專利名稱：：鑒定至少兩組微生物的方法鑒定至少兩組微生物的方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及一種鑒定至少兩組表達相同酶活性的微生物的方法。本發(fā)明還涉及一種特異性反應培養(yǎng)基和其在鑒定至少兩組表達相同酶活性的微生物中的用途。多年來，特異性酶底物用于測定代表微生物特征的酶活性的存在或者缺失。這些酶底物通常由兩部分組成，第一部分對待測的酶活性特異，也稱為靶部分，第二部分作為標記，也稱為標記部分，例如當?shù)孜锉凰鈺r誘導菌落的特異性顯色或者出現(xiàn)可迅速檢測的沉淀。通過選擇這些底物，根據(jù)是否存在反應例如不同的顯色就可以表征微生物的性質(zhì)或者辨別不同組的微生物。因此，就細菌而言，大腸桿菌(&c/ien'c/n》co//)菌株通常通過顯示氧化酶類型的酶活性來揭示，例如P-葡糖醛酸糖苷酶或者P-半乳糖苷酶活性。類似地，利斯特氏菌(丄&^^)屬可以通過顯示{3-葡糖苷酶活性來檢測。提及的還包括特別用于顯示沙門氏菌(^/wo"e/to)屬的酯酶活性檢測。事實上，沙門氏菌屬具有能夠水解顯色底物例如indigog6niques、合成底物的非特異性酯酶。就沙門氏菌的檢測而言，更寬泛的就具有酯酶活性的細菌而言，通常在瓊脂培養(yǎng)基上進行這些細菌的檢測和/或鑒定，這允許檢測和/或鑒定菌落，所述菌落被懷疑是具有酯酶活性的細菌。但是，考慮到另一組微生物，單一的酶活性并不總是足以表征一組特異的微生物。例如，如果期望區(qū)分革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌，例如KES組(克雷伯氏桿菌屬(幻6^'^/0)，腸桿菌屬(^7tera&cter)和沙雷氏菌屬(&m^/a)，革蘭氏陰性細菌)細菌和腸球菌屬(五"teracocc^)(革蘭氏陽性細菌)細菌，必須檢測數(shù)種酶的活性以便提高特異性。然后建議在相同的培養(yǎng)基中組合數(shù)種酶底物，這可能導致成本高昂。此外，在某些情況下，在相同反應培養(yǎng)基中不可能自發(fā)地顯示不同的活性，因為用于表達不同活性的條件是不相容的。因此，當使用bioM6rieux出售的顯色培養(yǎng)基CPSID3時，通過氧化酶活性(P-葡糖苷酶)檢測的KES組細菌(克雷伯氏桿菌，腸桿菌和沙雷氏菌，革蘭氏陰性細菌)與腸球菌屬細菌(革蘭氏陽性細菌)類似，生成藍綠色菌落這兩組的鑒別必須利用其他步驟確認，通過顯微鏡檢查。本發(fā)明通過提供一種尤其適于特異鑒定和鑒別不同組微生物的新方法，以快速、廉價和便于實現(xiàn)的方式解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。令人驚訝地，本發(fā)明人證實通過明智選擇特異于兩組微生物表達的酶活性的底物組合，有可能區(qū)分表達相同酶活性的兩組微生物。在進一步公開本發(fā)明前，給出下列定義以有利于理解本發(fā)明為本發(fā)明目的，術(shù)語m^ir涵蓋革蘭氏陽性或者革蘭氏陰性細菌，酵母和更寬泛的，通常是憑肉眼看不見的可以在實驗室中被擴增或者操縱的單細胞生物體。就革蘭氏陰性細菌來說，可以提及的是下列屬的細菌假單胞菌(尸"wfifowo"os)，埃希氏菌(Esc/2en'c/n'a),沙門氏菌(Sa/wo"e〃(3)，志賀氏菌(幼/gd/a),腸桿菌(￡"feraZacfer)，克雷伯氏菌(K/e^zW/a),沙雷氏菌0S^raria),變形菌CPra&w力，彎曲桿菌(Caw/^/o6acfer),嗜血菌(T/aewo//zz7w",摩根氏菌(iWorga"e〃a)，弧菌(P^n'o)，耶爾森氏菌(Jera/m'G)，不動桿菌G4c/"eto6acter)，布蘭漢氏球菌CSra"/zame〃a),奈瑟氏球菌(7Ve&en'")，伯克霍爾德氏菌(^^狄o/(3fen'a),檸檬酸桿菌(C"ra6ac^0，哈夫尼菌(//a/m'a)，愛德華氏菌(Edwa/^/e〃a)，氣單胞菌(^erawo"cw),莫拉氏菌(^/0^^//3)，巴斯德氏菌(尸0^"^//"),普羅威登斯菌CPrav/^"c/")，放線桿菌(」"/"6^""7/"》，產(chǎn)堿菌(^/<^//^^^)，博德牛寺氏菌050^^&//<3)，西土也西菌(Cecfecea)，歐文氏菌CErw/m'a)，泛菌(戶朋toea)，雷爾氏菌(i^/"om'a)，寡養(yǎng)單胞菌,福ra盧mo畫)，黃單胞菌(J&wf/zom畫力禾口軍團菌就革蘭氏陽性細菌來說，可以提及的是下列屬的細菌腸球菌(五她racocc—，鏈球菌(5"fre/tococcw力，葡萄球斷S鄉(xiāng)一ococcus)，芽胞桿菌CBac/〃w力，利斯特氏菌(丄/"en'a)，梭菌(C/o^rWww)，加德納氏菌(GW"ere〃a)，/Cocwn'a，孚L球菌(丄actococc—，明串珠菌(丄ewcowo加c)，微球菌(Mcracocc—，分枝桿菌(JV^co6"cfm'a)禾口棒桿菌(Co^v"^)flcfen'a)。就酵母來說，可以提及的是下列屬的酵母念珠菌(Om&^)，隱球酵母(Co^ococcw》，紅酵母(/^fitotonJa)，糖酵母(5"acc/zarawyces)和絲孢酵術(shù)語反應培養(yǎng)基(milieur6actionnel)旨在表示一種培養(yǎng)基，其包括代謝表達和/或微生物生長所需的所有成分。