專利名稱：通過dna標簽的生物的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用DNA標簽的生物的鑒定方法，更具體地，涉及 通過特定的堿基序列的檢測，鑒定個體、種、棲息地等的方法。更具體地， 涉及預(yù)先將特定的堿基序列有意地添加給檢查對象，然后通過檢測該序列， 鑒定個體、種、棲息地等的方法。由于生物具有的DNA的堿基序列4艮據(jù) 個體、種、棲息地等而不同，通過利用本發(fā)明的鑒定方法，可以判別生物 的個體、種、棲息地等。而且，最近，食品帶有附加說明的封印的偽裝，
以及向食品混入基因重組體等已成為社會問題，本發(fā)明的鑒定方法就可以 應(yīng)用于這些偽裝和混入的判定等。
背景技術(shù)：
近年來，從食品的放心和安全的觀點看來，農(nóng)產(chǎn)物的產(chǎn)地判定和品種 鑒別等的鑒定的必要性日益增加，但很多情況下僅依據(jù)外觀無法鑒定產(chǎn)地 和品種，無法得出鑒定結(jié)果，因此最近，采用DNA的鑒定方法開始^皮應(yīng) 用(例如參考非專利文獻l)。
現(xiàn)在，為了使用DNA進行產(chǎn)地和品種的鑒別，需要在各產(chǎn)地和品種 中預(yù)先檢索并確定堿基序列不同的DNA的部位，在實際的產(chǎn)地和品種的 鑒別時，用堿基序列分析和PCR - RFLP等方法分析作為檢查對象的生物 的DNA的該部位的堿基序列，判斷獲得的堿基序列與哪個產(chǎn)地或品種的 相同。迄今為止，為了確定這種鑒定中使用的DNA的部位， 一直在鑒定 對象的生物原本具有的DNA中，尋找具有與其它生物不同的堿基序列的 部位(例如參考專利文獻l、 2)。具體地，例如，為了確定草莓的品種鑒別 中使用的DNA部位，首先，大量收集例如名為"豐香(i J:0力、)"的同 一品種的草莓，分別從其中提取DNA,用多種限制性酶分別切割各DNA 后，分別進行電泳，獲得切割模式。然后，大量收集希望與"豐香"相辨別 的名為"栃乙女(t!: 6&i:力)"品種的草莓，從其中分別提取DNA，用多種 限制性酶分別切割各DNA后，分別進行電泳，獲得切割模式。然后，將"豐 香"和"栃乙女，，的各個限制性酶的切割模式互相比較，探尋"豐香"和"栃乙 女"的切割模式的差異。用相同限制性酶呈現(xiàn)不同的切割模式，是因為可以 用限制性酶切割的堿基序列的某些部位在"豐香，，和"栃乙女"中并不相同。 因此，將呈現(xiàn)出這種不同的切割模式的DNA的部位確定為用于判別"豐香" 和"栃乙女"的部位。因此，現(xiàn)在，為了確定用于判別產(chǎn)地和品種的DNA 的部位，需要花費大量時間、費用、勞動力。實際判別產(chǎn)地和品種時，將 從作為檢查對象的生物中提取的DNA，用在"豐香"和"栃乙女"中呈現(xiàn)不同 的切割模式的限制性酶切割后，進行電泳，判斷獲得的切割模式呈現(xiàn)的是 "豐香"和"栃乙女，，中的哪一種圖i瞽，鑒定檢查對象生物是"豐香"還是"栃乙 女"。因此，實際的產(chǎn)地和品種的鑒定的方法，使用的是與最初的確定用于 判別"豐香"和"栃乙女"的部位的方法相同的方法。
另一方面，現(xiàn)在，在試驗性進行的利用基因重組的基因治療和品種改 良中，正在開發(fā)在對象中導(dǎo)入發(fā)揮有益功能的基因和基因表達單元，使之 穩(wěn)定保持，并且檢測這些基因或基因表達單元保持在對象中的各種方法， 并使之實用化(例如非專利文獻2 ~ 4)。
專利文獻l:專利^Hf 2002-112774
專利文獻2:專利z^開2004-344004
非專利文獻l: 2006年7月21日農(nóng)林水產(chǎn)部新聞發(fā)布，關(guān)于2005年 產(chǎn)米農(nóng)產(chǎn)物檢查的通過DNA分析獲得的品種判別調(diào)查結(jié)果< http:〃www.maff.go.jp/www/press/2006/20060721press—3.pdf >
非專利文獻2: SambrookJ和Russell DW:第16章將克隆的基因?qū)?入培養(yǎng)的哺乳動物細胞(Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells )，分子克隆實驗手冊(Molecular Cloning : A laboratory manual),第三版，2001;第16.1-16.62頁。
