專利名稱：：啤酒釀造方法P卑酒釀造方法發(fā)明領域本發(fā)明涉及用于釀造啤酒的方法，其包括添加不含或基本上不含(essentiallywithout)葡萄糖氧化酶的過氧化氬酶組合物，從而改進成品啤酒(finishedbeer)的風味(flavor)和/或風味穩(wěn)定性。背景已知在釀造方法中應用包含過氧化氫酶和葡萄糖氧化酶的酶組合物來改進啤酒的風味穩(wěn)定性。然而，使用過氧化氫酶-葡萄糖氧化酶組合物獲得的結果并非是完全成功的，并且已顯示葡萄糖氧化酶和亞硫酸鹽可以作為有吸引力的替代物(Blockmansetal.ASBCJournal1987，vol.45,85-90)。因此需要用于改進啤酒風味穩(wěn)定性的進一步的方法。發(fā)明簡述目前本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過應用不含葡萄糖氧化酶的過氧化氫酶組合物能夠顯著改進酶處理的效果。因此，本發(fā)明提供用于釀造啤酒的方法，其包括將不含或基本上不含葡萄糖氧化酶的過氧化氫酶(E.C.Ul丄6)組合物添加于醪(mash)、發(fā)酵麥芽汁(fermentingwort)或經發(fā)酵的啤酒(fermentedbeer)，從而改進成品啤酒的風味和/或風味穩(wěn)定性。發(fā)明詳述啤酒釀造方法是本領域技術人員熟知的。常規(guī)流程可以按照以下方式來概括起始材料為發(fā)芽的(malted)(即使其潮濕、發(fā)芽，繼而將其干燥的)大麥和/或未發(fā)芽的輔料(adjunct),稱為制粉用谷物(grist)。在糖化(mashing)過程中，將制粉用谷物研磨并且與將其水混合、加熱并攪拌時，借助于天然存在于麥芽中的酶將碳水化合物降解成可發(fā)酵的糖。糖化之后，需要將液體提取物(麥芽汁)從固體(廢谷物顆粒和輔料)中分離，從而獲得澄清的麥芽汁。麥芽汁過濾是重要的，因為所述固體含有大量的蛋白質，不良改性的(poolymodified)淀粉，脂肪物質，硅酸鹽，以及多酚(鞣質(tannin))和蛋白質。在添加啤酒花(hop)之后，將麥芽汁煮沸。由此將發(fā)生多酚的沉淀。在冷卻并去除沉淀后，向完成的制啤酒用麥芽汁(beerwort)(a)通氣并且添加酵母。在持續(xù)通常為5-10天的主發(fā)酵之后，將大多數(shù)酵母去除，并將所謂的新啤酒(greenbeer)(b)在通常為0-5。C的低溫貯藏l-12周。在這期間，剩余的酵母將與多酚一起沉淀。為了去除剩余的過量多酚而進行過濾。現(xiàn)在可以將經發(fā)酵的啤酒(c)在裝瓶之前碳化(carbonize)。二氧化碳不僅對感覺的"豐滿度(fbllness)"和"酒體(body)"有所貢獻，還作為風味增強劑，其還發(fā)揮增強起泡潛力的作用，并且在延長產品貯藏期限(shelflife)方面發(fā)揮重要作用。不受到任何理論的限制，認為在麥芽制造(malting)和糖化期間的氧化處理是引起瓶裝啤酒中的異味(off-flavor)和風味不穩(wěn)定的主要原因。最重要的氧化產物是DMS(二曱基硫醚)、反式-2-壬烯醛(Trans-2-nonenal)(T2N)。DMS和T2N是啤酒中重要的異味。氧化的原因和活性氧的形成歸因于在麥芽制造方法的過程中形成的脂氧合酶(lipoxygenase)和來自反應性銅(Cu+)和鐵的非酶氧化，其是一種導致自由基和過氧化氫形成的機制。天然麥芽過氧化氫酶使麥芽中的氧自由基水平降低。然而，天然過氧化氫酶在麥芽制造和初始糖化步驟期間容易失活。對釀造過程應用過氧化氬酶是本領域熟知的(EP1122303)。然而，現(xiàn)有技術的應用包括使用包含過氧化氫酶以及葡萄糖氧化酶的酶組合物。