該反應培養(yǎng)基可以只用作顯示培養(yǎng)基(milieuder6vdation)，或者可以作為培養(yǎng)和顯示培養(yǎng)基。第一種情況下，在接種前進行微生物的培養(yǎng)，在第二種情況下，反應培養(yǎng)基還構(gòu)成培養(yǎng)培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基可以含有任意其他添加劑，例如蛋白胨，一或多種生長因子，糖類，一或多種選擇劑，緩沖液，一或多種膠凝劑(g61ifiants)等。該反應培養(yǎng)基可以是可即用的液體或者凝膠形式，即在管或者燒瓶或者培養(yǎng)皿中預備好用于接種。術(shù)語aiiii旨在表示可以被酶水解成允許直接或者間接檢測微生物的產(chǎn)物的任意底物。該底物特別包括特異于待揭示酶活性的第一部分和作為標記的第二部分，以下稱為標記部分。該標記部分可以是顯色的，熒光的，發(fā)光的等等。作為適于固相支持物(濾紙，瓊脂，電泳凝膠)的顯色底物，可以特別提及的是基于吲哚酚和其衍生物的底物和基于羥基喹啉或者6，7-二羥香豆素和它們衍生物的底物，其允許檢測氧化酶和酯酶活性。對于基于吲哚氧基的底物，可以特別提及的是以下物質(zhì):5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-l3-D-葡糖胺，5-溴-3』引哚基-N-乙?；?!3-D-葡糖胺,6-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-P-D-葡糖胺，5-溴-6-氯-3-吲哚基-N-乙?；?P-D-葡糖胺，5-溴_4_氯_3』引噪基_^乙?；?_0-半乳糖胺，5-溴-4-氯-3』引哚基-(3-D-纖維二糖糖昔，5-溴-3』引哚基-(3-D-纖維二糖糖苷，6-氯-3-吲哚基-P-D-纖維二糖糖苷，5-溴-6-氯-3』引哚基-P-D-纖維二糖糖苷，5-溴-4-氯-3』引哚基-p-D-半乳糖苷,5-溴-3』引哚基-P-D-半乳糖苷，6-氯-3』引哚基-p-D-半乳糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-卩-D-半乳糖苷，6-溴-3』引哚基-P-D-半乳糖苷，3-吲哚氧基-P-D-半乳糖苷，5-溴-4-氯-3』引哚基-ot-D-半乳糖苷，5-溴-3-吲哚基-oc-D-半乳糖苷，6-氯-3』引哚基-a-D-半乳糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-cx-D-半乳糖苷,5-溴-4-氯-3-吲哚基-P-D-葡糖苷，5-溴-3-吲哚基-p-D-葡糖苷，^氯-;3』引哚基爺D-葡糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-f3-D-葡糖苷，5-溴-4-氯-3』引哚基-N-甲基-(3-D-葡糖苷，6陽溴-3-吲哚基-P-D-葡糖苷，3-吲哚氧基-p-D-葡糖苷，5-溴-4-氯-3』引哚基-ot-D-葡糖苷，5-溴-3』引哚基-a-D-葡糖苷，6-氯-3-吲哚基-ot-D-葡糖苷，5-溴-6-氯-3』引哚基-06-0-葡糖苷，5-溴-4-氯-3』引哚基-N-甲基-a-D-葡糖苷，5-溴_4-氯_3』引噪基_(3_1>葡糖苷酸，5-溴-3-吲哚基-P-D-葡糖苷酸，6-氯-3』引哚基-|3畫)葡糖苷酸，5-溴-6-氯-3-啡哚基-P-D-葡糖苷酸，6-溴-3-吲哚基-P-D"葡糖苷酸，3-吲哚氧基-P-D-葡糖苷酸，5-溴-4-氯-3-吲哚基-a-D-甘露糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-01-0-甘露糖苷，6-氯-3』引哚基-a-D-甘露糖苷，5-溴-4-氯-3』引哚基-P-D-甘露糖苷，5-溴-6-氯-3-卩引哚基-P-D-甘露糖苷，5-溴-4-氯-3』引哚基-P畫D-核苷，5-溴-4-氯-3』引哚基-P-L-墨角藻糖苷，5-溴-4-氯-3』引哚基-P-D-木糖苷，5-溴-6-氯-3-卩引哚基-p-D-木糖苷，5-溴-4-氯-3-卩引哚基肌醇-l-磷酸酯，5-溴-4-氯-3』引哚氧基磷酸酯，5-溴-3-吲哚氧基-P-D-磷酸酯，6-氯-3』引噪氧基磷酸酯，5-溴-6-氯-3-吲哚氧基磷酸酯，3-吲哚氧基磷酸酯，5-溴-4-氯-3-吲哚氧基醋酸酯，5-溴-3-吲哚氧基-卩-D-醋酸酯，6-氯-3-吲哚氧基醋酸酯，5-溴-6-氯-3-吲哚氧基醋酸酉旨，5-溴-4-氯-3-吲哚氧基丁酸酯，5-溴-3』引哚氧基-P-D-丁酸酯，6-氯-3-n引哚氧基丁酸酯，5-溴-6-氯-3』引哚氧基丁酸酯，5-溴-4-氯-3』引哚氧基辛酸酯，5-溴-3-吲哚氧基-(3-D-辛酸酯，6-氯-3-卩引哚氧基辛酸酯，5-溴-6-氯-3』引哚氧基辛酸酯，5-溴-4-氯-3-吲哚氧基壬酸酯，5-溴-3-吲哚氧基-卩-D-壬酸酯，6-氯-3-吲哚氧基壬酸酯，5-溴-6-氯-3』引哚氧基壬酸酷,5-溴-4-氯-3-吲哚氧基癸酸酯，5-溴-3』引哚氧基-(3-D-癸酸酯，6-氯-3-卩引哚氧基癸酸酯，5-溴-4-氯-3-吲哚氧基油酸酯，5-溴-4-氯-3-吲哚氧基棕櫚酸酯,5-溴-4-氯-3-B引哚氧基硫酸酯和5-溴-6-氯-3-H引哚氧基硫酸酯。