非專利文獻3: SambrookJ和Russell DW，方法介紹DNA雜交(方 法8 - 10 ) ( Protocol : Introduction to Southern hybridization (Protocols 8-10)),在第6章制備和分析真核基因組DNA (Chapter6 Preparation and analysis of eukaryotic genomic DNA )，分子克隆實驗手冊(Molecular Cloning : A laboratory manual)，第三版，2001;第6.33-6.38頁。
非專利文獻4: SambrookJ和RussellDW，方法28通過雜交篩選細 菌菌落小規(guī)模(Protocol 28 Screening bacterial colonies by hybridization: Small numbers )，在第1章質(zhì)粒和它們在分子克隆中的使用(Chapterl Plasmids and their usefulness in Molecular Cloning )， 分子克隆實驗手 冊(Molecular Cloning : A laboratory manual )，第三版，2001;第1.1-1.142 頁。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題
然而，現(xiàn)在用于DNA的鑒定中使用的方法，即通過對其它生物所具 有的DNA的堿基序列與鑒定對象所具有的DNA的堿基序列分別進行分 析，對它們進行相互比較，確定鑒定對象中固有的DNA的堿基序列，通 過檢測該DNA的序列進行鑒定的方法，在多種堿基序列的分析和比較的 操作中，需要大量的勞動力、時間和費用。
本發(fā)明的目的在于提供新的生物的鑒定方法，以代替這種伴隨大量勞 動力的鑒定方法。
解決問題的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明人為了解決上述問題，反復(fù)進行了積極的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，為 了容易地確定并鑒定鑒定對象中特異的堿基序列，通過設(shè)定特定的DNA 堿基序列為DNA標簽，檢測該特定的DNA的堿基序列，可以比現(xiàn)行的方 法節(jié)約大量勞動力和時間以及費用，基于這種認識，完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明提供了以下的(1)~(7)。
(1) 生物的鑒定方法，該方法是鑒定是否是特定生物或該生物的后代
的方法，其特征在于預(yù)先在所述特定生物或在其上寄生或共生的生物的 細胞中導(dǎo)入DNA標簽，根據(jù)是否能從作為鑒定對象的生物或在其上寄生 或共生的生物提取的DNA中檢測出所述DNA標簽，判斷所述鑒定對象生 物是否是所述特定生物或該生物的后代。
(2) 根據(jù)(l)所述的生物的鑒定方法，其特征在于，向細胞中導(dǎo)入DNA 標簽是向基因組DNA中插入DNA標簽。
(3) 根據(jù)(2)所述的生物的鑒定方法，其特征在于，在基因組DNA中不 具有功能的部位插入DNA標簽。
(4) 根據(jù)(2)或(3)所述的生物的鑒定方法，其特征在于，向基因組DNA 中的1處以上的部位插入1種DNA標簽。
(5) 根據(jù)(2)或(3)所述的生物的鑒定方法，其特征在于，向基因組DNA 中的1處以上的部位插入多種DNA標簽。
(6) (2)~(5)的任意一項所述的生物的鑒定方法，其特征在于，DNA標序列。
(7) (2)~(5)的任意一項所述的生物的鑒定方法，其特征在于，DNA標
將DNA標簽插入到該生物中原本不存在該DNA標簽的部位,
發(fā)明的效果
如上述(1)和(2)的方法所述，通過在特定生物中預(yù)先導(dǎo)入具有特定的堿 基序列的DNA標簽，就可以不花費過多的勞動力、時間和費用，確定用 于鑒定的DNA的堿基序列。另外，通過在特定生物中寄生或共生的生物 中預(yù)先導(dǎo)入具有特定的堿基序列的DNA標簽，使該生物在特定生物中寄 生或共生后，檢測該DNA標簽，即使在難以直接向特定生物中導(dǎo)入DNA 標簽的情形下，也能夠間接導(dǎo)入DNA標簽。
另外，如上述(3)的方法那樣，通過在特定生物的基因組DNA中不具
