化，PCR，用作引物的寡核苷酸的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些 方法在Sambrook, J., Fritsch， E.F.，和Maniatis， T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Sprig Harbor Laboratory Press, (1989) 等中描述。通過(guò)常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法如電穿孑L(Canadian Journal of Microbiology, 43. 197 (1997))將由此制備的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌。也可以通過(guò)用氯化鈣處理受體細(xì)胞 來(lái)提高DNA的通透性，這在大腸桿菌K-12中已有報(bào)道(Mandel, M. and Higa, A.， J. Mol. Biol.， 53, 159 (1970));和將DNA導(dǎo)入增殖期的感受態(tài)細(xì)胞，其已 才艮道用于枯草芽孢桿菌(J5(3c/〃iw sMZ)"fc) (Duncan, C.H., Wilson, G.A and Young: RE, Gene， 1, 153 (1977》。還可以通過(guò)向宿主細(xì)菌染色體DNA中導(dǎo)入多拷貝的acs基因來(lái)提高該基 因的拷貝數(shù)。利用以多拷貝存在于染色體DNA上的耙序列，通過(guò)同源重組將 多拷貝的基因?qū)胨拗骷?xì)菌的染色體DNA。這可能是重復(fù)DNA或存在于轉(zhuǎn) 座元件(transposing element)末端的反向重復(fù)序列?？蛇x擇地，如JP 2-109985 A 中所公開的，通過(guò)將acs基因插入轉(zhuǎn)座子中并將其轉(zhuǎn)移以使多拷貝的所述基因整合入染色體DNA，可以把多拷貝的acs基因?qū)肴旧wDNA?？梢岳?部分所述基因作為探針，通過(guò)Southern雜交來(lái)確認(rèn)該基因整合入染色體中。 此夕卜,如WO 00/18935, WO98/04715所述，可通過(guò)取代表達(dá)調(diào)控序列, 例如以更強(qiáng)的啟動(dòng)子取代天然啟動(dòng)子，無(wú)論基因存在于染色體或質(zhì)粒上，擴(kuò) 增能夠增加該基因表達(dá)的調(diào)控元件，或者缺失或削弱^吏acs基因表達(dá)減少的 調(diào)控元件，來(lái)增強(qiáng)acs基因的表達(dá)。已知的強(qiáng)啟動(dòng)子實(shí)例包括lac啟動(dòng)子，trp 啟動(dòng)子，trc啟動(dòng)子，tac啟動(dòng)子，X喧菌體PR啟動(dòng)子，PL啟動(dòng)子，和tet啟 動(dòng)子。評(píng)估啟動(dòng)子強(qiáng)度的方法和強(qiáng)啟動(dòng)子的實(shí)例在Goldstein等(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1， 105-128)等中4苗述。 此外，已知核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)與翻譯起始密碼子之間的間隔序列，尤其是 正好在起始密碼子上游的幾個(gè)核苷酸對(duì)于翻譯效率有很大的影響。因此，可 以修飾此序列。此外，為增強(qiáng)由acsA基因編碼的蛋白的活性，可以將增加ACS活性的 突變引入該基因。這樣的突變的實(shí)例包括增加acs基因轉(zhuǎn)錄水平的啟動(dòng)子序 列中突變，以及增加ACS蛋白比活性的編碼區(qū)中的突變。<2>產(chǎn)生L-氨基酸的方法本發(fā)明的產(chǎn)生L-氨基酸的方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌，以在 所述培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生和積累L-氨基酸，并且從所述培養(yǎng)基或所述細(xì) 菌細(xì)胞中收集L-氨基酸?？梢允褂迷贚-氨基酸的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)中通常使用的常規(guī)培養(yǎng)基。即，可 以使用包含碳源、氮源、無(wú)機(jī)離子，如果需要的話還包含其它有機(jī)成分的常 規(guī)培養(yǎng)基。