也可以提及衍生自類黃酮的底物。術(shù)語"衍生自類黃酮"尤其旨在表示3'，4'-二羥基黃酮-4'-P-D-核苷，3'，4'-二羥基黃酮-4'-J3-D-半乳糖苷，3'，4'-二羥基黃酮-4'-卩-D-葡糖苷，3-羥基黃酮-J3-D-半乳糖苷，3-羥基黃酮-(3-D-葡糖苷或者3',4'-二羥基黃酮-3'，4'-二醋酸酯。也可以提及基于硝基苯酚和硝基苯胺和衍生物的底物，就基于硝基苯酚的底物來說用于檢測氧化酶和酯酶活性，就基于硝基苯胺的底物來說用于檢測肽酶活性。也可以提及基于香豆素和衍生物的底物，就基于羥基香豆素尤其是基于4-甲基傘形酮或者cyclohexenoescul6tine的底物來說，用于檢測氧化酶和酯酶活性，就基于氨基香豆素尤其是基于7-氨基-4-甲基香豆素的底物來說，用于檢測肽酶活性。也可以提及基于氨基苯酚和衍生物的底物，用于檢測氧化酶、酯酶和肽酶活性。也可以提及基于茜素(Alizarine)和衍生物的底物，用于檢測氧化酶和酯酶活性。最后，可以提及基于萘酚和萘胺和它們衍生物的底物，可以利用萘酚檢測氧化酶和酯酶活性以及利用萘胺檢測肽酶活性。術(shù)語"基于萘酚的底物"旨在表示尤其是基于a-萘酚、(3-萘酚、6-溴-2-萘酚、萘酚ASBI、萘酚AS或者p-萘酚苯(p-Naphtolbenzeine)的底物，如申請人在專利申請EP1224196中所限定的。這可以是氧化酶，酯酶，磷酸酶或者硫酸酯酶底物。氧化酶底物特別是N-乙?；?卩-氨基己糖苷酶,p-半乳糖苷酶,a-半乳糖苷酶，P-葡糖苷酶，a-葡糖苷酶，卩-葡糖醛酸糖苷酶，|3-纖維二糖糖苷酶(p-cdk)biosidase)或者a-甘露糖苷酶底物。術(shù)語"基于茜素的底物"旨在表示尤其是申請人在專利EP1235928中描述的底物，即具有以下通式的底物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中-R,是靶部分或者H，和R2是靶部分或者H，R，和R2中的至少一個是耙部分，-R3是H，S03H,Cl，Br，F(xiàn),I,N02，NH2,NR9R1()，酰氨基，NHCOX型的氨基芳基或者氨基酰氨基，其中X等于烷基，芳基和芳烷基，或者cx-氨基酸殘基例如丙氨酸，-R4是H,S03H，Cl,Br，F(xiàn)，I，N02，NH2,NR9R1Q,OH，酰氨基，NHCOX型的氨基芳基或者氨基酰氨基，其中X等于烷基，芳基，芳垸基或者a-氨基酸殘基例如丙氨酸，-根據(jù)一種變體，R3和R4彼此連接以便形成至少5個面的環(huán)，優(yōu)選具有6個面，-R5,R6,R7和R8每個均由下列原子之一或者一組原子組成H，鹵氣尤其是Cl或者Br，OH,S03H,垸基或者烷氧基，和-R9和R10獨立地由甲基、垸基、芳基或者芳垸基組成，或者R9或者R10中1個構(gòu)成環(huán)(哌啶，吡咯烷，嗎啉等)和另一個R10或者R9組成氫原子。酶底物可以是天然底物，其水解產(chǎn)物被直接或者間接地檢測。作為天然底物，可以特別提及的是色氨酸，用于檢測色氨酸酶或者脫氨酶活性，環(huán)狀氨基酸(色氨酸，苯丙氨酸，組氨酸，酪氨酸)用于檢測脫氨酶活性，磷脂酰肌醇用于檢測磷脂酶活性等等。為達到這種效果，本發(fā)明涉及一種鑒定至少兩組表達相同酶活性的微生物的方法，包括以下步驟a)在反應培養(yǎng)基中溫育所述微生物組，所述反應培養(yǎng)基包括第一種酶底物和第二種酶底物，所述第一種和第二種酶底物通過相同的酶活性代謝；b)鑒定所述微生物組。通常，溫育和鑒定步驟是本領域技術(shù)人員公知的。例如，溫育溫度可以是37'C。至于溫育氣氛，優(yōu)選的是好氧的，但也可以是厭氧的，微需氧的或者在C02中?？梢杂萌庋弁ㄟ^觀察顯色的變化進行鑒定，所述顯色不擴散到反應培養(yǎng)基，因此集中在菌落處。就熒光的檢測來說，使用本領域技術(shù)人員已知的熒光讀數(shù)設備。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種鑒定表達相同酶活性的第一組微生物和第二組微生物的方法，包括以下步驟a)在反應培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述第一組和第二組微生物，所述反應培養(yǎng)基包括第一種酶底物和第二種酶底物，所述第一種和第二種酶底物通過相同的酶活性代謝；b)鑒定所述微生物組。優(yōu)選地，所述相同的酶活性選自下列酶活性氧化酶，酯酶和肽酶，甚至更優(yōu)選地，所述相同的酶活性選自下列酶活性(3-D-葡糖苷酶,p-D-半乳糖苷酶，oc-D-葡糖苷酶，ot-D-半乳糖苷酶，a-甘露糖苷酶，P-D-葡糖醛酸糖苷酶，N-乙?；?p-D-氨基己糖苷酶，J3-D-纖維二糖糖苷酶，酯酶，磷酸酶，磷脂酶，硫酸酯酶和肽酶。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，所述第一組微生物是一組金黃色葡萄球菌dp/zy/ococcwsawreitf)，所述第二組是一組類腸球菌(五她racocci^s/ae^&)，所述相同的酶活性是a-葡糖苷酶活性，所述第一種和第二種底物是基于B引哚氧基的。