通過使用不含或基本上不含葡萄糖氧化酶的包含過氧化氫酶的酶組合物，在風味和/或風味穩(wěn)定性上獲得了增加的積極效果。不受任何理論的限制，認為通過本發(fā)明的方法獲得的對風味穩(wěn)定性的效果的增加可以通過因葡萄糖氧化酶形成的H202而引起的氧化產物量的減少來解釋。在本發(fā)明的上下文中，將術語"基本上不含葡萄糖氧化酶"理解為酶組合物中的葡萄糖氧化酶活性與過氧化氫酶活性的比率GODU/CIU小于1，優(yōu)選地小于0.75，例如小于0.50，小于0.25,小于O.IO，小于0.50，小于0.25，小于O.IO，小于0.05,小于O.Ol,小于0.001,小于0.0001,并且最優(yōu)選地小于0.00001。優(yōu)選地葡萄糖氧化酶活性在4企出水平以下。根據(jù)本發(fā)明，在釀酒方法的過程中添加包含過氧化氫酶的酶組合物。所述酶組合物應該不包含或基本上不包含葡萄糖氧化酶?？梢栽谒龇椒ㄖ械娜魏尾襟E添加包含過氧化氫酶的酶組合物，例如添加于醪(mash)、制啤酒用麥芽汁、新啤酒和/或經發(fā)酵的啤酒。優(yōu)選地在糖化步驟之前和/或期間添加所述包含過氧化氫酶的酶組合物。優(yōu)選將包含過氧化氫酶的酶組合物添加于制粉用谷物和水的混合物(即醪)?？梢詫⑦^氧化氬酶以0.02-200mg酶蛋白(EP)/kg醪，優(yōu)選0.2-20mg酶蛋白(EP)/kg醪，更優(yōu)選1-10mg酶蛋白(EP)/kg醪的量添加?？蓪⑦^氧化氫酶以1ClU至一千萬(10mill)CIU/kg醪，優(yōu)選10ClU至一百萬CIU/kg醪，更優(yōu)選IOOCIU至十萬ClU/kg醪，并且還更優(yōu)選1000CIU至1000ClU/kg醪的量添加。優(yōu)選地，過氧化氫酶是微生物過氧化氫酶，例如從真菌或細菌分離的過氧化氫酶。優(yōu)選地，過氧化氫酶源自柱頂孢屬菌種OScyto/Wwmsp.)，優(yōu)選嗜熱柱頂孢(S.Aem7c^/zz7Mm)的菌抹；曲霉屬菌種(Apwg/〃wsp),優(yōu)選黑曲霉(A"/ger)的菌4朱；孩i5求菌屬菌種(A/"/cracoccwssp.),優(yōu)選藤黃孩O求菌(M/wteiw)的菌抹。優(yōu)選地，所述不含或基本上不含葡萄糖氧化酶的包含過氧化氬酶的酶組合物是單組分組合物，其通過純化源自非重組生產菌抹的酶組合物獲得。用于純化多肽(包括酶)的方法是技術人員所熟知的。更優(yōu)選地，所述包含過氧化氬酶的酶組合物是通過重組技術產生的。通過重組技術，可以獲得包含基本上純的過氧化氫酶的酶組合物，例如不含或基本上不含葡萄糖氧化酶的組合物。用于重組產生多肽(包括酶)的方法是技術人員所熟知的。優(yōu)選的通過重組纟支術產生的商業(yè)酶組合物可以作為來自NovozymesA/S的TerminoxUltraTM和來自GenencorInt的Fercolase獲得。優(yōu)選的源自黑曲霉的商業(yè)單組分酶組合物可以作為Catazyme從NovozymesA/S獲得。在優(yōu)選的實施方式中，酶組合物還包含漆酶。通過本發(fā)明的方法產生的啤酒可以是任何類型的啤酒。優(yōu)選的啤酒類型包括愛兒啤酒(ale)、烈性愛兒啤酒(strongale)、烈性黑啤酒(stout)、缽爾透黑啤酒(porter)、陳貯啤酒(lager)、苦味酒(bitter)、出口啤酒(exportbeer)、麥芽酒(maltliquor)、低麥芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcoholbeer)、低醇啤酒(low-alcoholbeer)、4氐熱量P卑酒(low陽caloriebeer)iU青;炎P卑酒(lightbeer)。