在本發(fā)明中，碳源的實(shí)例包括糖類，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半 乳糖、果糖及淀粉水解物；醇類如甘油和山梨糖醇；和有機(jī)酸如延胡索酸、 檸檬酸及琥珀酸。氮源的實(shí)例包括無(wú)機(jī)銨鹽如硫酸銨、氯化銨和磷酸銨；有 機(jī)氮如大豆水解物；氨氣；和氨水。至于有機(jī)痕量營(yíng)養(yǎng)物，營(yíng)養(yǎng)缺陷的物質(zhì) 如維生素B1和L-高絲氨酸，酵母提取物等優(yōu)選以適當(dāng)?shù)牧堪谂囵B(yǎng)基中。 除這些物質(zhì)外，如果需要的話，還可以加入少量磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、 錳離子等。本發(fā)明使用的培養(yǎng)基可以是天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基，只要其包 含碳源、氮源、無(wú)機(jī)離子，如果需要的話，還包含其它有機(jī)痕量營(yíng)養(yǎng)物。培養(yǎng)優(yōu)選在需氧條件下，在24°C至37°C的溫度及pH 5-9，進(jìn)行1到7 天?？梢杂脽o(wú)機(jī)或有機(jī)的酸性或堿性物質(zhì)、氨氣等來(lái)調(diào)節(jié)pH?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)方 法如離子交換樹脂、沉淀及其它已知方法從發(fā)酵液中收集L-氨基酸。當(dāng)L-氨基酸在細(xì)菌細(xì)胞中積累時(shí)，可以通過(guò)如下方法收集L-氨基酸，例如，通過(guò) 超聲處理等破^^細(xì)菌細(xì)胞以將L-氨基酸釋放到上清級(jí)分中，然后通過(guò)離心去 除細(xì)菌細(xì)胞，然后將所得上清級(jí)分通過(guò)離子交換樹脂等。在產(chǎn)生堿性L-氨基酸時(shí)，可在進(jìn)行發(fā)酵的同時(shí)將培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基的pH 控制在6.5-9.0并在完成培養(yǎng)后將培養(yǎng)基的pH控制在7.2-9.0,以及在發(fā)酵過(guò) 程中控制發(fā)酵罐的壓力使其為正壓。可選擇地，可以將二氧化碳或含有二氧 化碳的混合氣體加入培養(yǎng)基以使碳酸氬根離子和/或碳酸根離子在培養(yǎng)期內(nèi) 以至少2 g/L的量存在于培養(yǎng)基中。這些離子作為反荷離子(counter ion)起到 對(duì)抗堿性L-氨基酸的陽(yáng)離子的作用，并可以收集目標(biāo)堿性L-氨基酸 (EP 1182261， WO2006/038695)。實(shí)施例在下文中，將參考下述的非限定性實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。 實(shí)施例1<1>構(gòu)建用于擴(kuò)增acs基因的質(zhì)粒為評(píng)估acs基因的擴(kuò)增對(duì)產(chǎn)生L-氨基酸的影響，構(gòu)建了用于擴(kuò)增acs基 因的質(zhì)粒載體。大腸桿菌(大腸桿菌K-12菌抹)的完整染色體核苷酸序列已經(jīng) 公開(Science, 277， 1453-1474(1997))?；诖宋募泄_的acs基因的核苷酸 序列，使用SEQ ID NO: 2的寡核苷酸作為5'引物，其包含與GenBank登錄 號(hào)No. NC—000913的核苷酸4285765至4285784的互補(bǔ)序列附接的Sall位點(diǎn)； 并且使用SEQ ID NO: 1的寡核苦酸作為3'引物，其包含與No. NC—000913 的4283415至4283435的序列附接的BamHI位點(diǎn)。使用大腸桿菌MG1655菌 抹的染色體DNA作為模板利用這些引物進(jìn)行PCR。將擴(kuò)增的acs基因純化并用Sail和BamHI消化，然后連接于經(jīng)Sail和 BamHI消化的載體pMW119 (Takara Bio)，以獲得用于擴(kuò)增acs基因的質(zhì)粒 (pMWacs)。實(shí)施例2:構(gòu)建具有破壞的賴氨酸脫羧酶編碼基因(cadA和ldcC)的菌抹構(gòu)建了不產(chǎn)生賴氨酸脫羧酶的菌林。賴氨酸脫羧酶由cadA基因(Genbank 登錄號(hào)No. NP_418555， SEQ ID NO: 5)和ldcC基因(Genbank登錄號(hào)No, NP—414728, SEQ ID NO: 7)編碼(WO 96/17930)。