有功能的部位插入DNA標簽，能夠不使特定生物的性質(zhì)發(fā)生任何變化地 添加DNA標簽。
另外，如上述(4)的方法那樣，通過向特定生物的基因組DNA的多個 位點插入1種DNA標簽，通過變化DNA標簽的種類和插入位點，能夠制 備DNA標簽的多種模式，可以在多種鑒定對象中分別使用這些模式進行鑒定。
另外，如上述(5)的方法那樣，通過向特定生物的基因組DNA的多個 位點插入多種DNA標簽，通過變化DNA標簽的拷貝數(shù)和插入位點，能夠 制備DNA標簽的多種模式，能夠在多種特定生物中分別使用這些模式進 行鑒定。而且，即使一部分DNA標簽由于偶發(fā)的重組等而脫落，也可以 使用殘留的DNA標簽進行鑒定。
另外，如上述(6)的方法那樣，通過使用特定生物原本不具有的DNA 的堿基序列作為DNA標簽，能夠明確鑒定特定生物中有無DNA標簽。
另外，如上述(7)的方法那樣，通過使用特定生物原本具有的DNA的 一部分的堿基序列作為DNA標簽，不需要設(shè)計新的堿基序列，因此可以 節(jié)約勞動力、時間和費用而確定DNA標簽。而且，通過在特定生物中原 本不存在該DNA標簽的位置插入該DNA標簽，通過只觀察插入位置的差 異，就可以分辨是否是DNA標簽。
附圖的簡要說明


圖1 是表示在特定生物的DNA中預(yù)先插入DNA標簽，通過檢測該 DNA標簽進行鑒定的方法的流程圖。
符號的說明
1- ■ ■特定生物、2. . ■測序引物結(jié)合序列部分、3. ■ ■標簽信息 序列部分、4, ■ , DNA標簽、5, ■.標簽信息序列、■ ■標簽信息 序列的測序沖莫式、7, ■ ■插入了 DNA標簽的基因組DNA、 8,,,具有 插入了 DNA標簽的基因組DNA的細胞、9.,.特定生物的基因組DNA
的一部分、10. ■ ■鑒定對象生物、11. ■ ■含有鑒定對象生物作為材料 的加工品、12, ■,從鑒定對象生物提取的基因組DNA、 13. ■,測序引 物、14. ■ ■測序片段、15. ■ ■鑒定對象生物的測序模式
具體實施例方式
以下對本發(fā)明進行詳細的"i兌明。
本發(fā)明的生物的鑒定方法是鑒定是否是特定生物或該生物的后代的方 法，所述方法的特征在于，預(yù)先在所述特定生物或在其上寄生或共生的生 物的細胞中導(dǎo)入DNA標簽，根據(jù)是否能從作為鑒定對象的生物或在其上 寄生或共生的生物提取的DNA中檢測出所述DNA標簽，判斷所述鑒定對 象生物是否是所述特定生物或該生物的后代。
特定生物可以由本發(fā)明的鑒定方法的實施者任意決定，例如，可以以 特定的個體、屬于分類學上的特定的單位(品種、種、屬等)的生物、特定 的棲息地的生物等作為特定生物。特定生物可以是動物、植物、微生物的 任意一種，另外，也可以是多細胞生物或單細胞生物的任意一種。
導(dǎo)入DNA標簽的細胞沒有特別的限定，優(yōu)選將導(dǎo)入的DNA標簽傳播 到該生物的后代的那樣的細胞。作為這種細胞，例如，如果是動物細胞， 可以例舉受精卵、精子、卵等，如果是植物細胞，可以例舉，像構(gòu)成愈傷 組織的細胞那樣的可以分化成個體的細胞。
DNA標簽通常導(dǎo)入到特定生物，但也可以導(dǎo)入到在特定生物上寄生或 共生的生物。作為特定生物和在其上寄生等的生物的具體例，例如，可以 列舉海苔和與其共生的oc-變形菌綱(a-Proteobacteria)、蜂蟲和與其共生 的巴克納氏菌(Buchnera)、造成赤潮的纖毛蟲的中縊蟲(Mesodinium)和 與其共生的隱藻、所有的病毒及其寄生的宿主等。
在細胞中導(dǎo)入DNA標簽的方法沒有特別的限定，優(yōu)選將DNA標簽插 入基因組DNA的方法。作為這種方法，例如，可以列舉使用同源重組和 在基因組中整合DNA的載體的方法等。利用同源重組的方法(動物基因 組Paul D. Richardson等人，基因修復(fù)和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因療法(Gene