所述方法可以包括向經發(fā)酵的麥芽汁添加水凝硅膠(silicahydrogd)、硅藻土(kieselguhr)和/或聚乙晞聚p比。各烷酮(polyvinylpolypyrrolidone)(PVPP)和進行過濾以提煉嫩啤酒(beerbright)。在本發(fā)明的方法期間應用的過氧化氫酶對重要的引起異味的化合物(off-flavorcoursingcompound)的濃度具有降低效果。優(yōu)選地，與通過常規(guī)糖化方法產生的麥芽汁或啤酒中的水平相比，將麥芽汁和/或啤酒中DMS的濃度降低，例如分別相對于通過標準Congress(歐洲啤酒協(xié)會)糖化方法產生的麥芽汁或啤酒中的水平，降低至少10%,至少20%，至少30%，至少40%，至少50%或至少60%。優(yōu)選地，分別與通過常規(guī)方法產生的麥芽汁或啤酒中的水平相比，將麥芽汁或啤酒的T2N濃度降低，例如降低至少10%，至少20%，至少30%，至少40%，至少50%或至少60%。過氧化氫酶活性可以用CIU測量過氧化氬酶活性。過氧化氬酶催化一級反應2H202—2H20+02使用分光光度法在240nm監(jiān)測過氧化氫的降解。在指定的1"1202濃度吸光率減少指定量所用的時間是一種過氧化氫酶活性的表示方式。將lCIU定義為在pH7.0和25。C每分鐘將降解1|LiMH202，將H202濃度從10.3降至9.2mM的酶活性。反應條件酶濃度大約100CIU/mL底物濃度10.3mMH2O2緩沖液50mM磷酸鹽溫度25°CpH7.0檢測波長240nm吸收范圍0.450-0.400時間范圍0.267-0.400分鐘(16-24秒)對CIU標準方法(EB-SM-0250.02/01)的詳細描述可以通過請求乂人NovozymesA/S獲得。葡萄糖氧化酵活性葡萄糖氧化酶單位(Qlucose-Qxi啦seUnit;GODU)是每分鐘氧化1|umol卩-D-葡萄糖的酶量。葡萄糖氧化酶(P-D-葡萄糖氧-l-氧化還原酶，ECLl.3.4.)在氧存在下將(3-D-葡萄糖氧化為5-葡糖酸內酯和過氧化氫。產生的過氧化氫在過氧化物酶(POD)存在下氧化ABTS-R(2，2-連氮-二-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸酯(2，2-Azino-di-(3-ethylbenzthiazoline)-6國sufonate))。這會產生藍綠色(green-bluecolour),其可通過光度計在405nm測量。卩-D-葡萄糖+02「。…脇>S-葡萄糖酸內酯+H202'zGOD,30C,pH5.6H202+AB了S還原型H20+ABTS氧化型反應條件底物ABTS葡萄糖氧化酶過氧化物酶(POD)緩沖液PH葡萄糖90mM(16.2g/L)1.25mM(688mg/L)0.0061-0.0336GODU/mL2930U/L乙酸鹽，100mM5.60±0.0530°C±136秒(8x4.5秒)405nm對GODU標準方法(EB-SM-0244.02)的詳細描述可通過請求從NovozymesA/S獲得。反應時間波長才才泮+禾口方法電子自旋共振(ESR)譜法為了預知啤酒的風味穩(wěn)定性，電子自旋共振(ESR)譜法迄今已經使用了多年，用于通過在升高的溫度(60。C)加速啤酒陳化(beerageing)來測定啤酒的所謂的滯后時間(lagtime)。將通過這種方法測定的滯后時間值看作啤酒內源抗氧^b;昝能(endogenousanti-oxidativeactivity)的判斷標準(criterion)，其主要基于還原性化合物(例如S02、抗壞血酸)，并且其本身與氧化啤酒穩(wěn)定性直接相關聯(lián)。