使用大腸桿菌WC196 (FERM BP-5252)作為親本菌林(W096/17930)。通過(guò)由Datsenko和Wanner開發(fā)的稱為"Red-驅(qū)動(dòng)整合(Red-driven integration)"的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97， No. 12, p6640-6645)，并通過(guò)源自人嗟菌體的切除系統(tǒng)(J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH， Gumport RI, Gardner JF.)來(lái)破壞cadA 基因和ldcC基因。"Red-驅(qū)動(dòng)整合"通過(guò)使用PCR產(chǎn)物能夠在一 步中構(gòu)建基因 破壞的菌林，所述PCR產(chǎn)物通過(guò)使用合成寡核普酸作為引物獲得，將所述合 成寡核苷酸設(shè)計(jì)為5'端具有部分的靶向基因并且在3'端具有部分抗生素抗性 基因。與源自X噬菌體的切除系統(tǒng)的組合允許將已經(jīng)并入基因被破壞的菌抹 中的抗生素抗性基因去除(W02005/010175)。(2-1) cadA基因的破壞利用pMW118-attL-Cm-attR質(zhì)粒(WO2005/010175)作為PCR的模板。 pMW118-attL-Cm-attR是通過(guò)將attL和attR基因(其為X噬菌體的附著位點(diǎn)) 以及cat基因(其為抗生素抗性基因)插入pMW 118 (Takara Bio Inc.)而獲得的。 各基因以下列順序排列attL-cat-attR。使用SEQIDNOS:9和10中所示的合成寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR，所 述合成寡核苷酸在3'端具有與attL和attR對(duì)應(yīng)的序列，并且在5'端具有與部 分靶向的基因cadA對(duì)應(yīng)的序列。在瓊脂糖膠中純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，并用電穿孔法將其導(dǎo)入大腸桿菌 WC196菌林。該菌抹攜帶有pKD46， pKD46具有溫度敏感的復(fù)制性。pKD46 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645)含有源自X噬菌 體的2154個(gè)核苷酸的DNA片段，其含有X Red同源重組系統(tǒng)的Red重組酶 編碼基因(Y， (3,和exo基因)，該系統(tǒng)受到阿拉伯糖可誘導(dǎo)的ParaB啟動(dòng)子的 控制(GenBank/EMBL登錄號(hào)No. J02459,核苷酸號(hào)31088至33241)。 pKD46 對(duì)于將PCR產(chǎn)物整合入WC196菌林的染色體是必需的。如下所述制備用于電穿孔的感受態(tài)細(xì)胞。即，將具有pKD46的大腸桿菌WC196菌抹的細(xì)胞在含100 mg/L氨千青霉素的LB培養(yǎng)基中在30°C培養(yǎng)過(guò) 夜，然后用含氨芐青霉素(20 mg/L)和L-阿拉伯糖(l mM)的5 mL SOB培養(yǎng)基 (Molecular Cloning: Laboratory manual, 2nd edition, Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))稀釋100倍。將稀釋的細(xì)胞在30。C通氣 培養(yǎng)直至OD600達(dá)到約0.6，然后濃縮100倍并且以10%的甘油洗滌三次以 使細(xì)胞可用于電穿孔。用70laL感受態(tài)細(xì)胞和約100ngPCR產(chǎn)物進(jìn)行電穿孑L 電穿孔結(jié)束后，向細(xì)胞中添力o 1 mL SOC培養(yǎng)基(Molecular Cloning: Laboratory manual, 2nd edition, Sambrook, J. et al.， Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989》,將細(xì)胞在37。C培養(yǎng)2.5小時(shí),然后在含有Cm (氯霉素)(25 mg/L)的 L-瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)，從而選擇Cm抗性的重組菌抹。隨后，為除 去質(zhì)粒pKD46，將細(xì)胞在含Cm的L-瓊脂培養(yǎng)基上于42°C進(jìn)行兩次傳代培 養(yǎng)，并檢驗(yàn)所得菌落的氨千青霉素抗性，以產(chǎn)生消除了(cured)pKD46的氨千 青霉素敏感的菌抹。