專利名稱：用于檢測巴氏桿菌耐藥性的基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本案屬于生物物質(zhì)檢測領(lǐng)域，特別涉及檢測巴氏桿菌耐藥性的芯片。

背景技術(shù)：
巴氏桿菌病(pasteurellosis)主要是由特定血清型的多殺性巴氏桿菌(Pasteurellosis multocida)引起畜禽共患的一種烈性傳染病。該病的發(fā)病率和死亡率很高，常給養(yǎng)殖業(yè)造成較為嚴(yán)重的損失。
大量流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，由于抗菌藥物的大量使用，導(dǎo)致巴氏桿菌細(xì)菌耐藥性普遍存在，特別是高耐藥菌株的出現(xiàn)，致使多數(shù)藥物對耐藥菌的臨床療效降低或無效。針對目前巴氏桿菌耐藥性日益增強(qiáng)的趨勢，臨床上選擇有效的抗巴氏桿菌藥物及提高對化學(xué)療法的響應(yīng)程度，要求對藥物的敏感性進(jìn)行測試。常規(guī)檢測耐藥性的方法有藥物敏感試驗(yàn)、質(zhì)粒消除試驗(yàn)、質(zhì)粒指紋圖譜技術(shù)、基因探針、Southern-blot、PCR、RT-PCR等方法，但是這些方法只能對少量樣品進(jìn)行分析，大約需要一周的時(shí)間。目前業(yè)界在引用基因技術(shù)提高檢測效率方面作出了許多貢獻(xiàn)。
已知的技術(shù)，如中國專利01105981.8公開了一種檢測豬產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素抗體的ELISA試劑盒及應(yīng)用，涉及結(jié)核分支桿菌耐藥性檢測芯片及其制作方法和應(yīng)用方法，主要是根據(jù)已知的結(jié)核分支桿菌耐利福平、異煙肼等的基因突變信息，設(shè)計(jì)相應(yīng)的結(jié)核分支桿菌耐藥性寡核苷酸探針，然后將合成的探針固定在經(jīng)修飾的玻片上，從而構(gòu)成結(jié)核分支桿菌耐藥性檢測芯片，利用設(shè)計(jì)的相應(yīng)引物將結(jié)核分支桿菌DNA樣品擴(kuò)增并加入熒光標(biāo)記處理以后，與芯片雜交，然后用芯片信號分析系統(tǒng)掃描芯片，并對雜交信號進(jìn)行分析，獲得有關(guān)結(jié)核分支桿菌的耐藥性信息。
又如中國專利200520119230.6公開了一種結(jié)核桿菌基因突變型檢測芯片，涉及結(jié)核桿菌的DNA水平診斷的三項(xiàng)指標(biāo)集成檢測基因芯片和基因芯片試劑盒，所述的基因芯片包括基片和反應(yīng)區(qū)域，所述的反應(yīng)區(qū)域包括12-200個(gè)探針點(diǎn)，1-10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)。
再如中國專利01105981.8公開了一種結(jié)核分支桿菌耐藥性檢測芯片及其制作方法和應(yīng)用方法，主要是根據(jù)已知的結(jié)核分支桿菌耐利福平、異煙肼等的基因突變信息，設(shè)計(jì)相應(yīng)的結(jié)核分支桿菌耐藥性寡核苷酸探針，然后將合成的探針固定在經(jīng)修飾的玻片上，從而構(gòu)成結(jié)核分支桿菌耐藥性檢測芯片，利用設(shè)計(jì)的相應(yīng)引物將結(jié)核分支桿菌DNA樣品擴(kuò)增并加入熒光標(biāo)記處理以后，與芯片雜交，然后用芯片信號分析系統(tǒng)掃描芯片，并對雜交信號進(jìn)行分析，獲得有關(guān)結(jié)核分支桿菌的耐藥性信息。
已知的技術(shù)尚沒有針對巴氏桿菌耐藥性的檢測芯片問世。

發(fā)明內(nèi)容
本實(shí)用新型所要解決的問題在于，克服襲用技術(shù)存在的上述缺陷，而提供一種用于檢測巴氏桿菌耐藥性的基因芯片。
本實(shí)用新型解決技術(shù)問題是采取以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的，依據(jù)本實(shí)用新型提供一種用于檢測巴氏桿菌耐藥性的基因芯片，包括經(jīng)過修飾的載玻片1，該載玻片上固定一系列寡核苷酸點(diǎn)陣探針，其中所述載玻片1為醛基修飾基片，預(yù)制合成的寡核苷酸探針點(diǎn)制于醛基修飾的玻片上，每條探針點(diǎn)4個(gè)重復(fù)；每個(gè)探針長度設(shè)計(jì)為15-30bp。