優(yōu)選地，第一種底物是5-溴-4-氯-3』引哚基-N-甲基-a-葡糖苷，第二種底物是6-氯-3-吲哚基-a-葡糖苷。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案，所述第一組和第二組微生物是不同血清型的沙門氏菌，所述相同的酶活性是酯酶活性，所述第一種和第二種底物是基于B引哚氧基的。優(yōu)選地，所述第一種底物是5-溴-4-氯-3-噴哚氧基辛酸酯，所述第二種底物是5-溴-6-氯-3-吲哚氧基辛酸酯。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案，所述第一組微生物是一組革蘭氏陽性細菌，所述第二組微生物是一組革蘭氏陰性細菌，所述相同的酶活性是(3-葡糖苷酶活性，所述第一種底物是類黃酮衍生物，所述第二種底物是基于吲哚氧基的。優(yōu)選地，所述第一種底物是3-羥基黃酮-|3-葡糖苷，所述第二種底物是5-溴-4-氯-N-甲基-3-吲哚基-P-葡糖苷。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案，所述第一組微生物是一組革蘭氏陽性細菌，所述第二組微生物是一組革蘭氏陰性細菌，所述相同的酶活性是(3-葡糖醛酸糖苷酶活性，所述第一種底物是基于萘酚的，所述第二種底物是基于吲哚氧基的。優(yōu)選地，所述第一種底物是p-萘酚苯-P-葡糖苷酸，所述第二種底物是6-氯-3-吲哚基-p-葡糖苷酸。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案，所述第一組微生物是一組酵母，所述第二組微生物是一組細菌，所述相同的酶活性是氨基已糖苷酶活性，所述第一種底物是基于茜素的，所述第二種底物是基于吲哚氧基的。優(yōu)選地，所述第一種底物是茜素-N-乙?；?P-氨基葡糖苷，所述第二種底物是5-溴-4-氯-3』引噪基-N-乙酰基-P-氨基葡糖苷。與本發(fā)明方法的實施方案無關，反應培養(yǎng)基還可以包括至少一種其他底物，優(yōu)選包括數(shù)種，所述底物通過至少一種其他酶活性代謝，優(yōu)選數(shù)種酶活性代謝，所述其他酶活性優(yōu)選選自(3-D-葡糖醛酸糖苷酶活性，P-葡糖苷酶活性，色氨酸酶活性和脫氨酶活性。根據(jù)一個更優(yōu)選的實施方案，所述其他底物選自6-氯-3-吲哚基-P-葡糖苷酸，5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-卩-0-葡糖苷，3'，4'-二羥基-4'+0-葡糖苷和色氨酸。因此有可能不但區(qū)別和鑒定表達P-葡糖苷酶活性的第一組革蘭氏陰性細菌和第二組革蘭氏陽性細菌，而且還可能鑒定表達(3-葡糖醛酸糖苷酶活性的至少第三組細菌和表達脫氨酶活性的第四組細菌，以及表達色氨酸酶活性的亞組。本發(fā)明還涉及反應培養(yǎng)基用于鑒定至少兩組微生物的用途，所述反應培養(yǎng)基包括至少第一種酶底物和至少第二種酶底物，所述第一種和第二種酶底物通過相同的酶活性代謝，優(yōu)選第一組微生物和第二組微生物表達相同的酶活性。優(yōu)選地，本發(fā)明還涉及反應培養(yǎng)基用于鑒定表達相同酶活性的第一組微生物和第二組微生物的用途，所述反應培養(yǎng)基包括至少第一種酶底物和至少第二種酶底物，所述第一種和第二種酶底物通過相同的酶活性代謝。優(yōu)選地，所述相同的酶活性選自下列酶活性氧化酶，酯酶和肽酶，甚至更優(yōu)選的，所述相同的酶活性選自下列酶活性(3-D-葡糖苷酶,j3-D-半乳糖苷酶，a-D-葡糖苷酶，a-D-半乳糖苷酶，a-甘露糖苷酶，P-D-葡糖醛酸糖苷酶，N-乙酰基-P-D-氨基己糖苷酶，P-D-纖維二糖糖苷酶，酯酶，磷酸酶，磷脂酶，硫酸酯酶和肽酶。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，所述第一組微生物是一組金黃色葡萄球菌，所述第二組是一組糞腸球菌，所述相同的酶活性是a-葡糖苷酶活性，所述第一種和第二種底物是基于B引哚氧基的。優(yōu)選地，第一種底物是5-溴-4-氯-3』引哚基-N-甲基-ot-葡糖苷，第二種底物是6-氯-3-吲哚基-ot-葡糖苷。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案，所述第一組和第二組微生物是不同血清型的沙門氏菌，所述相同的酶活性是酯酶活性，所述第一種和第二種底物是基于剛哚氧基的。優(yōu)選地，所述第一種底物是5-溴-4-氯-3』引哚氧基辛酸酯，所述第二種底物是5-溴-6-氯-3-吲哚氧基辛酸酯。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，所述第一組微生物是一組革蘭氏陽性細菌，所述第二組是一組革蘭氏陰性細菌，所述相同的酶活性是P-葡糖苷酶活性，所述第一種底物是類黃酮衍生物，所述第二種底物是基于n引哚氧基的。優(yōu)選地，所述第一種底物是3-羥基黃酮-P-葡糖苷，所述第二種底物是5-溴-4-氯-N-甲基-3』引哚基-|3-葡糖苷。