Repair and Transposon畫Mediated Gene Therapy ) , Stem Cells: 2002; 20: 105-118、植物基因組EndoM等人，在擬南芥CAF-1突變體中同源重組 和 T-DNA 整合的增力口的頻率(Increased frequency of homologous recombination and T-DNA integration in Arabidopsis CAF-1 mutants ), EMBO J., 2006年11月29日；25(23): 5579-90，電子公開:2006年11月 16日)和使用在基因組中整合DNA的載體的方法(慢病毒的例子Bryda EC 等人，在用慢病毒產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物中檢測和鑒定多個染色體整合位點的 方法(Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus )， Biotechniques: 2006年12月，41(6): 715-9、逆轉(zhuǎn)錄病毒的例子Koo， B.C. 等人，使用基于MoMLV的逆病毒載體產(chǎn)生表達增強的綠色熒光蛋白的胚 系轉(zhuǎn)基因雞 (Production of germline transgenic chickens expressing enhanced green fluorescent protein using a MoMLV-based retrovirus vector) ， FASEBJ.， 2006年11月，20(13): 2251-60)是眾所周知的，只要 是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就可以利用這些方法在基因組DNA中插入DNA標簽。
方法，也可以使之以游離的狀態(tài)存在于細胞中那樣導(dǎo)入DNA標簽。這樣 的導(dǎo)入方法也是眾所周知的(EB病毒的例子Ren， P.等人，在人胚胎干 細胞中建立和應(yīng)用基于EB病毒的游離型載體(Establishment and Applications of Epstein-Barr Virus-Based Episomal Vectors in Human Embryonic Stem Cells ) ， Stem Cells: 2006,24 (5) 1338-1347)，只要是本 領(lǐng)域技術(shù)人員，就可以利用該方法在細胞中插入DNA標簽。
在基因組DNA中插入DNA標簽時，理論上，DNA標簽的堿基序列 和數(shù)量和長度、插入部位的性質(zhì)和數(shù)量、插入形態(tài)、檢測方法這七點都成 為重大問題。
作為DNA標簽的堿基序列，理論上，可以有以下兩種選擇使用特 定生物或在其上寄生或共生的生物(以下稱為"特定生物等，，)中原本存在的 堿基序列，或使用特定生物等中原本不存在的堿基序列。特定的DNA的
堿基序列是否存在于特定生物等中，如果是特定生物等所具有的DNA的 堿基序列全部完成分析的生物，作為本領(lǐng)域技術(shù)人員，使用公知的同源檢 索用軟件，檢索該DNA的堿基序列數(shù)據(jù)與作為DNA標簽使用的預(yù)定的 I)NA的堿基序列的同源性，可以容易地進行確認(例如，參考DNA Data Bank of Japan 同源性檢索用軟件 FASTA 的說明 < http:〃www.ddbj.nig.ac.jp/search/explain/fasta」xt-j.html 〉)。 特定生物等 具有的DNA的堿基序列還沒有完全完成分析時，不需要對特定生物等具 有的DNA的堿基序列進行詳細的分析，可以通過DNA印跡雜交和斑點印 跡雜交等分子生物學的基本實驗方法，進行確認(例如，參考Sambrook J 和Russell DW，方法介紹DNA雜交(方法8 - 10 X Protocol: Introduction to Southern hybridization (Protocols 8-10))，在第6章制備和分析真核 基因組DNA ( Chapter6 Preparation and analysis of eukaryotic genomic I)NA )，分子克隆實驗手冊(Molecular Cloning : A laboratory manual)， 第三版，2001;第6.33-6.38頁，日本專利局資料室其它參考信息標準 技術(shù)集 核酸的擴增和檢測 2-2-5 DNA雜交<
https:〃www.jpo.go.jp/shiryou/s—sonota/hyoujun—gijutsu/kakusan/0018.htm
1〉)。而且，對于DNA標簽的堿基序列，可以選擇該序列自身具有某種功