本實(shí)用新型解決技術(shù)問題還可以采用以下措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn) 前述的用于檢測巴氏桿菌耐藥性的基因芯片，其中所述探針為針對磺胺耐藥基因sulI、sulII、鏈霉素耐藥基因strA、strBy、氯霉素耐藥基因CatB2和四環(huán)素耐藥基因TetG及其突變基因設(shè)計(jì)的探針。
前述的用于檢測巴氏桿菌耐藥性的基因芯片，其中針對磺胺耐藥基因sulII的突變位點(diǎn)合成的探針是 前述的用于檢測巴氏桿菌耐藥性的基因芯片，其中針對鏈霉素耐藥基因strA的突變位點(diǎn)合成的探針是 前述的用于檢測巴氏桿菌耐藥性的基因芯片，其中合成所述探針的引物序列為 本實(shí)用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比具有顯著的優(yōu)點(diǎn)和有益效果。由以上技術(shù)方案可知，本實(shí)用新型在優(yōu)異的結(jié)構(gòu)配置下，至少有如下的優(yōu)點(diǎn) 本案以從巴氏桿菌中擴(kuò)增得到的磺胺耐藥基因sulI、sulII、鏈霉素耐藥基因strA、strBy、氯霉素耐藥基因CatB2和四環(huán)素耐藥基因TetG等6種耐藥基因?yàn)榘谢颍瑯?gòu)建了耐藥基因的基因檢測芯片，為巴氏桿菌耐藥基因的高通量、并行化、自動(dòng)化和快速檢測奠定了基礎(chǔ)。
本案述及的用于檢測巴氏桿菌耐藥性的基因芯片，克服了前述現(xiàn)有技術(shù)的不足，能夠針對巴氏桿菌對常用抗菌藥物產(chǎn)生的耐藥性進(jìn)行檢測和篩選，在一次反應(yīng)中進(jìn)行多種信息的平行分析。由于其在檢測中的高效率，因此要優(yōu)越于傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測技術(shù)。應(yīng)用該技術(shù)將有利于巴氏桿菌病治療方案的合理安排，提高巴氏桿菌病的防治水平。因此基因芯片技術(shù)在細(xì)菌耐藥性檢測中有著巨大的應(yīng)用價(jià)值，具有廣闊的應(yīng)用前景。
本實(shí)用新型的具體實(shí)施方式
由以下實(shí)施例及其附圖詳細(xì)給出。

圖1為本實(shí)用新型檢測芯片的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為本實(shí)用新型中檢測探針在芯片上的陣列示意圖； 圖3為本實(shí)用新型的制備框圖； 圖4為本實(shí)用新型基因芯片雜交后的掃描圖片。
具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖及較佳實(shí)施例，對依據(jù)本實(shí)用新型提供的具體實(shí)施方式
、結(jié)構(gòu)、特征及其功效，詳細(xì)說明如后。
參見圖1-2所示，一種用于檢測巴氏桿菌耐藥性的基因芯片，包括經(jīng)過修飾的載玻片1，該載玻片上固定一系列寡核苷酸點(diǎn)陣探針2，其中所述載玻片1為醛基修飾基片，預(yù)制合成的寡核苷酸探針點(diǎn)制于醛基修飾的玻片上，每條探針點(diǎn)4個(gè)重復(fù)；每個(gè)探針長度設(shè)計(jì)為15-30bp； 所述探針為針對磺胺耐藥基因sulI、sulII、鏈霉素耐藥基因strA、strBy、氯霉素耐藥基因CatB2和四環(huán)素耐藥基因TetG及其基因突變設(shè)計(jì)的探針。
參見圖3所示，制備用于檢測巴氏桿菌耐藥性的基因芯片的材料與方法 制備用于檢測巴氏桿菌耐藥性的基因芯片的材料與方法 1.菌種和菌株來源 巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥株為公知材料，源于中國藥品生物制品監(jiān)察所。
2.巴氏桿菌菌株藥敏試驗(yàn) 采用肉湯稀釋法(公知方法)進(jìn)行最小抑菌濃度(MIC)測定，試驗(yàn)操作程序及結(jié)果的判定均嚴(yán)格按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)的新規(guī)定及標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)用菌均對磺胺、鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素高度耐藥。