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案，所述第一組微生物是一組革蘭氏陽性細菌，所述第二組微生物是一組革蘭氏陰性細菌，所述相同的酶活性是P-葡糖醛酸糖苷酶活性，所述第一種底物是基于萘酚的，所述第二種底物是基于吲哚氧基的。優(yōu)選地，所述第一種底物是p-萘酚苯-p-葡糖苷酸，所述第二種底物是6-氯-3』引哚基-p-葡糖苷酸。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案，所述第一組微生物是一組酵母，所述第二組微生物是一組細菌，所述相同的酶活性是氨基已糖苷酶活性，所述第一種底物是基于茜素的，所述第二種底物是基于吲哚氧基的。優(yōu)選地，所述第一種底物是茜素-N-乙?；?P-氨基葡糖苷，所述第二種底物是5-溴-4-氯-3-卩引哚基-N-乙?；?P-氨基葡糖苷。與本發(fā)明的使用方式無關，反應培養(yǎng)基還可以包括至少另一種底物，優(yōu)選包括數(shù)種，所述底物通過至少一種其他酶活性代謝，優(yōu)選數(shù)種酶活性代謝，所述其他酶活性優(yōu)選選自(3-D-葡糖醛酸糖苷酶活性，P-葡糖苷酶活性，色氨酸酶活性和脫氨酶活性。根據(jù)一個甚至更優(yōu)選的實施方案，所述其他底物選自6-氯-3-吲哚基-(3-葡糖苷酸，5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-P-D-葡糖苷，3',4'-二羥基-4'-P-D-葡糖苷和色氨酸。因此有可能不但區(qū)別和鑒定均表達(3-葡糖苷酶活性的第一組革蘭氏陰性細菌和第二組革蘭氏陽性細菌，而且還可能鑒定表達P-葡糖醛酸糖苷酶活性的至少第三組細菌和表達脫氨酶活性的第四組細菌，以及表達色氨酸酶活性的亞組。這類培養(yǎng)基具有重要的用途，尤其是用于診斷泌尿系感染。本發(fā)明還涉及包括至少第一種酶底物和至少第二種酶底物的反應培養(yǎng)基，所述第一種和第二種酶底物通過相同的酶活性代謝。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，所述第一種和第二種底物是基于吲哚氧基的；優(yōu)選地，第一種底物是5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-a-葡糖苷，第二種底物是6-氯-3-P引哚基-ot-葡糖苷。這類培養(yǎng)基尤其適于鑒定一組金黃色葡萄球菌和一組糞腸球菌。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案，所述第一種和第二種底物是基于吲哚氧基的；優(yōu)選地，所述第一種底物是5-溴-4-氯-3-吲哚氧基辛酸酯，所述第二種底物是5-溴6-氯-3-吲哚氧基辛酸酯。這類培養(yǎng)基尤其適于鑒定兩組不同血清型的沙門氏菌。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案，所述第一種底物是類黃酮衍生物，優(yōu)選3-羥基黃酮-p-葡糖苷，所述第二種底物是基于吲哚氧基的，優(yōu)選5-溴-4-氯_^甲基-3』引哚基-p-葡糖苷。這類培養(yǎng)基尤其適于鑒定一組革蘭氏陽性細菌和一組革蘭氏陰性細菌。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案，其中所述第一種底物是基于萘酚的，所述第二種底物是基于吲哚氧基；優(yōu)選地，所述第一種底物是p-萘酚苯-P-葡糖苷酸，所述第二種底物是6-氯-3-吲哚基-(3-葡糖苷酸。這類培養(yǎng)基尤其適于鑒定一組革蘭氏陽性細菌和一組革蘭氏陰性細菌。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案，所述第一種底物是基于茜素的，所述第二種底物是基于吲哚氧基的；優(yōu)選地，所述第一種底物是茜素-N-乙酰基-P-氨基葡糖苷，所述第二種底物是5-溴-4-氯-3』引哚基->^乙?；?卩-氨基葡糖苷。這類培養(yǎng)基尤其適于鑒定一組細菌和一組酵母。與本發(fā)明的實施方案無關，反應培養(yǎng)基還可以包括至少另一種底物，優(yōu)選數(shù)種底物，所述底物通過至少一種其他酶活性代謝，優(yōu)選數(shù)種酶活性代謝，所述其他酶活性優(yōu)選選自P-D-葡糖酸酸糖苷酶活性，p-葡糖苷酶活性，色氨酸酶活性和脫氨酶活性。根據(jù)甚至更優(yōu)選的實施方案，所述其他底物選自6-氯-3』引哚基-P-葡糖苷酸，5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-P-D-葡糖苷,3'，4'-二羥基-4'-P-D-葡糖苷和色氨酸。因此有可能不但區(qū)別和鑒定均表達P-葡糖苷酶活性的第一組革蘭氏陰性細菌和第二組革蘭氏陽性細菌，而且還可能鑒定表達P-葡糖醛酸糖苷酶活性的至少第三組細菌和表達脫氨酶活性的第四組細菌，以及表達色氨酸酶活性的亞組。下列實施例通過說明的方式給出，實際上不是以任何方式進行限制。它們使得可以更清楚地理解本發(fā)明。實施例1:測定表達相同酶活性的不同組微生物對相同底物代謝的差異的測試目的是區(qū)分至少兩組微生物，例如表達相同給定酶活性例如a酶的酶活性的第一組和第二組微生物。