通過ESR譜法的滯后時間測量基于在加速啤酒陳化期間對啤酒中自由基產生的間接檢測。能夠通過以自旋捕捉器(spintrap)捕獲來監(jiān)測形成的短壽命反應性自由基，并使用ESR錯法來檢測長壽命的自旋加合物(spinadduct)。在特定的時間段中，可以通過啤酒的內源抗氧化活性來延遲或防止自由基形成(滯后期)。在滯后期之后，自由基的量開始隨時間迅速增加。內源抗氧化潛能(EAP)是啤酒樣本將在加熱至63°C并暴露于大氣氧時產生的自由基淬滅(quench)的天然能力。在ESR信號中的滯后期越長，啤酒中的EAP越高。遵循這個觀點，自由基將在啤酒中天然地形成。為了比較不同的啤酒，將在給定時間的總ESR(T，-7o。)信號等同于在特定時間點仍在63。C和暴露于大氣時形成的自由基的量。信號越低，則啤酒樣本中形成的自由基越少。定義為BAX(sp)=EAP-值/AS02-含量[min*1/mg]的飲料抗氧化指標(BAX)測量的是摻料的S02(spikedS02)對啤酒的影響，以及與啤酒中存在的天然抗氧化劑的相互作用。高EAP以及高BAX與較佳的啤酒貯藏穩(wěn)定性相關(Uchidaetal.1996,J.Am,Brew.Chem.54205-211,Andersenetal.1998.J.Agric.FoodChem.1998,Vol46,pp.1272-1275，Andersenet.al.2000.J，Agric.FoodChem.2000，Vol48，pp.3106-3111)。實施例1制啤酒用的麥芽汁產生自包含35。/o麥芽(EsperanzaRiego)、未發(fā)芽大麥15%和50。/。玉米渣(maizegrit)的制粉用谷物。使用0ppm過氧化氬酶(對照)、2ppm過氧化氫酶(按照mg/kgDS)和10ppm對照來糖化所述制粉用谷物。所述過氧化氫酶是高度純化的來自黑曲霉的過氧化氫酶，其具有132000CIU/ml的活性，并且不具有可^企測的葡萄糖氧化酶活性。用釀酒酵母(brewer，syeast)將麥芽汁發(fā)酵成陳貯啤酒(lagerbeer)。在從發(fā)酵臺(fermentationrest)轉移時，向新啤酒添加以下添加劑；34gr/HlBritesorb(珪酸4美鹽)和2gr/Hl異抗壞血酸鈉(sodiumeritorbate)。分析麥芽汁和啤酒，所得結果示于表1和2。表1.對使用0ppm過氧化氫酶(對照)、2ppm過氧化氫酶(按照mg/kgDS)和10ppm對照糖化的制粉用谷物產生的麥芽汁的分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2.對使用0ppm過氧化氫酶(對照)、2ppm過氧化氫酶(按照mg/kgDS)和10ppm對照糖化的制粉用谷物產生的啤酒的分析。0ppm2ppm10ppmpH4.154.14.1顏色，。SRM3.33.33.3苦味單位15.716.216.2醇，％P3.393,53.52真實提取物(realextract),%3.924.023.95計算的原始提取物(calculatedoriginalextract)10.710.910.8表觀提取物，％2.42.462.38濁度(。ASBC)262625泡沫,sigma值111107109游離S02，mg/11.251.251.41總S02,mg/16.66.186.85溶解氧(ppb)185192177二氧化碳，％重量0.5050,480.52對哞酒進行由經過訓練的品嘗組進行的感官分析(sensorialanalysis)。用于強制穩(wěn)定性測試(forcedstabilitytest)的方法如下在攪拌下24小時和在38°C3天。