在已經(jīng)通過(guò)氯霉素抗性基因鑒定的突變菌抹中，通過(guò)PCR來(lái)確認(rèn)cadA 基因的缺失。將cadA-破壞的菌抹命名為WC196AcadA::att-cat。隨后，利用輔助質(zhì)粒pMW-intxis-ts (WO2005/010175)將導(dǎo)入cadA基因的 att-cat基因去除。質(zhì)粒pMW-intxis-ts攜帶編碼X噬菌體整合酶(Int)的基因， 以及編碼切除酶(Xis)的基因，并且具有溫度敏感的復(fù)制性。通過(guò)常規(guī)方法制備WC196AcadA::att-cat菌抹的感受態(tài)細(xì)胞，然后將其用 輔助質(zhì)粒pMW-intxis-ts轉(zhuǎn)化，然后在含有50 mg/L氨節(jié)青霉素的L-瓊脂培養(yǎng) 基上在30。C進(jìn)行平板培養(yǎng)，從而選擇氨千青霉素抗性菌株。隨后，為除去質(zhì)粒pMW-intxis-ts，將細(xì)胞在L-瓊脂培養(yǎng)基上于42°C進(jìn) 行兩次傳代培養(yǎng)，檢驗(yàn)所得菌落的氨千青霉素抗性和氯霉素抗性，從而產(chǎn)生 氯霉素和氨卡青霉素敏感的菌抹，該菌林中的cadA基因被破壞，并且去除了 att-cat和pMW-intxis-ts。將所述菌林命名為WC196AcadA。(2-2) WC196AcadA菌抹中l(wèi)dcC基因的破壞通過(guò)與上述相同的方式利用SEQIDNOS: 11和12的寡核苷酸作為引物， 破壞WC196AcadA菌株中的ldcC基因。用這種方式，得到了名為 WC196AcadAAldcC的石皮壞了 cadA和ldcC的菌才朱。<3>在埃希氏菌屬細(xì)菌的產(chǎn)生L-賴氨酸的菌抹中擴(kuò)增acs基因的效果將用于賴氨酸產(chǎn)生的質(zhì)粒導(dǎo)入WC196AcadAAldcC菌株用攜帶dapA基因、dapB基因、lysC基因和ddh基因的名為pCABD2 (WO01/53459)的用于賴氨酸生產(chǎn)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化WC196AcadAAldcC菌抹，從而制備WC196AcadAAldcC/pCABD2菌抹。用實(shí)施例1中構(gòu)建的用于擴(kuò)增acs基因的質(zhì)粒(pMWacs)和對(duì)照質(zhì)粒霉素和氨千青霉素抗性菌株。確認(rèn)了質(zhì)粒的引入，并將引入pMWacs的菌抹 和引入pMW119的菌抹分別命名為WC196AcadAAldc/pCABD2-acs菌林和 WC196AcadAAldc/pCABD2-119菌抹。將WC196AcadAAldc/pCABD2-acs和WC196AcadAAldc/pCABD2-119菌 抹在含50 mg/L氨千青霉素和20 mg/L鏈霉素的L-培養(yǎng)基中于37。C培養(yǎng)，直 至最終OD600達(dá)到約0.6，再將等體積的40%甘油溶液添加到培養(yǎng)物中，然 后攪拌。接著，將得到的懸液以適當(dāng)量分裝并保存于-80。C,其用作甘油原種 (glycerol stock)。將菌抹的甘油原種融化，以每個(gè)菌抹100jiL均勻地涂布在含50mg/L氨 千青霉素和20mg/L鏈霉素的L-平板上，并于37。C培養(yǎng)24小時(shí)。將平板上 每個(gè)菌抹約八分之一的細(xì)胞接種到500 mL-Sakaguchi燒瓶中的20 mL發(fā)酵培 養(yǎng)基中(用于埃希氏菌屬細(xì)菌的L-賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基)，所述培養(yǎng)基含50 mg/L 氨芐青霉素和20 mg/L鏈霉素，并用往復(fù)式搖床于37。C培養(yǎng)19小時(shí)。利用 Biotech Analyzer AS210 (Sakura Seiki Co，. Ltd.)來(lái)測(cè)定培養(yǎng)基中積累的L-賴氨 酸的量。[用于埃希氏菌屬細(xì)菌的L-賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基]葡萄糖 40g/L硫酸銨 24 g/L磷酸二氫鉀 1.0 g/L七水合碌b酸4美 1.0 g/L七水合^克酸亞鐵 0.01 g/L七水合^5克酸4孟 0.01 g/L酵母提取物 2.0 g/L碳酸鉤(法定級(jí))(Official grade) 30 g/L (單獨(dú)滅菌)利用氫氧化鉀將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH7.0并且于115。