根據(jù)a酶的不同底物例如底物A、底物B和底物C計算兩組微生物中每組的活性。向反應培養(yǎng)基中分別添加底物A、B和C中的每一種，所述反應培養(yǎng)基適用于期望區(qū)分的所述第一組和所述第二組微生物的代謝。因此獲得包括底物A的培養(yǎng)基A，包括底物B的培養(yǎng)基B，包括底物C的培養(yǎng)基C等等。按照指示，為了區(qū)分酵母，適于酵母代謝的培養(yǎng)基特別可以是Saboumud培養(yǎng)基，任選部分或者完全不含葡萄糖。適于細菌代謝的培養(yǎng)基特別可以是類胰蛋白酶大豆培養(yǎng)基或者Columbia培養(yǎng)基o適于泌尿系統(tǒng)微生物代謝的培養(yǎng)基特別可以是不含其酶底物的CPSID3培養(yǎng)基。當然，根據(jù)待區(qū)分的微生物和研究的酶活性，可以優(yōu)選其他反應培養(yǎng)基。根據(jù)應用，它們可以是液體培養(yǎng)基或者凝膠培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基被等分。在每種培養(yǎng)基的等份中接種待區(qū)分的每組微生物的一或多種菌株。然后在合適的條件下溫育這些培養(yǎng)物。任選在不同溫育時間后，計算每種底物的水解，以便測定相同酶活'性的至少兩種底物之間是否存在與微生物組相關的水解差異。當鑒定出這類差異時，制備添加酶底物的相似反應培養(yǎng)基，所述酶底物顯示這種水解差異。如前所述，它被等分。在這種培養(yǎng)基的等份中接種待區(qū)分的這些微生物組的一或多種菌株。然后在合適的條件下溫育這些培養(yǎng)物，然后任選在不同溫育時間后檢查，以便評估酶的表達差異是否能夠區(qū)分被研究的微生物組。事實上，組的差異不僅依賴于底物間的水解差異，而且依賴于每種底物水解產(chǎn)生的信號和可能的相互作用之間的差異，尤其是在酶底物和/或產(chǎn)生的信號的水平。可以采用類似的方式進行上述實施例，以便鑒別不只兩組微生物，而是3、4或者更多組的微生物。實施例2:基于吲哚氧基的兩種a-葡糖苷酶底物5-溴-4-氯-3』引哚基-N-甲基-a-葡糖苷(X-N-Me-a-GLU)與6-氯-3-吲哚基-a-葡糖苷(Rose-a-GLU[Pink-a-GLUl訴于區(qū)別金黃色葡萄球菌和糞腸球菌向下表1所述的不同底物組合物中添加200ml體積50"C熔化的Columbia瓊月旨表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>這樣組成的培養(yǎng)基被分裝到培養(yǎng)皿。利用lOpl標定接菌環(huán)接種金黃色葡萄球菌和糞腸球菌各不同的3株到各培養(yǎng)基，利用0.5McFarland的標定懸浮液。所有培養(yǎng)物在37。C溫育24小時。溫育24小時獲得的生長和顯色結(jié)果列于表2，其中G表示生長，C表示顯色，I表示無色，In表示顯色強度，符號++表示非常好的生長，符號+表示菌株良好生長，符號+/-表示菌株的中等生長，符號-表示沒有菌株的生長。l對應于微弱的顯色強度，2對應于中等的，3對應于強的。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>上面表2的結(jié)果顯示兩個被測的種屬，金黃色葡萄球菌和糞腸球菌，對于每種底物顯示不同的顯色強度。相同培養(yǎng)基中這兩種底物的組合使觀察到每個種屬的不同顯色成為可能。因此，對于相同的酶活性和存在兩種該活性底物的條件下，有可能區(qū)分兩個種屬，其中它們的酶對每種底物的親和力是不同的。此外，如果添加合適濃度例如2和16mg/l之間的糖肽，例如萬古霉素或者游壁菌素，則該培養(yǎng)基尤其適于抗糖肽的格蘭氏陽性球菌的檢測，特別是那些具有"獲得性"抗性的，例如萬古霉素抗性金黃色葡萄球菌(VRSA)或者萬古霉素抗性糞腸球菌或者屎腸球菌(VRE)。實施例3:兩種基于吲哚氧基的酯酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚氧基辛酸酯(X-C8)結(jié)合5-溴-6-氯-3-吲哚氧基辛酸酯(Magenta-C8)用于鑒別不同血清型的沙門氏菌菌株向下面表3所概述的不同底物組合物中添加200ml體積50"C熔化的Columbia瓊月旨<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>這樣組成的培養(yǎng)基被分裝到培養(yǎng)皿。利用10ul標定接菌環(huán)接種不同的沙門氏菌血清型到各培養(yǎng)基，利用0.5McFarland的標定懸浮液。所有培養(yǎng)物在37。C溫育24小時。溫育24小時獲得的生長和顯色結(jié)果列于表3，其中G表示生長，C表示顯色，I表示無色，In表示顯色強度，符號++表示非常好的生長，符號+表示菌株良好生長，符號+/-表示菌株的中等生長，符號-表示沒有菌株的生長。l對應于微弱的的顯色強度，2對應于中等的，3對應于強的。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表4的結(jié)果顯示不同沙門氏菌血清型的酯酶活性親和力根據(jù)底物而不同。