3.細(xì)菌DNA的制備 采用標(biāo)本處理試劑盒提取DNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 4.引物和探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥株細(xì)菌的耐藥基因測序結(jié)果及基因庫已公布的基因序列，識別菌種間多態(tài)性位點(diǎn)，使用DNAStar及引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)通用及菌種特異性探針。根據(jù)磺胺耐藥基因sulI、sulII、鏈霉素耐藥基因strA、strBy、氯霉素耐藥基因CatB2和四環(huán)素耐藥基因TetG序列多態(tài)性位點(diǎn)分布，設(shè)計(jì)特異性探針。
以包含磺胺耐藥基因sulII的突變位點(diǎn)合成的探針是 以包含鏈霉素耐藥基因strA的突變位點(diǎn)合成的探針是 合成各探針的引物序列根據(jù)巴氏桿菌基因組序列設(shè)計(jì)為 5.基因芯片制備 對巴氏桿菌的6個(gè)耐藥基因的常見基因型和突變型設(shè)計(jì)寡核苷酸探針后，進(jìn)行合成，以DMSO作為點(diǎn)樣液，采用微量點(diǎn)樣技術(shù)通過自動(dòng)點(diǎn)樣儀將事先合成好的寡核苷酸探針直接點(diǎn)制于醛基修飾的玻片上。每條探針點(diǎn)4個(gè)重復(fù)。
將點(diǎn)樣后的玻片進(jìn)行水合、干燥等點(diǎn)樣后處理，使DNA結(jié)合在醛基修飾的玻片上，對芯片進(jìn)行封閉，以避免在雜交過程中的非特異性吸附。用5′端熒光素標(biāo)記的上游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物與DNA微陣列于42℃雜交、42℃洗滌后，用scanarray基因芯片掃描儀掃描DNA陣列，通過GenePix Pro 4.0軟件分析TAMRA熒光信號的強(qiáng)度。
6.基因芯片的雜交與洗滌 將PCR擴(kuò)增的巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥株細(xì)菌的6種耐藥基因混合后，用Cy5-dUTP標(biāo)記，乙醇沉淀0.5h后溶解在20μL 5×SSC+2g/LSDS雜交液中；將基因芯片和雜交探針分別在95℃水浴中變性5min。將探針加在基因芯片上，用蓋玻片封片，置于42℃雜交16h，雜交后分別用1×SSC+0.03％SDS60℃洗滌20min；0.2×SSC 37℃洗滌15min；0.05xSSC 37℃洗滌15rain；超純水沖洗10次，乙醇浸泡1min。最后放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)干燥。整個(gè)過程避光。
7.檢測與分析 采用與靶基因完全一致的探針分別與芯片雜交，觀察芯片雜交的特異性；再用所有探針與芯片同時(shí)雜交，觀察芯片檢測的并行性。選用制備好的芯片10張，用sulI、sulII、strA、strBy、CatB2、tetA探針進(jìn)行同批次重復(fù)試驗(yàn)研究，觀察芯片檢測的重復(fù)性。
用scanarray基因芯片掃描儀掃描芯片，觀察掃描結(jié)果，根據(jù)相關(guān)軟件分析Cy5熒光信號的強(qiáng)度。檢測結(jié)果是 利用磺胺耐藥基因sulI、sulII、鏈霉素耐藥基因strA、strBy、氯霉素耐藥基因CatB2和四環(huán)素耐藥基因TetG檢測芯片得到的結(jié)果與藥敏檢測結(jié)果的比較，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率為99％。
鏈霉素、磺胺、氯霉素和四環(huán)素對耐藥株巴氏桿菌的MIC值(mg/L)
注PA為標(biāo)準(zhǔn)株巴氏桿菌；PB-PH為耐藥株巴氏桿菌 參見圖4所示，基因芯片雜交后掃描，結(jié)果信號清晰、富有層次、且背景均勻(雜交信號較強(qiáng)的點(diǎn)陣說明耐藥基因堿基序列與探針堿基序列互補(bǔ)，雜交信號較弱的點(diǎn)陣說明耐藥基因序列與探針堿基序列不完全互補(bǔ)，在芯片的點(diǎn)陣中同時(shí)設(shè)有陰性對照)?；蛐酒瑨呙杞Y(jié)果經(jīng)分析與上述藥敏檢測結(jié)果相符合。