風味穩(wěn)定性的等級為從1到7。l表示未品嘗出氧化，而7是帶有高度氧化的啤酒。結果示于表3。表3.風味穩(wěn)定性。風味穩(wěn)定性等級為從1到7，其中數(shù)值1表示未品嘗出氧化，而7表示高度氧化。新鮮的強制的30天60天90天120天對照2.553.163.583.404.084.872ppm2.543.002.913.103.604.7510ppm2.42.832.913.003,403,56實施例2使用100。/o比爾森大麥麥芽(barleypilsnermalt)來釀造經典德國比爾森型啤酒(classicGermanpilsnertypebeer)。在糖化步驟期間添加酶，然后將麥芽汁煮沸、熟化(maturation)并裝瓶。使用的酶是包含葡萄糖氧化酶副活性的黑曲霉過氧化氫酶組合物(Catazyme⑧)，以及不含葡萄糖氧化酶副活性的嗜熱柱頂孢過氧化氬酶組合物(TerminoxUltra)。將瓶裝哞酒貯藏在20°C,并在4周和12周之后進行分析。表4.于20。C貯藏4周和貯藏12周之后的內源抗氧化潛能(分鐘)和總ESR(總信號)。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1:含有3870GODU/g(葡萄糖氧化酶單位)；2:在1.5GODU/g的檢出水平以下的水平實施例3使用比爾森大麥麥芽和玉米淀粉輔料來釀造比爾森型啤酒。在糖化步驟期間添加酶，然后將麥芽汁煮沸、熟化并裝瓶。使用的酶是包含葡萄糖氧化酶副活性的黑曲霉過氧化氫酶組合物(Catazyme⑧)，不含葡萄糖氧化酶副活性的黑曲霉過氧化氫酶組合物的純化樣品，以及不含葡萄糖氧化酶副活性的嗜熱柱頂孢過氧化氬酶組合物(Termi墜Ultra)。將瓶裝啤酒貯藏在20°C,并在120天時進行分析。表5.于20。C貯藏120天之后的飲料抗氧化指標(min"/mgS02)和總ESR(總信號)。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1:含有3870GODU/g(葡萄糖氧化酶單位)；2:在1.5GODU/g的檢出水平以下的水平；3:在1.5GODU/g的檢出水平以下的水平。權利要求1.用于生產啤酒的方法，其包括向醪、發(fā)酵麥芽汁、新啤酒(greenbeer)和/或經發(fā)酵的啤酒添加過氧化氫酶組合物，從而改進成品啤酒的風味和/或風味穩(wěn)定性，所述過氧化氫酶組合物不含或基本上不含葡萄糖氧化酶。2.根據(jù)權利要求l的方法，其中所述過氧化氫酶是微生物過氧化氫酶，例如可從細菌或真菌得到的過氧化氫酶。3.根據(jù)權利要求1-2中任一項的方法，其中所述微生物過氧化氬酶可從真菌得到，特別是從屬于柱頂孢屬菌種，優(yōu)選嗜熱柱頂孢，曲霉屬菌種，優(yōu)選黑曲霉，和/或微球菌屬菌種，優(yōu)選藤黃微球菌的真菌得到。4.根據(jù)權利要求l的方法，其中所述過氧化氬酶通過重組技術產生。5.根據(jù)權利要求3的方法，其中所述酶組合物進一步包含漆酶。6.不含或基本上不含葡萄糖氧化酶的包含過氧化氬酶的酶組合物在用于生產啤酒的方法中的用途。7.根據(jù)前項權利要求的酶組合物的用途，其中存在漆酶。全文摘要本發(fā)明涉及用于釀造啤酒的方法，其包括添加酶組合物來改進成品啤酒的風味和/或風味穩(wěn)定性，所述酶組合物包含過氧化氫酶，并且不含或基本上不含葡萄糖氧化酶。文檔編號C12C7/04GK101400776SQ200780008210公開日2009年4月1日申請日期2007年3月6日優(yōu)先權日2006年3月7日發(fā)明者亨里克·比斯加德-弗朗曾,尼爾斯·埃爾維格,賴克·M·費斯特森申請人:諾維信公司