Dublin血清型相對于Magenta-C8更特異的水解X-C8。相反，另一血清型優(yōu)先水解Magenta-C8，對于該底物的顯色強度更強。因此，含有這兩種相同酶活性的底物的培養(yǎng)基使得可能對不同的沙門氏菌血清型獲得著色菌落，并從其他沙門氏菌血清型和不表達酯酶的細菌中分離出Dublin血清型。實施例4:卩-葡糖苷酶底物3-羥基黃酮-13-葡糖苷(HF-P-GLU)或者3'，4'-二羥基黃酮-P-葡糖苷(DHF-P-GLU)和基于吲哚氧基的底物5-溴-4-氯-N-甲基畫3-吲哚基-P-葡糖苷(X-N-Me-(3-GLU)用于鑒別具有(3-葡糖苷酶活性的革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌向下面表5所概述的不同底物組合物中添加200ml體積50'C熔化的Columbia瓊月旨表5<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>這樣組成的培養(yǎng)基被分裝到培養(yǎng)皿。利用l(Hil標定接菌環(huán)將陰溝腸桿菌(五"fera6a"erc/oacae)、月市炎克雷伯氏菌(X/eZw'e〃a/wewmow'ae)、粘質(zhì)沙雷氏菌(&rra"amarc"cem)、屎腸球菌、糞腸球菌、鶉雞腸球菌^〃/"w"m)、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的菌株接種到各培養(yǎng)基，利用0.5McFarland的標定懸浮液。所有培養(yǎng)物在37。C溫育24小時。溫育24小時獲得的生長和顯色結(jié)果列于表4，其中G表示生長，C表示顯色，I表示無色，In表示顯色強度，符號++表示非常好的生長，符號+表示菌株良好生長，符號+/-表示菌株的中等生長，符號-表示沒有菌株的生長。l對應于微弱的顯色強度，2對應于中等的，3對應于強的，4對應于非常強的。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表6結(jié)果顯示革蘭氏陰性和P-葡糖苷酶陽性種屬優(yōu)先水解基于吲哚氧基的底物，而格蘭氏陽性和P-葡糖苷酶陽性種屬優(yōu)先水解基于類黃酮的底物。因此，有可能區(qū)分具有相同酶活性的革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌。實際上，組的差異不僅取決于底物之間的水解差異，還取決于底物水解產(chǎn)生的信號之間的差異。實施例5:p-萘酚苯-P-葡糖苷酸底物(pNB-p-GUR)和基于U引哚氧基的底物6-氯-3-吲哚基-p-葡糖苷酸(Rose-P-GUR)[pink-(3-GURl)用于鑒別具有卩-葡糖醛酸糖苷酶活性的革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌向下面表7所概述的不同底物組合物中添加200ml體積5(TC熔化的Columbia瓊月旨表7<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>這樣組成的培養(yǎng)基被分裝到培養(yǎng)皿。利用10^1標定接菌環(huán)將微生物的不同菌株接種到各培養(yǎng)基，利用0.5McFarland的標定懸浮液。所有培養(yǎng)物在37。C溫育24小時。溫育24小時獲得的生長和顯色結(jié)果列于表5，其中G表示生長，C表示顯色，I表示無色，In表示顯色強度，符號++表示非常好的生長，符號+表示菌株良好生長，符號+/-表示菌株的中等生長，符號-表示沒有菌株的生長。l對應于微弱的顯色強度，2對應于中等的，3對應于強的，4對應于非常強的。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表8結(jié)果顯示革蘭氏陰性和(3-葡糖醛酸糖苷酶陽性種屬優(yōu)先水解基于吲哚氧基的底物，而格蘭氏陽性和P-葡糖醛酸糖苷酶陽性種屬優(yōu)先水解基于p-萘酚苯的底物。因此，有可能區(qū)分具有相同酶活性的革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌。實施例6:基于茜素的底物茜素-P-N-乙酰氨基葡糖苷(Aliz-(3-NAG)和基于吲哚氧基的底物5-溴-4-氯-3-噴哚基-P-N-乙酰氨基葡糖苷(X-P-NAG)用于鑒別具有氨基已糖苷酶活性的細菌和酵母向下面表9所概述的不同底物組合物中添加200ml體積5(TC熔化的Columbia瓊月旨。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>這樣組成的培養(yǎng)基被分裝到培養(yǎng)皿。利用ioy標定接菌環(huán)接種微生物的不同菌株到各培養(yǎng)基，利用0.5McFarland的標定懸浮液。所有培養(yǎng)物在37。C溫育24小時。溫育24小時獲得的生長和顯色結(jié)果列于表6，其中G表示生長，C表示顯色，I表示無色，In表示顯色強度，符號++表示非常好的生長，符號+表示菌株良好生長，符號+/-表示菌株的中等生長，符號-表示沒有菌株的生長。