能(例如，結(jié)構(gòu)基因、啟動子、增強子等)，或不具有功能。雖然可以選擇 具有功能的序列或者不具有功能的序列中的任一序列，但是在具有功能的 序列的情況下，由于存在使得特定生物等的表現(xiàn)型發(fā)生某種變化的可能性， 因此優(yōu)選選擇不具有功能的序列。
DNA標簽的數(shù)量可以任意選擇，可以插入1種DNA標簽，也可以插 入多種DNA標簽。DNA標簽的長度可以按照后述的DNA檢測方法任意 進行選擇，優(yōu)選為數(shù)個堿基 數(shù)千個堿基左右的長度，更優(yōu)選為30個堿 基~ l，OOO個堿基左右的長度。
作為插入DNA標簽的部位，理論上，在特定生物等中的插入部位可 以有以下兩種選擇在具有某種功能的部位插入，或者在不具有功能的部 位插入。但是，在特定生物等中具有某種功能的部位處插入DNA標簽的
情況，因為在插入的生物中，插入部位原本應(yīng)當發(fā)揮的功能缺失，發(fā)生某 種性質(zhì)的變化的危險性高，所以這樣的部位作為插入以鑒定作為目的的
DNA標簽的部位并不合適。因此，實際上可以認為，理想的是，在特定生 物等中不具有功能的部位中插入DNA標簽。 一般來說，難以證明特定的 部位在特定生物等中不具有功能。但是，例如，人們已經(jīng)周知，生物所具 有的假基因中，有的已經(jīng)完全喪失功能(例如，參考Julie R. Wafaei和 Francis Y.M. Choy，葡糖腦苷脂酶重組等位基因在靈長類中葡糖腦苷脂 酶基因和假基因的分子進4b ( Glucocerebrosidase recombinant allele: molecular evolution of the glucocerebrosidase gene and pseudogene in primates) ， Blood Cells Mol Dis.， 2005年9 — 10月；35(2): 277-85)。通過 在該部位中插入DNA標簽，能絲毫無損于特定生物等所原本具有的功能 而添加DNA標簽。即使在假基因的部位以外，如果是不具有功能的部位， 也可以作為插入部位的候補考慮，從這些部位中選擇l個或多個部位，作 為插入部位。而且，即使是具有某種功能的部位，也可以在其中不影響功 能的位置中插入DNA標簽。作為這種例子，可以例舉用于純化體外合成 的蛋白的各種His標簽融合蛋白中添加His標簽的部位(例如，Mathur D 和Garg LC.，來自結(jié)核分枝桿菌H37Rv的功能性磷酸葡糖異構(gòu)酶具高 產(chǎn)率和純度的快速純化(Functional phosphoglucose isomerase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Rapid purification with high yield and purity )， Protein Expr Purif.， 2006年10月25日[電子公開早于印刷)。
以此為前提，插入部位的數(shù)量可以任意選擇。而且，作為插入形態(tài)， 理論上，可以從以下情況中通過任意組合進行選擇在特定的l個或多個 部位中只插入1個DNA標簽的情況，和對于1個部位一次次地插入多個 同種或異種的DNA標簽的情況，或者，任意地連接同種或異種的DNA標 簽的堿基序列的方向和數(shù)量而在1個或多個部位中插入的情況。
作為DNA標簽的檢測方法，在特定生物等中使用原本不存在的堿基 序列作為DNA標簽的情形時，從插入了該DNA標簽的特定生物等中提取 DNA，確認是否含有其中插入的DNA標簽的特異的堿基序列。對于從特
ii定生物等中提取DNA，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就能夠通過合適地使用已 知的各種方法而容易地進行(例如，參考Sambrook J和Russell DW，方法 介紹DNA雜交(方法8-10) (Protocol : Introduction to Southern hybridization (Protocols 8-10))，在第6章制備和分析真核基因組DNA