C用蒸汽滅菌IO分鐘。將葡萄糖和七水合硫酸鎂單獨(dú)滅菌。將碳酸^5(法定級(jí))通過(guò)于180°C加熱兩小時(shí)單獨(dú)滅菌。表1顯示 19小時(shí)后存在的L-賴氨酸的量。關(guān)于 WC196AcadAAldc/pCABD2-acs 菌林，與不含 acs 基因的 WC196AcadAAldc/pCABD2-119菌才朱相比，L-賴氨酸的量4交高。該數(shù)據(jù)il明 通過(guò)增強(qiáng)acs基因的表達(dá)，改進(jìn)了產(chǎn)生L-賴氨酸的能力。表1菌抹L-賴氨酸累積L-賴氨酸得率(yield)(g/L)(%)WC196AcadAAldc/pCABD2-1196.442.9WC196 AcadAAldc/pCABD2-acs6.745.0工業(yè)適用性本發(fā)明的細(xì)菌使以下L-氨基酸的有效發(fā)酵產(chǎn)生成為可能堿性L-氨基酸 如L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸和L-瓜氨酸；脂肪族L-氨基酸 如L-異亮氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-甘氨酸；羥基單氨基羧 酉吏(hydroxy monoaminocarboxylic acids)^口 L-蘇氛酸禾口 L-絲氛酸；J不y夫L-氛基 酸如L-脯氨酸；芳香族L-氨基酸如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸；含 硫L-氨基酸如L-半胱氨酸、L-胱氨酸和L-甲硫氨酸；以及酸性L-氨基酸如 L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生L-氨基酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，并從培養(yǎng)基或所述細(xì)菌中收集L-氨基酸，其中所述細(xì)菌是產(chǎn)生L-氨基酸的屬于腸桿菌科的細(xì)菌，其經(jīng)過(guò)修飾以增強(qiáng)乙酰-CoA合成酶的活性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)選自下組的方法增強(qiáng)乙酰-CoA合 成酶的活性a) 增加編碼乙酰-CoA合成酶的acs基因的拷貝數(shù)，和b) 修飾所述基因的表達(dá)調(diào)控序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述acs基因選自下組(a) 包含SEQ ID NO: 3的核苷酸序列的DNA，和(b) 在嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO: 3的核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列，或 者與由所述核苷酸序列制備的探針雜交的DNA，其中所述DNA編碼具有乙 酰-CoA合成酶活性的蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中L-氨基酸選自下組L-賴氨酸，L-精氨酸，L-組氨酸，L-異亮氨酸，L-纈氨酸，L-亮氨酸，L-蘇氨酸， L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-色氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，和它們的組合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌屬于埃希氏菌屬， 泛菌屬，或腸桿菌屬。
全文摘要
通過(guò)培養(yǎng)產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌來(lái)產(chǎn)生L-氨基酸，所述產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌屬于腸桿菌科并且其經(jīng)過(guò)修飾以增加乙酰-CoA合成酶活性。
文檔編號(hào)C12P13/04GK101405398SQ200780009668
公開日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2007年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月30日
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