l對應于微弱的顯色強度，2對應于中等的，3對應于強的，4對應于非常強的。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表10的結(jié)果顯示氨基已糖苷酶陽性細菌優(yōu)先水解基于茜素的底物，而氨基已糖苷酶陽性酵母優(yōu)先水解基于吲哚氧基的底物。因此，利用這種相同活性的兩種底物有可能區(qū)分具有相同酶活性的細菌和酵母，其中每組的酶對兩種底物的親和力是不同的。權(quán)利要求1.一種鑒定至少兩組表達相同酶活性的微生物的方法，包括以下步驟a)在反應培養(yǎng)基中溫育所述微生物組，所述反應培養(yǎng)基包括第一種酶底物和第二種酶底物，所述第一種和第二種酶底物通過相同的酶活性代謝；b)鑒定所述微生物組。2.—種反應培養(yǎng)基用于鑒定至少兩組表達相同酶活性的微生物的用途，所述反應培養(yǎng)基包括至少第一種酶底物和至少第二種酶底物，所述第一種和第二種酶底物通過相同的酶活性代謝。3.—種鑒定表達相同酶活性的第一組微生物和第二組微生物的方法，包括以下步驟a)在反應培養(yǎng)基中溫育所述第一組和第二組微生物，所述反應培養(yǎng)基包括第一種酶底物和第二種酶底物，所述第一種和第二種酶底物通過相同的酶活性代謝；b)鑒定所述微生物組。4.一種反應培養(yǎng)基用于鑒定表達相同酶活性的第一組微生物和第二組微生物的用途，所述反應培養(yǎng)基包括至少第一種酶底物和至少第二種酶底物，所述第一種和第二種酶底物通過相同的酶活性代謝。5.如權(quán)利要求1或者3所述的方法或者如權(quán)利要求2或者4所述的用途，其中所述相同的酶活性選自下列酶活性氧化酶、酯酶和肽酶。6.如權(quán)利要求3所述的方法或者如權(quán)利要求4所述的用途，其中-"所述第一組微生物是一組金黃色葡萄球菌(&w"m)，所述第二組是一組糞腸球菌(￡./aea2/&)，■所述相同的酶活性是a-葡糖苷酶活性，-所述第一種和第二種底物是基于吲哚氧基的。7.如權(quán)利要求3所述的方法或者如權(quán)利要求4所述的用途，其中-所述第一和第二組微生物是不同血清型的沙門氏菌，，所述相同的酶活性是酯酶活性，■所述第一種和第二種底物是基于吲哚氧基的。8.如權(quán)利要求3所述的方法或者如權(quán)利要求4所述的用途，其中，所述第一組微生物是一組革蘭氏陽性細菌，所述第二組微生物是一組革蘭氏陰性細菌，"所述相同的酶活性是p-葡糖苷酶活性，，所述第一種底物是類黃酮衍生物。9.如權(quán)利要求3所述的方法或者如權(quán)利要求4所述的用途，其中，所述第一組微生物是一組革蘭氏陽性細菌，所述第二組微生物是一組革蘭氏陰性細菌，，所述相同的酶活性是p-葡糖醛酸糖苷酶活性，■所述第一種底物是基于萘酚的，所述第二種底物是基于吲哚氧基的。10.如權(quán)利要求3所述的方法或者如權(quán)利要求4所述的用途，其中"所述第一組微生物是一組酵母，所述第二組微生物是一組細菌，■所述相同的酶活性是氨基已糖苷酶活性，■所述第一種底物是基于茜素的，所述第二種底物是基于吲哚氧基的。11.如權(quán)利要求1、3禾B5到10中任意一項所述的方法，其中反應培養(yǎng)基包括至少另一種底物，所述底物通過至少一種其他酶活性代謝，所述其他酶活性優(yōu)選選自p-D-葡糖醛酸糖苷酶活性、P-葡糖苷酶活性、色氨酸酶活性和脫氨酶活性。12.如權(quán)利要求2、4和5到10中任意一項所述的用途，其中反應培養(yǎng)基包括至少另一種底物，所述底物通過至少一種其他酶活性代謝，所述其他酶活性優(yōu)選選自(3-D-葡糖醛酸糖苷酶活性、P-葡糖苷酶活性、色氨酸酶活性和脫氨酶活性。13.—種反應培養(yǎng)基，包括至少第一種酶底物和至少第二種酶底物，所述第一種和第二種酶底物通過相同的酶活性代謝。14.如權(quán)利要求13所述的反應培養(yǎng)基，其中所述第一種和第二種底物是基于吲哚氧基的。15.如權(quán)利要求13所述的反應培養(yǎng)基，其中所述第一種底物是類黃酮衍生物，所述第二種底物是基于吲哚氧基的。16.如權(quán)利要求13所述的反應培養(yǎng)基，其中所述第一種底物是基于萘酚的，所述第二種底物是基于n引哚氧基的。17.如權(quán)利要求13所述的反應培養(yǎng)基，其中所述第一種底物是基于茜素的，所述第二種底物是基于P引哚氧基的。18.如權(quán)利要求13到17中任意一項所述的反應培養(yǎng)基，其特征在于其還包括至少另一種底物，所述底物通過至少一種其他酶活性代謝，所述其他酶活性優(yōu)選選自p-D-葡糖醛酸糖苷酶活性、P-葡糖苷酶活性、色氨酸酶活性和脫氨酶活性。全文摘要本發(fā)明涉及一種鑒定至少兩組表達相同酶活性的微生物的方法，包括以下步驟a)在反應培養(yǎng)基中溫育所述微生物組，所述反應培養(yǎng)基包括第一種酶底物和第二種酶底物，其中所述第一種和第二種酶底物通過相同的酶活性代謝；b)鑒定所述微生物組。文檔編號C12Q1/37GK101395278SQ200780007132公開日2009年3月25日申請日期2007年2月23日優(yōu)先權(quán)日2006年2月28日發(fā)明者A·詹姆斯,C·羅杰-達爾伯特,J·佩里,S·歐倫加申請人:生物梅里埃公司