(Chapter6 Preparation and analysis of eukaryotic genomic DNA )， 分子 克隆實驗手冊(Molecular Cloning : A laboratory manual)，第三版， 2001;第6.33-6.38頁)。而且，對于確認提取的DNA中是否含有插入的 I)NA標簽的特異的堿基序列，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就能夠通過已知的 以I)NA標簽的堿基序列作為探針的DNA印跡雜交和斑點印跡雜交等分子 生物學的基本實驗方法(例如，參考Sambrook J和Russell DW,方法介 紹DNA雜交(方法8 - 10 ) ( Protocol : Introduction to Southern hybridization (Protocols 8-10))，在第6章制備和分析真核基因組DNA
(Chapter6 Preparation and analysis of eukaryotic genomic DNA ), 分子 克隆實驗手冊(Molecular Cloning : A laboratory manual)，第三版， 2001;第6.33-6.38頁)、或堿基序列測定法(例如，參考Sambrook J和 Russell DW，第12章DNA測序(Chapter12 DNA s叫uencing)， 分子 克隆實驗手冊(Molecular Cloning : A laboratory manual)， 第二版， 2001;第12.1-12.120頁)等，容易地進行。
而且，作為使用原本在特定生物等中存在的堿基序列作為DNA標簽 的時的DNA標簽的檢測方法，可以列舉如下方法以DNA標簽的堿基序 列作為探針，進行從特定生物等中提取的DNA的DNA印跡雜交，檢測探 針與多個電泳條帶雜交的方法(例如，參考M Yoshida， M Sdki， K Yamaguchi,和K Takatsuki:在成人T細胞白血病的所有原發(fā)性肺瘤中人 T細胞白血病原病毒的單克隆整合暗示人T細胞白血病病毒在該疾病中的 病因性角色(Monoclonal integration of human T-cell leukemia provirus in
all primary tumors of adult T-cell leukemia suggests causative role of human T-cell leukemia virus in the disease ) ， Proc Natl Acad Sci USA. 1984年4月；81(8): 2534-2537)， 4吏用插入的DNA標簽外側(cè)的插入部位附
近的堿基序列作為引物，進行PCR，通過對該擴增產(chǎn)物進行電泳，檢測含 有DNA標簽的長度的片段的方法(例如，參考S Murata， N Takasaki， M Saitoh,和N Okada:通過使用短散在元件(SINEs)作為進化的時間里程碑 來確定太平洋鮭魚之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(Determination of the phylogenetic relationships among Pacific salmonids by using short interspersed elements (SINEs) as temporal landmarks of evolution ) ， Proc Natl Acad Sci USA. 1993年8月1日；90(15): 6995-6999),同樣進行PCR后，進行雙鏈特異的 熒光性嵌入反應(yīng)，由于擴增出比不含DNA標簽時的PCR產(chǎn)物長的片段， 而確認熒光增強的方法；使用插入的DNA標簽外側(cè)的插入部位附近的堿 基序列作為引物，進行實時PCR，由于擴增出比不含DNA標簽時的PCR 產(chǎn)物長的片段，而確認熒光增強的方法；等等。只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員， 就能夠通過使用這些已知的分子生物學方法，容易地檢測DNA標簽。
本發(fā)明中，對于通過以特定生物中原本不存在的堿基序列作為DNA 標簽，預(yù)先插入特定生物的基因組DNA，判斷特定生物是否具有該堿基序 列進行鑒定的方法，用圖l說明基本的思路。該鑒定方法包括2個步驟， 即，預(yù)先在特定生物中插入DNA標簽的第1階段，和判斷鑒定對象生物 是否具有DNA標簽的笫2階段。在圖l中，第1階段在〈A〉部分圖示、 第2階段在〈B〉部分圖示。