寡核苷酸芯片的驗(yàn)證用藥敏實(shí)驗(yàn)檢測出來的磺胺耐藥野生型、鏈霉素耐藥野生型、氯霉素耐藥野生型和四環(huán)素耐藥野生型和突變型模板進(jìn)行不對稱PCR擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物混和，并和制備的芯片進(jìn)行雜交，結(jié)果顯示在不同探針的相應(yīng)位置上出現(xiàn)陽性信號(圖4-1、圖4-2、圖4-3、圖4-4、圖4-5)。在用野生型進(jìn)行對照時(shí)，圖4-6、圖4-7的野生型探針出現(xiàn)強(qiáng)信號。掃描結(jié)果顯示信號清晰、富有層次、且背景均勻(雜交信號較強(qiáng)的點(diǎn)陣說明耐藥基因堿基序列與探針堿基序列互補(bǔ)，雜交信號較弱的點(diǎn)陣說明耐藥基因序列與探針堿基序列不完全互補(bǔ)，在芯片的點(diǎn)陣中同時(shí)設(shè)有陰性對照，見圖4-0。
應(yīng)用寡核苷酸微芯片對Hp致病性相關(guān)的基因型及耐藥基因點(diǎn)突變進(jìn)行檢測，在同一芯片上同時(shí)可獲得多種臨床需要的相關(guān)信息。經(jīng)過反復(fù)的優(yōu)化，寡核苷酸微陣列檢測時(shí)對樣品取材和保存的要求不高；可同時(shí)對多個(gè)樣品進(jìn)行檢測；具有較高的準(zhǔn)確性；寡核苷酸微芯片的制備采用了合成后交聯(lián)的方法，大大降低了成本。芯片雜交特異性高，重復(fù)性好，實(shí)現(xiàn)了6種耐藥基因的同時(shí)檢測。
綜上，利用公知的PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)從巴氏桿菌敏感株和耐藥株中擴(kuò)增出相關(guān)耐藥基因，在基因克隆及同源性分析的基礎(chǔ)上利用分子生物學(xué)和基因芯片技術(shù)定位巴氏桿菌耐藥基因和基因突變位點(diǎn)，研制用于巴氏桿菌耐藥性檢測的基因芯片，使其能夠快速、準(zhǔn)確、高效地針對巴氏桿菌對多種藥物產(chǎn)生的耐藥性進(jìn)行檢測和篩選，在一次反應(yīng)中進(jìn)行多種信息的平行分析，在巴氏桿菌耐藥性檢測過程中突顯優(yōu)越于傳統(tǒng)的藥理學(xué)檢測技術(shù)。
以上所述，僅是本實(shí)用新型的較佳實(shí)施例而已，并非對本實(shí)用新型作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本實(shí)用新型的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本實(shí)用新型技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求1.一種用于檢測巴氏桿菌耐藥性的基因芯片，包括經(jīng)過修飾的載玻片，該載玻片上固定一系列寡核苷酸點(diǎn)陣探針，其特征在于所述載玻片為醛基修飾基片，預(yù)制合成的寡核苷酸探針點(diǎn)制于醛基修飾的玻片上，每條探針點(diǎn)4個(gè)重復(fù)；每個(gè)探針長度設(shè)計(jì)為15-30bp。
2.如權(quán)利要求1所述的用于檢測巴氏桿菌耐藥性的基因芯片，其特征在于所述探針為針對磺胺耐藥基因sulI、sulII、鏈霉素耐藥基因strA、strBy、氯霉素耐藥基因CatB2和四環(huán)素耐藥基因TetG及其突變基因設(shè)計(jì)的探針。
3.如權(quán)利要求2所述的用于檢測巴氏桿菌耐藥性的基因芯片，其特征在于針對磺胺耐藥基因sulII的突變位點(diǎn)合成的探針是
4.如權(quán)利要求2或3所述的用于檢測巴氏桿菌耐藥性的基因芯片，其特征在于針對鏈霉素耐藥基因strA的突變位點(diǎn)合成的探針是
5.如權(quán)利要求4所述的用于檢測巴氏桿菌耐藥性的基因芯片，其特征在于合成所述探針為具有下述引物序列的探針
專利摘要一種用于檢測巴氏桿菌耐藥性的基因芯片，涉及生物物質(zhì)檢測領(lǐng)域，它包括經(jīng)過修飾的載玻片，該載玻片上固定一系列寡核苷酸點(diǎn)陣探針，其特征在于所述載玻片為醛基修飾基片，預(yù)制合成的寡核苷酸探針點(diǎn)制于醛基修飾的玻片上，每條探針點(diǎn)4個(gè)重復(fù)；每個(gè)探針長度設(shè)計(jì)為15-30bp。本案以從巴氏桿菌中擴(kuò)增得到的磺胺耐藥基因sulI、sulII、鏈霉素耐藥基因strA、strBy、氯霉素耐藥基因CatB2和四環(huán)素耐藥基因TetG等6種耐藥基因?yàn)榘谢颍瑯?gòu)建了耐藥基因的基因檢測芯片。
文檔編號C12Q1/68GK201148440SQ20072009788
公開日2008年11月12日 申請日期2007年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月20日
發(fā)明者金天明, 李向陽, 段縣平, 劉海學(xué), 毛景東, 武迎紅, 程漢良, 偉 張 申請人:天津農(nóng)學(xué)院