首先，對第1階段的在特定生物中插入DNA標簽的步驟進行說明。 例如，對圖l(a)那樣的在特定生物1的基因組DNA中插入標簽的情形進行 說明。首先，準備特定生物1的受精卵(動物)或愈傷組織的細胞(植物)等。 這樣的細胞等，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就可以容易地制備。從特定生物 1的基因組DNA中原本不存在的堿基序列中，像(b)那樣，選擇DNA標簽 4的堿基序列，制備具有該序列的DNA。制備的方法，如果是本領(lǐng)域技術(shù) 人員，就可以使用公知的分子生物學的方法中的任意一種。例如，如果DNA 標簽短，可以采用分別化學合成單鏈后，使之退火，形成雙鏈的化學的合 成法；如果是可以制備適當?shù)哪０錎NA的比較長的DNA標簽，可以通過 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR:例如，參考MullisK以及其他5人，體外DNA的特 異寸生酶促才廣增聚合酶鏈反應(yīng)(Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction ) ， Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986; 51 Pt l:263畫73)制備。DNA標簽4采用了測序引物結(jié)合序列部 分2連接在標簽信息序列部分3的3，端的結(jié)構(gòu)。測序引物結(jié)合序列部分2 具有與測序引物13互補的堿基序列，當通過堿基序列的分析檢測DNA標 簽時，就成為測序引物結(jié)合的部位。標簽信息序列部分3是從特定生物提 取的基因組DNA中原本不存在的比較短的堿基序列，具有例如(c)中所示 的標簽信息序列5那樣的堿基序列，如果通過毛細管電泳分析堿基序列， 則顯示出例如標簽信息序列的測序模式6這樣的模式。將具有這種結(jié)構(gòu)的 DNA標簽4，通過體外的同源重組等(例如，參考Paul D. Richardson以及 其他3人，基因修復(fù)和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因療法(Gene Repair and Transposon-Mediated Gene Therapy) , Stem Cells: 2002; 20: 105-118), 插入到受精卵(動物)或愈傷組織的細胞(植物)等特定生物1的細胞的基因組 l)NA中，制備具有插入了 DNA標簽4的基因組DNA7的細胞8 (d)。如果 放大該DNA標簽插入部位，就如(e)那樣，形成特定生物的基因組DNA的 一部分9中插入了 DNA標簽4的形態(tài)。通過具有這種插入了 DNA標簽的 基因組DNA7的細胞8,制備具有插入了 DNA標簽4的基因組DNA7的 個體。至此，就是第1階段的在特定生物中插入DNA標簽的步驟。
然后，對圖KB〉部分中圖示的、第2階段的判斷鑒定對象生物是否 具有DNA標簽的步驟進行說明。從(f)那樣的鑒定對象生物10，或含有(g) 那樣的鑒定對象生物作為材料的加工品11中，提取鑒定對象生物中所含的 基因組DNA12 (h)。提取的方法，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，可以在已知的 分子生物學的方法中采用適于各種材料的任何方法(例如，參考Sambrook J和Russell DW,第6章制備和分析真核基因組DNA ( Chapter6 Preparation and analysis of eukaryotic genomic DNA )， 分子克隆實驗 手冊(Molecular Cloning : A laboratory manual)，第三版，2001;第 6.1-6,64頁、以及Sambrook J和Russell DW，第7章提取、純化和分析 來自真沖亥細月包的mRNA( Chapter7 Extraction, purification, and analysis of
mRNA from eukaryotic cells )，分子克隆實驗手冊(Molecular Cloning : A laboratory manual)，第三版，2001;第7.1-7.94頁)。如果鑒定對象生 物10具有DNA標簽4，那么由于DNA標簽4中含有測序引物結(jié)合序列部 分2，接著，用具有與該測序引物結(jié)合序列部分2的一部分互補的堿基序 列的測序引物13進行測序反應(yīng)，制成能夠分析標簽信息序列部分3的部分 的堿基序列的測序片段14，進行堿基序列分析。將由該結(jié)果獲得的鑒定對 象生物10的測序模式15，與標簽信息序列的測序模式6進行比較檢查， 判斷鑒定對象生物的測序模式15中是否含有標簽信息序列的測序模式6。 如果鑒定對象生物的測序模式15中含有標簽信息序列的測序模式6，可以 鑒定，鑒定對象生物10，或含有鑒定對象生物作為材料的加工品11含有 DNA標簽4。
實施例
以下，通過實施例對本發(fā)明進行具體的說明。但是當然，本發(fā)明不受 該實施例限制。
為了獲得有用的DNA標簽的堿基序列的例子，對于公開了全基因組 堿基序列的擬南芥，檢索基因組內(nèi)不存在的序列。作為擬南芥的數(shù)據(jù)庫， 使 用 由 The Arabidopsis Information Resource (TAIR) (http:Vwww.arabidopsis.org/)所提供的全基因組信息。檢索的結(jié)果是，作 為擬南芥的基因組內(nèi)不存在的序列，可以找到如序列編號1所示的堿基序 列。由此得知，可以尋求有效的堿基序列作為DNA標簽。
本說明書包括作為本申請的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請(特愿 2007-011739號)的說明書和/或附圖中所述的內(nèi)容。而且，本發(fā)明中引用 的所有的出版物、專利和專利申請按原樣作為參考并入本說明書。
權(quán)利要求
1. 生物的鑒定方法，該方法是鑒定是否是特定生物或該生物的后代的方法，其特征在于，預(yù)先在所述特定生物或在其上寄生或共生的生物的細胞中導(dǎo)入DNA標簽，根據(jù)是否能從作為鑒定對象的生物或在其上寄生或共生的生物提取的DNA中檢測出所述DNA標簽，判斷所述鑒定對象生物是否是所述特定生物或該生物的后代。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的生物的鑒定方法，其特征在于，向細胞中導(dǎo) 入DNA標簽是向基因組DNA插入DNA標簽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物的鑒定方法，其特征在于，在基因組 I)NA中不具有功能的部位插入DNA標簽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的生物的鑒定方法，其特征在于，向基因 組DNA中的1處以上的部位插入1種DNA標簽。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的生物的鑒定方法，其特征在于，向基因 組DNA中的1處以上的部位插入多種DNA標簽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2 5任意一項所迷的生物的鑒定方法，其特征在于， l)NA標簽的堿基序列是導(dǎo)入DNA標簽的生物的基因組DNA中本來不存 在的堿基序列。
7. 權(quán)利要求2~5任意一項所述的生物的鑒定方法，其特征在于，DNA 標簽的堿基序列是導(dǎo)入DNA標簽的生物的基因組DNA中存在的堿基序 列，將DNA標簽插入到該生物中原本不存在該DNA標簽的部位。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種新的生物鑒定方法，以代替以往的伴隨大量勞動力的通過DNA進行的生物鑒定方法，本發(fā)明開發(fā)了一種生物的鑒定方法，該方法是鑒定是否是特定生物或該生物的后代的方法，其特征在于，預(yù)先在所述特定生物或在其上寄生或共生的生物的細胞中導(dǎo)入DNA標簽，根據(jù)是否能從作為鑒定對象的生物或在其上寄生或共生的生物提取的DNA中檢測出所述DNA標簽，判斷所述鑒定對象生物是否是所述特定生物或該生物的后代。
文檔編號C12N15/09GK101379188SQ200780004858
公開日2009年3月4日 申請日期2007年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月22日
發(fā)明者五條堀孝, 今村馨, 奈須永典, 小林敬典, 辻本敦美 申請人:日本軟件開發(fā)株式會社;五十嵐孝雄;奈須永典